CN102041316A - miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术和医学领域，涉及一种人脑胶质瘤新的标志物miR-219的用途。首次证实了miR-219在人脑胶质瘤组织和细胞中表达均显著下调，并证实miR-219在胚胎早期神经管发育和脑胶质瘤发生中能直接调控Hh-Gli2和Pdgfra信号通路，且能显著抑制人脑胶质瘤细胞的增殖和浸润。进一步对不同级别的脑胶质瘤临床标本进行定量分析表明miR-219能作为脑胶质瘤检测的标志物。

Description

miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种RNA小分子的用途，尤其是涉及miRNA-219的用途，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

最近的研究表明，miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，其突变或者异位表达与人类癌症密切相关。脑胶质瘤是成年人最为频发的脑恶性肿瘤。研究报道显示，脑胶质瘤中一些miRNAs（如miR-21, miR-10b, miR-221/222, miR-26a, miR-124, miR-128和miR-34a）发生失调会影响肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润、转移和血管新生。寻找miRNA靶基因，揭示其作用机制，不仅是后基因组时代需要解决的问题之一，也有望为肿瘤和其它疾病的诊断和治疗提供新的策略。

miRNAs在脑中的表达极为丰富，但对其功能的诠释仍处于起步阶段。Miska等利用Northern 印迹方法对在特定组织器官表达的miRNA进行了研究时发现7个miRNA在人脑中特异表达，这些miRNA是miRNA-9，-124a，-124b，-135，-153，-183和-219。已有的研究表明，miRNA在神经系统发育过程中起着极其重要的作用，如miRNA-219能调控少突胶质细胞的发育，miRNA-134可以调控大鼠神经元树突棘的大小。当神经细胞在miRNA-134的存在的情况下，树突数量会减少，从而减弱突出的形成；当miRNA-134被抑制后，树突数量就会增加，突触连接也因此增强。进一步的研究表明，miRNA-134对神经元树突形成影响的可能机制是其能抑制Limk1基因的表达。由于Limk1基因缺失与威廉综合征相关，因此推测miRNA-134可能与一些神经疾病如弱智和自闭症相关。Krichevsky等的研究发现miRNA-9和miRNA-131在PS-1敲除小鼠E17.5显著下调，因此推断它们在神经退行性疾病中发挥调控作用。

关于miRNA-219作为脑胶质瘤一种抑癌基因的用途和作为脑胶质瘤诊断的一种标志物的用途目前未见文献报道。

发明内容

本发明旨在提供miRNA-219作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。

本发明旨在提供miRNA-219作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。

首先采用整胚原位杂交检测了miR-219在斑马鱼胚胎8hpf到72hpf时空表达模式，观察到在16hpf已经在后脑明显表达（图1A）。新近研究表明，miR-219在小鼠对少突胶质前体细胞具有调控作用。因此，设想miR-219可能在斑马鱼神经管发育过程中也发挥重要作用。采用反义抑制技术和过表达技术（图1B和C）研究了miR-219在斑马鱼胚胎发育过程中所起到的作用。采用TUNEL法我们发现过表达miR-219会引起斑马鱼胚胎头部细胞凋亡现象（图2A）。 B）pH3染色观察抑制miR-219表达则引起斑马鱼胚胎头部细胞的增生（图2B）。对miR-219、NtlA和Shha整胚原位杂交的组织学分析表明，miR-219在神经管中特异表达（图2C）。综合这些实验现象，采用本研究室发展的斑马鱼miRNA靶标预测软件ZfinTar对miR-219靶标进行预测，发现Gli2a 的3‘UTR区和Pdgfra的CDS区含有miR-219 结合位点（图3A）。进一步我们克隆了含有miR-219 结合位点的基因序列进行斑马鱼的体内3’UTR报告基因实验。结果显示miR-219能结合在Gli2a 的3‘UTR区和Pdgfra的CDS区，而不能结合它们的突变体序列上。因此推测Gli2a和Pdgfra可能是miR-219的直接靶标（图3B）。

