CN104379740B - 新型fgfr3融合体 - Google Patents

新型fgfr3融合体 Download PDF

Info

Publication number
CN104379740B
CN104379740B CN201380012774.XA CN201380012774A CN104379740B CN 104379740 B CN104379740 B CN 104379740B CN 201380012774 A CN201380012774 A CN 201380012774A CN 104379740 B CN104379740 B CN 104379740B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence number
fgfr3
tacc3
polypeptide
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380012774.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104379740A (zh
Inventor
铃木淳
浅海真
角山和久
西村耕一
森中绍文
山内智弘
吉野正康
吉崎浩亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49116820&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN104379740(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN104379740A publication Critical patent/CN104379740A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104379740B publication Critical patent/CN104379740B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本发明的课题是阐明作为癌的新致病基因的多核苷酸，由此，提供该多核苷酸或其编码的多肽的检测方法、其检测用试剂盒、探针组、以及引物组。另外，还提供癌治疗用医药组合物。在所述检测方法中，检测FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的融合基因、或者其编码的融合蛋白。所述引物组、探针组或检测用试剂盒含有根据编码FGFR3的部分设计的正义引物、探针组、根据编码TACC3的部分设计的反义引物和探针组。由于所述多肽的抑制剂显示出抗肿瘤效果，因此，提供所述融合基因阳性或该多肽阳性的癌的治疗用医药组合物。

Description

新型FGFR3融合体
技术领域
本发明涉及含有FGFR3激酶区域的新型融合基因或由各融合基因所编码的融合蛋白的检测方法。另外，涉及含有抑制该融合蛋白的物质的、用于治疗该融合基因阳性或该融合蛋白阳性的癌的医药组合物。
背景技术
纤维母细胞生长因子受体3(Fibroblast Growth Factor Receptor 3；FGFR3)基因存在于第4号染色体短臂，并且编码的蛋白质为受体型酪氨酸激酶，在中央部具有细胞膜贯通区域，并且在其羧基末端侧具有酪氨酸激酶区域、在氨基末端侧具有细胞外区域。根据氨基末端侧的剪接的不同，已知有FGFR3b及FGFR3c这样的异构体，FGFR3b以FGF-1及FGF-9为配体，FGFR3c以FGF-1、-2、-4、-8、-9、-17、-18、-23为配体形成二聚物，由此，将自己的酪氨酸磷酸化而活化(非专利文献1及非专利文献2)。
已知的是，在多发性骨肉瘤中，FGFR3基因通过染色体间转座而与IgH基因融合，由于该转座所形成的蛋白质的异常而引起细胞的异常增殖，从而成为软骨发育不全症的致病基因(非专利文献3)。另外，在末梢性T细胞恶性淋巴瘤中，已知通过染色体间转座，FGFR3基因和ETV6基因融合(非专利文献4)。另外，在膀胱癌等中，已知FGFR3基因的活化点突变，并且已知若将这些活化点突变基因导入到小鼠正常细胞NIH3T3细胞中，则其转化为癌细胞样，但是已知的是野生型的FGFR3单独不会发生转化(非专利文献5)。
转化酸性卷曲螺旋含蛋白3(transforming,acidic coiled-coil containingprotein 3；TACC3)基因与FGFR3基因一样存在于第4号染色体短臂，由16个外显子构成。已知的是，所编码的蛋白质作为肌动 蛋白与有丝分裂纺锤体的稳定化有关(非专利文献6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：“细胞因子&生长因子综述(Cytokine&Growth Factor Review)，(英国)、2005年、16卷、p.139-149”
非专利文献2：“生物化学杂志(Biochemical journal)，((英国)，2011年、437卷、p.199-213)”
非专利文献3：“血液(Blood)、((美国)、2002年、100卷、p.1579-1583)”
非专利文献4：“癌症研究(Cancer Reserch)、((美国)、2001年、61卷、p.8371-8374)”
非专利文献5：“癌基因(Oncogene)、((英国)、2009年、28卷、p.4306-4316)”
非专利文献6：“细胞生物学趋势(Trends in Cell Biology)、((英国)、2008年、18卷、p.379-388)”
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于阐明作为癌的新致病基因的多核苷酸，由此提供该多核苷酸或其编码的多肽的检测方法、及其检测用试剂盒、引物组及探针组。另外，本发明的课题在于，对表达这些融合蛋白的癌症患者提供抑制本发明的多肽的药物。
解决问题的手段
本发明对由肺癌症患者及膀胱癌症患者检体所得到的激酶FGFR3的一部分与TACC3基因的一部分融合而成的新型融合基因进行分离鉴定(实施例1、2、3及23)，发现这些融合基因存在于肺癌症患者检体及膀胱癌症患者检体中(实施例4、5、6、20及23)，另外，为了表达这些融合基因而制作了逆转录酶病毒(实施例7、10及24)，发现感染细胞具有肿瘤形成能力，因此该融合基因是癌症的致病基因(实施例8、11及25)。构建了一种检测方法(实施例4、 5、6、19、20、27及28)，其中，从源自人膀胱癌症患者的细胞株或肺癌症患者检体及膀胱癌症患者检体检测该新型融合基因以及由该新型融合基因所编码的融合蛋白。另外，发现具有由该融合基因所编码的融合蛋白的抑制作用的药物抑制了感染细胞的肿瘤形成能力，因此，对于表达该融合蛋白或对其编码的融合基因的癌症患者而言(即，FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌症患者)，该融合蛋白的抑制剂是有效的(实施例9、12、13、14、16、22及30)。
