TW201819625A - 製備誘導型間質幹細胞及增進間質幹細胞之特質的方法及其應用 - Google Patents

製備誘導型間質幹細胞及增進間質幹細胞之特質的方法及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明一般係關於一種製備誘導型間質幹細胞(induced mesenchymal stem cells, iMSCs)的方法及其應用。誘導型間質幹細胞(iMSCs) 與間質幹細胞(MSCs)相似，可分化成多種譜系，這對於疾病的治療可能是有益的。此外，本發明還提供一種增進間質幹細胞(MSCs)的功能特徵之方法，使得該間質幹細胞(MSCs)更適合於細胞治療或體外應用。

Description

製備誘導型間質幹細胞及增進間質幹細胞之特質的方法及其應用
相關申請：本申請根據美國專利法第119條主張於2016年8月23日提出之美國臨時申請案號62/378,556的權利，其全部內容透過引用之方式併入本文。
本發明一般係關於一種製備誘導型間質幹細胞或增進間質幹細胞特徵的方法及其應用。
間質基質/幹細胞(MSCs)可以自我更新並且是多能分化性的。它們首先從骨髓中分離出來，並能分化成多種譜系，包括骨、脂肪、軟骨、肝細胞、神經元、胰島細胞、纖維母細胞等1,2 。此外，間質幹細胞(MSCs)構成維持造血幹細胞及其他成人幹細胞所必需的利基微環境(niche)3 。間質幹細胞(MSCs)具有多能分化性，表現出免疫調節功能4 ，並分泌多種促進組織癒合的細胞因子5 。因此，間質幹細胞(MSCs)對多種疾病的治療具有很大的前景。最重要的是，與具有致癌能力的胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)或誘導型多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)不同的是，間質幹細胞(MSCs)不具有致癌能力，因此被認為具有更高的生物安全性14 。
ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrials.gov)註冊的許多臨床試驗使用間質幹細胞(MSCs)進行疾病治療。該試驗包括急性肺損傷(acute lung injury, ALI)6 、移植物抗宿主病7 、克羅恩氏病8 、第1型糖尿病9 、糖尿病性創傷、多發性硬化症、神經疾病(脊髓損傷、帕金森氏症、阿茲海默症、肌萎縮性側索硬化症、糖尿病性周圍神經病變、癲癇、精神分裂症、自閉症)10 、心血管疾病(心肌梗塞、缺血性心臟病、慢性心力衰竭、冠狀動脈疾病、擴張型心肌病外周血管疾病、缺血性擴張型心肌病)11 、成骨不全症12 、潰瘍性結腸炎、幹細胞移植、肝硬化、骨折、軟骨損傷、腎移植、腎衰竭、骨關節炎、急性呼吸窘迫症候群、修格蘭氏症候群(Sjögren's syndrome, pSS)、系統性硬化症、杜氏肌營養不良、癌症、退行性椎間盤疾病、關節鏡肩袖修復、貧血、危重肢體缺血視、神經脊髓炎譜系疾病、器官移位的亞臨床排斥、上頜囊腫、動脈粥樣硬化、卵巢早衰、前十字韌帶損傷、關節軟骨缺損、金伯克氏病、敗血症/感染性休克、肛門廔管、骨壞死、假性關節、移植物功能延遲、局部部分腎絲球硬化症、慢性阻塞性肺疾病、骨軟骨炎、類風濕性關節炎、發音困難、骨壞死、藥物性嗜中性白血球缺乏症、腦損傷、燒傷、急性腎損傷、乳房重建、肝衰竭、肝硬化、異物反應、發炎、膝關節積水、皮膚潰瘍、膀胱與陰道瘻管、營養不良型大皰性表皮鬆懈症、骨質疏鬆症、局部女性壓力性尿失禁治療(HULPURO)、視網膜疾病、黃斑部病變、遺傳性視網膜營養不良、視神經疾病、青光眼、髖關節成形術、腦性麻痹、男性不育症、關節固定術、龍博格氏病、關節黏連性脊椎炎、尿毒症、慢性半月板損傷、皮膚光老化、肺氣腫、支氣管肺發育不良、大便失禁、特發性肺纖維化、自體免疫性肝炎、膽汁性肝硬化、脊椎關節炎、大皰性表皮鬆懈症、氣喘、口腔乾燥症、失智症、內側半月板切除術恢復、進行性核上性麻痺、尋常型牛皮癬、CMV感染、肩袖部疾病、血球減少症、骨髓增生異常症候群、佩羅尼氏症、角膜緣角症候群、龍博格氏病、肝再生、難治性系統性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、巴拉刈中毒、肺炎、肺氣腫、衰老脆弱、肺移植、骨囊腫、腦腎上腺腦白質營養不良、勃起功能障礙、椎間盤疾病、脂肪營養障礙、伯格氏病、血友病、威爾森氏病、支氣管擴張症、色素沈著性視網膜炎、小腦性運動失調症、汗腺疾病、系統性紅斑狼瘡、德維克氏症候群、唇裂及腭裂、修格蘭氏症候群，以及賀勒氏症13 。目前，約543個臨床試驗檢試間質幹細胞(MSCs)在細胞療法中的功效(www.clinicaltrials.gov)。
間質幹細胞(MSCs)也在加拿大及紐西蘭被批准用於治療移植物抗宿主病，以及在韓國被批准用於治療退化性關節炎及肛門廔管15 。此外，在糖尿病、多發性硬化症、腎臟移植、克羅恩氏症、系統性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)及潰瘍性結腸炎15 (www.clinicaltrials.gov)的臨床試驗中，間質幹細胞(MSCs)已經顯示出有益的作用。到目前為止，在臨床試驗中間質幹細胞(MSCs)幾乎沒有被報導出有安全性問題16 。
由於其分化為多種細胞類型的能力，間質幹細胞(MSCs)也有很大的潛力用來治療其他疾病。間質幹細胞(MSCs)可分化為成骨細胞(硬骨)、軟骨細胞(軟骨)、脂肪細胞(脂肪)、神經元、肝細胞、β細胞等。間質幹細胞(MSCs)衍生的細胞可用於組織工程及再生醫學的臨床上。例如，間質幹細胞(MSCs)可適用於治療關節炎的軟骨及骨再生、下背疼痛(lower back pain, LBP)、軟骨退化、骨折或骨質疏鬆症。可由間質幹細胞(MSCs)衍生的細胞治療的疾病包括但不限於糖尿病、神經退行性疾病(例如，帕金森氏症、阿茲海默症及肌萎縮性側索硬化症)、肝臟疾病(例如，肝炎、酒精濫用)以及肝臟移植。此外，由於間質幹細胞(MSCs)可以分化為脂肪及軟骨，因此，間質幹細胞(MSCs)也可以用於整形手術，如自體脂肪移植及鼻腔擴大軟骨移植。間質幹細胞(MSCs)還可以支持造血幹細胞及其他成人幹細胞植入或維持3 。
間質幹細胞(MSCs)可以從各種來源獲得，如骨髓、脂肪或牙齒組織，然後培養以擴增。臨床上，較佳的來源是從髂嵴(iliac crest)抽吸骨髓或來自脂肪組織，這需要對患者進行侵入性及造成痛苦的外科手術。胚胎幹細胞(ESCs)或誘導型多能幹細胞(iPSCs)可以分化為間質幹細胞(MSCs)；然而這種方式涉及致癌的風險。此外，據報導，血小板衍生的生長因子-AB (platelet-derived growth factor-AB, PDGF-AB)及5-氮雜胞苷(5-Azacytidine, AZA)在誘導小鼠骨細胞及人類脂肪細胞轉化為類間質幹細胞(MSCs)細胞方面是有效的26 。然而，這些轉化方法需要使用胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)並花費25天來完成轉化，這是很耗費時間的。另外，獲得人類脂肪細胞需要抽脂，其不如皮膚穿刺那麼容易。使用胎牛血清對於個體中的細胞治療是不利的，這是由於胎牛血清中的組成分不明確以及使用動物產品的顧慮，這增加了感染風險及其他問題。故仍然需要開發一種以更有效的方式從體細胞產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的改進方法，具體而言是使用小分子，而不需要動物組成分。
此外，已知來自某些捐贈者(如老化者)的初級分離的間質幹細胞(MSCs) 具有低量的間質幹細胞(MSCs)功能特徵，具體而言是擴增(expansion)、選殖系形成(clonogenicity)及/或分化(differentiation)的活性，因此對於細胞治療而言並非完美的選擇。據報導，一些生長因子可以改善上述間質幹細胞(MSCs)的功能特性。到目前為止，還沒有已發表的論文描述使用非蛋白質小分子來增強間質幹細胞(MSCs)的功能特徵之方法。
在本發明中，出乎意料地發現，透過在包含至少蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β)抑制劑的培養基中培養皮膚細胞，如纖維母細胞，可以成功的產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)。根據本發明，皮膚細胞，如纖維母細胞，可被去分化/重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)，其可分化為多種譜系並有益於疾病治療。
因此，於一方面，本發明提供一種產生誘導型間質幹細胞(iMSC)之方法，包括在允許一定比例之皮膚細胞去分化//重新編程為iMSC的條件下培養該皮膚細胞，如纖維母細胞，其中該條件包含培養基，該培養基包含蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β)抑制劑。
於一些具體實施例中，該培養基進一步包含輔助劑以增強從該皮膚細胞去分化/重新編程為iMSC之功效，該輔助劑係選自由下列所組成之群組： p38抑制劑(例如SB202190或SB203580)、c-jun N端激酶(c-jun N terminal kinase, JNK)抑制劑(例如SP600125)、Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)抑制劑(例如Y-27632)、細胞外調節激酶(extracellular regulated kinase, ERK)抑制劑(例如PD325901)、AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)抑制劑(例如多索模芬(Dorsomorphin))、骨形態發生(bone morphogenesis)蛋白抑制劑(例如多索模芬)、Src酪胺酸激酶抑制劑(例如PP1、達沙替尼(Dasatinib))、未分化淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制劑(例如SB431542)、磷酸肌醇3-激酶抑制劑(phosphoinositide 3-kinase inhibitor, PI3K)抑制劑(例如LY294002)、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活劑(例如佛司可林(Froskoin)、咯利普蘭(Rolipram))、組蛋白去乙醯酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑(例如VPA)、一抗氧化劑(例如NAC、GSH、維生素C等)、腫瘤生長因子β (tumor growth factor beta, TGFβ)抑制劑(例如雷普薩斯(Repsox))、雷帕黴素的標的(target of rapamycin, mTOR)抑制劑(例如雷帕黴素)、G9a甲基轉移酶抑制劑(例如BIOX01294)、DOTIL抑制劑(例如SGC0946)，及其任何之組合。
具體而言，本文使用之PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及輔助劑為小分子。
於一些具體實施例中，用於本發明之培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (1) PKC抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (2) PKC抑制劑、ALK抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (3) PKC抑制劑及Src家族酪胺酸激酶抑制劑之組合； (4) PKC抑制劑及GSK3β抑制劑之組合； (5) PKC抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (6) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及Src酪胺酸激酶抑制劑之組合； (7) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及雷帕黴素的標的(mTOR)抑制劑之組合； (8) PKC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (9) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及G9a甲基轉移酶抑制劑之組合； (10) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及DOT1L抑制劑之組合； (11) PKC抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑及p38抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (13) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (14) PKC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及一AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於一些具體實施例中，該皮膚細胞為纖維母細胞，較佳為獲自人類細胞。
於一些具體實施例中，該皮膚細胞在培養基中培養至少1天或更多天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天)。
於一些具體實施例中，至少0.9%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60% 、65%、70%、75%、80%或更多(例如約80%)的皮膚細胞去分化/重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
於一些具體實施例中，該皮膚細胞為纖維母細胞，包括新生兒纖維母細胞或成人纖維母細胞。
於一些具體實施例中，該培養基為無血清的。
於一些具體實施例中，從該皮膚細胞去分化/重新編程之誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有選自由下列所組成之群組的一種或多種特徵：(i) 該誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以維持及擴增至少3個培養繼代、(ii) 該誘導型間質幹細胞(iMSCs)具多能分化性、(iii) 該誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現間質幹細胞(MSC)標記，以及上述的任何組合。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現間質幹細胞(MSC)標記，該間質幹細胞(MSC)標記係選自由階段特異性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen, SSEA)-4、足糖萼蛋白狀蛋白(podocalyxin-like protein, PODXL)及其組合所組成之群組。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)進一步表現間質幹細胞(MSC)標記，該間質幹細胞(MSC)標記係選自由CD105、CD73、CD44、CD90及其組合所組成之群組。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)對於CD45、CD34、CD11b、CD19呈現陰性。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)為SSEA-4+ 、PODXL+ 、CD105+ 、CD73+ 、CD44+ 、CD90+ 、CD45- 、CD34- 、CD11b- 、CD19- 。
於一些具體實施例中，本發明之方法進一步包括分離表現間質幹細胞(MSC)標記的細胞，以獲得分離的誘導型間質幹細胞(iMSCs)群體。
於另一方面，本發明提供包含如本文所述之誘導型間質幹細胞(iMSCs)的細胞培養物。具體而言，相較於表現功能標記SSEA-4及PODXL的天然骨髓間質幹細胞，在如本文所述之化學誘導後，約35%至約50%的本發明之細胞培養物包含0.9%至80%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，具體而言是50%或更高、55%或更高、60%或更高、65%或更高、70%或更高、75%或更高、80%或更高的間質幹細胞(MSCs)。
於另一方面，本發明提供如本文所述之分離的誘導型間質幹細胞(iMSCs)群體。
還提供了包含透過上述方法產生的誘導型間質幹細胞(iMSCs)之醫藥組合物。
