CN117959494A - 一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料,属于生物材料领域。该水凝胶能够智能刺激响应逐级释放药物,在炎症阶段,释放的姜黄素能够减少细胞凋亡和炎症反应;在增生阶段,持续释放重组III型人源化胶原蛋白促进血管生成;在重塑阶段,缓慢释放RepSox抑制心肌纤维化,从而能够减少室壁重塑并改善心肌梗死后的心脏功能。本发明水凝胶能有效恢复心肌梗死后的心脏收缩功能,显著提高心室壁厚度,抑制心肌梗死造成的心肌组织中的细胞凋亡,降低促炎因子TNF‑α的表达,显著促进Cx43蛋白和α‑Actinin蛋白的表达水平,促进心肌梗死区域生成新生血管,抑制心肌纤维化,在心肌梗死治疗中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,具体涉及一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料。
背景技术
心肌梗死(MI)已经成为全球心血管疾病发病率和死亡率高的主要因素,其主要原因是冠状动脉急性和持续性阻塞。MI的病理变化是一个渐进的过程,可分为三个阶段:炎症阶段(0-4天),增殖阶段(4-14天)和重塑阶段(>14天)。在早期炎症阶段,局部缺血/缺氧导致心肌组织氧化应激,高反应性氧化物质(ROS)环境诱导细胞凋亡和过度炎症反应,导致ECM降解。增殖阶段的特征是内皮细胞增殖和血管生成。此后,心脏成纤维细胞迁移到受损区域并增殖,产生大量ECM成分和胶原沉积。这导致瘢痕在梗死区域内形成,替代心肌组织。
最近的研究表明,直接将生物材料,如可注射水凝胶,注入心肌可以有效预防不良的心脏重塑,并阻止MI后心脏功能的丧失。可注射水凝胶是具有高水含量的三维网络材料,其特性类似于ECM,模拟生物组织的柔软和多孔结构,并可以封装治疗药物并将其传递到MI治疗的靶位点。其中,由于其通过对MI病理微环境的响应(ROS、pH、基质金属蛋白酶等)在适当的位置和时间实现精确和可控药物释放能力,智能刺激响应水凝胶受到极大关注。
因此,基于特定阶段和病理微环境,可以设计刺激响应水凝胶以在适当的治疗过程中释放不同的治疗药物。简而言之,在炎症阶段,水凝胶应具有抗氧化/抗凋亡/抗炎的能力,以防止细胞凋亡和过度炎症反应。随后,在增殖阶段,水凝胶应促进血管生成,在重塑阶段阻止成纤维细胞的增殖并抑制纤维化。目前,已经设计了用于MI不同阶段的水凝胶,例如制备具有抗炎和促血管生成特性的水凝胶。尽管先前的水凝胶具有治疗效果,但仍然仅限于仅针对MI病理微环境的一部分,并且治疗效果可以进一步改善。
Cur是从姜黄中分离出的疏水性多酚,具有抗氧化、抗凋亡和抗炎作用等多种生物活性,对心血管系统具有多重保护作用。
RepSox是一种选择性的转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂,可在MI期间抑制TGF-β信号传导,从而抑制心肌成纤维细胞的增殖和心肌纤维化。
因此,有必要设计一种刺激响应水凝胶,该水凝胶能够在三个MI病理微环境的不同阶段按需控制治疗物质的释放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料。
本发明提供了一种双交联网络结构水凝胶,所述水凝胶由PF127-CHO@RepSoxNPs、rhCol III、GelB-Cur、PVA和H2O制备而成,
所述PF127-CHO@RepSox NPs为负载有RepSox的PF127-CHO纳米粒,PF127-CHO为醛基封端的PF127;
GelB-Cur为负载有姜黄素的GelB,GelB为苯硼酸接枝的明胶,姜黄素的负载率为10-15%;
其中 PF127-CHO@RepSox NPs、GelB-Cur 、rhCol III 、PVA和H2O的质量体积比为:(5-10)mg:(6.25-12.5)mg:(0.5-2)mg:(40-100)mg:(0.1-10)ml。
进一步地,所述PF127-CHO@RepSox NPs、GelB-Cur 、rhCol III 、PVA和水的质量体积比为(5-10)mg:(6.25-12.5)mg:(0.5-2)mg:(40-80)mg:1ml;优选地为10mg:12.5 mg:2mg:50mg:1ml。
进一步地,所述PF127-CHO为4-羟基苯甲醛接枝到PF127得到的;所述PF127-CHO@RepSox NPs由PF127-CHO和RepSox制备而成,PF127-CHO和RepSox质量比为5:(0.1-2);优选PF127-CHO和RepSox质量比为5:0.7。
进一步地,所述PF127-CHO@RepSox NPs按照如下方法制备而成:将RepSox和PF127-CHO溶解在有机溶剂中,旋转蒸发,加入H2O,超声即得,其中RepSox在有机溶剂中的质量分数为0.1%-2%;优选地,所述有机溶剂为三氯甲烷,RepSox在有机溶剂中的质量分数为0.7%。
进一步地,所述GelB-Cur中,姜黄素的负载率为12.2%;和/或所述GelB为接枝有3-氨基苯硼酸的明胶,优选3-氨基苯硼酸与明胶通过酰胺化反应制备而成,其中,3-氨基苯硼酸与明胶的投料质量比为1:(1-4),进一步优选3-氨基苯硼酸与明胶的投料质量比1:2。
进一步地,所述水凝胶按照如下方法制备:
1)制备PF127-CHO@RepSox NPs、rhCol III、PVA的混合水溶液;
2)制备GelB-Cur水溶液;
3)将步骤1)混合水溶液与步骤2)中的GelB-Cur水溶液,混匀,形成水凝胶;
优选地,步骤1)中PVA在混合水溶液中的浓度为2-50wt%,优选地为1-50%,更优选的为10%。
