CN110499285A - Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用 - Google Patents

Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用 Download PDF

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CN110499285A CN201910415384.6A CN201910415384A CN110499285A CN 110499285 A CN110499285 A CN 110499285A CN 201910415384 A CN201910415384 A CN 201910415384A CN 110499285 A CN110499285 A CN 110499285A
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Abstract

本发明提供了一种ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用。本发明首次揭示了ALPL基因调控干细胞功能在低碱性磷酸酯酶症发病中的作用，并为低碱性磷酸酯酶症的有效治疗提供了潜在的治疗策略。

Description

ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种调控肝/骨/肾型碱性磷酸酶的ALPL基因、重组载体、转基因细胞及其在制备用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物中的应用。
背景技术
组织非特异性碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP)是由肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)编码的一种蛋白，其主要功能是过水解有机和无机焦磷酸盐释放单磷酸与钙离子结合并沉积在细胞外基质上形成钙化结晶，即矿化。临床上由于遗传因素导致碱性磷酸酶水平降低的疾病称为低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)。低碱性磷酸酯酶症是一种罕见的常染色体遗传性全身系统疾病，其特征为先天性骨代谢异常，并引起骨骼和牙齿的矿化不全，血清及骨组织中碱性磷酸酶活性降低。低碱性磷酸酯酶症根据碱性磷酸酶蛋白功能影响的程度分为轻度与重度。据统计重症低碱性磷酸酯酶症发病率在十万分之一左右，而轻型发病率相对较高，可达0.1％，其临床表现有很大的变异性，有的仅表现为年轻恒上前牙过早脱落，有的会出现严重的全身性骨骼形成不良，甚至导致新生儿死亡。该病目前尚无可靠的治疗方法。
骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，在骨形成和骨组织再生过程中发挥重要作用。临床上利用骨髓移植或骨髓间充质干细胞移植可以有效缓解或改善骨质疏松症状，同样临床上也利用骨髓间充质干细胞移植治疗低碱性磷酸酯酶症患者，经多次细胞治疗改善骨矿化不足的症状。说明以骨髓间充质干细胞为切入点可能成为研究低碱性磷酸酯酶症发病机制和筛选药物治疗方面的新策略。然而，骨髓间充质干细胞来源困难，并存在一定的安全性及伦理问题，骨髓间充质干细胞的作用机理尚不明确，碱性磷酸酯酶表达的遗传因素尚未有相关研究报道。因此，探索调控碱性磷酸酯酶的基因的内在因素、并利用调控碱性磷酸酯酶的基因制备相关的产品及利用调控碱性磷酸酯酶的基因制备治疗低碱性磷酸酯酶症的产品，成为本发明需要解决的主要问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用。本发明首次揭示了低碱性磷酸酯酶症的遗传机理，并为低碱性磷酸酯酶症的有效治疗提供了潜在的治疗策略。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明第一方面，提供了ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用。
优选地，所述产品为重组载体，所述的重组载体包含所述ALPL基因和表达载体。
根据本发明提供的重组载体，所述表达载体可以为本领域公知的各种能够连接外源基因的表达载体，例如，所述表达载体可以为T载体、原核表达载体和真核表达载体中的至少一种。其中，T载体和原核表达载体的主要作用可以是初步验证功能基因和目标蛋白的功能，而真核表达载体的作用可以是为了后续将其转化进细胞中。因此，能够满足上述应用的各种T载体(例如，pMD18-T、pMD19-T等)、原核表达载体(例如，pET32a等)和真核表达载体(例如，pGN-M、pcDNA3.1等)均可用于本发明。
优选地，所述产品为转基因细胞，所述转基因细胞包含上述的ALPL基因。
优选地，所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞。这些细胞的选择均为本领域技术人员所公知。并且所述转基因细胞不能够发育为完整的生物体
本发明第二方面，提供了所述的ALPL基因、所述的重组载体、所述的转基因细胞在制备碱性磷酸酶中的应用。
本发明第三方面，提供一种碱性磷酸酶的制备方法，该方法包括：在ALPL基因能够表达的条件下，培养所述的转基因细胞，以使其表达碱性磷酸酶。
本发明第四方面，提供了所述的ALPL基因、所述的重组载体、所述的转基因细胞或所述的碱性磷酸酶的制备方法在制备用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物中的应用。