於又一方面，本發明提供一種生產分化的體細胞之方法，包括使本文所述之誘導型間質幹細胞(iMSCs)處於適於分化的條件下，從而產生特定的體細胞。具體而言，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)係透過以如本文所述之蛋白激酶C (PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑及可視需要的一種或多種輔助劑處理而衍生自皮膚細胞。
於一些具體實施例中，從該誘導型間質幹細胞(iMSCs)分化的特定體細胞係選自由下列所組成之群組：纖維母細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞、成肌細胞、神經元、β胰島細胞、肝細胞、心肌細胞，以及神經幹細胞。
於另一方面，本發明提供了一種治療疾病或病症之方法，包括向需要這種治療之個體施用治療有效量的如本文所述之誘導型間質幹細胞(iMSCs)。具體而言，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)係透過以如本文所述之蛋白激酶C (PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑及可視需要的一種或多種之輔助劑處理而衍生自皮膚細胞。還提供了如本文所述之誘導型間質幹細胞(iMSCs)在製備用於治療疾病或病症的藥物中之用途。
於一些具體實施例中，根據本發明之待治療的疾病或病症係選自由下列所組成之群組：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)、移植物抗宿主病、克羅恩氏病、第1型糖尿病、糖尿病性創傷、多發性硬化症、神經疾病(脊髓損傷、帕金森氏症、阿茲海默症、肌萎縮性側索硬化症、糖尿病性周圍神經病變、癲癇、精神分裂症、自閉症)、心血管疾病(心肌梗塞、缺血性心臟病、慢性心力衰竭、冠狀動脈疾病、擴張型心肌病外周血管疾病、缺血性擴張型心肌病)、成骨不全症、潰瘍性結腸炎、幹細胞移植、肝硬化、骨折、軟骨損傷、腎移植、腎衰竭、骨關節炎、急性呼吸窘迫症候群、修格蘭氏症候群(Sjögren's syndrome, pSS)、系統性硬化症、杜氏肌營養不良、癌症、退行性椎間盤疾病、關節鏡肩袖修復、貧血、危重肢體缺血視、神經脊髓炎譜系疾病、器官移位的亞臨床排斥、上頜囊腫、動脈粥樣硬化、卵巢早衰、前十字韌帶損傷、關節軟骨缺損、金伯克氏病、敗血症/感染性休克、肛門廔管、骨壞死、假性關節、移植物功能延遲、局部部分腎絲球硬化症、慢性阻塞性肺疾病、骨軟骨炎、類風濕性關節炎、發音困難、骨壞死、藥物性嗜中性白血球缺乏症、腦損傷、燒傷、急性腎損傷、乳房重建、肝衰竭、肝硬化、異物反應、發炎、膝關節積水、皮膚潰瘍、膀胱與陰道瘻管、營養不良型大皰性表皮鬆懈症、骨質疏鬆症、局部女性壓力性尿失禁治療(HULPURO)、視網膜疾病、黃斑部病變、遺傳性視網膜營養不良、視神經疾病、青光眼、髖關節成形術、腦性麻痹、男性不育症、關節固定術、龍博格氏病、關節黏連性脊椎炎、尿毒症、慢性半月板損傷、皮膚光老化、肺氣腫、支氣管肺發育不良、大便失禁、特發性肺纖維化、自體免疫性肝炎、膽汁性肝硬化、脊椎關節炎、大皰性表皮鬆懈症、氣喘、口腔乾燥症、失智症、內側半月板切除術恢復、進行性核上性麻痺、尋常型牛皮癬、CMV感染、肩袖部疾病、血球減少症、骨髓增生異常症候群、佩羅尼氏症、角膜緣角症候群、龍博格氏病、肝再生、難治性系統性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、巴拉刈中毒、肺炎、肺氣腫、衰老脆弱、肺移植、骨囊腫、腦腎上腺腦白質營養不良、勃起功能障礙、椎間盤疾病、脂肪營養障礙、伯格氏病、血友病、威爾森氏病、支氣管擴張症、色素沈著性視網膜炎、小腦性運動失調症、汗腺疾病、系統性紅斑狼瘡、德維克氏症候群、唇裂及腭裂、修格蘭氏症候群，以及賀勒氏症。
於本發明中，進一步發現如本文所述之化學試劑可用於增進該間質幹細胞(MSC)的功能特徵，具體而言是擴增、選殖系形成及/或分化中的活性。
因此，於另一方面，本發明提供了一種增進間質幹細胞(MSCs)的功能特徵之方法，包括以一種或多種如本文所述之化學試劑處理該間質幹細胞(MSCs)。間質幹細胞(MSCs)的功能特徵包括但不限於擴增、選殖系形成及/或分化。
於下面的描述中闡述了本發明的一個或多個具體實施例之細節。從以下幾個具體實施例的詳細描述以及從所附之申請專利範圍中，本發明的其他特徵或優點將是顯而易見的。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常理解的相同含義。
1. 定義
如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指示物。因此，例如，對「一部件」的引用包括多個這樣的部件以及本領域技術人員已知之其等同物。
「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞通常以包括(動詞)/包括(動名詞)意旨允許存在一個或多個特徵，成分或組成分的意義來使用。術語「包括」或「包含」涵蓋術語「由...組成」或「由......組成」。
如本文所用，「間質基質/幹細胞(MSCs)」可以自我更新且具多能分化性。本文中「多能分化性」乙詞係指具有分化成多於一種細胞類型之能力的幹細胞。多能幹細胞不能在體內產生任何類型的成熟細胞；它們僅限於有限範圍的細胞類型。例如，間質幹細胞可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經元、β胰島細胞、腸細胞。間質幹細胞可以從各種來源獲得，如骨髓(骨髓間質幹細胞)、脂肪或牙齒組織，然後培養以擴增。
如本文所用，「誘導型間質幹細胞(iMSCs)」乙詞係指從其他細胞類型如皮膚細胞產生(或去分化/重新編程)的類間質幹細胞之細胞(即具有間質幹細胞狀特徵的細胞)。誘導型間質幹細胞(iMSCs)具多能分化性，例如能夠分化為特定之細胞，例如成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞。如本文所用，「皮膚細胞」係指皮膚上得到的細胞，例如上皮細胞或纖維母細胞。
如本文所用，「去分化」乙詞係指有更多分化細胞回復到更原始細胞之過程。
如本文所用，「重新編程」乙詞係指將細胞轉化為具有一些不同性質或生物學功能的不同細胞類型之過程。例如，末端分化的細胞可以重新編程為多能幹細胞。若皮膚細胞以化學物質轉化為多能間質幹細胞的情況下，所得之細胞被稱為「化學誘導型間質幹細胞(iMSC)」。
如本文所用，術語「培養物」係指以培養基培養之一群細胞。該細胞可以被繼代。細胞培養物可為從動物組織中分離出來後還沒有繼代之初代培養物，或者可以是多次繼代的(繼代培養一次或多次)。
如本文所用，「激酶抑制劑」係指可下調、降低或抑制激酶的量及/或活性之試劑，其可透過以下而達成，例如與激酶蛋白直接結合、變性或另使激酶失活，或抑制編碼該激酶的基因之表現(例如轉錄成mRNA，轉譯成多胜肽及/或修飾為成熟的蛋白質)，或可阻斷激酶活性的序列中的突變體。通常，激酶抑制劑可為蛋白質、多胜肽、核酸、小分子或其他化學分子部分。鑑定激酶抑制劑的方法為本領域可使用者，如西方墨點分析法。
如本文所用，「酶抑制劑」係指可下調、降低或抑制酶的量及/或活性之試劑，其可透過以下而達成，例如直接與酶蛋白結合、變性或另使酶失活，或抑制編碼該酶的基因之表現(例如轉錄為mRNA、轉譯為多胜肽，及/或修飾為成熟的蛋白質)，或抑制可阻斷酶活性的序列中的突變體。通常，酶抑制劑可為蛋白質、多胜肽、核酸、小分子或其他化學分子部分。鑑定酶抑制劑的分析方法為本領域可使用者，如西方墨點分析法或酶活性試驗。
本文使用之術語「小分子」係指合成的或天然存在的有機或無機分子，通常具有分子量小於10,000克/莫耳，具體而言是小於5,000克/莫耳，具體而言是小於2,000克/莫耳，以及具體而言是小於1,000克/莫耳。於一些具體實施例中，小分子係指非聚合的，例如，基於非蛋白質或核酸之化學分子。
如本文所使用之術語「約」係指正在使用的數字之數值的正或負10%。因此，約1%意味著在0.9%至1.1%的範圍內。
如本文所述之激酶抑制劑包括例如p38抑制劑、c-jun N端激酶(JNK)抑制劑、Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑、細胞外調節激酶(ERK)抑制劑、AMP活化的蛋白激酶(AMPK)抑制劑、Src酪胺酸激酶抑制劑、未分化淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑(PI3K)抑制劑、腫瘤生長因子β (TGFβ)抑制劑(例如RepSox)、雷帕黴素的分子標的(mTOR)抑制劑及其任何組合。這些激酶抑制劑可從本領域商業獲得。如本文所用之其他酶抑制劑包括例如組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、G9甲基轉移酶抑制劑，以及DOT1L抑制劑。
如本文所述之PKC抑制劑的實例包括，但不限於，Go6976、Go66850、Go6983、羅特列林(rottlerin)、雙吲哚馬來醯亞胺II、C-1、鈣磷酸蛋白C (calphostin C)、蜂毒肽、GF109203X、二氫鞘氨醇、白屈菜紅鹼、氯化物、CGP53353、CID 2858522、二氫鞘氨醇、GF 109203X、Go 6976、Go 6983、[Ala107]-MBP (104-118)、Ala113 ]-MBP (104-118)、(±)-棕櫚醯肉鹼氯化物、PKC(19-36) (假底物胜肽；PKC抑制劑)、PKC 412、PKC假基質、Ro 32-0432鹽酸鹽、羅特列林、D-赤-鞘氨醇(合成)、ZIP，及其他。
如本文所述之GSK3β抑制劑的實例包括，但不限於，CHIR 99021、CHIR 99021三鹽酸鹽、BIO、BIO-丙酮肟、3F8、AR-A 014418、TWS 119、TCS 2002、SB 216763、SB 415286、L803，及其他。
如本文所述之p38抑制劑的實例包括，但不限於，SB202190、SB 242235、EO 1428、Org 48762-0、SD 169、SB 203580、SB 202190、SB 239063、SB 220025、RWJ 67657、VX 745、VX 702、SD-282、SCIO 469、PH-797804，及其他。
如本文所述之JNK抑制劑的實例包括，但不限於，SP600125、TCS JNK 5a、TCS JNK 60、AEG 3482、BI 78D3、CEP 1347、IQ 1S、IQ3，及其他。
如本文所述之ROCK抑制劑的實例包括，但不限於，Y-27632、AS 1892802、GSK 269962、GSK 429286、H 1152二鹽酸鹽、HA 1100鹽酸鹽、OXA 06二鹽酸鹽、RKI 1447二鹽酸鹽、SB 772077B二鹽酸鹽等。
如本文所述之ERK抑制劑的實例包括，但不限於，PD98059 (MEK1及MEK2的高選擇性抑制劑)、司咯替尼(也稱為AZD6244)、ARRY-438162、PD198306、PD0325901、AZD8330、PD184352 (也稱為CI-1040)、PD184161、SL327、U0126、GW5074、BAY43-9006、Ro 09-2210、FR180204、PKI-ERK-005、ARRY-704、GSK120212、RDEA119、XL518、CAY10561，及其他。
如本文所述之AMPK抑制劑的實例包括，但不限於，多索模芬(6- [4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑並[1,5,-α]嘧啶)、BML-275，及其他。
如本文所述之BMP抑制劑的實例包括，但不限於，多索模芬(6- [4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑並[1,5,-α]嘧啶)，及其他。
如本文所述之Src酪胺酸激酶抑制劑的實例包括，但不限於、PP1 (4-胺基-5-(4-甲基苯基)-7-(三級丁基)吡唑並[3,4-d]-嘧啶)、PP2、達沙替尼、A 419259三鹽酸鹽、AZM 475271、博舒替尼、除莠黴素A、KB SRC 4、LCB 03-0110二鹽酸鹽、MNS、1-萘基PP1、白皮杉醇、WH-4-023、Src I1，及其他。
ALK抑制劑的實例包括，但不限於，SB431542、A83-01、SB 505124，及其他。
PI3K抑制劑的實例包括，但不限於，LY294002、A66、AS 252424、AS 605240、AZD 6482、BAG 956、CZC 24832、ETP 45658、GSK 1059615、KU 0060648、LY 294002鹽酸鹽、3-甲基腺嘌呤、PF 04691502、PF 05212384、PI 103鹽酸鹽、PI 828、PP 121、槲皮素、TG 100713、TGX 221、渥曼青黴素，及其他。
DOT1L甲基轉移酶抑制劑的實例包括，但不限於，SGC 0946、EPZ 004777，及其他。
GLP及G9a組蛋白賴胺酸甲基轉移酶抑制劑的實例包括，但不限於，BIX 01294、A 366、UNC 0224、UNC 0638、UNC 0642、UNC 0646，及其他。
mTOR抑制劑的實例包括，但不限於，雷帕黴素(西羅莫司)、替西羅莫司、依維莫司、雷帕黴素前藥AP-23573、AP-23481等及其組合。
如本文所用，環狀腺苷單磷酸(cAMP)激活劑係指當藥劑不存在時，與背景生理細胞內含量相比，增加細胞內cAMP含量之藥劑。cAMP活化劑的實例包括，但不限於，毛喉素、咯利普蘭、NKH477、PACAP1-27、PACAP1-38，及其他。
如本文所用，組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑係指下調、降低或抑制組蛋白去乙醯酶的量及/或活性，以從組蛋白上的賴胺酸殘基除去乙醯基之藥劑。HDAC抑制劑的實例包括，但不限於，丙戊酸(VPA、2-丙基戊酸)、亞批西丁(Apicidin)、CI 994、FK 228、LMK 235、M 344、MC 1568、MC 1742、MI 192、NCH 51、NSC 3852、PCI 34051、4-苯基丁酸鈉、派羅西脈(Pyroxamide)、SAHA、SBHA、西派艾德(Scriptaid)、丁酸鈉、TC-H 106、TCS HDAC6 20b、曲古黴素A、曲巴辛(Tubacin)、UF 010，及其他。
如本文所用，抗氧化劑係指能夠減緩或防止其他分子氧化的試劑。抗氧化劑的實例包括，但不限於，維生素E、β-胡蘿蔔素、抗壞血酸(維生素C)及含巰基的化合物(即，包含由硫及氫原子組成之官能基的化合物，稱為如-SH)，如穀胱甘肽及穀胱甘肽前體N-乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine, NAC)。
如本文所用，腫瘤生長因子β (TGFβ)抑制劑係指下調、降低或抑制TGFβ的量及/或活性的試劑，其可透過，例如，與TGFβ的結合或抑制透過與在TGFβ途徑中的因子相互作用而誘導之TGFβ信號傳導來實現。TGFβ抑制劑的實例包括，但不限於、RepSox、A 83-01、D 4476、GW 788388、LY 364947、R 268712、SB 431542、SB 505124、SB 525334、SD 208，及其他。
如本文所用，用於增強來自皮膚細胞去分化/重新編程功效之輔助劑，例如纖維母細胞分化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)，係指當該皮膚細胞以PKC抑制劑及/或GSK3β抑制劑與這種試劑組合一起培養，與當該皮膚細胞以PKC抑制劑及/或GSK3β抑制劑培養但不存在該藥劑時相比，可以提高或改善來自皮膚細胞之去分化/重新編程的功效以分化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)之試劑。
如本文所使用的，術語「多能分化性（muktipotency）」在本文中係指具有分化成多於一種細胞類型的能力的幹細胞。多能幹細胞可以變成至少一種或兩種某種細胞的類型。例如，間質幹細胞可以分化為成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞。
如本文所用，術語「分離的或純化的細胞群」或「分離的或純化的細胞」係指從其他細胞組成分或來自與該細胞相關的其他細胞分離的細胞之製劑。例如，分離的細胞可能已經從其天然環境或細胞群中被移出，或者可能是由已經從一細胞群中移出的一細胞所繁殖而產生的。當細胞被描述為「分離的」或「純化的」時，應當理解為不是絕對分離或純化的，而是相對分離或純化的。例如，包含分離的細胞的製劑可以包含該細胞的量為該製劑中的總細胞的0.5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、90%或更多，或100%。於一些特定的具體實施例中，包含分離的細胞的製劑可以包含該細胞的量為該製劑中的總細胞的50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、90%或更多，或100%。
如本文所用，本文所用之術語「個體」包括人類及非人類的動物，例如伴侶動物(如狗，貓及其類似物)、農場動物(如牛、綿羊、豬、馬及其類似物)或實驗動物(如大鼠、小鼠、豚鼠及其類似物)。