已有研究表明，Gli2和Pdgfra不仅在胚胎发育过程中对少突胶质前体细胞具有调控作用，而且在脑肿瘤的发生中起着重要作用。因此在上述工作的基础上，采用猜想miR-219可能在脑胶质瘤发生过程中调控Gli2和Pdgfra，充当抑癌基因角色。为此，采集了脑胶质瘤临床样本对其miRNA进行Deep-sequencing分析。结果发现miR-219在脑胶质瘤组织样品中显著下调（图4A）。为了证实这个的发现，用RNA印迹杂交技术分析了脑胶质瘤临床样本和6个脑胶质瘤细胞系（SW1783，U138, U251, U87, U373，TJ905）及1个神经母细胞瘤细胞系（SK-N-SH），发现miR-219在所有组织样品和脑胶质瘤细胞系中均显著下调 （图4B）。进一步的分析表明，过表达miR-219可显著抑制脑胶质瘤细胞的侵袭作用（图4C）和引起脑胶质瘤细胞凋亡（图4D）。蛋白免疫印迹分析Caspase-3的表达情况进一步证实miR-219在脑胶质瘤细胞中过表达会介导Caspase-3(C3)的激活（图4E）。随后，通过MiRanda v1.0b（Enright et al.2003）预测软件针对miR-219可能作用靶基因的3’UTR和CDS区域进行搜索，发现人类Gli2和Pdgfra的CDS序列中含有miR-219的保守作用位点。荧光素酶报告试验证实mir-219能能分别结合在Gli2和Pdgfra的CDS区，显著抑制Gli2和Pdgfra质粒的荧光表达（图5A）。蛋白免疫印迹实验表明，在U87和U251细胞系中过表达miR-219可显著抑制Gli2和Pdgfra蛋白的生成（图5B）。这些研究结果均提示miR-219在脑胶质瘤发生过程中可能通过抑制Gli2和Pdgfra的生成而发挥抑癌基因的作用。

最后，本发明探讨了miRNA-219在脑胶质瘤早期诊断中的意义。对miR-219在人脑胶质瘤组织样品进行了定量检测。人脑胶质瘤组织样品包括正常组8例，II期7例，III期7例，IV期8例。研究证实miRNA-219在脑胶质瘤发展的不同临床时期的表达水平均显著下调（图6A）。蛋白免疫印迹实验分析表明Pdgfra、 Gli2、ERK1/2和pErk1/2在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达均显著上调（图6B）, 进一步证实了Pdgfra和Gli2同miR-219的相互关系。

本发明首次发现miR-219在脑胶质瘤和神经管发育过程中均能调控Hh-Gli信号传导通路。作为肿瘤抑制基因，miR-219能显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖和浸润。对脑胶质瘤临床标本进行定量发现，miR-219在脑胶质瘤各时期的表达均显著下调。研究结果表明，通过检定或干涉人脑胶质瘤中miR-219的表达可为脑胶质瘤提供新的诊断或治疗方案。

附图说明

图1. miR-219时空表达模式。

A） 整胚原位杂交检测斑马鱼8hpf到72hpf的mir-219的表达，紫色区域（BM Purple显色）表明miR-219的表达部位，在16hpf已经在后脑明显表达。

B）整胚原位杂交检测注射MO219的胚胎在30hpf时miR219的表达情况。

C）Northern Blotting 检测注射Pre-mir-219和MO219的胚胎在30hpf时miR219的表达情况.

图2. miR-219在斑马鱼中的靶标预测。

A）TUNEL法检测整胚细胞凋亡情况。 

B）pH3染色观察MO-219注射后细胞的增生情况。

C）miR-219、NtlA和Shha整胚原位杂交的组织学分析。结果表明miR-219在神经管中特异表达。这提示miR-219可能参与了少突胶质细胞前体的调控。

D）本研究室发展的斑马鱼miRNA靶标预测软件ZfinTar工作流程。

图3. miR-219靶向作用Gli2a and Pdgfra。

A）采用本研究室发展的ZfinTar软件预测miR-219 的靶标。结果表明Gli2a 的3‘UTR区和Pdgfra的CDS区含有miR-219 结合位点。

B）斑马鱼的体内3’UTR报告基因实验。结果提示miR-219能显著抑制Gli2a and Pdgfra的翻译过程。

图4. miR-219在脑胶质瘤中充当抑癌基因角色。

A）Deep-sequencing 检测miR-219在脑胶质瘤中的表达。

B）RNA印迹杂交分析miR-29a在脑胶质瘤中的表达。miR-29a在正常人脑组织中高表达而在脑胶质瘤tissue及细胞系中低表达。

C）脑胶质瘤细胞系U87和U251转染miR-29a后侵袭实验分析（×200）。

D）Annexin V细胞染色标定检测凋亡。图示右下峰为早期凋亡的细胞，而右上峰则为晚期凋亡的细胞。在U87和U251细胞系中，miR-29a可以促进细胞的凋亡。

