CN110624112A - 一种连接前列腺素e2的水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种连接前列腺素E2的水凝胶及其制备方法和应用，水凝胶主要由胶原蛋白、纤维蛋白，脱细胞基质等含有蛋白的生物提取物、透明质酸以及海藻酸钠天然大分子化合物通过连接聚乙烯亚胺PEI共价结合PGE2而成。具有可注射性、良好的温度稳定性和生物相容性，在体内能够缓慢释放PGE2分子。注射到损伤器官的包膜或实质内，促进受损组织的细胞增殖和血管新生，抗凋亡，减少组织纤维化的发生，降低器官的损伤，促进损伤后器官结构和功能的恢复。受损器官包膜下注射可避免药物注射过程中对器官实质的二次受损，并且可以促进整个受损器官对药物的均匀吸收，更好的促进组织修复。

Description

一种连接前列腺素E2的水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种连接前列腺素E2的水凝胶及其制备方法和应用，增强干细胞的治疗效果。
背景技术
急性器官损伤类疾病包括：急性肾损伤、急性下肢缺血、皮肤损伤、急性心肌梗死、急性肠炎、急性肝损伤等，促进急性损伤器官的组织的生理性修复和血管新生对于治疗急性器官损伤以及延缓慢性病进展至终末期非常重要。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是由环加氧酶(COX)将花生四烯酸转化为中间体PGH2，再通过至少三种不同的PGE2合酶异构化产生，PGE2在疼痛，发热，炎症和具有炎性成分的疾病中的关键作用。分泌的PGE2以自分泌或旁分泌方式与细胞膜表面蛋白偶联受体起作用，在促进肠干细胞的研究中表明，PGE2可以在在体外促进肠干细胞(ISC)扩增和细胞增殖，诱导形成类器官肿胀和球状体的形态，但不能产生是类器官隐窝结构。PGE2可以刺激结肠或肝损伤后的细胞增殖，加速这些组织的修复。增加PGE2的组织水平，促进了移植的造血干细胞(HSC) 的归巢、以及正常血细胞数目恢复。PGE2也可以抑制肠上皮细胞分化并促进肠上皮细胞的修复。卵巢中的血管生成研究表明PGE2可诱导分支血管生成，PGE2介导的MMP-2激活促进子宫内膜异位症中的血管生成。人间充质干细胞的研究表明，PGE2信号通过促进GSK3 β的磷酸化，进而影响β-catenin的稳定性，促进了间充质干细胞的增殖。PGE2也可以有效的促进骨骼肌干细胞功能，增强再生和强度至关重要。另一方面，高浓度PGE2处理人骨髓间充质干细胞通过阻止细胞在G0/G1期，抑制细胞增殖。
胶原(Collagen)、纤维蛋白，脱细胞基质等含有蛋白的生物提取物、海藻酸钠以及透明质酸等是天然大分子化合物，具有较好的组织相容性、生物可降解性及丰富的生物学活性，以胶原、纤维蛋白，脱细胞基质等含有蛋白的生物提取物、海藻酸钠以及透明质酸等为基础的多种类型支架材料已经在组织工程领域显示出重要的应用价值。
在受损器官的治疗过程中，水凝胶注入某些器官(例如肝脏，心脏)的实质会诱发组织损伤和出血，而受损器官包膜下移植为疾病的治疗提供很好的器官微环境，能与其他器官隔离，防止药物对其他器官的影响，并提高局部药物浓度，同时器官包膜下注射缓释类药物可以避免药物注射过程中对器官实质的二次受损，并且可以促进整个受损器官对药物的均匀吸收，避免局部注射后仅对损伤的局部有修复作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种连接前列腺素E2的水凝胶及其制备方法和应用，具有可注射性、良好的温度稳定性和生物相容性，在体内能够缓慢释放PGE2分子。注射到损伤器官的包膜或实质内，促进受损组织的细胞增殖和血管新生，抗凋亡，减少组织纤维化的发生，降低器官的损伤，促进损伤后器官结构和功能的恢复。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种连接前列腺素E2的水凝胶，水凝胶的分子共价结合了前列腺素E2，既具备水凝胶生物材料的物理和化学性能，也具有前列腺素E2的生物活性。
水凝胶为含有蛋白的生物提取物、海藻酸钠以及透明质酸中的至少一种，所述含有蛋白的生物提取物为胶原蛋白、纤维蛋白或脱细胞基质。
上述前列腺素E2通过化学反应共价键直接结合到水凝胶的分子上。
所述化学反应是缩合反应。
上述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，所述前列腺素E2与聚乙烯亚胺PEI通过化学反应共价键间接连接到水凝胶的分子上。
所述PEI为含有18～20个氨基的PEI分子。还包括含有2～40个氨基、羧基的起连接作用的分子。
上连接前列腺素E2的水凝胶在直接用于治疗损伤部位药物或者制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。