如本文所用，當涉及醫療性的治療時，術語「治療（treating）」係指將包含一種或多種活性劑之組合物施用或投用於患有疾病、該疾病之症狀或病症，或該疾病之進展的個體，以治癒、治療、緩解、減緩、改變、補救、減輕、改善或影響該疾病、該疾病之病症或狀況、由該疾病誘發的殘疾，或該疾病之進展為目的。另一方面，術語「處理（treating）」可以指與醫療性治療疾病無關的施用或過程，例如施用一種或多種成分或試劑與細胞接觸以改變其命運，例如，恢復到其他細胞之類型。
如本文所用，本文使用之術語「醫療有效量」係指賦予治療個體醫療效果的活性成分之量。該醫療有效量可以根據各種原因而改變，例如給藥途徑及頻率，接受該藥物之個體的體重及物種，以及給藥之目的。如本文所用，當提及與醫療性治療疾病無關的施用或過程時，術語「有效量」可以指為達到預期目的而施用的成分或試劑之量，例如，待施用於接觸細胞的成分或試劑之量，例如用於去分化之纖維母細胞。
2. 使用化學試劑以產生誘導型間質幹細胞 (iMSCs)
本發明基於意想不到的發現，即皮膚細胞，例如纖維母細胞，透過與PKC抑制劑及/或GSK3β抑制劑一起培養，可以被去分化/重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)，而無需基因調節。
根據本發明，皮膚細胞可在含有一有效誘導去分化/重新編程的量之PKC抑制劑及/或GSK3β抑制劑的培養基中培養，使該皮膚細胞轉化成誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
適用於培養依據本發明之皮膚細胞的培養基是本領域可獲得的，例如DMEM、MEM或IMEM培養基。培養可在正常條件下進行，如於37°C、1-5% CO2 下。具體而言，該培養基可以為無血清的。
於一些具體實施例中，用於轉化的培養基(轉化培養基)含有剔除DMEM、AlbuMAX I、N2補充物、非必需胺基酸(nonessential amino acids, NEAA)。
於一些具體實施例中，該培養進行至少1天或更多(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天)，由此該皮膚細胞的一比例被轉換成誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
於一些具體實施例中，可以將輔助劑添加至該培養基，以增強從纖維母細胞去分化/重新編程至誘導型間質幹細胞(iMSCs)的功效。本文所用之輔助劑係選自由下列所組成之群組： p38抑制劑、JNK抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑、AMPK抑制劑、Src酪胺酸激酶抑制劑、ALK抑制劑、PI3K抑制劑、cAMP激活劑、HDAC抑制劑、抗氧化劑、TGFβ抑制劑、mTOR抑制劑、G9a甲基轉移酶抑制劑、DOTIL抑制劑，及其任何之組合。如本文使用的輔助劑以有效提高從皮膚細胞去分化/重新編程至誘導型間質幹細胞(iMSCs)的功效之量添加至該培養基中。
於一些具體實施例中，培養該皮膚細胞，例如纖維母細胞，並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑及/或GSK3β抑制劑及/或一種或多種輔助劑之組合。這種組合之實例如下： (1) PKC抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (2) PKC抑制劑、ALK抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (3) PKC抑制劑及Src家族酪胺酸激酶抑制劑之組合； (4) PKC抑制劑及GSK3β抑制劑之組合； (5) PKC抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (6) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及Src酪胺酸激酶抑制劑之組合； (7) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及雷帕黴素的標的(mTOR)抑制劑之組合； (8) PKC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (9) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及G9a甲基轉移酶抑制劑之組合； (10) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及DOT1L抑制劑之組合； (11) PKC抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑及p38抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (13) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (14) PKC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於一些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與GSK3β抑制劑之組合，選擇性地具有一種或多種輔助劑。這種組合之實例如下： (4) PKC抑制劑及GSK3β抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
於某些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與HDAC抑制劑之組合，選擇性地具有GSK3β抑制劑及/或一種或多種其他輔助劑。這種組合之實例如下： (5) PKC抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (6) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及Src酪胺酸激酶抑制劑之組合； (7) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及雷帕黴素的標的(mTOR)抑制劑之組合； (9) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及G9a甲基轉移酶抑制劑之組合； (10) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及DOT1L抑制劑之組合； (11) PKC抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑及p38抑制劑之組合； (13) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於某些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合，選擇性地具有一種或多種其他輔助劑。這種組合之實例如下： (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於某些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與AMPK/BMP抑制劑之組合，選擇性地具有GSK3β抑制劑及/或一種或多種其他輔助劑。這種組合之實例如下： (14) PKC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於某些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與ROCK抑制劑之組合，選擇性具有GSK3β抑制劑及/或一種或多種其他輔助劑。這種組合之實例如下： (1) PKC抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (2) PKC抑制劑、ALK抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
於某些具體實施例中，培養該皮膚細胞並重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養基包含PKC抑制劑與GSK3β抑制劑與ROCK抑制劑之組合，進一步具有JNK抑制劑、p38抑制劑以及ERK抑制劑，選擇性地具有及/或一種或多種其他輔助劑。這種組合之實例如下：
(12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、一ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
本領域中有許多PKC抑制劑及GSK3β抑制劑是可使用的。表A說明了本文使用之激酶抑制劑的一些實例。
表B說明了本文使用之輔助劑的一些實例。
根據本發明，約1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65 %、70%、75%、80%或更多的在該培養物中的皮膚細胞被去分化/重新編程為誘導型間質幹細胞(iMSCs)。於某些具體實施例中，該培養物中大約55%至85%的皮膚細胞被去分化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
3. 用於去分化 / 重新編程之皮膚細胞
皮膚細胞例如纖維母細胞在本文中可被用於產生本發明中的誘導型間質幹細胞(iMSCs)。本文用於去分化/重新編程的纖維母細胞可以從新生兒兒或成人捐贈者獲得。
皮膚活組織檢體可以透過皮膚穿刺或包皮環切從適當的自體或同種異體捐贈者獲得，且皮膚纖維母細胞可以從皮膚活組織檢體中生長。一般而言，大約4mm的皮膚活組織檢體可以產生1500-2000萬個纖維母細胞19 。於一些具體實施例中，商業纖維母細胞是可用的。較佳地，如本文所用之用於轉化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)的纖維母細胞為哺乳動物來源的，最佳為人類來源的。
4. 誘導型間質幹細胞 (iMSCs)
根據本發明，所產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有類間質幹細胞的特徵。具體而言，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有類似間質幹細胞的形態，具有少量細胞過程的小細胞體，即梭形細胞狀。更具體而言，所產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以表現典型的間質幹細胞標記。
於一些具體實施例中，該間質幹細胞標記係選自由階段特異性胚胎抗原(SSEA)-4與類足糖萼蛋白狀蛋白(PODXL)所組成之群組。
於一些具體實施例中，該間質幹細胞標記係選自由CD105、CD73、CD44、CD90及其組合所組成之群組。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)對於CD45、CD34、CD11b及CD19呈現陰性。
於一些具體實施例中，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)為SSEA-4+ 、PODXL+ 、CD105+ 、CD73+ 、CD44+ 、CD90+ 、CD45- 、CD34- 、CD11b- 、CD19- 。
此外，產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)具多能分化性，其可以分化成特定的細胞類型，包括成骨細胞(硬骨細胞譜系)、脂肪細胞(脂肪譜系)及軟骨細胞(軟骨細胞譜系)。此外，所產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)也可以表現免疫調節功能。於某些實例中，如在動物模型中所證實的，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以抑制急性肺損傷(參見以下實例)。而且，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以在培養物中進行擴增並儲存起來供以後取回及使用。於一些具體實施例中，本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以維持並擴增至少3代、4代、5代、6代、7代或8代或更多。
一旦建立了誘導型間質幹細胞(iMSCs)的培養物，在有助於細胞增殖的條件下進行細胞密度控制期間，在有或沒有組織形成的情況下，將細胞群透過繼代於常規間質幹細胞培養基中而在體外有規律地擴增。這樣的培養方法可以包括，但不限於，在具有特定生長因子(例如，IGF、EGF、FGF、VEGF，及/或其他生長因子)的培養基或商業培養基中繼代細胞。可以將培養的細胞轉移到常規間質幹細胞培養物中直至細胞密度達到為止。因此，可以使用適當的繼代技術來減少接觸抑制作用並維持適當的細胞生理學。
此外，可以將該誘導型間質幹細胞(iMSCs)冷凍保存以存儲在含有10-90%胎牛血清(FBS)及10%二甲基亞碸(DMSO)的「冷凍培養基」中，細胞濃度約為，但不限於5x105 -1x107 個細胞/ml。於一些具體實施例中，該細胞可用商業培養基冷凍。將細胞分配到塑膠小管中，然後將其轉移到冷凍室中。一旦含有細胞的小管達到-80°C，可以將其轉移到液態氮中儲存。冷凍保存的細胞可以儲存數年。
於一些具體實施例中培養之後，為了進一步富集誘導型間質幹細胞(iMSCs)，可以使用一種或多種間質幹細胞標記以分選細胞。細胞分選可以透過本領域已知的各種技術來實現。細胞分選技術的實例包括螢光激活細胞分選(FACS)、免疫親合管柱分離，或免疫磁性分離(MACS)或能夠基於物理特性(密度)或結構特性(具體而言是特定的抗原)獲得一種特定細胞類型的富集的任何技術。
5. 誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 之應用
5.1 分化為特定之細胞
由於多能分化性，誘導型間質幹細胞(iMSCs)就如同天然的間質幹細胞一樣，可以被誘導分化為細胞，例如，纖維母細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞骨細胞、成肌細胞、神經元、β胰島細胞、肝細胞、心肌細胞、神經幹細胞，更典型地為纖維母細胞、成骨細胞、骨細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，以及肌細胞。此外，誘導型間質幹細胞(iMSCs)/間質幹細胞可以轉分化為神經系細胞或胰腺β-細胞。
該誘導型間質幹細胞(iMSCs)分化為其他細胞類型可透過改變培養條件或透過用特定的外源生長因子的處理來觸發。誘導細胞分化為所需細胞類型的方法為本領域所公知的。
可用於誘導誘導型間質幹細胞(iMSCs)分化之因子包括生長因子、酶、激素及其他信號分子。例如，β-甘油磷酸鹽(BGP)、抗壞血酸及地塞米鬆(dexamethasone)對於骨生成是至關重要的；胰島素、IBMS、吲哚美辛及地塞米鬆對脂肪生成至關重要；TGF-β及地塞米鬆對軟骨形成至關重要；氫化可的松（hydrocortisone）及地塞米鬆對於肌形成是至關重要的。該誘導型間質幹細胞(iMSCs)也可以與組織定型細胞一起培養，轉為特定之譜系。
5.2 細胞治療
基於我們的研究結果，可以透過在臨床上很容易獲得之可獲得的皮膚活組織檢體，產生自體或同種異體的誘導型間質幹細胞(iMSCs)。這個過程不需要手術或任何其他痛苦的程序。鑑於間質幹細胞修復受損組織及免疫調節功能的能力，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)s可以治療疾病，可包括但不限於，心臟疾病(例如，外周動脈疾病、局部缺血、中風、心肌梗塞)、急性肺損傷(ALI)、移植物抗宿主病、克羅恩氏病、第1型糖尿病、多發性硬化症、神經疾病、成骨不全症、纖維化及遺傳性疾病如赫勒氏症候群。誘導型間質幹細胞(iMSCs)的治療用途包括將誘導型間質幹細胞(iMSCs)、幹細胞群或其子代移植到個體中以治療幾種不同的疾病，例如抗炎症(免疫調節能力)、心血管疾病、神經退化性疾病、組織工程及其類似物。根據本領域已知的任何方法，治療可使用該細胞來構建新的組織(具有或不具有生物材料)。可以將該細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)或子代注射或移植到組織損傷部位，以便它們在體內將產生新的組織。該誘導型間質幹細胞(iMSCs)衍生細胞可用於組織工程及再生醫學的臨床。例如，誘導型間質幹細胞(iMSCs)可用於軟骨及骨再生以治療關節炎、下背疼痛(LBP)、軟骨退化、骨折或骨質疏鬆症。此外，由於該誘導型間質幹細胞(iMSCs)可分化為脂肪及軟骨，因此該誘導型間質幹細胞(iMSCs)也可用於整形手術，如自體脂肪移植及鼻腔擴增之軟骨移植。
