CN108060121B - 小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法 - Google Patents

小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法。所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF‑β受体抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，TGF‑β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂。本发明通过小分子化合物分阶段诱导，能够将分化的细胞转分化为成骨细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明提供的方法供体来源广泛，患者本人即可作为供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的成骨细胞。

Description

小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细 胞制备成骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法。
背景技术：
现有的骨组织工程或再生医学成骨种子细胞包括分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞。但此类细胞的存在来源有限、获取过程复杂并伴随供体较重的伤害等问题，因而应用受限。
多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。
传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMA EC，et al，2014)、神经细胞(HU W，et al，2015)、胰岛细胞(Sh eng Ding，et al，2015)的成果已陆续见诸报道。
由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为成骨细胞。
发明内容
本发明提供了一种小分子化合物组合及利用小分子化合物组合诱导制备成骨细胞的方法。本发明通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地获得大量成骨细胞或其产物。
本分明第一方面，提供一种小分子化合物组合，所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF-β受体抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶(Lysine deacetylases inhibitors，KDACIs)抑制剂，TGF-β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂。
进一步地，所述第一阶段小分子化合物还包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，所述第二阶段小分子化合物还包括RAR激动剂，DNMT抑制剂，HMT抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK抑制剂，ROCK抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种。
作为优选，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂为sodium phenylbutyrate，butyrate，sodium butyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(Histone Deacetylase Inhibitor III)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracin ostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinost at)，Trichostatin(TSA)，Psammaplin A，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtin ol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，R GFP 966，PHOB，BG45，Nexturastat A，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTAC H，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；
所述TGF-β受体抑制剂为616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431 542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB 525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；
所述PKC抑制剂为Go6983，Ro31-8220Mesylate，Go6976和Bisindolylmaleimide I(G F109203X)的至少一种；
所述WNT/β-catenin激动剂为MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CBM1078，SB 216763和AR-A014418中的至少一种；
所述cAMP激动剂为EPAC/RAP1激动剂，8-Bromo-cAMP，Dibutyryl-Camp和Sp-8-Br-cAMPs中的至少一种；
所述EPAC/RAP1激动剂为Forskolin，IBMX，Prostaglandin E2(PGE2)，NKH477，8-pC PT-2′-O-Me-cAMP，GSK256066，Apremilast(CC-10004)，Roflumilast，Cilomilast，Rolipram和Milrinone中的至少一种；
所述RAR激动剂为TTNPB，Bexarotene，Ch55，Tamibarotene，Retinol，AM580，ATRA，13-cis RA，Vitamin A及Vitamin A衍生物中的至少一种；
所述ROCK抑制剂为Y-27632，Y-27632 2HCl，Thiazovivin，Ripasudil(K-115)，Fasudi l，Fasudil(HA-1077)HCl，GSK429286A，RKI-1447和PKI-1313中的至少一种；
所述JNK抑制剂为SP600125，JNK Inhibitor IX，AS601245，AS602801和JNK-IN-8中的至少一种；
所述DNMT抑制剂为RG108，Thioguanine，5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)，SGI-1 027，Zebularine和5-Azacytidine(AZA)中的至少一种；
所述HMT抑制剂为EPZ004777，EPZ5676，GSK503，BIX 01294和SGC 0946中的至少一种。
所述组蛋白去甲基化酶抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，Tranylcypromine(2-PCPA)HCl，SP2509，4SC-202，ORY-1001(RG-6016)，GSKJ1和GSK-LSD1中的至少一种。
所述小分子化合物组合为选自下述第一阶段小分子化合物的任一项和第二阶段小分子化合物的任一项的时序性小分子化合物组合，所述时序性小分子化合物组合所属的小分子化合物必须按一定的时序与相应的细胞或细胞产物接触；
作为优选，所述第一阶段小分子化合物采用下列任一项：
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin；
VPA+BIO+Repsox+Forskolin；
VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin；
VPA+CHIR99021+SB431542+Rolipram；
VPA+BIO+SB431542+Forskolin；
VPA+BIO+SB431542+Rolipram；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Rolipram；
VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+SB431542；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Repsox；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Repsox+Rolipram；