优选地，所述用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物为增加碱性磷酸酶表达的药物、增加干细胞成骨分化能力的药物或改善牙硬组织矿化异常的药物。
此处能够理解的是，以上各种药物中含有如上所ALPL基因、如上所述的重组载体、如上所述的转基因细胞和编码的碱性磷酸酶症中的至少一种
优选地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。
本发明第五方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含ALPL基因或ALPL基因的表达蛋白。
所述药物组合物可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的赋形剂、药学上可接受的载体等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
本发明第六方面，提供所述的ALPL基因在建立牙硬组织矿化异常小鼠模型中的应用。
优选地，所述应用过程包括：1)在ALP基因的intron2-3和intron4-5中插入Loxp位点，构成ALPL基因的打靶载体；2)将Cas9/sgRNA与ALPL基因的打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过胚胎移植的方法获得重组ALPL基因的转基因小鼠。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于，本发明首次解开了低碱性磷酸酶症的遗传密码，并在此基础上提供了ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用。为碱性磷酸酶症的治疗和药物开发提供了有效的方案和策略。
本发明所述的重组载体，包含上述的ALPL基因，所述重组载体可将所述ALPL基因运输到生物体的特定位置，可用于低碱性磷酸酶症的基因治疗药物的开发。
本发明提供的转基因细胞，包含所述的ALPL基因，在ALPL基因能够表达的条件下，培养所述的转基因细胞，以使其表达低碱性磷酸酶，实现了低碱性磷酸酶的体外制备。
本发明提供了所述的ALPL基因、所述的重组载体、所述的转基因细胞或所述的碱性磷酸酶的制备方法在制备用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物中的应用。为低碱性磷酸酶症的治疗和药品的制备提供了有效的方案。
附图说明
图1为低碱性磷酸酯酶症患者P1组的突变位点检查结果；
图2A-图2B为低碱性磷酸酯酶症患者P1组的突变位点检查结果；
图3A是碱性磷酸酯酶症患者P1组的牙齿CT检测图；
图3B是碱性磷酸酯酶症患者P2组的牙齿CT检测图；
图4A为正常人膝关节CT检测图；
图4B为P1组膝关节CT检测图；
图4C为P2组膝关节CT检测图；
图5A为正常人乳牙髓腔电镜显微图；
图5B为低碱性磷酸酯酶症患者乳牙髓腔电镜显微图；
图6A为正常人牙骨质表面电镜显微图；
图6B为低碱性磷酸酯酶症患者牙骨质表面电镜显微图；
图7A为正常对照PDLSCs细胞培养倒置显微镜图；
图7B为低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs细胞培养倒置显微镜图；
图8A为流式细胞术检测正常对照患者PDLSCs周期；
图8B为流式细胞术检测低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs周期；
图9A、图9B和图10为正常对照及低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs克隆形成率(CFU-F)比较对照图；
图11A为使用MTT法检测正常对照PDLSCs增殖情况结果统计图；
图11B为使用MTT法检测低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs增殖情况结果统计图；
图12A为正常PDLSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色结果；
图12B为低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者PDLSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色结果；
图13A为正常PDLSCs成骨诱导分化28天后茜素红染色结果；
图13B为低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者PDLSCs成骨诱导分化28天后茜素红染色结果；
图14A为正常PDLSCs包裹牙本质片显微检测结果；
图14B为HPP患者PDLSCs包裹牙本质片显微检测结果；
图14C为后正常PDLSCs形成牙周纤维的能力显微检测图；
图14D为HPP患者PDLSCs形成牙周纤维的能力显微检测图；
图15A为正常BMMSCs细胞培养倒置显微镜图；
图15B为低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs细胞培养倒置显微镜图；
图16A为流式细胞术检测正常对照患者BMMSCs周期；
图16B为流式细胞术检测低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs周期；