於一較佳的具體實施例中，患者可以使自體皮膚細胞產生用於治療的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，且不需要服用免疫抑制藥物。於另一具體實施例中，與用於獲得間質幹細胞的骨髓抽吸相比，找到願意捐獻用於誘導型間質幹細胞(iMSCs)生產的皮膚細胞的捐贈者將更容易。如果人類誘導型間質幹細胞(iMSCs)來自一異質/同種異體來源，則有時會施用伴隨的免疫抑制療法，例如施用免疫抑制劑FK560或環孢菌素。於一些具體實施例中，可以將該誘導型間質幹細胞(iMSCs)或子代封裝在可交換但阻止細胞及細胞接觸的膜中。微膠囊化的移植在本領域為已知的，例如， Dixit等人，Cell Transplantation 1：275-79 (1992年)；及Balladur等人，Surgery ，117：198-94 (1995年)。
另外，間質幹細胞在免疫調節能力以及調節/抑制免疫系統中的B細胞、T細胞及NK細胞的功能方面是眾所周知的。具體而言，本發明中產生的誘導型間質幹細胞(iMSCs)被證實在小鼠模型中具有免疫調節能力。如以下實例所示，本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)有效減少動物中的LPS調節的急性肺損傷。
6. 透過化學處理改善間質幹細胞的功能特徵
本發明還基於出乎意料的發現，即用本文所述之化學試劑處理後的間質幹細胞表現出增強的間質幹細胞功能特徵。
具體而言，如本文所述之改善間質幹細胞功能特徵的化學治療包括在包含蛋白激酶C (PKC)抑制劑(例如GO6983)及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑(例如CHIR99021)的培養基中培養間質幹細胞。
於一些具體實施例中，該培養基可進一步包含如本文所述之輔助劑，包括但不限於p38抑制劑(例如SB202190或SB203580)、c-jun N端激酶(JNK)抑制劑(例如SP600125)、Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(例如Y-27632)、細胞外調節激酶(ERK)抑制劑(例如PD325901)、AMP活化的蛋白激酶(AMPK)抑制劑(例如多索模芬)、Src酪胺酸激酶抑制劑(例如PP1、達沙替尼)、未分化淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑(例如SB431542)、磷酸肌醇3-激酶抑制劑(PI3K)抑制劑(例如LY294002)、環磷酸腺苷(cAMP)激活劑(例如佛司可林、咯利普蘭)、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑(例如VPA)、抗氧化劑(例如NAC、GSH等)、抗氧化劑(例如維生素C)、腫瘤生長因子β (TGFβ)抑制劑(例如雷普薩斯)、雷帕黴素的分子標的(mTOR)抑制劑(例如雷帕黴素)、G9a甲基轉移酶抑制劑(例如BIOX01294)、DOTIL抑制劑(例如SGC0946)，及其任何之組合。
在一具體實施例中，該化學治療僅包括蛋白激酶C (PKC)抑制劑(例如GO6983)。
於一些具體實施例中，該化學治療包括p38抑制劑(例如SB202190)、JNK抑制劑(例如SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(例如Go6983)、ROCK抑制劑(例如Y-27632)、ERK1/2抑制劑(例如PD0325901)以及GSK3β抑制劑(例如CHIR99021)，任選地還包含HDAC抑制劑(VPA)及/或BMPa AMPK/BMP抑制劑(多索模芬)之組合。
具體而言，可以透過如本文所述之化學治療來改善間質幹細胞的功能特徵，如擴增、選殖系形成及/或分化(多能性)中的活性。可以透過本領域已知的方法確定間質幹細胞的功能特徵之增進，例如，基於代表性間質幹細胞標記的表現增加，例如， SSEA4 +及PODXL+，選殖系形成性及分化活性測定的細胞培養觀察。
一般而言，本發明提供了一種產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)及增進間質幹細胞功能特徵之新技術，其特徵如下： (1) 一種容易且簡單的體外方法以從皮膚細胞，如纖維母細胞，產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)； (2) 皮膚細胞的來源是容易獲得的，且不需要進行手術或其他顯著疼痛的過程來獲得皮膚細胞(更容易找到願意為同種異體誘導型間質幹細胞(iMSCs)生產捐獻皮膚細胞的捐贈者，相較於以骨髓抽吸或抽脂以獲得間質幹細胞而言)； (3) 有可能透過可獲得的皮膚活體檢體產生自體或同種異體誘導型間質幹細胞(iMSCs)，然後患者使用自體誘導型間質幹細胞(iMSCs)不需要服用免疫抑制藥物，具有更好的長期植入的可能性，並增加安全性； (4) 僅需要化學混合物(無基因修飾)將皮膚細胞重新編程/去分化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)(先前的技術沒有可使用化學試劑及具有良好臨床應用的化學試劑以纖維母細胞生成間質幹細胞)； (5) 誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以很快(在6天內)以少量化學試劑(具有或不具有生長因子)來產生； (6) 來自皮膚細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)轉化率高；於一較佳具體實施例中該效率可以達到約80%； (7) 新生兒纖維母細胞及成人皮膚纖維母細胞都可以轉化為功能性之誘導型間質幹細胞(iMSCs)(注意，本領域已知難以從老年患者中分離功能性及可擴展的間質幹細胞)； (8) 相似於間質幹細胞，誘導型間質幹細胞(iMSCs)可擴增至少8代； (9) 用於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的混合物的組成分都是明確的，且不含有動物血清，其係適合於臨床應用並具有高再生性； (10) 相似於間質幹細胞，誘導型間質幹細胞(iMSCs)為多能分化性的，並可分化為多種功能細胞類型； (11) 相似於間質幹細胞，誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有免疫調節功能，可以治療動物模型中的疾病； (12) 所產生的誘導型間質幹細胞(iMSCs)與間質幹細胞具有相同的分子特徵；以及 (13) 重新編程過程只需要化學試劑(具有或不具有生長因子)；對於去分化/重新編程過程，不需要用於改變遺傳信息的逆轉錄病毒/慢病毒/質體，這避免了插入誘變或其他生物安全問題； (14) 此方法可以增加高度表現SSEA-4及PODXL的間質幹細胞之群體。SSEA-4+ 及PODXL+ 細胞為具有更好的擴增能力、選殖系形成能力及分化能力的間質幹細胞。功能性間質幹細胞很難從老年人或某些捐贈者中分離出來。這種方法可能有助於使擴增或分化不良的細胞轉化為功能性間質幹細胞。
透過以下實例進一步說明本發明，這些實例被提供用於說明之目的而非限制。根據本發明公開內容，本領域技術人員應該理解的是，可以在所公開的具體實施方式中做出許多改變，並且仍然獲得相似或類似的結果，而不偏離本發明之精神及範圍。
實例
1. 材料及方法
1.1 試劑
培養基，例如，剔除達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM)，係購自Invitrogen公司(Carlsbad，加州，美國)。化學物質，例如，激酶抑制劑，係購自LC Laboratories公司(Woburn，麻州，美國)、TOCRIS公司(Bristol，英國)，Sigma Aldrich公司(St.Louis，密蘇里州，美國)或其他公司。重組蛋白，例如重組生長因子，係購自Peprotech公司(Rocky Hill，紐澤西州，美國)、R＆D公司(Minneapolis，明尼蘇達州，美國)或其他公司。
1.2 細胞培養
所有以初代人類細胞進行的實驗都由人體試驗委員會(台灣，台北)批准。人類初代新生兒兒包皮纖維母細胞(CRL2097)購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)(Manassas，維吉尼亞州，美國)，並培養於含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM高葡萄糖(DMEM-HG)培養基中(HyClone公司，Logan，猶他州，美國)。初代成人皮膚纖維母細胞源自42歲或56歲的女性(LONZA公司，Basel，瑞士)，並以含有10%FBS的DMEM-HG培養基培養。人類初代骨髓間質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC)則以含有10%FBS的DMEM低葡萄糖(DMEM-LG)培養基培養。所有的細胞皆培養於37°C，5% CO2 下。
1.3 誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 的產生
對於來自人類纖維母細胞去分化所得之誘導型間質幹細胞(iMSCs)，將初代纖維母細胞在DMEM-HG中培養2天。然後將培養基換成含有不同化學物質的培養基，具有或不具有生長因子，持續3至21天(圖1A)。細胞在37°C，5% CO2 下培養。用於轉化的培養基含有剔除DMEM、AlbuMAX I、N2補充物、非必需胺基酸(NEAA)，其不含任何血清或不確定的組成分。
1.4 流式細胞儀及細胞分選
為了進行細胞表面標記分析，將骨髓間質幹細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)及纖維母細胞與FITC綴合的抗人類SSEA-4抗體(選殖系MC-813-70；eBiosciences公司，San Diego，加州，美國)以及與PE綴合的抗人類PODXL抗體(選殖系B34D1.3；eBiosciences)作用。然後透過FACSCanto (Becton Dickinson公司，Franklin Lakes，紐澤西州，美國)分析細胞。使用細胞分選儀(FACS Aria II，BD Biosciences公司)分離SSEA-4及PODXL雙陽性細胞。
1.5 微陣列分析
使用RNeasy套組(Qiagen公司，Hilden，德國)純化RNA。按照製造商的方法(Affymetrix公司，Santa Clara，加州，美國)，使用人類Affymetrix 3' IVT Express套組及GeneChip Human Genome U133A 2.0芯片製備樣品陣列雜交。使用Gene Spring GX 12.6軟體(Agilent Technologies公司，Santa Clara，加州，美國)分析陣列結果。先前在Pubmed Geo資料庫(GSM1533333)中描述了BMMSC_2的微陣列分析，並將所有其他陣列數據上傳到Pubmed Geo資料庫(GSE72693)。在此分析中使用了與纖維母細胞相比在誘導型間質幹細胞(iMSCs)中具有4倍或更高表現之基因。對數轉換的表現數據透過GeneSpring中的樣品及探針進行分層聚類。
1.6 免疫螢光分析
細胞以4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)固定15分鐘，在0.3% Triton X-100中透化10分鐘，然後以含2% BSA的PBS阻隔1小時。將細胞在FITC綴合的抗人類SSEA-4抗體(eBioscience公司)或PE綴合的抗人類PODXL抗體(eBioscience公司)中在室溫下作用1小時，然後以PBS洗滌3次。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)對細胞核進行對比染色，使用LAS-4000圖像系統(Fujifilm公司，東京，日本)獲取螢光圖像。最後，使用Multi Gauge version 3.0軟體(Fujifilm公司)對整幅圖像的亮度及對比度進行線性調整。
1.7 成骨分化
將人類初代骨髓間質幹細胞及誘導型間質幹細胞(iMSCs)在添加有10% FBS的DMEM-LG培養基中培養。纖維母細胞在添加有10% FBS的DMEM-HG培養基中培養。為了誘導分化，以成骨誘導培養基(90% DMEM-HG培養基、10% FBS、0.1 μM地塞米鬆、10 mM β-甘油磷酸酯、0.05 mM L-抗壞血酸磷酸酯)培養細胞(1×104 個細胞/cm2 )。在分化過程中培養基每週更換二次。
1.8 鹼性磷酸酶活性分析
成骨分化10天後，將細胞以含有4% PFA的PBS固定3分鐘。鹼性磷酸酶(ALP)染色使用鹼性磷酸酶套組並根據製造商的說明書(Sigma公司)進行。為了定量ALP活性，將細胞以PBS洗滌二次，並在室溫下與ALP基質對硝基苯磷酸(pNPP)作用5-20分鐘。測量405 nm光密度(O.D.)下的吸光度。
1.9 茜素紅 S 染色
骨形成分化21天後，將細胞以冰冷的70%乙醇在-20°C下固定1小時，然後以PBS洗滌。然後將細胞以40 mM茜素紅S (ARS)(pH4.2)染色10分鐘，隨後在風乾之前以ddH2 O洗滌5次。為了定量，將細胞與1 mL氯化十六烷基吡啶緩衝液一起作用1小時以萃取ARS，並記錄在波長550 nm下的O.D.值。
1.10 脂肪形成分化
為了脂肪形成誘導，將細胞在脂肪形成誘導培養基(Biological industry公司，Kibbutz Beit-Haemek，以色列)中培養，培養基在21天分化期間每週更換二次。
1.11 油紅 O 染色
細胞以4% PFA固定1小時，以60%異丙醇洗滌，然後風乾。將油脂囊泡以油紅O染色培養基(在2-丙醇中的30ml 0.5%油紅溶液，以20 ml水稀釋)染色10分鐘，然後以蒸餾水洗滌。為了定量，以異丙醇萃取油紅O，且吸收值在波長530 nm下測量O.D.值。
1.12 軟骨形成分化
對於軟骨形成分化，將各在15 mL管中的骨髓間質幹細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)及纖維母細胞(2.5×105 個細胞)在500g下離心10分鐘；然後將沉澱的細胞與軟骨誘導培養基(Biological industry公司)一起培養。過夜培養後，細胞形成球形聚集體。細胞連續誘導21天，取石蠟切片分析樣品。脫蠟後，切片以蘇木精 – 伊紅或阿爾新藍溶液染色。
1.13 阿爾新藍染色
將沉澱的細胞包埋在石蠟中。切薄片後，將切片以二甲苯脫蠟並以蒸餾水水合。切片於3%醋酸中作用3分鐘後，切片以1%阿爾新藍溶液(於3%醋酸中，pH2.5)染色30-45分鐘。然後將切片以水洗滌2分鐘，以二甲苯脫水，並以固定溶液(Thermo Fisher Scientific公司，Waltham，麻州，美國)固定。
1.14 內毒素誘導的小鼠急性肺損傷
所有動物實驗程序均由中央研究院動物倫理委員會(台北，台灣)批准。首先透過腹膜內途徑，以甲氧胺/唑拉西泮(Zolazepan) (25mg/kg)及賽拉嗪(xylazine) (10 mg/kg)麻醉BALB/c雌性小鼠(6-8週齡，國立實驗動物中心，台北，台灣)。然後透過氣管內(i.t.)滴注以從大腸桿菌O55:B5 (Sigma-Aldrich公司)純化的40 mg/kg脂多醣(LPS)或100 μl PBS誘導急性肺損傷(ALI)。在LPS處理4小時後，再次麻醉小鼠，然後隨機分為四組：(1) PBS、(2)人類纖維母細胞(100 μl PBS中含有106 個細胞)、(3) 誘導型間質幹細胞(iMSCs)(100 μl PBS中含有106 個細胞)，以及(4) 人類骨髓間質幹細胞 (BMMSCs，100 μl PBS中含有106 個細胞)。追蹤小鼠存活狀況48小時。每6小時觀察每組的存活率。針對組織學分析及肺損傷分析，在注射之前或48小時後收集樣品。
1.15 改善間質幹細胞的多能分化性
將BBMSCs在轉化培養基中培養6天，不含有化學處理(對照組)或含有化學混合物處理(6C+3GF組)(包括六種化學激酶(6C)抑制劑，即p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)以及三種生長因子，即白血病抑制因子(LIF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)及轉化生長因子-β(TGF-β))。在其他條件下，以不含生長因子的化學混合物(六種、七種或八種化學物質)培養間質幹細胞。透過流式細胞儀測定間質幹細胞標記，SSEA-4及PODXL的百分比。六種化學物質(6C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)。七種化學物質(7C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)及HDAC抑制劑(VPA)。八種化學物質(8C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)，HDAC抑制劑(VPA)及BMPa AMPK/BMP抑制劑(多索模芬)。