迄今为止，认为野生型的FGFR3单独不会转化为癌细胞，但是令人非常惊讶的是，即便是野生型，通过与TACC3融合，也转化为癌细胞。另外，令人惊讶的是，确认到该FGFR3和TACC3的融合蛋白在FGFR3激酶的羧基末端侧融合，形成了与迄今已知的在氨基末端的融合激酶不同的结构。
本发明人根据这些见解构建了这些融合基因的检测法，提供了用于该方法的试剂盒、引物组及探针组，并通过检测这些融合基因或其所编码的融合蛋白，可以筛选成为通过融合蛋白抑制剂的药物治疗对象的癌症患者。此外，还发现该融合蛋白抑制剂(特别是化合物A～E、Dovitinib、AZD4547、BGJ398或LY2874455)抑制FGFR3和TACC3的融合蛋白的活性，并且对表达FGFR3和TACC3的融合蛋白的(即，FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的)癌(例如肺癌或膀胱癌)等有效。
即，本发明涉及以下内容。
[1]一种纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)基因和转化酸性卷曲螺旋含蛋白3(TACC3)基因的融合基因或FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，包括检测从受试者得到的试样中的、编码下述多肽的多核苷酸或该多肽的存在的步骤：
所示多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[3]根据[1]所述的方法，其中，所述多肽是含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[4]根据[1]所述的方法，其中，所述多肽是含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[5]根据[1]所述的方法，其中，所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
[6]一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有以能够特异性地扩增编码下述多肽的多核苷酸的方式设计的正义引物及反义引物：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
[7]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者，所述多肽是含有在序列号2的氨基酸编号461～947、序列 号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[8]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[9]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肽是含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者，所述多肽是含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[10]根据[6]所述的试剂盒，其中，所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
[11]一种用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，其选自由下述a)～e)构成的组：
a)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分子所构成的正义引物；
b)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号3所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分子所构成的正义引物；以及
c)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号5所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分子所构成的正义引物；
d)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号25所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格 条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分子所构成的正义引物；
e)引物组，其含有由在严格条件下与由序列号27所示的碱基序列构成的多核苷酸杂交的核酸分子所构成的反义引物、以及由在严格条件下与该多核苷酸的互补链杂交的核酸分子所构成的正义引物。
[12]一种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
[13]一种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
[14]一种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
[15]一种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号25的碱基编号1～2242中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号25的碱基编号2243～3144中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
[16]一种正义引物及反义引物的引物组，所述正义引物由序列号27的碱基编号1～2233中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号27的碱基编号2234～3135中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
[17]一种用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探针组，选自由下述a)～c)构成的组：
a)探针组，其包括由含有与序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)、以及由含有与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)；
探针组，其包括由含有与序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)、以及由含有与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)；
c)探针组，其包括由含有与序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)、以及由含有与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组(优选包括20种探针组)。