图17A、图17B和图18为正常对照及低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs克隆形成率(CFU-F)比较对照图；
图19A为使用MTT法检测正常对照BMMSCs增殖情况结果统计图；
图19B为使用MTT法检测低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs增殖情况结果统计图；
图20为正常及低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者BMMSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色以及茜素红染色结果；
图21显示了正常及低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者BMMSCs成骨诱导分化28天后Westernblotting检测成骨分化相关基因ALP及Runx2的表达变化；
图22A显示了正常BMMSCs转染慢病毒载体下调Alpl的表达后，成骨诱导分化14天，茜素红染色后检
测结果；
图22B为对图22A的茜素红染色后的定量分析；
图22C显示了qRT-PCR(实时定量PCR)检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；
图22D显示了Western blotting检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；
图23A显示了HPP患者BMMSCs转染慢病毒载体上调Alpl的表达后，成骨诱导分化14天，茜素红染色后检测结果；
图23B为对图23A的茜素红染色后的定量分析；
图23C显示了qRT-PCR(实时定量PCR)检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；
图23D显示了Western blotting检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；
图24为小鼠骨髓替换模式图；
图25、图26A和图26B为替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨量恢复检测图；
图27和图28为替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨量恢复HE染色检测图；
图29A-图30为替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨量恢复钙黄绿素染色结果；
图31A-图32为替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠的骨髓腔油红O染色结果；
图33为基因芯片检测低碱性磷酸酯酶症患者间充质干细胞基因表达谱；
图34-图35B显示低碱性磷酸酯酶症患者BMMSC成骨诱导过程β-catenin入核情况；
图36-图37显示沉默ALPL基因抑制β-catenin活化；
图38-图39显示患者BMMSC中上调ALPL基因激活β-catenin；
图40-图42显示了ALPL基因去磷酸化胞外PPi调控经典Wnt通路的激活。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中细胞成骨诱导液可以按如下方法配制:含10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05g/L维生素C、1％青霉素-链霉素、5％胎牛血清的α-MEM培养基。
本实施例的细胞成脂肪诱导液可以按如下方法配制：60uM吲哚美辛、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10ug/mL胰岛素、0.1mM维生素C、0.5uM氢化可的松、1％青霉素-链霉素、5％胎牛血清的α-MEM培养基。
本发明实施例中胰酶消化液按如下方法配制：将胰酶溶于pH值为7.4的PBS缓冲液，配置成质量百分含量为0.25％的胰酶消化液。
本发明实施例中基因表达采用实时荧光定量PCR法检测，实施按如下方法进行：利用TRIzol(TaKaRa)提取细胞总RNA，应用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT Master Mix(RR036A)试剂盒将RNA反转录成cDNA；采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II RR820A试剂盒在BIO-RAD CFX96Real-time System进行实时荧光定量PCR反应。反转录反应：37℃5min，85℃5s；实时荧光定量PCR反应：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环进行PCR扩增。GAPDH作为内参,采用△△Ct方法进行分析。PCR采用的引物见表1
表1实时定量PCR引物列表