本发明还提供了一种上述的水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
1)制备PF127-CHO@RepSox NPs、rhCol III、PVA的混合水溶液;
2)制备GelB-Cur水溶液;
3)将步骤1)混合水溶液与步骤2)中的GelB-Cur水溶液,混匀,形成水凝胶,优选地,步骤1)中PVA在混合水溶液中的浓度为2-50wt%,优选地为1-50%,更优选的为10%。
本发明还提供了一种上述的水凝胶在制备用于心肌治疗的修复材料中的用途;优选地,所述修复材料为促进心肌组织修复或治疗心肌梗死的修复材料。
进一步地,所述修复材料是增强心室壁的收缩幅度、修复心肌组织损伤、降低细胞凋亡和炎症水平、促进血管生成、抑制心肌组织中的细胞凋亡、提高Cx43蛋白表达水平和α-Actinin蛋白表达水平、降低细胞抗纤维化、抑制促炎因子TNF-α的表达或增加胶原I和胶原III的沉积的修复材料。
本发明还提供了一种治疗心肌梗死的修复材料,其包含上述的水凝胶。
本发明的有益效果是:本发明提供了一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料,该水凝胶能够智能刺激响应逐级释放药物,能够在炎症阶段,释放的Cur能够减少细胞凋亡和炎症反应;在增生阶段,持续释放rhCol III促进血管生成;在重塑阶段,缓慢释放RepSox抑制心肌细胞纤维化,从而能够减少室壁重塑并改善MI后的心脏功能。本发明水凝胶治疗心肌梗死效果显著,不仅能有效恢复心肌梗死患者的心脏收缩功能,还能显著提高心室壁厚度。同时,它能抑制MI造成的心肌组织中的细胞凋亡,并显著促进Cx43蛋白和α-Actinin蛋白的表达水平。此外,它还能降低促炎因子TNF-α的表达,促进MI区域生成新生血管,同时它能增加胶原I和胶原III的沉积,抑制心肌纤维化,本发明为高效治疗MI提供了新的途径,在MI治疗中具有广泛的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1:本发明刺激响应水凝胶示意图。
图2:GelB和Gel的1H NMR结果图。
图3:本发明水凝胶的制备以及表征结果图。(A) PF127-CHO的1H-NMR光谱。(B)NPs的ζ电位和尺寸分布。(C) NPs的TEM图像。(D) PVA–GelB-Cur溶液和水凝胶4的照片。(E) 展示了 Hydrogel 4可注射性能。(F) Hydrogel 4的SEM图像。(G) 随着角频率变化的水凝胶的G'和G"。(H) 随着剪切应变从0.1%增加到1000%,水凝胶样品的G'和G"的变化;(I) 水凝胶样品的自愈合行为。(J-L) Hydrogel 4的药物释放(n = 3)。
图4:本发明水凝胶对心肌细胞H9C2细胞和RAW264.7细胞作用实验结果图。(A)H9C2细胞在H2O2和Hydrogel 1-4的3d提取物处理后的活/死染色。(B) H9C2细胞的相对存活率。(C) 经处理后的细胞凋亡的FCM图像,以及(D)定量数据。(E) 通过WB评估的BAX和Bcl-2的相对表达,以及(F)定量数据。通过ELISA评估的RAW264.7细胞的促炎因子TNF-α(G)和抗炎因子IL-4(H)。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;均值 ± 标准偏差[SD])。
图5:本发明水凝胶对HUVECs细胞作用实验结果图。 (A) HUVECs在不同水凝胶处理后的活/死染色。(C) HUVECs的相对活性。(B) 体外管生成实验的图像,以及(D)相关的定量数据。(E) 通过ELISA评估的Ang-1的相对表达,以及(F)VEGF的相对表达。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,# 表示没有显著差异;均值 ± 标准偏差[SD])。
图6:本发明水凝胶对心肌成纤维细胞作用实验结果图。 (A) 治疗对心肌成纤维细胞作用的水凝胶样品后的活/死染色。(B) 不同水凝胶处理后心肌成纤维细胞的相对细胞活性。(C) 通过ELISA评估的TGF-β的相对表达。(D) 通过WB评估的TGF-β和Smad 3的相对表达,并展示的定量数据(E)。(F) 细胞周期的FCM图像,以及(G)相关的定量数据。(*P<0.05,**P<0.01;均值 ± 标准偏差[SD])。
图7:本发明水凝胶对心梗大鼠治疗后的心脏超声、组织切片染色作用实验结果图。 (A) 治疗后14天和28天的M模式ECG。(B) 心功能的定量数据。(C) 治疗后28天的梗死心脏的H&E和Masson染色。(D) 梗死壁厚度的定量数据。治疗后28天的Cx43的IF染色图像(E)及相关的定量数据(F)。治疗后28天的α-actinin的IF染色图像(G)及相关的定量数据(H)(n=8;**P<0.01,***P<0.001;均值 ± 标准偏差[SD])。
图8:本发明水凝胶对心梗大鼠治疗后的心梗区域凋亡水平、炎症水平、新生血管水平以及胶原表达水平的实验结果图。凋亡细胞的TUNEL染色图像(A)和定量数据(E)。TNF-α的IF染色图像(B)和定量数据(F)。新血管的IF染色图像(C)和定量数据(G)。I/III型胶原的IF染色图像(D)和定量数据(H)(n=8;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;均值 ± 标准偏差)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