將間質幹細胞(來自40歲以下的年輕男性的對照間質幹細胞及分別來自40歲及69歲男性的老化間質幹細胞)在轉換培養基中培養6天，不具有化學處理(對照組)或者使用化學混合物(六、七或八種化學物質)。隨後將細胞在沒有化學混合物的常規培養基(具有10%FBS的DMEM-LG培養基)中再培養3天，並轉換到骨形成培養基中培養7天。進行ALP染色以確定骨形成分化的狀態。六種化學物質(6C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)。七種化學物質(7C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)及HDAC抑制劑(VPA)。八種化學物質(8C)包括p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)、HDAC抑制劑(VPA)及BMPa AMPK/BMP抑制劑(多索模芬)。
1.16 統計分析
所有統計數據以至少三個生物重複的平均值±標準偏差(S.D.)表示。統計學上的顯著差異係透過學生氏不成對雙尾t檢驗評估分析，其中p 值＜0.05被認為具有顯著差異。
2. 結果
2.1 六種化學激酶抑制劑與三種生長因子之組合在 6 天內從纖維母細胞產生誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 。
人類初代新生兒包皮纖維母細胞(CRL2097)被培養於含有化學混合物的DMEM培養基(6C + 3GF)6天，在一確定成分且無血清的培養基中，該培養基只含有AlbuMAX I、N2補充物、非必需胺基酸(NEAA)，該化學混合物包含六種化學激酶抑制劑，亦即p38抑制劑(SB202190, 10μM)、JNK抑制劑(SP600125, 10μM)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983, 5μM)、ROCK抑制劑(Y-27632, 5μM)、ERK1/2抑制劑(PD0325901, 1μM)及GSK3β抑制劑(CHIR99021, 3μM)，以及三種生長因子，亦即白血病抑制因子(LIF, 20 ng/ml)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF, 8 ng/ml)及轉化生長因子-β (TGF-β, 1 ng/ml)。圖1A所示為培養過程。培養後，以化學混合物處理的細胞透過流式細胞儀檢查。
如圖1B所示，以該化學混合物(6C + 3GF)處理後，細胞中功能性人類間質幹細胞標記，SSEA-4及PODXL20-22 顯著上調。為了確保該誘導型間質幹細胞(iMSCs)誘導的重現性，將重新編程實驗重複10次。一致的是，該化學混合物(6C + 3GF)誘導的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，其中26.4%-64.0%的細胞共表現SSEA-4及PODXL(平均值 = 37.62%)(圖1C)。
已經證明的是，以化學混合物(6C + 3GF)處理纖維母細胞會導致一定比例的纖維母細胞重新編程為類間質幹細胞之細胞(誘導型間質幹細胞(iMSCs))。
2.2 源自於新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 表現傳統的間質幹細胞標記
正如國際細胞治療學會(International Society for Cellular Therapy, ISCT)的間質幹細胞及組織幹細胞委員會所建議的，間質幹細胞對於CD105、CD73、CD44及CD90的表面標記呈現陽性，對於CD45、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR的表面標記呈現陰性。
分選出源自人類初代包皮纖維母細胞(CRL2097)且呈現SSEA-4+ PODXL+ 的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，並透過流式細胞儀測定以確定該誘導型間質幹細胞(iMSCs)是否表現傳統的間質幹細胞標記。
如圖1D所示，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)的標記表現圖譜對CD105、CD73、CD44及CD90表面標記顯示陽性結果(CD105+ 、CD73+ 、CD44+ 以及CD90+ )，對CD45、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR表面分子顯示陰性結果(CD45- 、CD34- 、CD11b- 、CD19以及HLA-DR- )，幾乎與骨髓間質幹細胞的表現相同， 且滿足了ISCT的間質幹細胞及組織幹細胞委員會定義的間質幹細胞標記標準。
2.3 誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 的轉錄體類似於骨髓間質幹細胞，但不類似於纖維母細胞。
透過化學混合物(6C + 3GF)處理誘導初代新生兒包皮纖維母細胞(CRL2097)及二種成人真皮纖維母細胞(一個來自42歲白人女性，另一個來自56歲白人女性)，以形成誘導型間質幹細胞(iMSCs)。對源自於初代新生兒包皮纖維母細胞(CRL2097)以及源自於二個成人真皮纖維母細胞(DF440547, 42歲以及DF443480, 56歲)的SSEA-4+ PODXL+ 誘導型間質幹細胞(iMSCs)進行微陣列分析。
如圖1E所示，來自新生兒纖維母細胞或成人纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)的cDNA表現圖譜比纖維母細胞更加類似於初代人類骨髓間質幹細胞的圖譜。
此外，如圖1F所示，主成分分析(principal component analysis, PCA)結果顯示，來自新生兒包皮纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)及來自成人皮膚纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)彼此相似，這些相似性不依賴於它們的起源。有趣的是，誘導型間質幹細胞(iMSCs)，相較於其親本纖維母細胞而言，更接近於骨髓間質幹細胞。然而，相較之下，來自新生兒或成人捐贈者的纖維母細胞之間有明顯的差異。
2.4 誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 擴增至少 8 代
為了從纖維母細胞進一步富集誘導型間質幹細胞(iMSCs)，將細胞以SSEA-4及PODXL進行分選。在沒有化學混合物(6C + 3GF)的情況下分選並培養8代後，誘導型間質幹細胞(iMSCs)，類似於骨髓間質幹細胞(BMMSCs)，仍然表現SSEA-4及PODXL(圖2)。
證明了根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以擴增至少8代，而不喪失它們類間質幹細胞的特徵。
2.5 來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 為多能分化的。
為了檢查根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)是否像初代分離的骨髓間質幹細胞一樣是多能分化的，我們檢查了誘導型間質幹細胞(iMSCs)分化為成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞的能力。
2.5.1 骨形成能力
鹼性磷酸酶(ALP)活性為早期骨形成階段中骨形成所需(骨形成的一早期標記)。茜素紅S染色(ARS)揭示鈣沉積的程度，這是在骨形成晚期中形成骨基質所需(骨形成的一晚期標記)。測試透過化學混合物處理(6C + 3GF)從新生兒纖維母細胞衍生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)的骨形成能力。
如圖3A及圖3B所示，在骨形成誘導培養基中誘導骨形成後的誘導型間質幹細胞在第10天顯示出ALP活性(骨形成的一早期標記)，在第21天顯示出ARS (骨形成的一晚期標記)，這在一定程度上係與初代骨髓間質幹細胞相當；然而，相較之下，初代纖維母細胞則未顯示ALP活性及ARS結果(圖3A及圖3B)。
證實了根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)在誘導後可以分化為成骨細胞。
2.5.2 脂肪形成能力
測試透過化學混合物處理(6C + 3GF)從新生兒纖維母細胞獲得之誘導型間質幹細胞(iMSCs)的脂肪形成能力。將誘導型間質幹細胞(iMSCs)在脂肪細胞誘導培養基中培養21天，然後透過油紅O染色對脂滴的存在進行分析。
如圖3C所示，在脂肪形成誘導後，類似於骨髓間質幹細胞，該誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出大量的脂滴(中圖及右圖)；然而，相較之下，初代纖維母細胞未能產生脂滴(左圖)。
證實了根據本發明之誘導型間質幹細胞(iMSCs)在誘導後可以分化為脂肪細胞。
2.5.3 軟骨形成能力
測試經由化學混合物處理(6C + 3GF)從新生兒纖維母細胞獲得之誘導型間質幹細胞(iMSCs)的軟骨形成能力。將該誘導型間質幹細胞(iMSCs)在軟骨誘導培養基中培養21天，然後透過蘇木精 - 伊紅(HE)染色以分析軟骨的空腔結構之存在，以及透過阿爾新藍染色以分析蛋白聚醣之存在。
如圖3D所示，軟骨誘導後之誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞顯著形成軟骨的空腔結構以及蛋白聚醣(中圖、右圖，上下)。然而，相較之下，初代纖維母細胞未能形成軟骨的空腔結構及蛋白聚醣(左圖、上下)。
證明了根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)在誘導後可以分化為軟骨細胞。
鑑於上述情況，顯示化學混合物(6C + 3GF) 係有效用於誘導新生兒包皮纖維母細胞去分化成為具多能分化性的功能性誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
2.6 來自成人皮膚纖維母細胞之誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 具多能分化性。
為了檢查源自於各種纖維母細胞之誘導型間質幹細胞(iMSCs)是否具有相似的分化潛能，將來自兩個不同成人捐贈者(DF440547, 42歲及DF443480, 56歲)的纖維母細胞用於重新編程及分化實驗。
如圖4所示，源自於成人纖維母細胞之誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出分化為成骨細胞(圖4A)、脂肪細胞(圖4B)及軟骨細胞(圖4C)的能力，其係與骨髓間質幹細胞程度相當。
2.7 誘導型間質幹細胞 (iMSCs) ，如同骨髓間質幹細胞，在小鼠模型中抑制脂多醣誘導之肺損傷的致死性。
在小鼠急性肺損傷(ALI)模型中測定根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)的免疫調節功能。
如圖5A所示，在脂多醣(LPS)處理4小時後，對ALI小鼠氣管內給予誘導型間質幹細胞(iMSCs)或骨髓間質幹細胞會顯著抑制小鼠中的急性肺損傷。值得注意的是，如圖5B所示，所有注射了誘導型間質幹細胞(iMSCs)或骨髓間質幹細胞的ALI小鼠都存活了；然而，相反地，在以PBS或纖維母細胞處理的ALI小鼠中觀察到約50%的死亡率。如圖5C所示，作為進一步的支持，相較於以PBS或纖維母細胞處理的ALI小鼠，以誘導型間質幹細胞(iMSCs)或骨髓間質幹細胞處理的ALI小鼠表現出較低的肺損傷評分。
證明了誘導型間質幹細胞(iMSCs)，類似於骨髓間質幹細胞，是治療上有效的，例如，在體內抑制LPS調節的ALI。
2.8 六種激酶抑制劑之組合有效從纖維母細胞產生誘導型間質幹細胞 (iMSCs)
為了檢查化學混合物(6C + 3GF)中哪些因子為產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)所需，我們嘗試不同之組合。如圖6所示，六種激酶抑制劑組合(6C，不含3GF)，包括p38抑制劑(SB202190, 10μM)、JNK抑制劑(SP600125, 10μM)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983, 5μM)、ROCK抑制劑(Y-27632, 5μM)、ERK1/2抑制劑(PD0325901, 1μM)及GSK3β抑制劑(CHIR99021, 3μM)，且不含三種生長因子TGF-β、bFGF及LIF，相較於該六種激酶抑制劑加上該三種生長因子之組合(6C + 3GF)，可以有效地產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)。此外，四種激酶抑制劑組合(4C，不含3GF)，包括p38抑制劑(SB202190, 10μM)、JNK抑制劑(SP600125, 10μM)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983, 5μM)以及ROCK抑制劑(Y-27632, 5μM)，且不含三種生長因子TGF-β、bFGF及LIF，相較於該四種激酶抑制劑加上該三種生長因子之組合(4C + 3GF)，可以有效地產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)，雖然相較於該6C組合時，該4C組合的效果相對較低。
因此，這三種生長因子TGF-β、bFGF及LIF可以在產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的過程中被去除；即這六種激酶抑制劑本身(p38i + JNKi + PKCi + ROCKi + ERK1/2i +GSK3βi)之組合或該四種激酶抑制劑(p38i + JNKi + PKCi + ROCKi)之組合對產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是有效的。
2.9 透過六種激酶抑制劑的處理所產生之誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 具多能分化性。
如上所述進行分化實驗。如圖7所示，來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)以六種激酶抑制劑(SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y-27632 + PD0325901 + CHIR969021)處理而不使用生長因子，顯現出分化為成骨細胞(圖7A)及脂肪細胞(圖7B)之能力，且達到與骨髓間質幹細胞相當之程度。
2.10 當單獨使用由纖維母細胞產生之誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 時，單一因子是有效的
在僅DMEM培養基(作為陰性對照組)或在含有GSK3β抑制劑(CHIR99021, 3μM)或蛋白激酶C抑制劑(Go6983, 5μM)的DMEM培養基中培養人類初代新生兒包皮纖維母細胞(CRL2097)並透過流式細胞儀測定共表現SSEA-4及PODXL的細胞轉化成誘導型間質幹細胞(iMSCs)的百分比。
如表1所示，GSK3β抑制劑(CHIR99021, 3μM)或蛋白激酶C抑制劑(Go6983, 5μM)本身對產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是有效的，雖然相較於多種激酶抑制劑的組合，其效率相對較低。 相較於只有DMEM, * p＜0.05, **, p＜0.001.
其他一些因子或組合也以相同的方式進行了測試。如表2所示，這些藥物不具有顯著的活性以產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)。 自0.1%至0.8%沒有顯著差異。
2.11 對於由纖維母細胞產生誘導型間質幹細胞 (iMSCs) 有效之化學物質的其他組合
針對從纖維母細胞產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的能力以分析化學物質的其他組合，並透過流式細胞儀測定轉化為共表現SSEA-4及PODXL的誘導型間質幹細胞(iMSCs)之細胞百分比。表3所示為結果。 a: 當單獨使用時，該因子對於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是有效的。 b: 當單獨使用時，該因子對於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是無效的。 註：SB202190可以由另一p38抑制劑SB203580取代。
如表3所示，出乎意料地發現，相較於各自單獨使用時(Go6983為6.60% (表1中的處理(2))及CHIR99021的0.9% (表1中的處理(1))，PKC抑制劑C (Go6983)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)的組合以協同方式(14.00%，表3中的處理(4))有效地產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)。