本发明实施例中蛋白表达采用免疫印迹法法检测，实施按如下方法进行：采用碧云天的蛋白质免疫印迹法及免疫共沉淀细胞裂解液(P0013)裂解细胞提取细胞总蛋白，碧云天聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)进行蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，采用湿转方法200毫安2h将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，室温5％BSA封闭1h，抗体孵育4℃过夜，二抗37℃孵育2h，采用化学发光法在天能化学发光仪检测。抗体具体稀释浓度：Runx2(1:1000，Abcam)，SP7(1:1000，Abcam),PPAR-γ(1:500，Abcam)，LPL(1:500，Santa Cruz Biotechnology)，RANKL(1:1000，Abcam)，GSK-3β(1:1000，Abcam)，p-GSK-3(1:1000，Abcam)，β-catenin(1:1000，Abcam)，active-β-catenin(1:500，Millipor)andβ-actin(1:4000，Abcam)
本发明实施例中ALP染色采用碧云天碱性磷酸酶染色试剂盒进行染色。
本发明实施例中茜素红染色检测，按如下方法进行：细胞用4％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤2次，1％茜素红染色37℃孵育30min，双蒸馏水洗涤2次，相机拍照。
本发明实施例中油红O染色检测，实施按如下方法进行：细胞用4％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤2次，加入油红O工作液室温染色10min，PBS洗涤2次，显微镜下拍照。
实施例
低碱性磷酸酯酶症患者ALPL基因突变位点分析
将低碱性磷酸酯酶症患者分为P1组和P2组两组，取外周血，分别利用血液DNA抽提试剂盒(德国QIAGEN)分离、纯化获得患者基因组DNA；根据ALPL基因12个外显子序列设计引物，采用PCR方法在PCR仪(美国ABI)体外扩增获得患者ALPL基因外显子片段；随后，利用DNA回收试剂盒(生工SK1141)分离获得纯化ALPL基因的外显子片段；采用一代DNA测序(ABI3730xl基因测序仪)检测ALPL基因存在的单核苷酸多态性(SNP)位点，通过基因组数据库筛查错义突变位点，核对低碱性磷酸酯酶症致病ALPL基因的突变位点，P1组的突变位点为c.551G>A，P1组的突变位点为c.407G>A,p.R136H和c.551G>A,p.R263Q，突变位点分析结果可参考图1-图2B，其中，图1为低碱性磷酸酯酶症患者P1组的突变位点检查结果；图2A-图2B为低碱性磷酸酯酶症患者P1组的突变位点检查结果。对P1组和P2组的血清中碱性磷酸酯酶和血浆磷酸吡哆醛分别进行检测，参考表2，发现P1组和P2组血清中碱性磷酸酯酶活性均不足，P1组和P2组的血浆磷酸吡哆醛均呈阳性；对P1组和P2组的牙齿发育状况进行CT检测，参考图3A-图3B，发现P1组和P2组的牙齿发育均存在严重缺陷，其中，图3A是碱性磷酸酯酶症患者P1组的牙齿CT检测图；图3B是碱性磷酸酯酶症患者P2组的牙齿CT检测图。对P1组、P2组和正常人的膝关节进行CT检测，参考图4A-图4C，发现P1组与正常人的检查结果相似，发现P2组的部分骨骼出现骨量和骨密度降低，其中，图4A为正常人膝关节CT检测图；图4B为P1组膝关节CT检测图；图4C为P2组膝关节CT检测图。通过以上检测结果，结合大量临床数据表明，突变位点的数量与临床症状成正比。
表2低碱性磷酸酯酶症患者临床检查数据
2.ALPL基因的突变抑制间充质干细胞骨向分化能力的实验验证
①取正常人和低碱性磷酸酯酶症患者牙齿切片，电镜显微拍照：参考图5A和图5B，图5A为正常人乳牙髓腔电镜显微图；图5B为低碱性磷酸酯酶症患者乳牙髓腔电镜显微图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症患者的乳牙髓腔侧牙本质小管开口分布不规则，牙本质矿化程度低，可见明显的胶原纤维网，牙本质小管管腔较正常乳牙大。参考图6A和图6B，图6A为正常人牙骨质表面电镜显微图；图6B为低碱性磷酸酯酶症患者牙骨质表面电镜显微图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症患者牙骨质表面凹凸不平，较正常乳牙牙根表面粗糙，可见部分牙本质小管开口于牙根表面。
②传统观念认为ALPL作为末端功能性基因，仅在组织矿化过程中发挥重要作用。本发明通过分离培养低碱性磷酸酯酶症患者牙周膜干细胞、牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞，在培养过程中进行观察检测发现，低碱性磷酸酯酶症患者相关间充质干细胞的细胞增殖能力减弱，包括克隆形成能力降低和细胞周期出现G2-M期阻滞。此外，ALPL基因突变导致相关间充质干细胞向成骨细胞方向分化受到抑制，裸鼠皮下再生形成具有牙周组织结构能力明显减弱。下调正常骨髓间充质干细胞中的ALPL基因表达明显抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，而上调低碱性磷酸酯酶症患者骨髓间充质干细胞中ALPL基因的表达可以明显恢复其成骨分化。本研究结果提示ALPL基因不仅仅是个末端的功能性基因，其可作为上游基因参与调控间充质干细胞的生物学特性。本研究突破了传统观念上对ALPL基因的认识，对全面认识ALPL基因具有重要意义，实验结果可参考图4-图8。图7A为正常对照PDLSCs细胞培养倒置显微镜图；图7B为低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs细胞培养倒置显微镜图。
图8A为流式细胞术检测正常对照患者PDLSCs周期；图8B为流式细胞术检测低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs周期。可以看出，低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs增殖能力显著低于正常对照，表现为细胞周期S期下降。