明胶(Gel)、3-氨基苯硼酸(3-APBA)、姜黄素(Cur)、聚乙烯醇(PVA)和Pluronic F-127(PF127)均从Sigma-Aldrich(美国圣路易斯)获得。所有使用的化学品和试剂均为分析纯。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)由Dojindo Technology Co., Ltd.(中国北京)获得。
MES缓冲液:购买自福州飞净生物科技有限公司,商品货号 PH1769。
PF127:CAS号为9003-11-6;
RepSox:CAS号为46859-33-2;
姜黄素(Cur):CAS号为458-37-7;
明胶(Gel):购买自Sigma-Aldrich,CAS号为9000-70-8;
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐:EDC·HCl,CAS号为25952-53-8;
NHS:CAS号为6066-82-6;
rhCol III:重组III型人源化胶原蛋白,山西锦波生物医药股份有限公司提供。
所有的动物实验程序均在四川大学实验动物伦理委员会的机构审查后获得批准。SD大鼠(体重140克)购买自成都多赛实验动物有限公司,并在标准条件下饲养。
实施例1、制备本发明双交联网络结构水凝胶
一、实验方法
(一)制备本发明双交联网络结构水凝胶
1、合成PF127-CHO@RepSox NPs及验证
1)合成醛基封端的PF127(PF127-CHO)
本发明通过以下方法制备PF127-CHO。
将PF127(Mn=12600Da)(12.6g)放入烧瓶中,在80℃下真空干燥12h,然后将干燥的二氯甲烷(120mL)加入烧瓶中。随后,将整个反应放入冰水浴中,并在混合物中加入干燥的三乙胺(0.875mL)。在N2的保护下,将溶解在干燥二氯甲烷(20mL)中的甲烷磺酰氯(0.32mL)加入溶液中30分钟。在室温下,连续搅拌反应24小时。之后,在烧瓶中加入150mLH2O,并用100mL二氯甲烷萃取3次。加入1M HCl溶液(2次,每次100ml)和饱和盐水(2次、每次100ml)以洗涤有机相。后将NaSO4添加到有机层中以去除水。有机溶液浓缩后,用冷乙醚沉淀得到PF-SO3。
将所有PF-SO3、0.74g 4-羟基苯甲醛和1.5g K2CO3加入DMSO(100mL)中。在N2保护下,将混合物在80℃下搅拌2天。接下来,向烧瓶中加入150mL H2O,并用100mL二氯甲烷萃取3次。然后加入饱和盐水(2次,每次100mL)以洗涤有机层。将溶液用无水Na2SO4干燥,并浓缩至50mL。最后,用冷乙醚沉淀浓缩的混合物。将纯化过程重复3次得到PF127-CHO。
2)合成PF127-CHO@RepSox NPs及验证
(1)合成PF127-CHO@RepSox NPs
PF127-CHO@RepSox NPs采用一步固相分散法合成,具体步骤如下:
RepSox和PF127-CHO在5ml三氯甲烷中溶解并搅拌,RepSox质量分数为0.7% ,PF127-CHO质量分数为5%,然后在65℃的旋转蒸发10min,直至形成一层薄膜,后加入10mlH2O,并超声处理10分钟(功率为100W,频率为40KHZ),然后冷冻干燥获得PF127-CHO@RepSoxNPs。
(2)PF127-CHO@RepSox NPs成功合成验证
使用动态光散射(DLS;Malvern Zetasizer;Malvern Panalytical,英国马尔文)和透射电子显微镜(TEM,日本日立H-600)来确认PF127-CHO@RepSox NPs的粒径分布和ζ电位。
2、合成含有Cur的苯硼酸-明胶(GelB-Cur)
1)合成GelB
①制备GelB
通过3-APBA的氨基与明胶的羧基之间的酰胺反应制备GelB。
具体的:将明胶(10.0g)溶解在100mM MES缓冲液(pH 5.4 500mL)中。同时,将EDC·HCl(4.0g)、NHS(1.5g)和3-APBA(5.0g)完全溶解在MES缓冲液中2小时。然后,将上述溶液完全混合并连续搅拌2天,后透析和冷冻干燥获得GelB。
②GelB合成验证
GelB和Gel的1H NMR结果如图2所示,可以看出GelB相比于Gel,在7.5-8左右出现了新锋,为苯硼酸的质子峰,此结果证明GelB的成功制备。
2)合成含有Cur的GelB(GelB-Cur)
①制备GelB-Cur
终浓度为25/3 mg/mL GelB的水溶液与终浓度为0.5 mg/mL Cur的二甲基亚砜(DMSO)混合(DMSO与水的体积比为1:5),在室温下暗处600转每分钟搅拌12小时,然后以1×104rpm的速度离心10分钟以去除未加载的Cur,离心后,将GelB-Cur溶液经过透析24h,然后冻干得到最终的GelB-Cur。
②GelB-Cur成功合成验证结果
通过紫外(UV)分光光度计(UV-1900;日本岛津,京都)在425 nm处测定Cur加载到GelB-Cur中的浓度。使用UV分光光度计在425 nm处测定Cur负载的百分比为12.2%。
3、合成本发明双交联网络结构水凝胶GelB-Cur/PVA/PF127-CHO@RepSox NPs/rhCol III水凝胶
1)制备本发明双交联网络结构水凝胶(水凝胶4/ Hydrogel4)
将10mg PF127-CHO@RepSox NPs和2 mg rhCol III,溶解在0.5ml的含有10wt%PVA(50mg)的水溶液中,得到混合液,将0.5ml含有12.5mg的GelB-Cur水溶液与混合液混合,制备得到本发明双交联网络结构水凝胶,命名为GelB-Cur/PVA/PF127-CHO@RepSox NPs/rhCol III水凝胶(Hydrogel 4)。