VPA+BIO+SB431542+Forskolin+Repsox；
VPA+BIO+SB431542+Forskolin+Repsox+Rolipram；
所述第二阶段小分子化合物采用下列任一项：
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Go6983；
VPA+BIO+SB431542+Forskolin+Go6983；
VPA+CHIR99021+SB431542+Rolipram+Go6983；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+Rolipram；
VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+Go6983；
VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram+Go6983+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+8-pCPT-2′-O-Me-cAMP；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+SB431542；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Go6983+Tranilast；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+SB431542+A8301；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+Rolipram+SB431542+A8301；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+Rolipram+SB431542；
VPA+BIO+Repsox+Forskolin+Go6983；
VPA+BIO+Repsox+Rolipram+Go6983；
VPA+BIO+SB431542+Rolipram+Go6983；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+SP600125+5-Aza-2'-deoxycytidine；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+5-Aza-2'-deoxycytidine；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+5-Aza-2'-deoxycytidine；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+5-Aza-2'-deoxycytidine+SP600125+AM580；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+5-Aza-2'-deoxycytidine+ascorbate；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+ascorbate；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate+5-Aza-2'-deoxycytidine。
本发明第二方面，提供一种制备成骨细胞的方法。一种利用所述的小分子化合物组合制备成骨细胞的方法，所述方法将分化的细胞依次与第一阶段小分子化合物、第二阶段小分子化合物接触诱导，最终制备得到成骨细胞。第一阶段小分子化合物用于上调该分化的细胞Runt相关转录因子2/核心结合因子a1 Runx2/cbfa1(Runt-relatedtranscription factor 2)和碱性磷酸酶ALP表达。第二阶段小分子化合物，维持第一阶段处理后获得的细胞产物的Runx2/cbfa1和降低分化的细胞的特异表达因子。
所述分化的细胞来源于哺乳动物如人，所述分化的细胞包括成纤维细胞，上皮细胞，脂肪细胞或血液细胞。优选地所述分化的细胞是成纤维细胞。
所述分化的细胞与第一阶段小分子化合物接触诱导的时间为3～8天，第一阶段接触诱导后的细胞产物与第二阶段小分子化合物接触诱导的时间为5～18天。
本发明的一些实施方案，具体小分子化合物的有效浓度如下，以下给出的浓度范围只是参考，可在此基础上做适应性修改，如果其他小分子替代以下小分子，浓度也可以做适应性调整。
Forskolin浓度为2μM～20μM；Repsox浓度为2～15uM；CHIR99021浓度为1μM～10μM；VPA浓度为0.5mM～1.5mM；TTNPB浓度为3μM～8μM；AM580浓度为0.03～0.08μM；EPZ004777浓度为3～8μM；Go6983浓度为1～15μM；Y-27632浓度为3～15μM，L-Ascor bin acid 2-phosphate浓度为0.15～0.25mM；SP600125浓度为1～15μM；5-Aza-2'-deoxycytidine浓度为0.5～15μM。
也可利用本发明方法或者在本发明方法的基础上做适应性调整，诱导分化的细胞制备其它类型细胞如软骨细胞。如果利用本发明提供的小分子化合物组合制备除软骨细胞、成骨细胞之外的其他细胞，可以根据实际需要进行调整相应小分子化合物的浓度，以及在小分子化合物组合上作调整。
本发明的方法在适合产生诱导成骨细胞的条件下进行，所述条件包括例如培养液、培养温度、培养时间等。基于现有的公开通用技术并结合本发明的示例性说明，本领域技术人员不需要过多实验即能够容易地确定本发明的培养条件。关键在于选择抑制或激活的信号途径及其顺序与作用时间的正确选择，另外小分子化合物的浓度也可在本发明提供的范围基础上做适应性调整。
本发明第三方面，还提供包括所述小分子化合物组合的试剂盒或培养液/基。
本发明第四方面，还提供所述小分子化合物组合、包含所述小分子化合物组合的试剂盒或培养液/基的应用，用于在体内动员诱导或体外诱导制备的成骨细胞或以其为源头细胞的再生医学种子细胞、组织工程种子细胞及其产物，可用于基础研究、临床治疗及组织工程产品研发与生产。
本发明第五方面，还提供由所述的小分子化合物组合或由所述的方法制备的成骨细胞。本发明提供的成骨细胞具备标准的成骨细胞的特性，且转分化得到成骨细胞的纯度很高，能够大量生产。
本发明第六方面，还提供所述的成骨细胞及其产物的应用，如用于制备骨组织工程产品或再生医学成骨种子细胞，其用途还包括制备成骨细胞的小分子化合物组合。
本发明的方法在适合产生诱导性成骨细胞的条件下进行，所述条件包括例如培养液的成分、浓度，培养温度，培养时间及其他条件。基于现有技术的充分教导并结合本发明的示例性说明，本领域技术人员不需要过度实验即能够容易地确定上述培养条件。关键在于选择所需抑制或激活的细胞信号通路，并确定作用细胞信号通路的顺序。另外，小分子化合物或其组合的浓度及其他条件也可在本发明提供的范围基础上做适应性调整。
本发明的机理如下：本发明第一阶段通过赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylases inhibitors，KDACIs)抑制剂，TGF-beta抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂处理分化的细胞，激活分化的细胞内源性成骨分化的转录因子Runx2/cbfa1的表达上调和ALP蛋白的表达上调；本发明第二阶段继续采用HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激活剂，同时联用DNA甲基转移酶(DNA methyltransferas，DNMT)的抑制剂，组蛋白甲基转移酶(Histone Methyltransferase，HMT)的抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK的抑制剂和ROCK(Rho-associated protein kinase)的抑制剂和RA受体激活剂中的至少一种，促进第一阶段所得分化的细胞产物继续重编程；第三阶段使用成骨细胞分化液进行培养；经过3个阶段成功获得成骨细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地获得大量成骨细胞或其产物，易于精准质控，标准化操作；所需样本量少，便于采集，来源广泛；便于规模化生产或个性化制备成骨细胞及相关产品，可广泛应用于基础医学研究、临床治疗及组织工程产品研发，具有产业化前景。
附图说明
图1为实施例1中人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞方法的示意图；
图2为小分子化合物诱导人源皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的细胞形态图；