所述干细胞包括间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、表皮干细胞或内皮祖细胞。
直接用于治疗损伤部位是指开放创面的涂抹、器官的包膜内注射、包括器官实质内注射以及腹腔内注射；所述组织损伤包括肾脏损伤、心肌梗死、皮肤缺损、下肢缺血和肝损伤器官损伤类。
本发明连接前列腺素E2的水凝胶具有不同的释放前列腺素E2的行为，通过PEI结合前列腺素E2方式来调控所述前列腺素E2的释放行为，具有可注射性、良好的温度稳定性和生物相容性。
本发明的制备方法，通过缩合反应共价结合PGE2的水凝胶的制备方法：
1.连接PGE2的蛋白类水凝胶的制备方法
(1)MES缓冲液(pH5.0)中透析蛋白24小时，后在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化下冰浴中反应24 小时，通过酰胺化反应将PEI接到蛋白分子侧基上，产物经超速离心、洗涤纯化。
(2)PGE2与EDC和Sulfo-NHS室温活化，加入上一步产物中冰浴反应24小时，通过酰胺化反应再将PGE2连接到蛋白分子连接的PEI侧基上，产物经超速离心、洗涤纯化，冻干。
(3)将连接PGE2的蛋白水凝胶以一定浓度(质量体积分数0.3-0.5％)溶解在水中；
(4)磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)溶液滴加到PGE2水凝胶溶液中，并调节PH＝7，冰水浴条件下搅拌0.5小时；
(5)混合溶液转移至37℃恒温箱中，即可见凝胶化。
2.连接PGE2的海藻酸钠水凝胶的制备方法
(1)海藻酸钠的酸化形成海藻酸，将干燥的海藻酸加入到水中，用四丁基氢氧化铵中和pH至中性；
(2)溶于DMSO中，以后在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化下室温中反应12小时，通过酰胺化反应将 PGE2接到海藻酸分子侧基上；
(3)用可置换四丁基阳离子的钠盐溶液透析。将四丁基阳离子用钠离子置换出来；
(4)索式提取，将其室温干燥；
(5)在室温下将海藻酸钠溶解在去离子水中并持续搅拌直至完全溶解。将CaCO3与d-葡糖酸-δ-内酯(GDL)组合用作钙离子的来源以引发凝胶化。
3.连接PGE2的透明质酸水凝胶的制备方法
(1)通过使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的碳二亚胺偶联反应将多巴胺与透明质酸(HA)骨架缀合反应6小时合成HA-CA，产物透析去除杂质；
(2)在EDC和Sulfo-NHS活化下室温反应6小时，通过酰胺化反应将PEI接到HA-CA分子侧基上，产物透析去除杂质；
(3)PGE2与EDC和Sulfo-NHS室温活化，加入上一步产物中室温反应12小时，通过酰胺化反应再将PGE2连接到蛋白分子连接的PEI侧基上，产物透析去除杂质，冻干；
(4)碱性条件(pH＝8)下，在氧化剂(高碘酸钠；NaIO4)存在下，在等摩尔当量的高碘酸钠与GE2-HA-CA缀合物的儿茶酚的情况下，使缀合物交联形成水凝胶。
本发明的有益效果是：使用PGE2连接的水凝胶或者负载干细胞可通过直接注射的方式移植到损伤组织，观察到组织学和功能学的恢复。这种治疗手段可以在显著增强受损区域存活的组织细胞增殖，也可通过结合PGE2的水凝胶与干细胞的相互作用增加水凝胶注射区域和临近部位的细胞增殖和受损区域的修复。该水凝胶具有有效的治疗作用、无毒副作用、损伤小、适合长期应用。本发明起到缓释PGE2的作用，避免药物浓度过高产生的副作用，同时可以延缓药物释放时间，更长效的促进器官功能修复。能显著地促进器官损伤后的功能恢复，激活受损部位血管新生的功能，显著抑制受损器官的病理性修复导致的纤维化，并可用于治疗器官损伤引起的人体和动物疾病。
附图说明
图1是本发明缓释PGE2的胶原水凝胶的合成方法图。
图2是本发明PGE2水凝胶随时间推移缓慢释放PGE2统计图(注：**代表具有显著的统计学差异，P值<0.01，***代表具有极显著的统计学差异,P值<0.001)。
图3是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen和Collagen-PGE2(肾包膜内注射，肾实质内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠3天后的血尿素氮、肌酸酐水平的统计图(注： *代表Collagen-PGE2包膜内注射组与Collagen包膜内注射组对比具有显著的统计学差异，P值<0.05，#代表Collagen-PGE2包膜内注射组与PGE2/Collagen包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05，$代表Collagen-PGE2肾实质内注射组与Collagen-PGE2 包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05)