水凝胶中PF127-CHO@RepSox NPs浓度为10 mg/mL,rhCol III浓度为2mg/mL,GelB-Cur浓度为12.5 mg/mL。
2)本发明双交联网络结构水凝胶的表征
使用扫描电子显微镜(SEM,日本日立S4800)观察够多阶段释放药物水凝胶提取物的微观孔径和结构。
通过流变-流体光谱仪(MCR302;奥地利安东帕尔,格拉茨)在振荡模式下测定本发明双交联网络结构水凝胶提取物的流变性质。
(二)本发明能水凝胶的药物释放行为
为了研究Cur、rhCol III和RepSox的释放行为,将多阶段释放药物水凝胶(1 g)装入透析袋中,然后在37℃的避光磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4或含有0.2 mM H2O2的pH=5.0)中浸泡。通过酶标仪(Synergy H1,BioTek Instruments Inc.)检测了rhCol III有关浓度。 使用UV光谱仪在425和328 nm处检测Cur和RepSox的浓度。
二、实验结果
(一)PF127-CHO的1H核磁共振结果
通过1H NMR光谱观察到的苯环质子峰位置在8.1 ppm(图3A)证实了PF127-CHO的成功合成。
(二)PF127-CHO@RepSox NPs成功合成验证结果
RepSox是一种选择性TGF-β抑制剂,可以抑制心脏成纤维细胞的增殖和抗纤维化。PF127是一种用于疏水药物的传递载体,具有独特的疏水核心-亲水外壳结构,赋予了两性物性。
PF127-CHO@RepSox NPs通过一步固体分散法合成,使用动态光散射法(DLS)研究了PF127-CHO NPs(5%的PF127-CHO在三氯甲烷中溶解并搅拌,然后在65℃的旋转蒸发器中浓缩,向共蒸发中加入10ml H2O,并超声处理10分钟,然后冷冻干燥以获得PF127-CHO NPs和PF127-CHO@RepSoxNPs的粒径和ζ电位。如图3C所示,空白的PF127-CHO NPs以及PF127-CHO@RepSox NPs都分散均匀且呈球形,表明RepSox的加载不影响NPs的结构。 如图3B所示,PF127-CHO@RepSoxNPs(184.9 nm)的平均粒径大于PF127-CHO NPs(161.7 nm)。这些NPs的聚分散指数(PDI)分别为0.22和0.25,表明颗粒尺寸均匀。通过透射电镜(TEM)图像中观察了PF127-CHO NPs的大小和形貌。如图3C所示,所有PF127-CHO NPs都分散均匀且呈球形,表明RepSox的加载不影响NPs的结构。
(三)本发明双交联网络结构水凝胶的表征
本发明Hydrogel 4的双重交联网络结构如图1所示,包括GelB-Cur、PF127-CHO@RepSox NPs和PVA之间形成的硼酯和Schiff碱键。本发明双交联网络结构水凝胶具有双网络结构,第一个网络结构是由GelB-Cur上的游离BA和PVA上的二醇之间的硼酯键形成的,而第二个网络结构涉及Gel上的氨基团和PF127-CHO@RepSox上的醛基之间的Schiff键。
实验结果表明,本发明双交联网络结构水凝胶,Hydrogel 4构建成功。
对比例1 制备GelB-Cur/PVA水凝胶(水凝胶1/ Hydrogel 1)
将含有12.5mgGelB-Cur水溶液和含有10wt%的PVA水溶液,按体积比1:1混合得到水凝胶1。其中水凝胶中GelB-Cur浓度为12.5 mg/mL。
对比例2 制备GelB-Cur/PVA/PF127-CHO@RepSox NPs水凝胶(水凝胶2/Hydrogel2)
将PF127-CHO@RepSox NPs溶解在PVA溶液中,将含有12.5mg的GelB-Cur水溶液和含有10wt%的PVA水溶液,按体积比1:1混合得到水凝胶。水凝胶中PF127-CHO@RepSox NPs浓度为10 mg/mL,GelB-Cur浓度为12.5mg/mL。
对比例3制备GelB-Cur/PVA/rhCol III水凝胶(水凝胶3/ Hydrogel3)
将P rhCol III溶解在PVA溶液中,将含有12.5mg的GelB-Cur水溶液和含有10wt%的PVA水溶液,按体积比1:1混合得到水凝胶。水凝胶中rhCol III浓度为2 mg/mL,GelB-Cur浓度为12.5mg/mL。
以下通过实验例证明本发明实施例1制备的Hydrogel 4的有益效果。
实验例1、本发明水凝胶表征
PVA溶液和GelB-Cur 溶液和Hydrogel1如图3D所示。
本发明Hydrogel1-4均具有良好的注射性能,并且可以轻松通过的27G针头挤出,图3E为Hydrogel 4注射性能测试图。
使用扫描电子显微镜观察了Hydrogel1-4冻干水凝胶样品,并发现所有样品都具有均匀的多孔微结构,孔径为200 μm(图3F)。
使用流变仪对Hydrogel 1和Hydrogel 4的流变性质进行了表征。所有样品都具有典型的水凝胶特性(储存模量(G')>损耗模量(G");(图3G)。 Hydrogel 4的G'约为1775Pa,略高于Hydrogel 1的G'(1564 Pa),表明Hydrogel 4相对Hydrogel1的流变性质得到了增强。应变扫描的结果(图3H)表明,两种水凝胶样品的G'和G"在应变为50%时相交,表明了溶胶-凝胶转变。