图9A、图9B和图10为正常对照及低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs克隆形成率(CFU-F)比较对照图，可以看出，低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs CFU-F低于正常对照。
图11A为使用MTT法检测正常对照PDLSCs增殖情况结果统计图，图11B为使用MTT法检测低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs增殖情况结果统计图，可以看出，低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs增殖能力低于正常对照。
图12A为正常PDLSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色结果；图12B为低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者PDLSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色结果；图13A为正常PDLSCs成骨诱导分化28天后茜素红染色结果，图13B为低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者PDLSCs成骨诱导分化28天后茜素红染色结果，显示HPP患者PDLSCs成骨分化能力显著下降；
将正常及HPP患者PDLSCs包裹牙本质片植入裸鼠皮下，8周后取材，HPP患者PDLSCs形成牙周纤维的能力显著弱于正常PDLSCs，实验结果参考图14A-14D。图14A为正常PDLSCs包裹牙本质片显微检测结果；图14B为HPP患者PDLSCs包裹牙本质片显微检测结果；图14C为后正常PDLSCs形成牙周纤维的能力显微检测图；图14D为HPP患者PDLSCs形成牙周纤维的能力显微检测图。
图15A为正常BMMSCs细胞培养倒置显微镜图；图15B为低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs细胞培养倒置显微镜图；
图16A为流式细胞术检测正常对照患者BMMSCs周期；图16B为流式细胞术检测低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs周期。可以看出，低碱性磷酸酯酶患者PDLSCs增殖能力显著低于正常对照，表现为细胞周期S期下降。
图17A、图17B和图18为正常对照及低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs克隆形成率(CFU-F)比较对照图，可以看出，低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs CFU-F低于正常对照。
图19A为使用MTT法检测正常对照BMMSCs增殖情况结果统计图，图19B为使用MTT法检测低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs增殖情况结果统计图，可以看出，低碱性磷酸酯酶患者BMMSCs增殖能力低于正常对照。
参考图20，正常及低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者BMMSCs成骨诱导分化28天后碱性磷酸酶染色以及茜素红染色结果，显示HPP患者PDLSCs成骨分化能力显著下降。
参考图21，图21显示了正常及低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者BMMSCs成骨诱导分化28天后Westernblotting检测成骨分化相关基因ALP及Runx2的表达变化，显示HPP患者BMMSCs成骨分化相关基因表达显著下降。
参考图22A-23D，本发明实施例对调控ALPL基因对BMMSC的成骨分化能力的影响进行了分析。图22A-23D显示了正常BMMSCs转染慢病毒载体下调Alpl的表达后，成骨诱导分化14天，茜素红染色显示下调Alpl后，成骨分化能力的检测结果。其中，图22A显示了正常BMMSCs转染慢病毒载体下调Alpl的表达后，成骨诱导分化14天，茜素红染色显示下调Alpl后，成骨分化能力显著下降；图22B为对图22A的茜素红染色后的定量分析；图22C显示了qRT-PCR(实时定量PCR)检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；图22D显示了Western blotting检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化。
图23A显示了HPP患者BMMSCs转染慢病毒载体上调Alpl的表达后，成骨诱导分化14天，茜素红染色显示恢复Alpl表达后，成骨分化能力显著增强；图23B为对图23A的茜素红染色后的定量分析；图23C显示了qRT-PCR(实时定量PCR)检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；图23D显示了Western blotting检测成骨相关基因Runx2和osterix的表达变化；
综上所述，以上检测结果表明ALPL基因能够影响BMMSC的成骨分化能力。
间充质干细胞功能异常是导致低碱性磷酸酯酶症骨质疏松表型的重要原因的实验验证