還意外地發現，當與單獨使用時對產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)無效的一種或多種化學物質於組合使用時，Go6983對產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的功效可以顯著提高。例如，當單獨使用PKC抑制劑C (Go6983)時，可以產生6.60%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表1中的處理(2))，當單獨使用ROCK抑制劑(替亞沙佛林)時被認為對於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是無效的(表2中的處理(24)，只有0.8%)；然而，令人驚訝的是，Go6983加替亞沙佛林之組合可以協同方式產生較高百分比為12.00%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表3中的處理(1))。又如另一實例，當單獨使用PKC抑制劑C (Go6983)時，可以產生6.60%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表1中的處理(2))，當單獨使用AMPK抑制劑/BMP抑制劑(多索模芬)時被認為對於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是無效的(表2中的處理(1)，只有0.1%)；然而，令人驚訝的是，Go6983加多索模芬之組合可以協同方式產生較高百分比為36.30%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表3中的處理(14))；再者，當該組合(Go6983加多索模芬)進一步包括HDAC抑制劑(VPA)時，該百分比進一步增加至57.00% (表3中的處理(17))，而單獨使用VPA時被認為對於產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是無效的(表2中的處理(8)，只有0.2%)。
類似地，當與一個或多個單獨使用無效的化學物質組合使用時，PKC抑制劑C (Go6983)與GSK3β抑制劑 (CHIR99021)之組合在產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的功效上可以被大幅增加。例如，PKC抑制劑C (Go6983)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)之組合可以產生14.00%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表3中的處理(4))，且組蛋白去乙醯酶抑制劑(VPA)被認為對產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)是無效的(表2中的處理(8)，僅為0.2%)；然而，令人驚訝的是，Go6983及CHIR99021加上VPA之組合可以協同方式產生更高的百分比為40.00%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表3中的治療(15))。
作為一些較佳的具體實施例， PKC抑制劑C (Go6983)與GSK3β抑制劑 (CHIR99021)加上HDAC抑制劑(VPA)之組合與額外之單獨使用時無效的其他化學物質，包括JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB202190；可被SB203580替代)、ROCK抑制劑(Y27632)及ERK1/2抑制劑(PD0325901)，一起時可產生一優異的百分比為59.30%的誘導型間質幹細胞(iMSCs)(表3中的處理(19))；且當該組合(Go6983 + CHIR99021 + VPA + SP600125 + SB202190 + Y27632 + PD0325901)進一步包括AMPK抑制劑/BMP抑制劑(多索模芬)(表3中的處理(20))時，該百分比可以進一步增加至78.60%。
2.12 增強間質幹細胞的多能分化性
我們進一步進行了間質幹細胞的化學處理以確定化學物質在增強間質幹細胞多能分化性中的作用。圖8A所示為六種化學激酶抑制劑與三種生長因子(6C: SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021；3GF: 人類LIF、bFGF、TGF-b)之組合可以增強在骨髓間質幹細胞中功能標記的表現從34.8%提高至50.3%，亦即增強了骨髓間質幹細胞的多能分化性。圖8B進一步顯示了存在六種化學物質(6C: SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021)、七種化學物質(7C: SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021 + VPA)，以及八種化學物質(8C: SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021 + VPA + 多索模芬)，不含生長因子，經過3天的轉化可使功能標記的表現從41%增加至64.7%、81.3%及95.7%。我們進一步以單一因子處理骨髓間質幹細胞，發現一種單一的PKC抑制劑(Go6983)可以有效地增加BMSCs功能標記之表現。我們進一步以四種化學物質(4C：Go6983 + CHIR99021 + VPA +多索模芬)處理骨髓間質幹細胞，發現4C處理也能有效增加骨髓間質幹細胞功能標記之表現。
此外，透過本發明之化學處理，在老化的間質幹細胞中骨形成能力也增強。如圖9A所示，從捐贈者分離出二個初代老化的間質幹細胞。相較於年齡小於35歲的健康對照相組，來自40歲及69歲的捐贈者之間質幹細胞表現出老化的表型。該些細胞失去紡錘形形態且顆粒度增加。如圖9B所示，在以六種化學物質(6C：SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021)、七種化學物質(7C：SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021 + VPA)及八種化學物質(8C：SB202190 + SP600125 + Go6983 + Y27632 + PD0325901 + CHIR99021 + VPA +多索模芬)處理後，骨形成增加。這表明該化學混合物可以改善衰老的間質幹細胞的多能分化性。
3. 總結
總而言之，我們首次報導了透過使用PKC抑制劑C及/或GSK3β抑制劑的化學處理，任選地與一種或多種輔助劑，例如單獨使用時無效的化學物質，由纖維母細胞產生誘導型間質幹細胞(iMSCs)之方法。該方法不需要使用血清進行細胞培養(即無血清)，其係適於臨床應用。該方法也可以是無異化的。此外，該方法不需要可能導致插入突變誘發的步驟，例如病毒感染或質體轉染。
在某些具體實施例中，根據本發明之來自纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)的轉化率可以高於約1%，具體而言可以達到約80%。例如，根據本發明產生之誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出間質幹細胞的特徵，包括SSEA-4及PODXL以及其他間質幹細胞標記(CD105+ 、CD73+ 、CD44+ 以及CD90+ )的表現，例如分化為成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞的多能分化性活性，以及至少在治療內毒素誘導的ALI動物中具有治療效果。本發明之方法在產生功能性誘導型間質幹細胞(iMSCs)方面是有效的，並適用於治療多種疾病之再生醫學。
此外，如本文所述之化學治療也可以增進間質幹細胞的功能特徵，例如在細胞治療中有利之擴增選、殖系形成及/或分化的活性。 References 1. Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M. & Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone 13, 81-88 (1992). 2. Pittenger, M. F. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147 (1999). 3. Kfoury, Y. & Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell 16, 239-253, doi:10.1016/j.stem.2015.02.019 (2015). 4. Wang, Y., Chen, X., Cao, W. & Shi, Y. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol 15, 1009-1016, doi:10.1038/ni.3002 (2014). 5. Karp, J. M. & Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell 4, 206-216, doi:10.1016/j.stem.2009.02.001 (2009). 6. Fang, X. et al. Human Mesenchymal Stem (Stromal) Cells Promote the Resolution of Acute Lung Injury in Part through Lipoxin A4. J Immunol 195, 875-881, doi:10.4049/jimmunol.1500244 (2015). 7. Le Blanc, K. et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 363, 1439-1441, doi:10.1016/S0140-6736(04)16104-7 (2004). 8. Duijvestein, M. et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment for refractory luminal Crohn's disease: results of a phase I study. Gut 59, 1662-1669, doi:10.1136/gut.2010.215152 (2010). 9. Ankrum, J. & Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol Med 16, 203-209, doi:10.1016/j.molmed.2010.02.005 (2010). 10. Mazzini, L. et al. Stem cell therapy in amyotrophic lateral sclerosis: a methodological approach in humans. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 4, 158-161 (2003). 11. Chen, S. L. et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. Am J Cardiol 94, 92-95, doi:10.1016/j.amjcard.2004.03.034 (2004). 12. Horwitz, E. M. et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 8932-8937, doi:10.1073/pnas.132252399 (2002). 13. Field, R. E., Buchanan, J. A., Copplemans, M. G. & Aichroth, P. M. Bone-marrow transplantation in Hurler's syndrome. Effect on skeletal development. J Bone Joint Surg Br 76, 975-981 (1994). 14. Trounson, A. & McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell 17, 11-22, doi:10.1016/j.stem.2015.06.007 (2015). 15. Gao, F. et al. Mesenchymal stem cells and immunomodulation: current status and future prospects. Cell Death Dis 7, e2062, doi:10.1038/cddis.2015.327 (2016). 16. de Girolamo, L. et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new ''cells as drugs'' paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr Pharm Des 19, 2459-2473 (2013). 17. Galotto, M. et al. Stromal damage as consequence of high-dose chemo/radiotherapy in bone marrow transplant recipients. Exp Hematol 27, 1460-1466 (1999). 18. Bosi, A. & Bartolozzi, B. Safety of bone marrow stem cell donation: a review. Transplant Proc 42, 2192-2194, doi:10.1016/j.transproceed.2010.05.029 (2010). 19. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R. & Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp, e3779, doi:10.3791/3779 (2013). 20. Gang, E. J., Bosnakovski, D., Figueiredo, C. A., Visser, J. W. & Perlingeiro, R. C. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow. Blood 109, 1743-1751, doi:10.1182/blood-2005-11-010504 (2007). 21. Rosu-Myles, M. et al. The globoseries glycosphingolipid SSEA-4 is a marker of bone marrow-derived clonal multipotent stromal cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev 22, 1387-1397, doi:10.1089/scd.2012.0547 (2013). 22. Lee, R. H. et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood 113, 816-826, doi:10.1182/blood-2007-12-128702 (2009). 23. Gafni, O. et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature 504, 282-286, doi:10.1038/nature12745 (2013). 24. Zhang, W. & Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res 12, 9-18, doi:10.1038/sj.cr.7290105 (2002). 25. Fang, R. et al. Generation of naive induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell 15, 488-496, doi:10.1016/j.stem.2014.09.004 (2014). 26. Chandrakanthan, V. et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 113(16):E2306-15. doi: 10.1073/pnas.1518244113 (2016).