图4是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen和Collagen-PGE2(肾包膜内注射，肾实质内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠3天后对损伤后肾脏组织的修复H&E染色图。
图5是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen和Collagen-PGE2(肾包膜内注射，肾实质内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠3天后的急性肾小管损伤情况统计图(注：** 代表Collagen-PGE2包膜内注射组与Collagen包膜内注射组对比具有显著的统计学差异，P值<0.01，#代表Collagen-PGE2包膜内注射组与PGE2/Collagen包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05，$代表Collagen-PGE2肾实质内注射组与Collagen-PGE2 包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05)。
图6是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen和Collagen-PGE2(肾包膜内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠3天后血管新生情况Living Image活体成像图。
图7是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen和Collagen-PGE2(肾包膜内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠后血管新生情况图和统计图(注：*代表Collagen-PGE2包膜内注射组与Collagen包膜内注射组对比具有显著的统计学差异，P值<0.05，#代表 Collagen-PGE2包膜内注射组与PGE2/Collagen包膜内注射组对比具有统计学差异，P值 <0.05)。
图8是Sham组，PBS、Collagen、PGE2/Collagen、Collagen-PGE2(肾包膜内注射，肾实质内注射)胶原水凝胶治疗AKI小鼠28天后肾脏切片Masson染色图和纤维化面积统计图(注：**代表Collagen-PGE2包膜内注射组与Collagen包膜内注射组对比具有显著的统计学差异，P值<0.01，#代表Collagen-PGE2包膜内注射组与PGE2/Collagen包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05，$代表Collagen-PGE2肾实质内注射组与 Collagen-PGE2包膜内注射组对比具有统计学差异，P值<0.05)
图9是Sham组，PBS、Collagen、ADSCs、ADSCs/Collagen和ADSCs/Collagen-PGE2(肌肉内注射)水凝胶治疗急性下肢缺血VEGFR2-luc(+)转基因C57小鼠血管新生情况统计图(注：*代表ADSCs/Collagen-PGE2组与ADSCs组对比具有显著的统计学差异，P值<0.05， **代表P值<0.01；#代表ADSCs/Collagen-PGE2组与ADSCs/Collagen组对比具有统计学差异，P值<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
下述所用的原料成分的材料均可以从市场上购买。
实施例1：连接PGE2的胶原蛋白水凝胶的合成
(1)在4℃条件下，使用6000～8000分子量的透析袋在50mM MES缓冲液(pH5.0)中透析150mg的酸溶性I型大鼠尾胶原蛋白(Collagen)24小时。将60mg的PEI与2.0ml MES缓冲液混合，pH调节至7.0，然后加入到MES缓冲液中的胶原中，并使用18G针头的注射器混合。轻轻拉起针，然后在4℃下反复混匀10分钟。向该混合物中加入20mg 1- 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和20mg的N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)并使用18G针混合30分钟，然后在4℃的搅拌24小时。将上述混合物强制通过18G针头，然后通过10kDa的超滤离心管，7500×g离心10分钟，以除去未反应的PEI和交联剂，并用5ml的50mM MES缓冲液冲洗收集用于下一步反应。