图3为对获得成骨细胞的转分化效率和细胞纯度的鉴定结果图；
图4为在免疫缺陷小鼠体内移植转分化的成骨细胞治疗小鼠股骨缺损结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下实验方案。
实施例1
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的重编程:第一阶段
通过上述第1步骤的处理后，完全更换为第一阶段的诱导培养液进行细胞培养，培养时间3～8天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述诱导培养液成分如下：10％胎牛血清(Hycl one)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+Forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
3、皮肤成纤维细胞的重编程:第二阶段
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段的诱导培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述第二阶段的诱导培养液成分如下：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例2
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例3
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)+SP600125(8～12μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例4
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)+SP600125(8～12μM)+5-Aza-2'-deoxycytidine(1μM～15μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例5
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)+5-Aza-2'-deoxycytidine(1μM～15μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例6
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+SP600125(8～12μM)+5-Aza-2'-deoxycytidine(1μM～15μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
实施例7
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(Day-1)，接种细胞密度1～2.5×104/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的激活
2.1启动转分化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～25μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的重编程
通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbinacid 2-phosphate(0.15～0.25m)+5-Aza-2'-deoxycytidine(1μM～15μM)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、重编程细胞的定向诱导
随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+10mmol/Lβ-gly(β-甘氨酸)+100nM dexamethasone(地塞米松)+0.2mM ascorbate-2-phosphate(维生素C磷酸酯)；
5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因RUNX2ALP，BSPII，OCN；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。
诱导人皮肤成纤维细胞制备成骨细胞，人源皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的细胞形态图见图2，获得的间充质干细胞的检测结果图3～图4；
图2为通过小分子化合物诱导人源皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的细胞形态图，其中A图为皮肤成纤维细胞；B为实施例1中的方法转分化获得的成骨细胞，并进行了茜素红的染色；C为实施例5中的方法转分化获得的成骨细胞，并进行了茜素红的染色；D为对转分化的成骨细胞，进行成骨细胞分子标志物的定量鉴定，其中HuFib代表未经处理的皮肤成纤维细胞(阴性对照)，Hu-iOS代表转分化的成骨细胞，Hu-OS代表由体内MSC体外诱导获得的成骨细胞(阳性对照)；
图3为对获得成骨细胞的转分化效率和细胞纯度的鉴定结果图。经过小分子化合物组合处理后，使用传统的成骨诱导液分化14天，A图为镜下成骨细胞分泌的矿化结节的茜素红染色，镜下观察大部分细胞分泌了矿化结节；B图为RUNX2的免疫荧光染色；C图为以RUNX2标记为阳性的细胞与总细胞数相比，进行分化效率的统计，结果为90％以上的细胞高表达RUNX2，向成骨方向分化；D图为从成年人体内分离的皮肤成纤维细胞(HuFib)在含10％血清的高糖培养液培养条件下，连续10代内的生长曲线，以此为原料制备的成骨细胞可以大量生产。
图4为在免疫缺陷小鼠体内移植转分化的成骨细胞治疗小鼠股骨缺损结果图；细胞移植28天后，使用microCT检测移植部位的缺损修复情况，A图为空白对照组；B图为MSC阳性对照组，C图为转分化的成骨细胞组。
以上实施例中才用的皮肤成纤维细胞可替换为其他分化的细胞，如血液细胞、脂肪细胞等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征在和下文(如实施例)中具体描述的各种技术特征之间可以互相结合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

Claims (1)

1.一种利用小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法，其特征在于，所述分化的细胞与第一阶段小分子化合物接触诱导的时间为3～8天，第一阶段接触诱导后的细胞产物与第二阶段小分子化合物接触诱导的时间为5～18天，随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液，培养12～30天后制备得到成骨细胞，所述分化的细胞为成纤维细胞；
所述第一阶段小分子化合物采用Forskolin、Repsox、CHIR99021和VPA，第一阶段小分子化合物用于上调分化的细胞Runt相关转录因子2/核心结合因子a1和碱性磷酸酶ALP表达；
所述第二阶段小分子化合物采用下列任一项：
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+L-Ascorbinacid 2-phosphate；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+L-Ascorbinacid 2-phosphate+ SP600125；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+L-Ascorbinacid 2-phosphate+ SP600125+5-Aza-2 '-deoxycytidine；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+L-Ascorbinacid 2-phosphate+5-Aza-2 '-deoxycytidine；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+SP600125+5-Aza-2 '-deoxycytidine；
Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+EPZ004777+Go6983+Y-27632+L-Ascorbinacid 2-phosphate+5-Aza-2 '-deoxycytidine；
促进第一阶段所得分化的细胞产物继续重编程。
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