無
當結合所附之圖式閱讀時，將會更好地理解前述發明內容以及以下對本發明的詳細描述。為了說明本發明之目的，在圖式中示出了目前較佳的具體實施例。然而，應該理解的是，本發明不限於所示的精確佈置及手段。
在圖式中：
圖1A、1B、1C、1D、1E及1F包括顯示以化學混合物及生長因子衍生來自新生兒及成人纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)的圖表。圖1A顯示為用於從真皮纖維母細胞高效化學衍生誘導型間質幹細胞(iMSCs)的實驗方案。擴增的誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以進一步分化成不同的譜系或在小鼠模型中治療疾病。圖1B顯示為具有間質幹細胞(MSCs)標記，SSEA-4及PODXL的人類新生兒纖維母細胞(CRL2097)、誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞的代表性流式細胞儀分析結果。SSEA-4及PODXL在誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞中大量表現。圖1C顯示來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)的高效一致性生產。化學混合物可重複性地將人類纖維母細胞高效轉化為誘導型間質幹細胞(iMSCs)。人類纖維母細胞未經處理(纖維母細胞)或以化學混合物［6C+3GF，6 化學 (6C)，包括p38抑制劑(SB202190、SB203580)、JNK抑制劑(SP600125)、PKC抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)，以及三種生長因子(3GF)，包括人類LIF、bFGF、TGF-β)］處理6天，然後以間質幹細胞(MSCs)標記，SSEA-4及PODXL，進行流式細胞儀分析。進行10次獨立實驗，化學混合物(6C + 3GF)處理的平均誘導型間質幹細胞(iMSCs)誘導率所示為37.62%。圖1D顯示為源自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現由ISCT定義的傳統間質幹細胞(MSCs)表面標記。間質幹細胞以ISCT公告的標記鑑定。使用所示抗體或同種型對照組透過流式細胞儀檢查傳統間質幹細胞(MSCs)標記。骨髓間質幹細胞作為對照組。誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現CD90、CD44、CD73及CD105，不表現CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR。圖1E顯示為新生兒纖維母細胞(CRL2097)，由新生兒(CRL2097)及成人真皮纖維母細胞(42歲及56歲女性)誘導的誘導型間質幹細胞(iMSCs)及兩種不同的BMMSC (BMMSC_1：初代人類骨髓間質幹細胞，在整個研究中使用；BMMSC_2：人類BMMSC的公開可用的基因表現資料，登錄號為GSM1533333)的基因表現圖譜之分層聚類(hierarchical clustering)。圖1F所示為纖維母細胞(CRL2097，42歲及56歲女性)，由這三種纖維母細胞誘導的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，以及兩種獨立來源的骨髓間質幹細胞 (BMMSC_1及BMMSC_2)的幹細胞性基因表現之主成分分析。主成分1佔40%的資料集的變化，主成分2佔19%的資料集的變化，以及主成分3佔14%的資料集的變化。源自三種不同纖維母細胞源的誘導型間質幹細胞(iMSCs)的聚群（clustering）表示該混合物的強效功效。
圖2顯示為誘導型間質幹細胞(iMSCs)可以在間質幹細胞培養基中擴增至少8代。分選後經過8代培養的誘導型間質幹細胞(iMSCs)穩定表現SSEA-4及PODXL。 使用化學混合物(6C + 3 GF)處理包皮新生兒纖維母細胞CRL2097，並以SSEA-4及PODXL抗體進行分選。 將得到的誘導型間質幹細胞(iMSCs)在常規間質幹細胞培養基(DMEM-LG + 10%FBS)中培養8代。顯示了骨髓間質幹細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)(第8代)及新生兒纖維母細胞(纖維母細胞)使用抗SSEA-4及PODXL的抗體之代表性免疫螢光圖像。比例尺，50 μm。
圖3A、3B及3C包括顯示來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)具多能分化性，且分化能力與骨髓間質幹細胞相當之圖表。圖3A顯示為早期的骨形成。將新生兒纖維母細胞(CRL2097)、源自CRL2097 (iMSC)的誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞在成骨誘導培養基中培養10天，並進行鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性測定。定量數據顯示在下方的小圖中。誘導型間質幹細胞(iMSCs)的ALP量與骨髓間質幹細胞的ALP量相當，而纖維母細胞的ALP量幾乎檢測不到。圖3B顯示為晚期骨形成。在第21天進行茜素紅S染色(Alizarin Red S, ARS)。定量數據顯示在下方的小圖中。誘導型間質幹細胞(iMSCs)的ARS量與骨髓間質幹細胞的ARS量相當，而纖維母細胞的ARS量幾乎檢測不到。圖3C顯示脂肪生成。將新生兒纖維母細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞在脂肪形成誘導培養基中培養21天，然後用油紅O染色。定量數據顯示在下方的小圖中。誘導型間質幹細胞(iMSCs)的油紅含量與骨髓間質幹細胞的油紅含量相當，而纖維母細胞的油紅含量幾乎檢測不到。比例尺，50 μm。所有樣品的n值 = 6。****p＜0.0001。圖3D顯示軟骨形成。檢查空腔結構(蘇木精 - 伊紅染色，HE)及軟骨蛋白聚醣(阿爾新藍染色)以評估誘導型間質幹細胞(iMSCs)在第21天分化為軟骨細胞之能力。空腔結構以黃色箭頭標記。比例尺，50 μm。誘導型間質幹細胞(iMSCs)分化為軟骨細胞的程度與骨髓間質幹細胞分化為軟骨細胞的程度相當。
圖4A、4B及4C包括顯示來自成人纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有多能分化性的圖表。圖4A顯示骨形成。來自人類成人纖維母細胞(42歲及56歲女性)的誘導型間質幹細胞(iMSCs)顯示與骨髓間質幹細胞相當的骨形成能力。將纖維母細胞(42歲及56歲的女性)、來自成人纖維母細胞(42歲及56歲女性)的誘導型間質幹細胞(iMSCs)以及骨髓間質幹細胞在成骨細胞誘導培養基中培養21天，然後以茜素紅染色(ARS)(上圖)進行測定。萃取染料並透過測量在波長550 nm下的光密度(O.D.)(下圖)(n = 6)以定量ARS。****p ＜0.0001。圖4B顯示脂肪生成。來自人類成人纖維母細胞(42歲及56歲女性)的誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出與骨髓間質幹細胞相當的脂肪形成能力。將指示用的纖維母細胞、誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞在脂肪細胞誘導培養基中培養21天，然後以油紅O (上圖)對脂滴進行染色。比例尺，50 µm。萃取染料，以在波長530 nm下測定O.D來定量油紅O染色(下圖)(n = 6)。****p ＜0.0001。圖4C顯示軟骨形成。來自人類成人纖維母細胞(42歲及56歲女性)的誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出與骨髓間質幹細胞相當的軟骨形成能力。檢查空腔結構(透過蘇木精及伊紅染色顯示，HE染色，上圖)(以黃色箭頭標記)及軟骨蛋白聚醣(以阿爾新藍染色顯示，下圖)，以評估細胞在第21天分化為軟骨細胞之能力。進行了三個獨立的實驗。比例尺，100 µm。
圖5A、5B及5C包括顯示來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)顯著降低小鼠模型中內毒素誘導的急性肺損傷的死亡率之圖表。將新生兒纖維母細胞(CRL2097)、來自CRL2097的誘導型間質幹細胞(iMSCs)，以及骨髓間質幹細胞注入給予脂多醣(liposaccharides, LPS，一種內毒素) 4小時後的小鼠中。在注射後48小時分析結果。圖5A顯示肺臟的組織學。誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞改善了肺部發炎。在LPS誘導的急性肺損傷後48小時的代表性肺臟組織學。比例尺，100 μm。圖5B顯示該存活曲線。誘導型間質幹細胞(iMSCs)在一定程度上與骨髓間質幹細胞相當，可有效提高LPS誘導的急性肺損傷之存活率。結果表示為存活率百分比(每組n值 = 10-12)。*p ＜0.05，LPS + PBS組對比於PBS組、LPS + 誘導型間質幹細胞(iMSCs)組或LPS + 骨髓間質幹細胞組。#p ＜0.05，LPS +纖維母細胞組對比於PBS組、LPS + 誘導型間質幹細胞(iMSCs)組或LPS + BMMSC組。圖5C顯示肺臟的損傷評分。LPS誘導的急性肺損傷的損傷評分。在LPS誘導的急性肺損傷後48小時的組織學定量，在整個切片的數位切片掃描之後，對所有切面進行量化，每組n值=10-12。損傷評分使用以下標準：0，無損傷；1，在該範圍內有25%的損傷；2，在該範圍內有50%的損傷；3，在該範圍內有75%的損傷；4，瀰漫性肺損傷。*p ＜0.05。
圖6顯示生長因子對於將人類纖維母細胞轉化成為誘導型間質幹細胞(iMSCs)而言是非必要的。以四種或六種化學物質與指定的生長因子結合處理纖維母細胞，然後在第6天進行流式細胞儀分析，以量化誘導型間質幹細胞(iMSCs)的轉化效率(SSEA-4+ PODXL+ 群體)。生長因子的加入不會促進以該四種或六種化學混合物處理的細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)之轉化。
圖7A及7B包括顯示來自僅六種化學物質的誘導型間質幹細胞(iMSCs)具有多能分化性的圖表。圖7A顯示為骨形成。來自人類新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)顯示與骨髓間質幹細胞相當的骨形成能力。將來自新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)及骨髓間質幹細胞在成骨細胞誘導培養基中培養21天，然後透過茜素紅染色(ARS)以進行測定(左圖)。萃取染料並透過測量波長為550 nm處的光密度(O.D.)以量化ARS (右圖)(n = 6)。****p ＜0.0001。圖7B顯示脂肪形成。來自人類新生兒纖維母細胞的誘導型間質幹細胞(iMSCs)表現出與骨髓間質幹細胞相當的脂肪形成能力。將指示用的纖維母細胞、誘導型間質幹細胞 (iMSCs)及骨髓間質幹細胞在脂肪細胞誘導培養基中培養21天，然後以油紅O染色(左圖)。比例尺，50 µm。萃取染料，在波長530 nm下測定O.D以定量油紅O染色(右圖)(n = 6)。
圖8A及8B包括顯示化學治療可以增強間質幹細胞(MSCs)多能分化性之圖表。圖8A顯示以具有三種生長因子的六種化學物質之處理(6C+3GF)增加了SSEA4及PODXL功能標記的表現。圖8B顯示以六種化學物質(6C)、七種化學物質(7C)及八種化學物質(8C)之處理增加了SSEA4及PODXL功能標記之表現。[6C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)及GSK3β抑制劑(CHIR99021)。7C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)及HDAC抑制劑(VPA)。8C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)、HDAC抑制劑(VPA)及BMPa AMPK/BMP抑制劑(多索模芬)]。
圖9A及9B包括顯示以優化之混合物6C、7C或8C使老化的間質幹細胞回春以具有更強之多能分化性的圖表。圖9A顯示為來自40歲及69歲男性的老化間質幹細胞之形態。圖9B顯示以化學混合物6C、7C及8C預處理6天後，將回春之間質幹細胞在常規間質幹細胞培養基中培養3天，然後切換至成骨培養基7天以進行ALP測試。圖像顯示化學混合物處理後骨形成量增加。ALP的定量結果使用單因子變異數分析(one-way ANOVA)及圖凱氏(Tukey's)測試進行檢驗，n = 3，*p ＜0.05。人類老化的間質幹細胞未進行處理或以該化學混合物處理[6C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)，以及GSK3β抑制劑(CHIR99021)。7C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)，以及HDAC抑制劑(VPA)。8C：p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)、蛋白激酶C抑制劑(Go6983)、ROCK抑制劑(Y-27632)、ERK1/2抑制劑(PD0325901)、GSK3β抑制劑(CHIR99021)、HDAC抑制劑(VPA)及BMPa AMPK/BMP抑制劑(多索模芬)]。
無

Claims (26)

  1. 一種產生誘導型間質幹細胞(induced mesenchymal stem cells, iMSC)之方法，包括在允許一定比例之皮膚細胞去分化為iMSC的條件下培養該皮膚細胞，其中該條件包含培養基，該培養基包含蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β)抑制劑。
  2. 如請求項1之方法，其中該皮膚細胞為纖維母細胞。