E） 蛋白免疫印迹分析Caspase-3的表达情况。miR-29a在U87细胞系中过表达会介导Caspase-3(C3)的激活。Bet-actin （bA）作为内参照。

图5. miR-219靶向作用于Gli2和Pdgfra 。

A）mir-219在U87细胞中的过表达可显著抑制Gli2和Pdgfra报告质粒的荧光表达。（n=3;*p < 0.05）。下图示miR-219对Gli2和Pdgfra的预测位点及其在不同物种中的保守情况。首先通过MiRanda v1.0b（Enright et al.2003）预测软件针对miR-29a可能作用靶基因的3’UTR和CDS区域进行搜索，然后在UCSC的基因组窗口浏览器中分析预测位点的保守型情况（NCBI36/hg18,http://genome.ucsc.edu/,红色框标示相应预测位点）。

B）蛋白免疫印迹技术检测Gli2和Pdgfra在U87和U251细胞系中的表达。 Gli2和Pdgfra均呈显著下调。

图6，mir-219在人脑胶质瘤中的表达同恶性程度负相关。

A）实时定量PCR分析mir-29a/b在脑胶质瘤组织中的表达。正常组织来源于无病个体（n=8）；II期（n=7）；III期（n=7）；IV期（n=8）。U6 rRNA作为对照。C1和C2分别为淋巴瘤和肺癌脑转移癌症样品。

B）和C）分别为蛋白免疫印迹实验分析Pdgfra、 Gli2、ERK1/2和pErk1/2在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达情况。结果表明 Pdgfra、Gli2、ERK1/2和pErk1/2在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达均显著上调。N:正常人脑组织；C1-6: U138, U351, U87, U373, TJ905和SK-N-SH。Beta-actin作为对照。 Mann-Whitney检验被用来比较肿瘤组织及肿瘤细胞与正常组织的差异。散点图标示miR-29a在三个不同组的表达，横线标示中值。数据分析使用GraphPad prism5软件，p<0.05具有统计显著性。

具体实施方式

1. 实验动物

    实验用斑马鱼均为Tübingen品系，购自上海第二医科大学医学基因组国家重点实验室。繁殖饲养与交配取卵参照斑马鱼手册中的方法进行，水温为28.5℃，明/暗光照周期为14h/10h，胚胎培养液为Holtfreter buffer，部分胚胎用0.003%的PTU处理来阻止色素形成。

2. 反义抑制技术和过表达技术

    为了获得miRNA功能研究中的Loss of Function表型，我们利用morpholinos寡核苷酸的反义抑制技术。系列MO、标准阴性对照morpholino（MO-NC）和p53的MO均购自Gene Tools公司，每个包装为300nmol。 除MO-219之外设miR-34a、miR-9*、miR-146b、miR-181a、miR-92b、miR-125b、miR-129、miR-130a、miR-139、 miR-148、miR-153a、miR-183和 miR-210 作为平行对照。为了获得miRNA功能研究中的Gain of Function表型，我们利用miRNA前体分子的。化学合成miRNA前体分子和标准前体对照（Pre-miR-NC）购自Ambion公司（Pre-miR?? miRNA Precursor Molecule系列产品），除Pre-miR-219之外，设置Pre-miR-let7b作为阳性对照，miR-130a、miR-148、miR-204、 miR- 146b、miR-143、miR-124 和miR-155作为平行对照。

