CN108660112A - 一种骨髓间充质干细胞及转基因小鼠的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供一种骨髓间充质干细胞及转基因小鼠的培养方法，涉及转基因克隆动物技术领域，能够提供一种模拟低碱性磷酸酯酶症表型的骨髓间充质干细胞，并以该细胞作为研究对象，为低碱性磷酸酯酶症的治疗奠定坚实的基础。所述骨髓间充质干细胞用于模拟低碱性磷酸酯酶症表型，所述骨髓间充质干细胞包括重组的肝/骨/肾型碱性磷酸酶ALPL基因。

Description

一种骨髓间充质干细胞及转基因小鼠的培养方法
技术领域
本发明涉及转基因克隆动物技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞及转基因小鼠的培养方法。
背景技术
低碱性磷酸酯酶症（Hypophosphatasia，HPP）是一种罕见的常染色体遗传性全身系统疾病，由肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（alkaline phosphatase, liver/bone/kidney,ALPL）突变导致，其特征为先天性骨代谢异常，并引起骨骼和牙齿的矿化不全，血清及骨组织中碱性磷酸酶活性降低。当ALPL基因发生突变时，其编码蛋白非组织特异性碱性磷酸酶（tissue -nonspecific alkaline phosphatase , TNAP）的功能就会受到影响，HPP根据TNAP蛋白功能影响的程度分为轻度与重度。据统计重症 HPP发病率在十万分之一左右，而轻型发病率相对较高，可达0.1%，其临床表现有很大的变异性，有的仅表现为年轻恒上前牙过早脱落，有的会出现严重的全身性骨骼形成不良，甚至导致新生儿死亡。该病目前尚无可靠的治疗方法。
随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，由RNA介导的基因组编辑技术 CRISPR/Cas9被广泛应用于转基因小鼠的制作中。引起HPP的致病基因ALPL基因位于1号染色体 1p36.1 ，小鼠Alpl基因在4号染色体反链上，全长54.7kb。且该基因在骨髓间充质干细胞中大量表达。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多能干细胞，在骨形成和骨组织再生过程中发挥重要作用。临床上利用骨髓移植或BMSCs移植可以有效缓解或改善骨质疏松症状，同样临床上也利用BMSCs移植治疗HPP患者，经多次细胞治疗改善骨矿化不足的症状。说明以骨髓间充质干细胞为切入点可能成为研究低碱性磷酸酯酶症发病机制和筛选药物治疗方面的新策略。然而，骨髓间充质干细胞来源困难，并存在一定的安全性及伦理问题。所以，构建一种可以模拟HPP症状的骨髓间充质干细胞模型为研究该病的发病机理及治疗提供指导。
发明内容
本发明实施例提供了一种骨髓间充质干细胞及转基因小鼠的培养方法，能够提供一种模拟低碱性磷酸酯酶症表型的骨髓间充质干细胞，并以该细胞作为研究对象，为低碱性磷酸酯酶症的治疗奠定坚实的基础。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种骨髓间充质干细胞，所述骨髓间充质干细胞用于模拟低碱性磷酸酯酶症表型，所述骨髓间充质干细胞包括重组的肝/骨/肾型碱性磷酸酶ALPL基因。
所述重组ALPL基因，在ALP基因的intron2-3和intron4-5中插入Loxp位点，构成ALPL基因的打靶载体。
进一步地，所述ALPL基因可被条件性敲除。
进一步地，所述ALPL基因exon3和exon4可被条件性敲除。
进一步地，所述ALPL基因5’端和3’端loxP位点分别插入在intron2-3和intron4-5中，构建打靶载体。
进一步地，所述骨髓间充质干细胞的来源为条件性敲除所述ALPL基因的转基因小鼠Prrx1CreALPL-/-。
进一步地，所述骨髓间充质干细胞用于研究低碱性磷酸酯酶症的模型细胞。
本发明实施例还提供一种转基因小鼠的培养方法，所述转基因小鼠的培养方法包括：
将Cas9/sgRNA与ALPL基因打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过胚胎移植的方法获得重组ALPL基因的转基因小鼠ALPLfl/+。
进一步地，所述方法还包括：
所述转基因小鼠为F1代fl杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠（prrx1-cre）交配获得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明构建了ALPL基因打靶载体，通过在ALPL基因的intron2-3和intron4-5中插入Loxp位点，使ALPL基因的exon3和exon4可被条件性敲除。
2、本发明通过最新的CRISPR/Cas9技术实现目的基因ALPL基因的条件性敲除。