  3. 如請求項1之方法，其中該培養基進一步包含選自由下列群組組成之輔助劑：p38抑制劑、c-jun N端激酶(c-jun N terminal kinase, JNK)抑制劑、Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)抑制劑、細胞外調節激酶(extracellular regulated kinase, ERK)抑制劑、AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)抑制劑、Src酪胺酸激酶抑制劑、未分化淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑(phosphoinositide 3-kinase inhibitor, PI3K)抑制劑、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活劑、組蛋白去乙醯酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑、抗氧化劑、抗氧化劑、腫瘤生長因子β (tumor growth factor beta, TGFβ)抑制劑、雷帕黴素的分子標的(molecular target of rapamycin, mTOR)抑制劑、G9a甲基轉移酶抑制劑、DOTIL抑制劑，及其任何之組合。
  4. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (1) PKC抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (2) PKC抑制劑、ALK抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (3) PKC抑制劑及Src家族酪胺酸激酶抑制劑之組合； (4) PKC抑制劑及GSK3β抑制劑之組合； (5) PKC抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (6) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及一Src酪胺酸激酶抑制劑之組合； (7) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及雷帕黴素的標的(mTOR)抑制劑之組合； (8) PKC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (9) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及G9a甲基轉移酶抑制劑之組合； (10) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及DOT1L抑制劑之組合； (11) PKC抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑及p38抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (13) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (14) PKC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合。
  5. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (4) PKC抑制劑及GSK3β抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  6. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (5) PKC抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (6) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及Src酪胺酸激酶抑制劑之組合； (7) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及雷帕黴素的標的(mTOR)抑制劑之組合； (9) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及G9a甲基轉移酶抑制劑之組合； (10) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及DOT1L抑制劑之組合； (11) PKC抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑及p38抑制劑之組合； (13) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及cAMP活化劑之組合； (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  7. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (15) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑及HDAC抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  8. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (14) PKC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (17) PKC抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合； (18) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑及AMPK抑制劑/BMP抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  9. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (1) PKC抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (2) PKC抑制劑、ALK抑制劑及ROCK抑制劑之組合； (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (16) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  10. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (12) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合； (19) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑及ERK抑制劑之組合；以及 (20) PKC抑制劑、GSK3β抑制劑、HDAC抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、ROCK抑制劑、ERK抑制劑及AMPK/BMP抑制劑之組合。
  11. 如請求項1之方法，其中該抑制劑為分子。
  12. 如請求項3之方法，其中該輔助劑為分子。
  13. 如請求項3之方法，其中該培養基包含選自由下列組成之群組的組合： (1) Go6983及替亞沙佛林(Thiazovivin)之組合； (2) Go6983、SB431542及替亞沙佛林之組合； (3) Go6983及達沙替尼(Dasatinib)之組合； (4) Go6983及CHIR99021之組合； (5) Go6983及VPA之組合； (6) Go6983、VPA及達沙替尼之組合； (7) Go6983、VPA及雷帕黴素之組合； (8) Go6983及法舒地爾(Fasudil)之組合； (9) Go6983、VPA及BIX01294之組合； (10) Go6983、VPA及SGC0946之組合； (11) Go6983、VPA、SP600125及SB202190之組合； (11-1) Go6983、VPA、SP600125及SB203580之組合； (12) Go6983、CHIR99021、SP600125、SB202190、Y27632及PD0325901之組合； (12-1) Go6983、CHIR99021、SP600125、SB203580、Y27632及PD0325901之組合； (13) Go6983、VPA及佛司可林(Froskoin)之組合； (14) Go6983及多索模芬(Dorsomorphin)之組合； (15) Go6983、CHIR99021及VPA之組合； (16) Go6983、CHIR99021、VPA、Y27632及PD0325901之組合； (17) Go6983、VPA及多索模芬之組合； (18) Go6983、CHIR99021、VPA及多索模芬之組合； (19) Go6983、CHIR99021、VPA、SP600125、SB202190、Y27632及PD0325901之組合； (19-1) Go6983、CHIR99021、VPA、SP600125、SB203580、Y27632及PD0325901之組合； (20) Go6983、CHIR99021、VPA、SP600125、SB202190、Y27632、PD0325901及多索模芬之組合；以及 (20-1) Go6983、CHIR99021、VPA、SP600125、SB203580、Y27632、PD0325901及多索模芬之組合； (21) Go6983； (22) CHIR99021。
  14. 如請求項1之方法，其中該皮膚細胞為人類細胞。
  15. 如請求項2之方法，其中該纖維母細胞為新生兒纖維母細胞或成人纖維母細胞。
  16. 如請求項1之方法，其中該皮膚細胞係培養於該培養基中至少1天或更多天。
  17. 如請求項1之方法，其中該培養基為無血清的。
  18. 如請求項1之方法，其中約1至80%該皮膚細胞被去分化為iMSC。
  19. 如請求項1之方法，進一步包括自該細胞培養物中分離出該iMSCs，以獲得分離之iMSCs群體。
  20. 一種生產分化的體細胞之方法，包括使透過以蛋白激酶C (PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑及可視需要的一種或多種輔助劑處理而衍生自體細胞的iMSC，接受於適於分化的條件下，從而產生特定之體細胞。
  21. 如請求項20之方法，其中該特定之體細胞係選自由下列所組成之群組：纖維母細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞、成肌細胞、神經元、β胰島細胞、肝細胞、心肌細胞，以及神經幹細胞。
  22. 一種治療疾病或病症之方法，包括施予治療有效量之誘導型間質幹細胞(iMSC)至需要這種治療之個體，該誘導型間質幹細胞(iMSC)係透過以蛋白激酶C (PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑及可視需要的一種或多種輔助劑處理而衍生自纖維母細胞。
  23. 如請求項22之方法，其中該疾病或病症係選自由下列所組成之群組：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)、移植物抗宿主病、克羅恩氏病、第1型糖尿病、糖尿病性創傷、多發性硬化症、神經疾病(脊髓損傷、帕金森氏症、阿茲海默症、肌萎縮性側索硬化症、糖尿病性周圍神經病變、癲癇、精神分裂症、自閉症)、心血管疾病(心肌梗塞、缺血性心臟病、慢性心力衰竭、冠狀動脈疾病、擴張型心肌病外周血管疾病、缺血性擴張型心肌病)、成骨不全症、潰瘍性結腸炎、幹細胞移植、肝硬化、骨折、軟骨損傷、腎移植、腎衰竭、骨關節炎、急性呼吸窘迫症候群、修格蘭氏症候群(Sjögren's syndrome, pSS)、系統性硬化症、杜氏肌營養不良、癌症、退行性椎間盤疾病、關節鏡肩袖修復、貧血、危重肢體缺血視、神經脊髓炎譜系疾病、器官移位的亞臨床排斥、上頜囊腫、動脈粥樣硬化、卵巢早衰、前十字韌帶損傷、關節軟骨缺損、金伯克氏病、敗血症/感染性休克、肛門廔管、骨壞死、假性關節、移植物功能延遲、局部部分腎絲球硬化症、慢性阻塞性肺疾病、骨軟骨炎、類風濕性關節炎、發音困難、骨壞死、藥物性嗜中性白血球缺乏症、腦損傷、燒傷、急性腎損傷、乳房重建、肝衰竭、肝硬化、異物反應、發炎、膝關節積水、皮膚潰瘍、膀胱與陰道瘻管、營養不良型大皰性表皮鬆懈症、骨質疏鬆症、局部女性壓力性尿失禁治療(HULPURO)、視網膜疾病、黃斑部病變、遺傳性視網膜營養不良、視神經疾病、青光眼、髖關節成形術、腦性麻痹、男性不育症、關節固定術、龍博格氏病、關節黏連性脊椎炎、尿毒症、慢性半月板損傷、皮膚光老化、肺氣腫、支氣管肺發育不良、大便失禁、特發性肺纖維化、自體免疫性肝炎、膽汁性肝硬化、脊椎關節炎、大皰性表皮鬆懈症、氣喘、口腔乾燥症、失智症、內側半月板切除術恢復、進行性核上性麻痺、尋常型牛皮癬、CMV感染、肩袖部疾病、血球減少症、骨髓增生異常症候群、佩羅尼氏症、角膜緣角症候群、龍博格氏病、肝再生、難治性系統性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、巴拉刈中毒、肺炎、肺氣腫、衰老脆弱、肺移植、骨囊腫、腦腎上腺腦白質營養不良、勃起功能障礙、椎間盤疾病、脂肪營養障礙、伯格氏病、血友病、威爾森氏病、支氣管擴張症、色素沈著性視網膜炎、小腦性運動失調症、汗腺疾病、系統性紅斑狼瘡、德維克氏症候群、唇裂及腭裂、修格蘭氏症候群，以及賀勒氏症。
  24. 一種增進間質幹細胞(MSCs)的功能特徵之方法，包括以蛋白激酶C (PKC)抑制劑及/或肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)抑制劑，以及可視需要的一種或多種輔助劑處理該間質幹細胞(MSCs)。
  25. 如請求項24之方法，其中該一種或多種輔助劑係選自由下列所組成之群組： p38抑制劑、c-jun N端激酶(JNK)抑制劑、Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑、細胞外調節激酶(ERK)抑制劑、AMP活化的蛋白激酶(AMPK)抑制劑、Src酪胺酸激酶抑制劑、未分化淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑(PI3K)抑制劑、環磷酸腺苷(cAMP)激活劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、抗氧化劑、抗氧化劑、腫瘤生長因子β (TGFβ)抑制劑、雷帕黴素的分子標的(mTOR)抑制劑、G9a甲基轉移酶抑制劑、DOTIL抑制劑，及其任何之組合。
  26. 如請求項24之方法，其中該間質幹細胞(MSCs)的功能特徵包括擴增(expansion)、選殖系形成(clonogenicity)及/或分化(defferentiation)的活性。
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