(2)将20mg的PGE2与溶解在0.5ml的50mM MES缓冲(pH＝5.0)中的EDC(20mg)和Sulfo-NHS(40mg)混合30分钟室温活化。然后使用带有18G针头的注射器在4℃下与 5ml上述收集液混合30分钟，并通过搅拌反应24小时。然后通过10kDa的超滤离心管， 7500×g离心10分钟，以除去未反应的PGE2和交联剂，并用无菌水充分洗涤收集，冻干(图1)。
(3)将连接PGE2的胶原水凝胶以一定浓度(质量体积分数0.1-0.5％)溶解在水中；
(4)磷酸盐缓冲液溶液滴加到PGE2水凝胶溶液中，并调节PH＝7，冰水浴条件下搅拌 0.5小时，37℃放置10分钟即可形成水凝胶。
实施例2：连接PGE2的海藻酸钠水凝胶的合成
(1)海藻酸钠的酸化：取酸与无水乙醇配制成酸浓度为6mol/L的溶液后，加入海藻酸钠(8％w/v)搅拌3小时后，0-4℃保存过夜；次日抽滤，用70％的乙醇洗涤沉淀直到去除所有的盐酸，室温下干燥；
(2)将干燥的海藻酸加入到水中，使其浓度为4％(W/V)，滴加一定量四丁基氢氧化铵中和，调节其pH至中性；然后冷冻干燥；
(3)取步骤2处理后的样品适量溶于DMSO中，以海藻酸钠单体与交联剂摩尔比＝1：2： 2～1：5：5加入交联剂EDC和sulfo-NHS，海藻酸单体：PGE2＝摩尔比1：5～1：18的比例加入PGE2，室温下中密闭搅拌反应12小时；
(4)将上述反应的混合物装入截留分子量为8000～14000分子量的透析袋中，用400mg/L叠氮化钠溶液透析72小时，期间更换10次透析液，将四丁基阳离子用钠离子置换出来；
(5)取出透析后的物质，80℃水浴下索式提取10小时，除去未反应的酰胺,将其室温干燥即得；
(6)室温下将上述产物溶解在去离子水中并持续搅拌直至完全溶解。
(7)始终保持CaCO3与GDL摩尔比＝1:2以达到中性pH值。随后在连续搅拌下将CaCO3和d-葡糖酸-δ-内酯悬浮液加入海藻酸钠溶液中。均匀混合后，冰水浴条件下搅拌0.5 小时，常温放置即可缓慢形成水凝胶。
实施例3：连接PGE2的透明质酸水凝胶的合成
(1)将0.1g透明质酸(HA，MW＝130kDa)溶解在脱气的50mLMES缓冲盐水中。将EDC(50mg)和NHS(30mg)缓慢加入混合溶液中，直至HA/EDC/NHS的最终摩尔比＝1：1： 1。搅拌20分钟后，向混合物中加入0.05g多巴胺。连续监测溶液的pH值并保持6小时。反应后，然后通过50kDa的超滤离心管，7500×g离心10分钟，以除去未反应的PEI和交联剂，并用5ml的50mMMES缓冲液冲洗收集用于下一步反应；
(2)向该透析物中加入20mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC) 和20mg的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，然后在常温的搅拌30分钟。将60mg的PEI与0.5ml的50mM MES缓冲液混合，pH调节至7.0，然后滴加并搅拌入到纯化后的溶液中，室温反应6小时反应后，反应后，然后通过50kDa的超滤离心管，7500×g离心 10分钟，以除去未反应的PEI和交联剂，并用5ml的50mM MES缓冲液冲洗收集用于下一步反应；
(3)将20mg的PGE2与溶解在0.5ml的2×PBS缓冲(pH＝5.0)中的EDC(20mg)和Sulfo-NHS(40mg)混合30分钟室温活化。向该混合物中加入20mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和20mg的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，然后在常温搅拌反应24小时。然后通过50kDa的超滤离心管，7500×g离心10分钟，以除去未反应的PGE2和交联剂，并用无酸化的超轻水(pH<2)充分洗涤收集，冻干。
(4)将上述冻干物溶于1×PBS，10％(w/v)中。通过加入NaOH将溶液的pH从8 调节至9。当加入0.4mg/(100μL溶解液)的NaIO4，室温下，PGE2-HA-儿茶酚水凝胶自发合成。
实施例4：PGE2水凝胶可以起到缓释PGE2的作用
将具有连接或未连接PGE2的200μl胶原(浓度3.5mg/ml)沉积在1.5ml微量离心管的底部。在37℃下孵育15分钟后，将500μl的1×PBS小心地分层在胶原蛋白上。然后将混合物在37℃下温育最多16天。在不同时间点从PBS层取出10μl溶液，并补充 10μl新鲜1×PBS。然后使用Elisa试剂盒测试上清液中PGE2的含量，并推算出积累释放量(图2)。
图2的结果显示，PGE2水凝胶Collagen-PGE2在体外释放速度缓慢，并且在第1天就与PGE2和胶原混合组对比有明显的统计学差异，在随后的时间内释放速度较为稳定，说明PGE2水凝胶可在体内达到缓慢释放药物PGE2的作用。
实施例5：PGE2水凝胶增强肾急性损伤后肾功能的修复
1.单侧急性肾脏损伤及治疗