3、本发明通过ALPL基因条件性敲除的转基因小鼠ALPLfl/+与组织特异性的Cre小鼠（prrx1-cre）交配获得ALPL基因骨髓间充质干细胞条件性敲除的小鼠Prrx1CreALPL-/-。
4．本发明通过分离Prrx1CreALPL-/-小鼠的骨髓间充质干细胞，获得的目的细胞，经过体外培养，发现该细胞可以模拟HPP患者骨髓间充质干细胞的生物学行为，即成骨分化能力降低，成脂分化能力升高。
附图说明
图1为ALPL基因在4号染色体反链的示意图；
图2为ALPL基因8个转录本的示意图；
图3为ALPL基因的结构域的示意图；
图4为ALPL基因的调控区的示意图；
图5为本发明提供的打靶载体示意图；
图6为本发明提供的Southern blot筛选策略的示意图；
图7为利用外源序列上的AseI和SspI作为Southern blot酶切位点的示意图；
图8为PCR引物的示意图；
图9为靶位点区域共设计的14条sgRNA的示意图；
图10为precut pCS质粒图谱；
图11为sgRNA的活性检测的检测结果；
图12为RNA 电泳图的示意图；
图13为打靶载体的构建示意图；
图14为打靶载图谱；
图15为注射后F0小鼠出生情况的示意图；
图16为引物设计原则示意图一；
图17为引物信息示意图一；
图18为引物设计原则示意图二；
图19为引物信息示意图二；
图20为PCR条件(Touchdown)示意图；
图21为Primers: ALPL -5’loxP-F/5’loxP-R鉴定结果；
图22为Primers: ALPL -3’loxP-F/3’loxP-R鉴定结果；
图23为Primers: ALPL-L-GT-F3/ L-GT-R3鉴定结果；
图24为Primers: ALPL-R-GT-F3/ R-GT-R3鉴定结果；
图25为F0代阳性小鼠EZ38-2与野生型小鼠交配得到F1代的交配结果示意图；
图26为引物设计原则示意图三；
图27为引物信息示意图三；
图28为Primers: ALPL -5’loxP-F/5’loxP-R鉴定结果；
图29为Primers: ALPL -3’loxP-F/3’loxP-R鉴定结果；
图30为Primers:EGE-ALPL-L-GT-F2/CKO-3’-DO-R;
CKO-5’-DO-F/EGE-ALPL-R-GT-R2鉴定结果；
图31为F1代阳性小鼠Southern blot检测的检测结果；
图32为fl杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配的交配方案示意图；
图33为图32中的交配方案的第一步示意图；
图34为基因型检测策略一；
图35为基因型检测策略二；
图36为图32中的交配方案的第二步示意图；
图37为基因型检测策略三；
图38为fl杂合子小鼠与Cre-deleter小鼠交配的交配方案示意图；
图39为图38中的交配方案的第一步示意图；
图40为基因型检测策略四；
图41为图38中的交配方案的第二步示意图；
图42为基因型检测策略五；
图43为纯合子小鼠的基因型鉴定的鉴定结果；
图44为Western blot 检测的检测结果；
图45为Prrx1CreALPL-/- BMSCs成骨分化能力检测的检测结果；
图46为Prrx1CreALPL-/- BMSCs成脂分化能力检测的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1ALPL基因条件性敲除模式小鼠的设计方案
如图1所示，ALPL基因在4号染色体反链上，全长54.7kb。NCBI ID: 11647。
ALPL基因8个转录本如图2所示。本设计参照转录本001。ALPL基因的结构域如图3所示。ALPL基因的调控区如图4所示。
一、打靶策略
分析ALPL基因的结构，exon3和exon4可被条件性敲除。
sgRNAs分别设计在intron 2-3以及intron 4-5的非保守区。
其中，打靶载体示意图如图5所示。
具体的，ALPL基因条件性敲除的打靶载体主要包括以下功能元件：
5’端和3’端loxP位点分别插入在intron2-3和intron4-5中；
5’端和3’端的同源臂分别为1.7kb和1.9kb。
二、Southern blot筛选策略
为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，我们采用PCR和Southern blot方法验证，并同时利用5’ Probe和A’ Probe验证F1代阳性小鼠。Southern blot筛选策略的示意图如图6所示。
从图7可见，利用外源序列上的AseI和SspI作为Southern blot酶切位点，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。
实施例2ALPL基因条件性敲除小鼠的制备
一、靶序列的测序确认
不同品系，基因序列可能有所差异。为了保证所设计CRISPR/sgRNA的效率，首先需要对B6鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与构建品系小鼠DNA序列完全一致。其中，PCR引物如图8所示。