通过在100%和1%的不同剪切应变下定量测定Hydrogel 1和Hydrogel 4的G'和G"来评估两种水凝胶样品的自愈性能。如图3I所示,在100%的应变下,样品的G'和G"迅速下降,且G'<G",表明其剪切变稀性能。在1%的应变下,Hydrogel1-4的G'和G"在三次应变后几乎恢复到初始值,表明Hydrogel1-4均具有很好的自愈能力。
实验例2、本发明Hydrogel 4中Cur、rhCol III和RepSox的释放行为
使用200 μM H2O2的pH 5.5环境模拟心肌梗死炎症阶段,增殖阶段, pH7.4模拟正常环境。取1 g Hydrogel 4装入透析袋中,在37℃避光的PBS缓冲溶液(pH=7.4或含有0.2mM H2O2的pH=5.0)中浸泡。通过酶标仪检测了rhCol III的浓度。使用UV光谱仪在425和328nm处检测Cur和RepSox的浓度。
Cur在不同环境下的释放量如图3J所示,可以看出,在200 μM H2O2的pH 5.5下,Cur在36小时时的释放率达到了85.6%,显著高于pH 7.4时Cur在36小时的释放率,证明Cur能够在MI的炎症阶段迅速释放并发挥治疗效果。
随着水凝胶的双网络结构破坏,水凝胶内封装的rhCol III持续释放,rhCol III释放结果如图3K所示,可以看出,在200 μM H2O2的pH 5.5下的释放速度显著高于pH 7.4时,如图3K所示,rhCol III在pH 5.5中,200 μM H2O2下,190h后可持续释放约85.5%,表明rhCol III能够在MI的增殖阶段持续释放,促进心肌组织修复和血管再生。
而RepSox随着PF127-CHO@RepSox NPs的降解而缓慢释放。如图3L所示,在pH5.5的200 μM H2O2下,300h后RepSox可以缓慢释放到约89.4%,显著高于pH 7.4时,表明RepSox可能在MI的重塑阶段缓慢释放,起到抗纤维化的作用。
实验结果表明,本发明水凝胶4能够逐级释放药物,可以在MI的三个阶段有针对性地控制Cur、rhCol III和RepSox的释放,实现不同病理阶段的抗凋亡、抗炎症、促进血管生成,最终抑制心肌纤维化的功能。
实验例3、细胞实验
一、实验方法
(一)实验步骤
将1g的水凝胶分别浸泡在37℃ 5mL的细胞培养基中,3天后通过离心和过滤获取提取物以去除水凝胶碎片,得到的细胞浸提液为3d提取物,同样的操作,延长浸泡时间到5天和7天,分别得到5d提取物和7d提取物。以上分别得到Hydrogel1-4的3d、5d和7d提取物。
将大鼠心肌细胞(H9C2)、RAW 264.7(大鼠单核巨噬细胞白血病细胞)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和心肌成纤维细胞以5×103cells/well的密度种植在96孔板中, 5% CO2,37℃的湿润培养箱中进行培养。为了使水凝胶释放速率与不同药物相匹配,选用不同天数的水凝胶提取物作用不同细胞,具体操作如下:
(1)H9C2细胞和RAW 264.7细胞实验
①H9C2细胞实验
将H9C2细胞和RAW 264.7细胞实验分为6组,分别为对照组(control)、H2O2组、Hydrogel1-4组;对照组在完全培养基中进行培养(未经H2O2处理),H2O2组在完全培养基中培养12小时后,后加入H2O2(H2O2终浓度为200 μM)。不同水凝胶组H9C2细胞和不同水凝胶组RAW 264.7细胞在完全培养基中培养12小时后,加入200 μM H2O2处理细胞4小时后,使用100微升3d提取物替换原培养基,继续培养。
②RAW264.7细胞实验
使用由脂多糖(LPS)激活的RAW264.7细胞来模拟MI中的炎症,用含脂多糖 LPS 10μg/mL 的细胞培养基孵育RAW264.7细胞2 h 。加入 2 mL不通水凝胶的3d提取液,将细胞放在细胞培养箱中,3 天后通过ELISA检验不同组RAW264.7细胞实验的TNF-α和IL-4的表达。
(2)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞实验
①人脐静脉内皮细胞血管细胞增殖实验
将细胞以5×103cells/well的密度种植在96孔板中,在含有5% CO2的湿润培养箱中以37℃培养。培养12小时后,用不同的水凝胶5d提取物100μl替换原培养基。
②人脐静脉内皮细胞血管生成实验
在96孔板上涂抹50 μL ABW基质胶(ABW Matrigengel)并在培养箱中培养40分钟后,在相同的板上播种2×104HUVECs,并用100 μL不同水凝胶的5d提取物培养6小时。加入草酸盐染色H源标记HUVECs并通过荧光显微镜(德国Leica DMI4000B)获取图像。
(3)心肌成纤维细胞的实验
心肌成纤维细胞在完全培养基中培养12小时后,分别使用不同水凝胶的7d提取物替换原培养基,继续培养。
收集各组细胞,然后在室温下用1 ml DNA染色溶液和10 μl通透液溶液处理30分钟,使用流式细胞术进行荧光激发,检测各组水凝胶7d提取物对心肌成纤维细胞的影响。
二、实验结果
(一)H9C2细胞和RAW 264.7细胞实验
在MI的早期阶段,心肌组织的局部缺血/缺氧引发氧化应激,导致高ROS环境诱导细胞凋亡和过度炎症反应,从而导致ECM降解。细胞实验中,使用200 μM H2O2时pH 5.5的环境模拟了高ROS微环境,未经H2O2处理的pH 7.4的细胞作为对照组。
1、H9C2细胞实验
通过FDA/PI(荧光二乙脂/碘丙啶, 细胞活死染色实验)对不同组H9C2细胞在24h和72h的细胞染色,结果如图4A所示。如图4A所示,H2O2组中死亡细胞(红色)的数量显著高于对照组,表明氧化应激对H9C2造成了严重的损害。Hydrogel 1-4组有效降低了细胞死亡。