根据[1]～[5]中任一项所述的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测方法，其特征在于，所述检测多核苷酸的存在的步骤包括：使用从受试者得到的试样以及[17]所述的探针组进行原位杂交的步骤；将杂交的信号放大的步骤；以及检测所述信号重叠的步骤。
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的检测用试剂盒，其含有用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的[17]所述的探针组以及将杂交后的信号放大的试剂。
根据[1]～[5]中任一项所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测多肽的存在的步骤包括：i)使识别该多肽的源自FGFR3基因的部分的抗体(一次抗体)及识别该多肽的源自TACC3基因的部分的抗体(一次抗体)与从受试者得到的试样接触的步骤；ii)添加与该一次抗体分别结合的、并且连结有寡核苷酸的各二次抗体的步骤；iii)添加连接溶液从而进行连接反应的步骤，其中该连接溶液含有与该二次抗体所连结的该寡核苷酸部分互补的二种寡核苷酸、以及在它们接近时能够使其连接从而在该二次抗体间形成环状结构的连接酶；iv)沿所形成的环状结构使核酸伸长的步骤；v)使能够与伸长的核酸杂交的经标记的寡核苷酸探针杂交的步骤；以及vi)检测该标记信号的步骤。
一种FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测用试剂盒，其用于 [1]～[5]中任一项所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法中，并且含有：识别所述融合多肽的源自FGFR3基因的部分的抗体(一次抗体)及识别所述融合多肽的源自TACC3基因的部分的抗体(一次抗体)、与该一次抗体分别结合并且连结有寡核苷酸的二次抗体、与连结于该二次抗体的该寡核苷酸部分互补的二种寡核苷酸、在它们接近时能够使其连接从而在该二次抗体间形成环状结构的连接酶、以及经标记的寡核苷酸探针。
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的治疗用医药组合物，其含有抑制下述多肽的物质：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列、并且具有肿瘤形成能力。
根据[22]所述的医药组合物，其中，所述多肽是含有序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
根据[22]所述的医药组合物，其中，所述多肽为由序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示的氨基酸序列构成的多肽。
根据[22]所述的医药组合物，其中，所述多肽为含有与序列号2、序列号4或序列号6所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
根据[22]所述的医药组合物，其中，所述多肽是含有序列号2、序列号4或序列号6所示氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽。
[27]根据[22]所述的医药组合物，其中，所述多肽为由序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽。
[28]根据[22]～[27]中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述的抑制多肽的物质为Dovitinib、AZD4547、BGJ398或LY2874455。
[29]根据[22]～[27]中任一项所述的癌治疗用医药组合物，其中，所述癌为肺癌或膀胱癌。
[30]抑制下述多肽的物质用于制造FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的治疗用医药组合物的应用：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
[31]抑制下述多肽的物质用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的应用：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
[32]抑制下述多肽的物质，其用于治疗FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
[33]一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌的治疗方法，包括向对象给予有效量的抑制下述多肽的物质：
所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982或序列号6的氨基酸编号461～996所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的存在的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
检测从受试者得到的试样中的编码下述(1)～(3)中记载的多肽的多核苷酸的存在的步骤，
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
另外，本发明涉及
一种本段落中记载的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的存在的检测方法，其特征在于，该多核苷酸的存在的检测步骤包括：使用从受试者得到的试样及[17]所述的标记探针组进行原位杂交的步骤；以及检测所述标记的信号重叠的步骤。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的诊断方法，其特征在于，包括下述步骤：
检测从受试者得到的试样中的编码下述(1)～(3)中记载的多肽的多核苷酸的存在的步骤，
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力：或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
另外，本发明涉及
一种本段落中记载的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的诊断方法，其特征在于，该多核苷酸的存在的检测步骤包括：使用从受试者得到的试样及[17]中记载的标记探针组进行原位杂交的步骤；以及检测所述标记的信号重叠的步骤。