可见，对B6鼠尾DNA进行PCR扩增并测序，结果表明：B6鼠尾靶序列与Genebank和Ensembl所给序列一致。
二、CRISPR/sgRNA设计及构建
sgRNA的设计
基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域共设计的14条sgRNA如图9所示。
Cas9/sgRNA质粒的构建
按照已设计sgRNA序列合成oligos，通过退火聚合的方式连入pCS载体，连接产物转化后送样测序验证正确。precut pCS质粒图谱如图10所示。
三、sgRNA的活性检测
sgRNA的活性检测，我们采用一种自主研发的CRISPR/Cas9活性检测方法-UCATM方式进行。其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点。综合选择ALPL–sgRNA5和ALPL–sgRNA10进行下一步实验，检测结果如图11所示。
四、sgRNA的RNA制备
将ALPL -sgRNA1和ALPL -sgRNA8连入带T7启动子质粒载体上并进行体外转录，得到进行显微注射的RNA。RNA 电泳图如图12所示。
五、打靶载体的构建
如图13所示，根据打靶方案，设计引物构建打靶载体，并通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。其中，打靶载图谱如图14所示。
六、受精卵显微注射
Cas9/sgRNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后F0小鼠出生情况如图15所示。
七、F0代小鼠基因型鉴定
本课题使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法制备条件性敲除小鼠。由于受精卵注射方法得到F0小鼠可能为嵌合体/杂合/纯合，以F0小鼠鼠尾进行基因型鉴定得到的F0 基因型仅供参考，不代表其基因突变型具有生殖系遗传，可遗传的基因型需F1代小鼠检测确定。
基因型检测的引物设计
引物设计原则如图16所示（用于检测片段插入）。引物信息如图17所示。
引物设计原则如图18所示（用于检测是否正确重组）。引物信息如图19所示。
PCR条件(Touchdown) 如图20所示。
F0代基因型鉴定结果
对ALPL基因条件性敲除小鼠进行PCR鉴定及测序检测，以下为F0代基因型检测结果：
Primers: ALPL -5’loxP-F/5’loxP-R鉴定结果如图21所示。
Primers: ALPL -3’loxP-F/3’loxP-R鉴定结果如图22所示。
Primers: ALPL-L-GT-F3/ L-GT-R3鉴定结果如图23所示。
Primers: ALPL-R-GT-F3/ R-GT-R3鉴定结果如图24所示。
结论：通过PCR扩增及产物测序，表明EZ38-2为F0阳性鼠。
八、F1代小鼠基因型及southern blot鉴定
F0代阳性小鼠EZ38-2与野生型小鼠交配得到F1代。交配结果如图25所示。
基因型检测的引物设计
引物设计原则（用于检测片段插入同F0），引物设计原则如图26所示（用于检测是否正确重组），引物信息如图27所示。
F0代基因型鉴定结果
Primers: ALPL -5’loxP-F/5’loxP-R鉴定结果如图28所示。
Primers: ALPL -3’loxP-F/3’loxP-R鉴定结果如图29所示。
Primers:EGE-ALPL-L-GT-F2/CKO-3’-DO-R; CKO-5’-DO-F/EGE-ALPL-R-GT-R2鉴定结果如图30所示。
结论：通过PCR及测序，表明1EZ38-1, 1EZ38-2, 1EZ38-3, 1EZ38-4, 1EZ38-5,1EZ38-6,1EZ38-7, 1EE38-8, 1EE38-9和1EE38-10为阳性小鼠。
F1代阳性小鼠Southern blot检测
经过基因型鉴定，提取小鼠鼠尾DNA进行Southern blot检测，检测结果表明：1EZ38-1，1EZ38-2，1EZ38-3，1EZ38-6，1EZ38-7和1EE38-8，6只F1两端均为正确重组，且没有随机插入。检测结果如图31所示。
实施例3条件性敲除模式小鼠的交配方案
一、获得条件性基因敲除小鼠
获得条件性基因敲除小鼠，fl杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，实现目的基因组织特异性的敲除。交配方案如图32所示。
第一步（如图33所示）：与组织特异性Cre小鼠（ts-Cre），本专利中所述为prrx1-cre交配，获得fl杂合子小鼠。基因型检测策略如图34和图35所示。
此步只能获得杂合子小鼠（fl/+, Cre/+），纯合子小鼠（实验用小鼠）需要进行进一步地交配获得；基因型为+/+, Cre/+、fl/+, +/+、+/+, +/+的小鼠，均可用做对照。
第二步：获得fl纯合子小鼠。
如图36所示，获得的杂合子小鼠（fl/+, Cre/+），相互交配，得到纯合子小鼠（fl/fl, Cre/+）。基因型检测策略如图37所示。