3. 斑马鱼胚胎显微注射

显微注射设备为尼康IM-9B操作手臂和Motic体视显微镜，注射针为尼康GD-1双层毛细管拉制。注射溶液包含0.05%的酚红作为指示剂，胚胎在琼脂槽上排好角度后被注射进卵黄区, 注射体积均为每个胚胎2nl。所有显微注射用的胚胎均为1细胞受精卵阶段。所有的morpholinos被溶解在1×Danieau缓冲液 (58 mmol/L NaCl, 0.7 mmol/L KCl, 0.4 mmol/L MgSO₄, 0.6 mmol/L Ca(NO₃)₂, 5.0 mmol/L HEPES pH 7.6). 注射浓度为4.1 ng/nL (500μmol/L) ，同时设高浓度和低浓度组，分别为750μmol/L和250μmol/L。为了排除morpholinos引起的非特异现象，同时设MO和1.5倍的MO-p53联合注射。前体miRNA都溶解在DEPC-Treated水中，高中低浓度分别为5 μmol/L 、2.5 μmol/L、1 μmol/L，前体阴性对照和阳性对照（Pre-let7b）注射浓度为5 μmol/L。对于mir-219过表达表型的拯救实验，我们采用Pre-219（1μmol/L）和pCS2-ntl-cds（50ng/μL）联合注射，对于in vivo 3’UTR实验，我们注射Pre-219（2.5μmol/L）、EGFP-gli2a-UTR和EGFP-Pdgfra-CDS的capped mRNA（50ng/μL）联合注射，对于联合注射我们采用两种组分分别注射，首先注射Pre-219，然后再注射质粒或mRNA。注射后的胚胎在28.5°C 的Holtfreter溶液中培养观察，将未分裂或死亡的胚胎及时清除，MO的观察时间点为1dpf、2dpf、3dpf、4dpf和5dpf ，Pre的观察时间点为10hpf 、16hpf、24hpf 、48hpf和72hpf。胚胎麻醉后放于2%的甲基纤维素溶液内，用园头的玻璃针调整胚胎的姿势。

4. 探针制备

Ntla、Shha、Gli2a和Pdgfra的探针用10hpf胚胎的反转cDNA产物PCR得到产物，连入pSPT18载体中。探针质粒经线性化后用T7酶体外转录法进行DIG的掺入标记。产物分装于-80度保存。

5. mRNA体外转录 

pCS2-EGFP报告基因质粒线性化后，利用Ambion公司的SP6 mMessage mMachine Kit进行转录。参考MEGA Clear说明书纯化得到的mRNA产物。

6. 总RNA抽提及实时荧光定量PCR

样品按Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取1ug总RNA进行反转录，参考invitrogen的SuperScript III Reverse Transcriptase反转录试剂盒说明书进行，得到的cDNA产物稀释两倍用于RT-PCR的模板，每个PCR体系加2ul模板，参考Takara公司的SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)的说明书进行，对于引物的序列参见附录，bactin用作内参对照。仪器为Stratagene公司的Mx3000 p，PCR条件为两步法：95度10s，95度5s，60度20s，40个循环。将生成的Ct值导入定量PCR相对表达软件REST (http://www.gene-quantification.de/download.html） 来分析处理组和对照组之间的差异。

7.  RNA印迹实验

RNA样品（25μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（15%）和尿素变性凝胶电泳（8 M）。待前沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行转膜（Amersham Biosciences）。将样品转至膜上后于80℃烘干2 h，进而用互补序列的寡聚核苷酸探针进行杂化处理。该探针为5’-末端[γ-32P]ATP标记的多聚核苷酸激酶。于39℃下在ULTRAhyb??-寡聚杂化缓冲溶液（Ambion）中杂化16 h。继而在42℃下用含0.1% SDS的SSC（2X）洗涤三次。移除寡聚核苷酸后，于65℃下在1% SDS中重杂化30 min。miRNA探针的序列为:

mir-219, 5’- AGAATTGCGTTTGGACAATCA-3’和

mir-124a, 5’-TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA-3’。

参照组则用一个互补序列的U6 RNA（5’-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCAATT- TT-3’）进行杂化, 最后在成像系统（scanner Storm 860，Sunnyvale, CA）得到印迹信号。寡居核苷酸由Biaosune公司合成（上海，中国）。

8. 斑马鱼整体胚胎原位杂交（Whole Mount ISH）

斑马鱼整体胚胎复水：75%、50%、25%的甲醇/PBST室温旋转混匀各10分钟，PBST清洗：快洗一次，室温旋转混匀5分钟，快洗一次。第二次固定：4%多聚甲醛4度混匀20分钟，PBST清洗。蛋白酶K消化：24hpf 以下的不消化，24hpf的用10ug/ml, 48hpf 的用20ug/ml，72hpf以上的用100ug/ml。第三次固定：4%多聚甲醛4度混匀1小时。PBST快速洗三次后转移到24孔板内，每孔不超过10个胚胎。预杂交加入提前预热到68度的预杂交液，每孔1ml，68度孵育1h以取出非特异性。杂交加入预热的杂交液300ul，68度孵育1-4h。加入DIG标记的mRNA探针，终浓度为20-100pM，68度杂交过夜。对于miR-219的LNA探针而言，杂交温度和清洗温度均为49度。预热68度的2xSSCT 50%甲酰胺清洗两次，每次30min；2XSSCT 68度清洗15min一次；0.2xSSCT 68度清洗30min两次。用MABT洗，室温轻摇5min三次。用终止液室温轻摇1h终止反应，每孔加3ml。将DIG抗体用终止液1：10稀释成工作液，使用时500倍稀释使每孔抗体浓度为1：5000，4度孵育过夜。在终止液中室温轻摇30min，MABT室温轻摇1h，在staining buffer中轻摇5min三次，在100mM的Tris-HCL（PH 9.5）室温清洗5min。检测用Roche的BM Purple显色4度过夜。PSBT常温洗5min 两次终止显色反应。将显色完全的胚胎放置于凹玻片上，在2%的羧甲基纤维素中调整位置，用体视显微镜加环形反射光拍照。