(1)经腹腔注射戊巴比妥钠(1％，80mg/kg)麻醉小鼠，用剃毛器背部毛剃除，用脱毛膏清理干净并清洗，将小鼠固定在加热垫温度(37℃)上，于背部中部、脊柱左侧0.2-0.5cm 处纵行切开皮肤(0.8-1cm)，分离皮下结缔组织，离断背部肌肉进入腹腔，探查并暴露左肾，可见正常肾脏呈现鲜红色；
(2)用尖镊分离肾周脂肪及筋膜，向左侧轻轻牵拉肾脏暴露肾动脉，使用微型血管夹夹住肾动脉，约1分钟可见肾脏颜色加深，随着时间的增加逐渐呈紫黑色；
(3)肾脏缺血期间，使用浸沾温生理盐水的纱布覆盖切口并保持纱布湿润，小鼠上方用暖灯照射并保持加热垫温度(37℃)恒定；
(4)缺血40分钟，移除血管夹，肉眼可见肾脏颜色由紫黑色缓慢变为红色，使用6-0丝线缝合肌层，使用3-0丝线缝合皮肤关闭背部切口；
(5)将小鼠置于加热垫上复温，待苏醒后放回饲养笼。
2.单侧急性肾脏损伤加对侧肾切除模型
(1)麻醉小鼠，并行左侧肾脏缺血再灌注损伤，方法同上；
(2)缺血损伤期间，用同样方式切开右侧背部皮肤，分离皮下组织和肌肉，探查并暴露右肾；
(3)游离肾周组织后，使用尖镊分离出右输尿管，使用6-0丝线(靠近肾脏)双结结扎肾蒂，同时注意保护输尿管，并切除肾脏；
(4)必要时，使用棉签吸净腹腔内血性渗出物，查无明显出血逐层缝合。
在肾脏缺血再灌注后(对于重度损伤模型，在对侧肾脏切除术后)，即刻行左肾内递送水凝胶。
3.水凝胶/PBS递送方法：
在肾脏缺血再灌注后(对于重度损伤模型，在对侧肾脏切除术后)，即刻行左肾包膜内递送水凝胶。
(1)肾包膜内递送
使用镊子将肾脏轻轻提拉到体外，用细棉条或纱布条包裹并固定肾脏；
使用胰岛素注射器(300μl规格)吸取输送介质(PBS或水凝胶，75μl)，于肾脏上极切面部位轻轻刺入肾脏包膜，缓缓移动针头，沿着肾脏切面进入到肾脏的中下部，并缓慢摆动针头，在不伤及肾脏表皮的前提下扩张包膜内体积，缓慢轻推注射器注入包膜内 75μl，同时观察小鼠的呼吸频率；
注射完成后，缓慢拔除注射器，同时使用棉球按压肾包膜进针处2-3分钟。
(2)肾实质内递送
使用镊子将肾脏轻轻提拉到体外，用细棉条或纱布条包裹并固定肾脏；
使用胰岛素注射器(300μl规格)吸取输送介质(PBS或水凝胶，30μl)，于肾脏上极、中部和下极三个部位轻轻刺入肾脏实质(深度约3mm)，缓慢轻推注射器，每点注入10μ l，同时观察小鼠的呼吸频率；
注射完成后，缓慢拔除注射器，同时使用棉球按压进针处肾脏组织止血1分钟。
为了评价肾脏功能学变化，我们对雄性C57小鼠随机分成六组，每组10只，除了Sham 组仅做单侧假手术对侧肾脏切除术，其他每组均接受单侧肾脏缺血再灌注损伤加对侧肾脏切除术。即肾动脉结扎40分钟，对侧肾切除。不同实验组肾包膜分别注射：75μl PBS，75μl胶原蛋白(Collagen 3.5mg/ml)，75μl胶原蛋白和PGE2(1.5μM)的混合物 (PGE2/Collagen)，75μl的Collagen-PGE2(PGE2的浓度为1.5μM)注射到肾包膜内和 30μl的Collagen-PGE2(1.5μM)于肾脏上极、中部和下极三个部位轻轻刺入肾脏实质 (深度约3mm)，缓慢轻推注射器(10μl/部位)。将60只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理。
在损伤后的第3天，收集血液样品并收集血清用于使用生化自动分析仪(VitalabSelectra E)评估血尿素氮BUN和肌酸酐，水平的降低表明在AKI后第3天肾功能恢复。并取肾脏组织，病理分析肾脏损伤情况。
胶原与PGE2连接的水凝胶Collagen-PGE2肾包膜内注射可显著降低肾脏急性损伤后小鼠血液中肌酸酐和血尿素氮的水平，而实质内注射PGE2的水凝胶Collagen-PGE2可引起一定程度的肾功能的恢复，但与包膜内注射相比，不如包膜内注射更明显促进肾脏急性损伤后的肾功能的恢复(图3)。说明Collagen-PGE2可明显增强进行肾损伤后的肾功能修复。
病理分析肾脏损伤情况：H&E染色结果显示，PBS组和Collagen组肾脏受损严重，表现为管腔扩张、肾小管上皮细胞的脱落和坏死、刷状缘消失、管型形成、肾小球萎缩； PGE2/Collagen组肾脏组织有一定的恢复，但炎症反应较为强烈；实质内注射 Collagen-PGE2，在靠近注射位置附近肾脏损伤部位有明显的恢复，而在远离注射部位肾小管损伤仍然很严重；而肾包膜下注射Collagen-PGE2，整个肾脏的损伤程度有明显的降低(图4、图5)，说明Collagen-PGE2可明显增强进行肾损伤后的肾结构修复。
实施例6：PGE2水凝胶促进肾损伤后血管新生