可见，fl/fl, Cre/+小鼠属于实验组，其它小鼠为对照组。最好的对照组是+/+,Cre/+小鼠。
二、获得全基因敲除的小鼠
获得全基因敲除小鼠，fl杂合子小鼠与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲小鼠。交配方案如图38所示。
第一步（如图39所示）：与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲除杂合子小鼠。
得到的F1代杂合子小鼠或者纯合子，与Cre-deleter小鼠交配，以去除exon4。所用的Cre-deleter小鼠可以是纯合子，也可以是杂合子。基因型检测策略如图40所示。
此步只能获得杂合子小鼠（Δ/+,Cre/+），实验用纯合子小鼠需要进行进一步地交配获得；基因型为+/+,Cre/+的小鼠可以用做对照。
第二步（如图41所示）：获得全基因敲除纯合子小鼠。基因型检测策略如图42所示。其中，Δ / Δ小鼠属于实验组，Δ / +小鼠和 + / +小鼠为对照组。
第三步：纯合子小鼠的基因型鉴定
根据小鼠标记示意图，剪小鼠趾头，提取DNA,。利用fl小鼠鉴定引物：ALPL-5′loxp-F:ACACCATGGATGGCTTGTGCTTACT和
ALPL-5′loxp-R: GAAGCTGGAATCTGACACTGGGTGG 以及prrx1-cre小鼠鉴定引物：
Prrx1iCre primer 1: AGCGTTTGGTGTTGATTCGAGC;
Prrx1iCre primer 2: AGTCCCGGTGACTCCAGCAG;
Prrx1iCre primer 3: TGGTGCACAGTCAGCAGGTTG, 分别进行PCR扩增。部分结果见图43。
实施例4条件性敲除ALPL基因的骨髓间充质干细胞的分离及鉴定
一、小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养
取Prrx1CreALPL-/-小鼠作为实验组，WT小鼠作为对照组。不同组小鼠采用颈部脱臼法处死，置于75%酒精浸泡消毒10min后，立即取出动物放于垫有冰袋的培养皿中。在超净工作台内尽快取出股骨、胫骨及肱骨，将其放入预冷PBS中去净粘附于股骨、胫骨及肱骨的软组织和筋膜，切除骨的两末端以暴露骨髓腔，然后用1ml注射器和α-MEM培养基(20%FBS，50μg/mL抗坏血酸，100mg/l链霉素，100µ/ml青霉素，2mmol/l谷胺酰胺)反复冲洗骨髓腔直至骨髓腔发白。将收集的骨髓轻轻吹打制成骨髓单细胞悬液以1×105cells/cm2密度接种于9cm一次性培养皿中，加入8-10ml α-MEM培养基，培养在37℃，5%CO2，95%空气孵箱，第3天首次半量换液弃去未贴壁细胞，继续培养贴壁细胞(之后每3天更换1次培养液)，待第10-12天细胞融合生长达85-95%后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。以2×106密度接种至75cm2玻璃培养瓶中继续培养形成较大的多个克隆后，再次消化制备成数个单克隆来源的细胞悬液，培养扩增。以多克隆来源的细胞第2-3代用于本实验。
二、mBMMSCs组织形态学观察
使用倒置相差显微镜观察细胞生长状态和细胞形态变化。
三、Western Blot检测条件性敲除BMSC中ALPL基因的表达
A、蛋白样品准备
1) 将Prrx1CreALPL-/-的BMMSCs与WT的BMMSCs用PBS清洗两遍，根据碧云天Western和IP细胞裂解试剂盒说明，将Western和IP细胞裂解溶液混匀，使用前数分钟将PMSF加入到适量裂解液中，使PMSF的最终浓度为1mM，然后加入六孔板中，冰上静置30min。
2) 在冰上用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞，转移到1.5ml EP管中。
3) 超声震荡裂解15s，共三次，使蛋白充分裂解。
5) 4℃离心15min(12000 rpm/min)，取上清于新的EP管中进行后续实验。
B、蛋白浓度测定及蛋白样品准备
严格按照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)操作方法检测制备的蛋白样品浓度。
1) 用0.9%NaCl与蛋白标准品配制成终浓度为0.5mg/ml的蛋白标准品。
2) 根据样品数量计数所需的BCA工作液，并按照试剂A试剂B=50:1配制工作液，充分混匀。
3) 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准孔中，然后加0.9%NaCl补足20µl。
4) 加2µl样品到96 孔板的样品孔中，然后加0.9%NaCl补足20µl，各孔加入200µlBCA工作液。
5) 在波长562 nm下测定各孔的OD值。
6) 绘制蛋白标准曲线，根据标准曲线计数样品蛋白含量。