9. 冰冻切片

选取显色完成的f的胚胎在4%的多聚甲醛再固定, 用玻璃针调胚胎整方位后再缓慢滴加熔化的琼脂蔗糖溶液, 凝固后用锋利的刀片修块，保持胚胎距边缘3-4mm左右。将包含胚胎的琼脂块放入30%的蔗糖溶液中，4度放置到胚胎完全沉底。在标本盘上涂抹一层OCT包埋剂，将琼脂块头部的方向粘在标本盘上，用镊子固定琼脂块的方向，再滴加适量OCT包埋剂。放置于冰冻切片机的速冻架上迅速冷冻10min。切片温度-20度，切片厚度25um。水溶性封片剂封片后放大200倍观察。

10. pH3免疫组化

胚胎去卵壳后4%多聚甲醛固定过夜，用甲醇/PBST梯度脱水（50%，70%，95%，100%）各5min。加入丙酮，-20度固定10min。PBST室温洗三次，每次5min。用新鲜配制的0.1%柠檬酸钠+0.1%的TritonX-100处理15min，PBST室温洗两次，每次10min，在封闭液中轻摇1h，加入pH3抗体（用封闭液按1：500稀释），4度轻摇过夜。PBST室温洗4次，每次30min。加入二抗（1：500）室温轻摇4小时，PBST室温洗4次，每次30min。用DAB显色试剂盒室温避光显色10min，PBST终止显色。

11. Whole mount TUNEL检测

对于Pre-219和前体阴性对照，选择高浓度5μmol/L注射的胚胎进行检测，对于MO-219、MO-219加p53联合注射和MO阴性对照，我们选择500 μmol/L注射的胚胎进行检测，所有胚胎的检测时间点均为1dpf。Roche试剂盒中的的TUNEL反应缓冲液（含FITC标记的dUTP）和脱氧核糖核苷酸末端转移酶在在冰上混合后加入EP管内，按照每个胚胎10ul的量添加。放于湿盒内4度孵育过夜，取出后放37度孵育30min。PBS清洗终止反应，荧光显微镜采集照片处理图象。

12. 斑马鱼3’UTR EGFP报告基因法

斑马鱼Gli2a基因3’UTR和PDGFRA基因CDS用下列引物进行PCR扩增： 

Gli2-3UTR -F: 5’- CCGGCTCGAGACCAAGTGCCTCAAGTAA -3’, 

Gli2-3UTR -R: 5’- CGGCTCGAGGAAGTCCTTTTAGTATGCG -3’, 

PDGFRA- CDS -F: 5’- GGCCTCGAGAACTATGTCTCCAAAGGAA -3’

PDGFRA- CDS -R: 5’- GCGCTCGAGCTGTAGTCTTCGTTAGA -3’。

PCR扩增产物经XhoI单酶切后连入pCS2-EGFP (中科院健康所刘廷析惠赠)，用NotI线性化后片段纯化溶于DEPC水中。然后用sp6 mMessage mMachine kit（Ambion) 在37度反应2小时，产物用MEGA Clear回收，将mRNA转录产物与Pre-219联合注射，观察24hpf的荧光表达，并收集拍照后的胚胎，进行GFP检测。miR-219突变体甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成。