将VEGFR2-luc(+)转基因C57小鼠分成五组(每组n＝10)，除了Sham组做假手术，其他每组接受肾动脉结扎40分钟，对侧肾切除，引起的肾急性缺血再灌注损伤。肾包膜注射不同溶液中：75μl PBS，75μl胶原蛋白(Collagen 3.5mg/ml)，75μl胶原蛋白和PGE2(1.5μM)的混合物(PGE2/Collagen)，75μl的Collagen-PGE2(1.5μM)注射到肾包膜内，将50只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理。
分别在损伤后的第1、4、7、14天，在小鼠眼底注射入25ul荧光素(Luciferin 30mg/mL)，并在IVIS Lumina成像系统中成像，观察小鼠肾脏血管新生情况，荧光轻度增强表明在AKI后PGE2水凝胶进而促进急性损伤后的肾脏血管新生(图6、图7)。
胶原与PGE2连接的水凝胶Collagen-PGE2肾包膜内注射可明显增加急性损伤后的肾脏活体成像显影的荧光强度，说明Collagen-PGE2可显著促进肾脏急性损伤后小鼠肾脏内血管新生。
实施例7：PGE2水凝胶显著抑制肾脏损伤后病理性修复引起的纤维化
将C57小鼠随机分成五组，每组n＝10，除了Sham组做假手术，其他每组接受肾动脉结扎40分钟，对侧肾切除，引起的肾急性缺血再灌注损伤。肾包膜注射不同溶液中：75 μlPBS，75μl胶原蛋白(Collagen 3.5mg/ml)，75μl胶原蛋白和PGE2(1.5μM) 的混合物(PGE2/Collagen)，75μl的Collagen-PGE2(1.5μM)注射到肾包膜内和75μl 的Collagen-PGE2(1.5μM)注射到肾实质内。将50只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理。
在损伤后的第28天，将实验小鼠人道处死后去肾脏进行固定、包埋、切片，并进行Masson染色，观察小鼠肾脏纤维化情况，肾脏损伤后病理性修复引起的成纤维细胞会分泌胶原蛋白会被染成蓝色，而普通修复好的组织会被染成红色(图8)。
胶原与PGE2连接的水凝胶Collagen-PGE2肾包膜内注射可明显减少急性损伤后的肾脏纤维化染色面积，说明Collagen-PGE2可明显抑制肾脏损伤后病理性修复引起的纤维化。
实施例8：Collagen-PGE2水凝胶和脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)共同移植治疗急性下肢缺血
(1)高温高压消毒手术器械(细尖镊子，尖头镊子，弹簧剪，手术剪，持针器和牵开器)，使用医用酒精消毒手术台区域；
(2)经腹腔注射戊巴比妥钠(1％，80mg/kg)麻醉小鼠，将小鼠以仰卧位固定在术前台上，使用剃毛器去除背部毛发，碘伏消毒手术区皮肤；使用电动剃须刀，从后肢移除毛发，使用脱毛膏彻底去除毛发；
(3)将VEGFR2-luc(+)转基因C57小鼠置于仰卧位置，放在手术台上的垂直加热垫上，用一块胶带伸展并固定后肢。一旦后肢安全，用三个交替的碘伏和酒精擦洗擦拭皮肤。使用10×或20×放大倍数的解剖显微镜观察后肢区域的放大视图；
(4)使用细镊子和手术剪，从膝盖朝向大腿内侧做一个约1cm长的皮肤切口；
(5)使用PBS沾湿过过的棉签，轻轻擦去大腿肌肉周围的皮下脂肪组织。对皮下脂肪组织进行切开和解剖，以显示下方的股动脉。使用牵开器打开伤口并更好地观察下肢脉管系统；
(6)用细镊子和细尖的棉签轻轻刺穿膜质股鞘，露出神经血管束。然后，使用一套干净的精细镊子和棉签，将股动脉从股静脉和神经处切开并分离在腹股沟附近的近端位置。解剖后，在股动脉近端下方通过一条7-0丝线缝合线。使用双结封闭股动脉近端。将绑带放置在尽可能靠近伤口的血管上，以留下第二系带的长度和将被横切的中间段；
(7)将股动脉与靠近膝盖的远端位置的股静脉分开。在股动脉远端的动脉附近通过一条7-0缝合线，使用双结封闭血管；
(8)在第一组结点附近用第二组双结阻塞远端股动脉。第二组缝合线将用于在交易过程中夹住动脉；
(9)类似地，为了抓握目的，用恰好在第一组结的远侧的第二组双结闭塞近端股动脉；
(10)用细尖棉签和一对弹簧剪切断远端和近端结之间的股动脉段。小心不要刺穿股静脉壁；
(11)缺血后，分别将60μl PBS，60μl胶原蛋白(Collagen 3.5mg/ml)，60μl 1 ×106ADSCs细胞，60μl胶原蛋白和1×106ADSCs细胞的混合物(ADSCs/Collagen)，60 μl的PGE2连接的胶原水凝胶Collagen-PGE2和1×106ADSCs细胞混合物 (ADSCs/Collagen-PGE2，PGE2含量终浓度1.5μM)肌内注射到随机分组的小鼠缺血后肢中，每组10只小鼠；
(12)假手术(Sham)对照组：大腿内侧做一个约1cm长的皮肤切口；使用PBS沾湿过过的棉签，轻轻擦去大腿肌肉周围的皮下脂肪组织。对皮下脂肪组织进行切开和解剖，穿线不接扎不移植任何溶液或胶原。
(13)取下牵开器，并用5-0缝合线闭合切口。将动物放在恢复笼中的垂褶加热垫的顶部，并持续监测直至清醒。在动物恢复1小时后，进行激光多普勒血液灌注步骤以确认缺血诱导。将60只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理。