7) 将定量好的蛋白样与5×loading buffer混匀配置成1:4的终浓度，用PBS补齐液体，置于-20℃备用。
C、Western blot 检测
配制10%的分离胶及5%的浓缩胶，点样，跑电泳，电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜上，将膜浸在含5%BSA的封闭液中，室温，摇床上封闭2h。将ALPL抗体按1:500稀释后，4℃过夜。将一抗孵育过的膜置于摇床上TBST洗膜10min×3次后，将膜置于1:4000稀释的二抗中，摇床上孵育1h。将二抗孵育过的膜置于摇床上TBST洗膜10min×3次后，按说明书配置DAB显色液1mL，凝胶成像仪成像。用GAPDH作为参照验证蛋白的含量。结果显示，在WT小鼠BMSC中有ALPL蛋白的表达，而Prrx1CreALPL-/-小鼠的BMSC中则未检测到其表达，说明成功实现了骨髓间充质干细胞的ALPL基因条件性敲除。结果见图44。
D、Prrx1CreALPL-/- BMSCs成骨分化能力检测
取对数生长期第2代Prrx1CreALPL-/-小鼠BMSCs和WT小鼠BMSCs，消化后，接种于6孔培养板内培养，每孔接种4×105个细胞，待细胞生长达到80-90％融合时，更换成骨诱导培养基（其内含10％FBS的α-MEM培养液，地塞米松10-8，抗坏血酸Vc 50μM，β-甘油磷酸钠10mM）进行成骨诱导培养14天，茜素红染色，同时收集细胞进行成骨相关蛋白RUNX2和OCN的Westernblot分析。结果表明，敲除ALPL基因后，BMSC的成骨能力降低，见图45。
茜素红染色：细胞首先弃去细胞培养液用PBS冲洗3遍，4％多聚甲醛溶液固定20min，之后后PBS冲洗3遍洗去固定液，每孔加入约1-2ml茜素红染色染15-20min，弃茜素红，PBS冲洗两遍，相差显微镜下拍照。
E、Prrx1CreALPL-/- BMSCs成脂分化能力检测
取对数生长期第2代Prrx1CreALPL-/-小鼠BMSCs和WT小鼠BMSCs，消化后，接种于6孔培养板内培养，每孔接种4×105个细胞，待细胞生长达到80-90％融合时，更换含10％FBS成脂诱导培养液（内含地塞米松1μM，吲哚美辛200μM，IBMX0.5mM，胰岛素10μM），每3天换液，相差显微镜下逐日观察细胞形态。培养第3-5天细胞浆中开始出现圆形透明脂滴，7天后进行油红染色并收集样品进行成脂肪分化相关蛋白PPAR-γ和LPL的western blot检测。染色时，弃去细胞培养液，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛溶液室温固定20min，加入油红O染色剂，染色30min。弃去油红O染料，PBS冲洗3遍，相差显微镜下拍照。利用异丙醇充分溶解后，分光光度计于520-540nm波长处测量吸光度进行定量。
油红O原染液配制：称取1g油红O溶解于100ml异丙醇，搅拌均匀。
油红O工作染液配制：40ml去离子水中加入60ml油红O原液，混匀过滤。结果表明，敲除ALPL基因后，BMSC的成脂分化能力增强见图46。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞用于模拟低碱性磷酸酯酶症表型，所述骨髓间充质干细胞包括重组的肝/骨/肾型碱性磷酸酶ALPL基因。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述ALPL基因可被条件性敲除。
3.根据权利要求2所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述ALPL基因exon3和exon4可被条件性敲除。
4.根据权利要求3所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述ALPL基因5’端和3’端loxP位点分别插入在intron2-3和intron4-5中，构建打靶载体。
5.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的来源为条件性敲除所述ALPL基因的转基因小鼠Prrx1CreALPL-/-。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞用于研究低碱性磷酸酯酶症的模型细胞。
7.一种转基因小鼠的培养方法，其特征在于，所述转基因小鼠的培养方法包括：
将Cas9/sgRNA与ALPL基因打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过胚胎移植的方法获得重组ALPL基因的转基因小鼠ALPLfl/+。
8.根据权利要求7所述的转基因小鼠的培养方法，其特征在于，所述方法还包括：
所述转基因小鼠为F1代fl杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠（prrx1-cre）交配获得。
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