通过CCK-8实验得到不同组H9C2细胞在24h和72h的相对存活率,结果如图4B所示。图4B可以看出,H2O2组H9C2细胞存活率相对对照组显著降低,表明成功模拟心肌梗死的高ROS微环境抑制H9C2细胞, Hydrogel 1-4均可提升心肌梗死高ROS微环境下H9C2细胞细胞存活率,且与Hydrogel 1和Hydrogel 2组相比,负载有rhCol III的水凝胶(Hydrogel 3和Hydrogel4)显著提高了炎症阶段的H9C2细胞的存活率,并且Hydrogel 4提升效果最好。
在72h时,H2O2组和Hydrogel 4组的相对存活率分别为78.6%和147.5%,实验结果表明,Hydrogel 4的3d提取物可以显著提高H9C2在高ROS微环境中的存活率,Hydrogel 4可以用于治疗心肌梗死。
通过Annexin V-PI染色,研究H9C2在这种微环境中的凋亡行为和水凝胶样品的治疗效果。
实验如图4C、图4D所示,H2O2组中的凋亡率为63.7%,远高于对照组的8.9%,表明MI的高ROS微环境会促进细胞凋亡。Hydrogel 1-4组中细胞的凋亡率分别为27.5%、28.3%、20.2%和18.9%,远低于H2O2组,实验结果表明,Hydrogel 4的3d提取物可以抑制在高ROS微环境造成H9C2的死亡,Hydrogel 4可以用于治疗心肌梗死。
使用Western blot检测H9C2中的促凋亡蛋白(BAX)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达。实验结果如图4E和图4F所示,WB显示Hydrogel 1组和Hydrogel 4组中BAX的表达明显低于H2O2组,证明本发明水凝胶能够显著降低促凋亡蛋白的表达。同时,Hydrogel 1组和Hydrogel 4组中Bcl-2的表达水平高于对照组和H2O2组,证明水凝胶可以通过促进Bcl-2的表达来抑制凋亡。
实验结果表明,Hydrogel 4可以有效促进H9C2细胞在高ROS微环境存活,降低因高ROS微环境引起的H9C2细胞凋亡,促进抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达以及抑制促凋亡蛋白(BAX)的表达,Hydrogel4可以保护细胞免受氧化应激损伤并减少凋亡,Hydrogel4可以用于治疗治疗心肌梗死。
2、RAW264.7细胞实验
RAW264.7细胞实验的TNF-α和IL-4的表达结果如图4G和图4H所示,LPS组与对照组相比,促炎因子TNF-α显著增多,代表成功构建炎症状态,与LPS组相比,Hydrogel 1-4组中促炎因子TNF-α的分泌明显减少,而抗炎因子IL-4的分泌增加。
实验结果表明,本发明Hydrogel 4有效降低了氧化应激造成的细胞死亡,并且有效抑制炎症反应。
(二)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞实验结果
内皮细胞增殖和血管生成是MI后增殖的关键因素。
(1)人脐静脉内皮细胞血管细胞增殖实验
通过FDA/PI染色测定人脐静脉内皮细胞的相对活力。实验结果如图5A所示,可以看出,Hydrogel 3和Hydrogel 4组,活跃的HUVECs(绿色)比Hydrogel1组和对照组更多,证明本发明Hydrogel4能够有效促进HUVECs的增殖。
使用CCK-8在24h和72h测定了不同组HUVECs细胞的相对活性,Hydrogel 3组和Hydrogel 4组在24h时72h时相对细胞活性分别为 130.3%和136.0%,且Hydrogel 3组和Hydrogel4组孵育24h时,HUVECs细胞活力相差不大,但是孵育72h时,Hydrogel 4组HUVECs细胞活力显著高于Hydrogel 3组,均显著高于水凝胶1组(109.8%)和对照组(100%)(图5C)。
(2)人脐静脉内皮细胞血管生成实验结果
使用管形成实验来评估Hydrogel 1-4组的血管生成能力,实验结果如图5B所示。在与ABW基质胶和不同水凝胶共孵育8小时后,观察到血管生成,Hydrogel 3和4组具有最佳的管形成效果。图5D中管形成实验的定量数据显示,与其他组相比,Hydrogel 3和Hydrogel4组显著促进了血管形成。
血管生成相关的蛋白(Ang-1和VEGF)的表达水平ELISA结果如图5E和图5F所示,与其他组相比,Hydrogel 3和Hydrogel 4组显著增加了Ang-1和VEGF的表达,表明水凝胶3和4组能够促进血管生成。
实验结果表明,本发明Hydrogel 4能够有效促进内皮细胞的增殖和促进血管生成相关的蛋白(Ang-1和VEGF)的表达促进血管生成,Hydrogel 4在MI后的心肌组织修复中发挥重要作用,Hydrogel 4可以用于治疗MI。
(三)水凝胶1-4组对纤维化抑制作用
通过FDA/PI染色和CCK-8测定评估了心肌成纤维细胞的相对活力。
FDA/PI染色结果,如图6A所示,Hydrogel 2和Hydrogel 4组,活跃的心肌成纤维细胞(绿色)较水凝胶1组和对照组少,证明本发明水凝胶能够有效抑制心肌成纤维细胞的增殖。
使用CCK-8在24h和72h测定了心肌成纤维细胞的相对活性,实验结果如图6B所示,Hydrogel 2和Hydrogel 4组在72h的心肌成纤维细胞相对活性分别为70.4%和75.5%,均远低于Hydrogel 1组(106.4%)和对照组。
使用ELISA测定了心肌成纤维细胞分泌的TGF-β浓度。如图6C所示,Hydrogel 2和Hydrogel 4组与其他组相比显著降低了TGF-β的表达,表明Hydrogel 2和Hydrogel 4组可以通过降低TGF-β的表达来抑制心肌成纤维细胞的增殖。