13. 细胞培养

人脑胶质瘤细胞株SW1783、U138、U251、U87、U373和人源神经母细胞株SK-N-SH购自ATCC（Manassas，VA），人源胎儿肾细胞株293A购自Invitrogen（Carlsbad, CA）。SW1783、U138、U87、U373和SK-N-SH细胞培养在MEM培养基（Gibco, CA）中，U251细胞培养在RPIM 1640培养基（Gibco）中，上述培养基都含有10%的FBS（PAA Laboratories, Linz, Austria）、青霉素（100单位/mL）和链霉素（100 ng/mL）。细胞293A培养在含有10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液（Gibco）和青霉素/链霉素的DMEM培养基中。所有细胞置37℃培养箱、5%CO2，每天传代一次。

14. 细胞转染

甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成，microRNA前体购自美国Ambion公司（Ambion Pre-mir miRNA precursor CaU No.17100），转染另设正常对照组，miRNA前体组和miRNA前体通用阴性对照组。细胞于铺板18-24h后至70%-80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 (Invitrogen)。转染按本室常规方法并参照说明书进行。细胞于铺板18-24h后约有70%-80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 具体转染方法参照说明书进行，寡核苷酸及siRNA的工作浓度均为100nmol/L。

15. 体外侵润实验

用miRNA-219转染U87细胞， 24h后将细胞接种于铺有胶原膜的小室上层，下层加入含10%血清的培养基，置于培养箱培养24 h。未吸附的细胞用棉签小心移除。侵入胶原膜下表面的细胞用细胞染色剂染色，继而计数，最终用微孔板读取器于560 nm处定量测定。

16. 流式细胞分析

U87细胞和U251细胞以50%密度接种于12孔培养板中培养24 h，转染miRNA-29a前体（100 nM）36h后收集所得细胞并用70%的乙醇于4℃下固定。所得细胞用Annexin V标定再进行流式细胞分析（BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA）。

17. 蛋白印迹实验

将分别转染miR-219（100 nM）U87和U251细胞于12孔培养板中培养48 h。收集细胞，抽取蛋白液进行PAGE电泳、转膜。多克隆抗体Gli2 (CST, USA) 和 PDGFRA（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）按照使用说明书稀释并于4°C下孵育过夜。随后与AP-标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h。最后采用BCIP/NBT（Ameresco）显色并用Labworks Instrument software（UVP LLC, Upland, CA）进行定量分析。β-肌动蛋白表达水平作为内参照。

18. 细胞荧光素酶活性实验

人源Gli2基因CDS和PDGFRA基因3’UTR用下列引物进行PCR扩增： 

Gli2-CDS-F: 5’- GGTACCGAGGATGCCAGTTAGGC -3’, 

Gli2-CDS-R: 5’- TCTAGACGGGAGGAGTTCTGGGAG -3’, 

PDGFRA-3UTR-F: 5’- GAATTCGCTACTTCCCACTGTATG -3’

PDGFRA-3UTR-R: 5’- CTCGAGTTTGTATTGGTAGACCCTA -3’。

PCR扩增产物克隆到pmd-19t载体(TaKaRa)，继而克隆到pGL3-Control vector（Promega）荧光素下游。核苷酸替换突变基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit,TOYOBO)。引物为：

Mut of Gli2 CDS: 5’- GGTCATCCCGGGCTACAGTCCGCAAGGC -3’ 和 

5’- CCAAAGGCAGGCTTCTGCTGCACCACCG -3’; 

Mut  of PDGFRA 3’UTR:  5’- CTGTTAGTAAGCCGGCCTGAGAAACA -3’ 和 

5’- ATCATAAAAATAGAAAGTAGGAAAG -3’。

上述质粒载体采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)分别与miR-29a前体共转染U87细胞，48小时后按Promega提供的方法处理细胞，在多功能酶标仪（BioTek）读取荧光值。所有实验结果重复三次。

19. 脑胶质瘤临床样品采集

正常脑组织样品及脑胶质瘤组织样品从复旦大学附属华山医院取得。手术取出后，组织块以PBS或生理盐水清洗干净，迅速将组织切成小块，部分样品放入2ml冻存管中于液氮中保存备用。其他用多聚甲醛固定后用于组织切片分析。用于分子分析的样本在液氮中研磨为粉末后分别提取RNA或蛋白质。 

20. 斑马鱼miRNA靶标预测

ZFIN的的基因表达和突变表型数据库http://www.zfin.org/ 。不同物种的miR-219前体序列比对用Invitrogen的Vector NTI Advance 10.0。斑马鱼miR-219的靶基因预测采用斑马鱼miRNA靶标预测软件ZfinTar。

Claims (2)

1.miRNA-219化合物作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。

2.miRNA-219化合物作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。

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