使用血流灌注成像仪PeriCam PSI检测在第1,4,7,14天在术后检测缺血/健康肢体中的血液灌注情况，结果显示：Collagen-PGE2和ADSCs细胞混合使用可明显促进缺血下肢血管的再生(图9)，并促进了下肢结构的生理性恢复，减少纤维化。
实施例9：Collagen-PGE2水凝胶移植治疗心肌梗死及Collagen-PGE2水凝胶移植
冠状动脉左前降支永久结扎建立及Collagen-PGE2水凝胶移植：
(1)C57小鼠麻醉：用5％的异氟烷气体预麻醉小鼠，麻醉后用医用胶带固定小鼠的四肢和头部于手术板上，剪开颈部气管，气管插管后接通麻醉呼吸机正压通气，调节异氟烷的含量约为1％-1.5％，呼吸频率为120/分钟；
(2)将小鼠以仰卧位固定在术前台上，使用剃毛器去除胸部毛发，使用脱毛膏彻底去除毛发，用医用酒精和碘伏进行消毒；
(3)行胸廓切开术，于第四肋间处开胸，并轻轻挤出心脏，仔细撕开心包膜暴露小鼠左心室前壁；
(4)左冠状动脉起始端的下方距离左心耳约1mm处，用7-0的缝合线结扎冠状动脉左前降支(以结扎点下方心肌的颜色变浅发白或出现紫黑色且心电图(electrocardioram，ECG)检测显示心肌电ST段抬高为结扎成功的标志)；
(5)结扎成功后于结扎位点左下、右下各1mm处分别注射10μl PBS、Collagen、PGE2/Collagen、Collagen-PGE2，每组10只小鼠，将50只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理；
(6)关胸，缝合肌肉和皮肤，伤口用碘伏再次消毒，妥善饲养。
(7)假手术(Sham)对照组：开胸，穿线不接扎不移植任何溶液或胶原，后关胸缝合肌肉。将50只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理。
此外，利用免疫染色、心脏超声等手段评价心肌再生情况。
使用Collagen-PGE2水凝胶局部注射受损心肌组织，结果显示：Collagen-PGE2减轻大型梗塞小鼠左心室功能的进行性恶化和不良重塑，并且在缺血性心肌病中它们改善左心室的功能，促进受损心肌的修复，即增强的微血管形成和减少的间质纤维化。
实施例10：Collagen-PGE2水凝胶移植治疗皮肤损伤及Collagen-PGE2水凝胶移植
手术操作过程：
(1)高温高压消毒手术器械(剪刀、眼科剪、尖镊、微型血管夹、持针器)，使用医用酒精消毒手术台区域；
(2)VEGFR2-luc(+)转基因C57小鼠麻醉：经腹腔注射戊巴比妥钠(1％，80mg/kg)麻醉小鼠，将小鼠以俯卧位固定在手术加热垫上，使用剃毛器去除背部毛发，碘伏消毒手术区皮肤；
(3)用无菌眼科剪在其背部形成一个直径约1cm皮肤全层损伤创面，深及筋膜，无菌纱布止血；
(4)将3mm厚度的环状有机硅胶片用尼龙缝线缝合在伤口上，以防止伤口非病理性收缩；
(5)手术后使小鼠平卧，将其舌头牵出置于一侧避免因舌、咽部肌肉松弛而引发窒息；
(6)将所有手术小鼠置于加热垫上复温，待苏醒后放回饲养笼；
根据实验小鼠接受治疗类型进行随机分组，每组6只：PBS组(经受皮肤损伤+损伤位点涂抹20μl PBS)；单独胶原组(经受皮肤损伤+损伤位点涂抹20μl胶原)；单独 PGE2组(经受皮肤损伤+损伤位点涂抹20μl PGE2溶液，PGE2的浓度为1.5μM)； PGE2/Collagen组(经受皮肤损伤+损伤位点涂抹20μl PGE2混合胶原，PGE2的浓度为 1.5μM)；Collagen-PGE2组(经受皮肤损伤+损伤位点涂抹20μl Collagen-PGE2水凝胶，PGE2的浓度为1.5μM)；
(7)术后大体观测及愈合曲线测定，每天观察并记录各组小鼠的精神状态、进食饮水情况、活动力、大小便情况。将36只动物按照国际标准的实验动物的饲养管理和实验操作《实验动物饲养管理和使用指南》进行管理；
(8)术后每隔2天麻醉后首先行活体成像检测，然后去除伤口敷料、仔细清除创面渗出物、痂皮，观察创面有无感染、创面愈合情况，并进行创面拍照同时以透明薄膜描印创面；
(9)拍照后，创面重新用IV3000无菌不透水伤口敷料贴膜覆盖，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于小鼠背部皮肤。
使用ImageJ软件分析各组术后第3、6、9、l2天残留创面面积，并做统计分析，利用免疫染色评价皮肤组织再生情况。结果显示：使用Collagen-PGE2水凝胶局部注射到皮肤缺损部位，可促进局部皮肤组织的修复，残留创面面积缩少快，并在IVIS Lumina 成像系统中成像中显示加快皮下血管新生，Masson染色显示Collagen-PGE2水凝胶减少组织的纤维化。
实施例11：Collagen-PGE2水凝胶和脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)共同移植治疗急性肠炎