通过WB研究TGF-β信号通路的下游蛋白Smad3的表达(图6D-图6E)。结果显示,Hydrogel 2和Hydrogel 4组中TGF-β和Smad3的表达明显低于其他组,证明本发明水凝胶通过抑制TGF-β通路能够减少心肌成纤维细胞的增殖。
为了进一步研究本发明水凝胶对心肌成纤维细胞增殖的抑制效果,使用PI/RNase染色验证了细胞周期。如图6F-图6G所示,Hydrogel 2和Hydrogel 4组S和G2/M期的细胞数目较其他组少,说明RepSox可以减少心肌成纤维细胞的增殖活性并抑制心肌成纤维细胞的增殖。
实验结果表明,本发明水凝胶能够有效抑制心肌成纤维细胞的增殖并具有抗纤维化作用。
实验例4、动物实验
一、实验方法
(一)动物建模
所有动物程序均按《四川大学实验动物护理和使用指南》进行。雄性SD大鼠6-8周龄,体重200±20g用2%的异氟烷麻醉,气管插管并连接呼吸机。对大鼠进行左侧开胸以暴露大鼠心脏。用6-0丝线永久结扎左前降支动脉以诱发MI。左室心肌呈白色心电图上显示典型的ST段抬高,则证实MI诱导成功。(二)动物分组
假手术组大鼠进行开胸手术。MI组大鼠在MI后没有接受任何治疗。
观察到MI成功后,然后,通过注射器向左心室前壁梗死区边缘心肌注射PBS或不同的水凝胶,具体分组如下。
实验大鼠随机分为六组,每组8只:
假手术组(sham组):进行胸腔切开,但不进行造模。
MI组:注射50微升PBS;
水凝胶1组(Hydrogel 1组):注射50微升Hydrogel1。
水凝胶2组(Hydrogel 2组):注射50微升Hydrogel 2。
水凝胶3组(Hydrogel 3组):注射50微升Hydrogel 3。
水凝胶4组(Hydrogel 4组):注射50微升Hydrogel 4。
使用飞利浦CX50超声系统(荷兰飞利浦医疗)在手术后的第14和28天检测心功能。手术后 28天,安乐死大鼠,取心脏组织样本进行心脏形态学和免疫组织化学染色(IHC)。
二、实验结果
(一)超声心动图结果
心肌梗死建模后的14、28天,对各组大鼠进行超声心动图(ECG)评估,实验结果如图7A所示,可以看出,MI组第28天左室壁收缩幅度明显减小第14天,表明心肌梗死的发展和持续存在。在水凝胶治疗后,心室壁的收缩幅度得到显著改善,尤其是Hydrogel 4组。
(二)射血分数(EF)检测结果
分别于第14天和第28天测量射血分数(EF)评估心脏功能,每组8只。如图7B和表1所示,MI组和水凝胶1组的EF值在手术后28天显著下降(EF:MI组45.1%,水凝胶1组为45.1%)。相比之下,水凝胶1-4组相对MI组EF均有所提升,Hydrogel 4组EF值提升最显著(EF:87.6%)。
实验结果表明Hydrogel 4能够有效增强模型鼠的体内的心脏收缩功能,Hydrogel4能够治疗MI。
(三)心肌纤维化程度结果
心肌梗死建模后的28天,每组随机取3只大鼠,使用H&E和Masson染色技术评估各组心室壁厚度和心肌纤维化程度(图7C)。梗死壁厚度的定量数据,如图7D和表2所示,可以看到MI组与假手术组相比,在28天时心室壁厚度显著减小,而水凝胶1-4组心室壁厚度均有所提高,且水凝胶4组提升最为显著。
实验结果表明,注射Hydrogel1-4,尤其是Hydrogel 4能够有效恢复模型大鼠的心脏收缩功能并提高心室壁厚度,加速损伤的心肌组织修复,能够用于治疗MI。
(四)相关蛋白表达水平
心肌梗死建模28天后,收集了不同组大鼠的心脏组织样本,每组3只,并通过免疫荧光(IF)染色在MI区域研究与心肌有关的蛋白质。
评估了在梗死部位的Connexin 43(Cx43)蛋白和α-Actinin蛋白的表达。
如图7E-图7H和表3所示,MI组中Cx43+和α-Actinin+细胞(Cx43+和α-Actinin+细胞指Cx43和α-Actinin阳性表达的细胞)的百分比与假手术组相比显著减少,表明心肌梗死建模后梗死部位的心肌细胞死亡显著增加。
Hydrogel1-4的Cx43+和α-Actinin+细胞显著增加, Hydrogel4组提升最为显著。Cx43蛋白和α-Actinin蛋白表达水平的提高表明了心肌细胞之间缝隙连接的形成和重塑。
实验结果表明,Hydrogel 4可以提高与心肌细胞相关的关键蛋白(Cx43蛋白和α-Actinin蛋白)的表达,并促进MI后心肌组织的修复,可以高效治疗MI。
(五)本发明双交联网络结构水凝胶细胞凋亡和炎症水平
使用TUNEL法研究了MI区域心肌组织中细胞凋亡情况。TUNEL结果显示,在建模后的4天,MI组心脏组织中出现了显著的凋亡水平(28.9%)。然而,注射Hydrogel 1-4分别显著减少了细胞凋亡(图8A和图8E),表明Hydrogel 1-4可以有效减轻MI区域ROS微环境中的细胞凋亡。
在MI后的4天,通过对TNF-α的免疫荧光染色来评估水凝胶治疗后的炎症反应,TNF-α是一种典型的促炎因子。实验结果如图8B和定量数据图8F所示,MI组中TNF-α的表达水平(38.4%)明显高于假手术组(1.69%),证实了MI后的炎症反应。水凝胶1-4组的TNF-α+细胞百分比(分别为18.9%,18.5%,10.9%和9.8%)显著低于MI组。
实验结果表明,Hydrogel 1-4在MI后的ROS微环境中有效减少了心肌组织中的细胞凋亡和降低TNF-α炎症因子的表达,可以高效治疗MI。
(六)本发明双交联网络结构水凝胶促进血管生成