构建GFP嵌合鼠模型，收集GFP+/+C57BL6，Alpl+/+以及Alpl+/-小鼠全骨髓，裂红后以1×106注射经钴60照射的Alpl+/+以及Alpl+/-小鼠(Alpl+/+小鼠替换疾病间充质干细胞，而Alpl+/-小鼠替换正常间充质干细胞)。1个月后检测治疗效果。参考图24-图32。其中，图24为小鼠骨髓替换模式图，小鼠骨髓替换具体包括：将ALPL敲除小鼠，进行总剂量8.5Gray的辐照，之后即刻注射ALPL敲除小鼠或GFP绿色荧光小鼠的全骨髓单核细胞，一个月后观察。一个月后行micro-CT检测，参考图25、图26A和图26B，结果显示替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨量显著恢复，表现为BMD(骨密度)以及BV/TV(骨体积分数)明显恢复；参考图27和图28，HE染色结果显示替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨量显著恢复，新生骨小梁增多。参考图29A-图30，钙黄绿素染色结果显示替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其新骨形成能力恢复。参考31A-图32，骨髓腔油红O染色结果表明，替换正常GFP小鼠骨髓的ALPL敲除小鼠其骨髓腔脂滴含量显著下降。
综上所述，Micro-CT显示，骨髓替换后，Alpl+/-小鼠骨量明显恢复；HE染色显示股骨骨小梁数量增多；钙黄绿素显示骨量的恢复主要是骨形成能力增强；冰冻切片油红染色表明骨髓腔脂滴数量明显下降。
基因可作为上游基因，通过去磷酸化PPi影响Wnt家族蛋白的分泌，从而抑制经典Wnt/β-catenin的激活，影响间充质干细胞的成骨分化能力的实验验证
①通过基因芯片分析，我们发现Wnt/β-catenin相关基因LRP5、MFRP、CTNNBL1、DKK3、WNT10B、WNT3、WNT2B、WNT5A、WNT8B、WNT6、WNT4、WNT6、WNT11及DKK2等，在低碱性磷酸酯酶症患者骨髓间充质干细胞中均下降。因此，我们认为低碱性磷酸酯酶症患者骨髓间充质干细胞在骨向诱导分化过程中经典Wnt/β-catenin受到抑制。然而，研究中我们发现ALPL基因突变后β-catenin入核能力明显受到抑制，致使骨向分化潜能减弱。同样，下调ALPL基因表达能够显著抑制β-catenin激活从而抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。相反，过表达ALPL基因明显上调β-catenin，Wnt/β-catenin信号通路激活，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。进一步研究其机制发现，低碱性磷酸酯酶症患者骨髓间充质干细胞胞外PPi堆积明显，由于ALPL突变，使得TNSALP表达下降，PPi去磷酸化减少，浓度显著高于患者，而过高的PPi抑制Wnt家族蛋白的分泌，尤其是Wnt3a及Wnt5a表达量明显减少，不能激活Wnt/β-catenin信号通路，从而影响间充质干细胞的骨向分化能力。以上揭示经典Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化；ALPL基因突变通过水解PPi影响经典Wnt/β-catenin通路的激活。本部分结果证明了ALPL基因可以作为上游基因参与信号通路的调控，全新定义了ALPL基因的功能。以上结果可参考图33-42，其中，图34-图35B显示低碱性磷酸酯酶症患者BMMSC成骨诱导过程β-catenin入核明显减少。图36-图37显示沉默ALPL基因抑制β-catenin活化；图38-图39显示患者BMMSC中上调ALPL基因激活β-catenin；图40-图42显示了ALPL基因去磷酸化胞外PPi调控经典Wnt通路的激活；
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.ALPL基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为重组载体，所述的重组载体包含所述ALPL基因和表达载体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为转基因细胞，所述转基因细胞包含权利要求1所述的ALPL基因。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转基因细胞为原核细胞或真核细胞。
5.权利要求1中所述的ALPL基因、权利要求2中所述的重组载体、权利要求3或4中所述的转基因细胞在制备碱性磷酸酶中的应用。
6.一种碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：在ALPL基因能够表达的条件下，培养权利要求3或4所述的转基因细胞，以使其表达碱性磷酸酶。
7.权利要求1中所述的ALPL基因、权利要求2中所述的重组载体、权利要求3或4中所述的转基因细胞或权利要求6所述的制备方法在制备用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的药物为增加碱性磷酸酶表达的药物、增加干细胞成骨分化能力的药物或改善牙硬组织矿化异常的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含ALPL基因或ALPL基因的表达蛋白。
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