TNBS诱导的结肠炎小鼠模型的建立及随机分组
(1)实验动物：8-10周龄BALB/c雄性小鼠，体重22±3g，饲养于SPF洁净级动物房，室温22±3℃，相对湿度50％-60％，调控昼夜各12小时，给予颗粒饲料喂养，自由进食水；
(2)实验前禁食24小时，自由饮水；
(3)实验时给予腹腔注射戊巴比妥钠(1％，80mg/kg)麻醉小鼠，
(4)选取一根直径为2mm的硅胶管(顶端用打火机烤一下，以免太过尖锐戳伤小鼠肠道)，由肛门缓慢插入约4cm开始灌注TNBS溶液(150mg/kg,TNBS原液：乙醇＝1:1)致炎；
(5)为了防止TNBS自肛门流出，倒提1-2分钟,使TNBS溶液充分进入整个肠道，以确保炎症模型的稳定性；
(6)让动物右侧卧位，自然清醒(可放在加热垫上)；
(7)3天后，实验动物随机分组(每组10只)：Sham组(假手术组，只进行开腹手术，不经受致炎和治疗)；PBS组(经受致炎+肠壁注射30μlPBS)；ADSCs组(经受致炎+肠壁注射溶于30μlPBS的1×106ADSCs)；ADSCs/Collagen组(经受致炎+肠壁注射溶于30μlCollagen的1×106ADSCs的混合物)；ADSCs/Collagen-PGE2组(经受致炎+ 肠壁注射溶于30μl Collagen-PGE2水凝胶的1×106ADSCs的混合物)。
(8)手术前将试验器械进行高压灭菌消毒，实验器械包括：剪刀、镊子、持针器等；
(9)经腹腔注射戊巴比妥钠(1％，80mg/kg)麻醉小鼠，小鼠麻醉后仰卧位平躺在手术加热垫上，用手术用胶带固定四肢，然后使用剃毛器、脱毛膏除去腹部毛发，碘伏消毒手术区域；
(10)于腹正中线右侧0.1cm处切开皮肤，分离皮下结缔组织，离断腹部肌肉，进入腹腔，用镊子温和的剥开结直肠上方的肠管，找到结直肠的炎症部位，可见肠壁红肿；
(11)用镊子轻轻提拉肠管，将肠系膜暴露；
(12)用300μl的胰岛素针吸取30μlPBS、30μl Collagen或Collagen水凝胶的细胞混悬液(30μl+106ADSCs)，经肠系膜与肠壁连接处选取3个部位轻柔注射，没个部位注射10ul，防止肠壁穿孔；
(13)将肠管还纳回腹腔，用6-0丝线缝合腹部肌肉，用4-0细线关闭腹部皮肤切口；
(14)将小鼠右侧卧位至自然清醒，放回鼠笼。
通过小动物活体成像技术，验证了Collagen-PGE2水凝胶可以促进ADSCs移植后在体内的存活，同时改善小鼠的结肠炎的大体表现及病理学特征，即对小鼠的结肠炎的治疗起到了明显的促进作用。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种连接前列腺素E2的水凝胶，其特征在于，水凝胶的分子共价结合了前列腺素E2，既具备水凝胶生物材料的物理和化学性能，也具有前列腺素E2的生物活性。
2.根据权利要求1所述连接前列腺素E2的水凝胶，其特征在于，水凝胶为含有蛋白的生物提取物、海藻酸钠以及透明质酸中的至少一种，所述含有蛋白的生物提取物为胶原蛋白、纤维蛋白或脱细胞基质。
3.如权利要求1所述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述前列腺素E2通过化学反应共价键直接结合到水凝胶的分子上。
4.根据权利要求3所述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述化学反应是缩合反应。
5.如权利要求1所述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述前列腺素E2与聚乙烯亚胺PEI通过化学反应共价键间接连接到水凝胶的分子上。
6.根据权利要求5所述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述PEI为含有18～20个氨基的PEI分子。
7.根据权利要求6所述连接前列腺素E2的水凝胶的制备方法，其特征在于，还包括含有2～40个氨基、羧基的起连接作用的分子。
8.如权利要求1所述连接前列腺素E2的水凝胶在直接用于治疗损伤部位药物或者制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述干细胞包括间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、表皮干细胞或内皮祖细胞。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，直接用于治疗损伤部位是指开放创面的涂抹、器官的包膜内注射、包括器官实质内注射以及腹腔内注射；所述组织损伤包括肾脏损伤、心肌梗死、皮肤缺损、下肢缺血和肝损伤器官损伤类。
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