在MI后,血管生成在向心肌组织提供氧气方面发挥着至关重要的作用。通过对成熟新生血管标志物α-smooth-muscle actin(α-SMA)进行免疫荧光染色来评估血管生成。具体的,每组取3张α-SMA的染色照片,通过image pro 软件计算出α-SMA的阳性表达区域面积,再除以整张照片的面积得到新生血管密度。
各组14天时血管密度,实验结果如图8C所示,在使用水凝胶处理的MI区域新生血管数量多于Sham组和MI组,尤其是在14天时水凝胶 3和水凝胶 4组。定量的血管密度数据表4、定量的血管密度数据图8G与染色图8C,可以看出,水凝胶4组在14天时显示出最高的新血管密度,比水凝胶3组高出25.8%。
实验结果表明,Hydrogel 4可以显著促进模型鼠新生血管的生成,增加 MI区域新血管密度,可以高效治疗MI。
(七)本发明Hydrogel4水凝胶促进MI组织修复
心肌纤维化通常伴随着胶原I的过度积累,第28天,随机选取大鼠3只,处死,取心脏进行胶原I和胶原III的免疫荧光染色,来评估MI区域的ECM成分。
如图8D和图8H所示,水凝胶 2组和水凝胶4组中的胶原III/I比值明显高于MI组(分别为53.7%和60.0%),实验结果表明,RepSox载药水凝胶能显著增加胶原I和胶原III的沉积,可以抑制心肌纤维化,促进MI组织修复,可以高效治疗MI。
总的来说,Hydrogel 4能够匹配三个MI阶段,按需控制释放Cur、rhCol III和RepSox,通过抗氧化、抗凋亡、抗炎、促血管生成和抗纤维化机制在体内实现对受损心脏的全过程修复。
本发明提供了一种双交联网络结构水凝胶及其制备方法及其用途及修复材料,该水凝胶能够智能刺激响应逐级释放药物,能够在炎症阶段,释放的Cur能够减少细胞凋亡和炎症反应;在增生阶段,持续释放rhCol III促进血管生成;在重塑阶段,缓慢释放RepSox抑制心肌纤维化,从而能够减少室壁重塑并改善MI后的心脏功能。本发明水凝胶治疗心肌梗死效果显著,不仅能有效恢复心肌梗死后的心脏收缩功能,还能显著提高心室壁厚度。同时,它能抑制MI造成的心肌组织中的细胞凋亡,并显著促进Cx43蛋白和α-Actinin蛋白的表达水平。此外,它还能降低促炎因子TNF-α的表达,促进MI区域生成新生血管,同时它能增加胶原I和胶原III的沉积,抑制心肌纤维化,本发明为高效治疗MI提供了新的途径,在MI治疗中具有广泛的应用前景。
Claims (10)
1.一种双交联网络结构水凝胶,其特征在于,所述水凝胶由PF127-CHO@RepSox NPs、rhCol III、GelB-Cur、PVA和H2O制备而成,
所述PF127-CHO@RepSox NPs为负载有RepSox的PF127-CHO纳米粒,PF127-CHO为醛基封端的PF127;
GelB-Cur为负载有姜黄素的GelB,GelB为苯硼酸接枝的明胶,姜黄素的负载率为10-15%;
其中 PF127-CHO@RepSox NPs、GelB-Cur 、rhCol III 、PVA和H2O的质量体积比为:5-10mg:6.25-12.5mg:0.5-2mg:40-100mg:0.1-10ml。
2.根据权利要求1所述的水凝胶,其特征在于,所述PF127-CHO@RepSox NPs、GelB-Cur、rhCol III 、PVA和水的质量体积比为10mg:12.5 mg:2 mg:50mg:1ml。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶,其特征在于,所述PF127-CHO为4-羟基苯甲醛接枝到PF127得到的;所述PF127-CHO@RepSox NPs由PF127-CHO和RepSox制备而成,PF127-CHO和RepSox质量比为5:0.1-2。
4.根据权利要求3所述的水凝胶,其特征在于,所述PF127-CHO@RepSox NPs按照如下方法制备而成:将RepSox和PF127-CHO溶解在有机溶剂中,旋转蒸发,加入H2O,超声即得,其中RepSox在有机溶剂中的质量分数为0.1%-2%。
5.根据权利要求4所述的水凝胶,其特征在于,所述GelB-Cur中,姜黄素的负载率为12.2%;所述GelB为接枝有3-氨基苯硼酸的明胶, 3-氨基苯硼酸与明胶通过酰胺化反应制备而成,其中,3-氨基苯硼酸与明胶的投料质量比为1:1-4。
6.根据权利要求1所述的水凝胶,其特征在于,所述水凝胶按照如下方法制备:
1)制备PF127-CHO@RepSox NPs、rhCol III、PVA的混合水溶液;
2)制备GelB-Cur水溶液;
3)将步骤1)混合水溶液与步骤2)中的GelB-Cur水溶液,混匀,形成水凝胶。
7.一种权利要求1-6任一项所述的水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备PF127-CHO@RepSox NPs、rhCol III、PVA的混合水溶液;
2)制备GelB-Cur水溶液;
3)将步骤1)混合水溶液与步骤2)中的GelB-Cur水溶液,混匀,形成水凝胶。
8.一种权利要求1-6任一项所述的水凝胶在制备用于心肌治疗的修复材料中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述修复材料是增强心室壁的收缩幅度、修复心肌组织损伤、降低细胞凋亡和炎症水平、促进血管生成、抑制心肌组织中的细胞凋亡、提高Cx43蛋白表达水平和α-Actinin蛋白表达水平、降低细胞抗纤维化、抑制促炎因子TNF-α的表达或增加胶原I和胶原III的沉积的修复材料。
10.一种治疗心肌梗死的修复材料,其特征在于,其包含权利要求1-6任一项所述的水凝胶。
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