另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗方法，包括对通过上述2个方案的诊断方法诊断为FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的患者给予本发明的抑制多肽的物质(在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物LY2874455)。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的存在的检测方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)以从受试者得到的试样作为模板，使用上述[11]～[16]中任一项所述的引物组进行PCR的步骤；以及
(2)检测PCR产物的存在的步骤。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的诊断方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)以从受试者得到的试样作为模板，使用上述[11]～[16]中任一项所述的引物组进行PCR的步骤；以及
(2)检测PCR产物的存在的步骤。
另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗方法，包括对通过上述诊断方法诊断为FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的患者给予抑制本发明的多肽的物质(在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物LY2874455)。
另外，本发明涉及
一种检测染色体的重排(genomic rearrangement，基因重排)的方法，包含下述步骤：
检测从受试者得到的试样中的编码下述(1)～(3)中记载的多肽的多核苷酸的存在的步骤，
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列 号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
此外，本发明还涉及
一种检测染色体的重排(genomic rearrangement，基因重排)的方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因的5’侧基因组区域的荧光标记探针(第一探针)、以及iii)含有编码TACC3基因的3’基因组区域的荧光标记探针(第二探针)(此处，第一探针和第二探针的荧光不同)进行原位杂交的步骤；以及
(2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的存在的检测方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因 的5’侧基因组区域的荧光标记探针(第一探针)、以及iii)含有编码TACC3基因的3’基因组区域的荧光标记探针(第二探针)(在此，第一探针和第二探针的荧光不同)进行原位杂交的步骤；以及
(2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
另外，本发明涉及
一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的诊断方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)使用i)从受试者得到的试样、ii)含有编码FGFR3基因的5’侧基因组区域的荧光标记探针(第一探针)、以及iii)含有编码TACC3基因的3’基因组区域的荧光标记探针(第二探针)(在此，第一探针和第二探针的荧光不同)进行原位杂交的步骤；以及
(2)检测所述标记的信号重叠的步骤。
另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗方法，包括对于通过上述诊断方法诊断为FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的患者给予抑制本发明的多肽的物质(在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物LY2874455)。
另外，本发明涉及
下述(1)～(3)中记载的多肽(以下也称为“本发明的多肽”)或编码该多肽的多核苷酸(以下也称为“本发明的多核苷酸”)：
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043 (或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
另外，本发明涉及一种FGFR3和TACC3的融合蛋白的检测方法，其特征在于，包含检测从受试者得到的试样中的下述(1)～(3)中记载的多肽的存在的步骤：
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
另外，本发明涉及
一种FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的存在的检测方法，其特征在于，包含下述步骤：
检测从受试者得到的试样中的下述(1)～(3)中记载的多肽的存在的步骤，
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
另外，本发明涉及
一种FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的诊断方法，其特征在于，包含下述步骤：
检测从受试者得到的试样中的下述(1)～(3)中记载的多肽的 存在的步骤，
(1)所述多肽含有与序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；
(2)所述多肽含有序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者所述多肽含有在序列号2的氨基酸编号461～947(或序列号2)、序列号4的氨基酸编号461～982(或序列号4)、序列号6的氨基酸编号461～996(或序列号6)、序列号26的氨基酸编号461～1043(或序列号26)或序列号28的氨基酸编号461～1040(或序列号28)所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力；或者
(3)所述多肽由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成。
另外，作为其他方案，本发明涉及一种FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗方法，包括对通过上述诊断方法诊断为FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的患者给予抑制上述(1)～(3)中记载的多肽的物质(在一种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物LY2874455)。
Science.2012Sep 7；337(6099)：1231-5.Epub 2012Jul 26.中报道了存在显示出癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因、FGFR抑制剂PD173074、AZD4547、BGJ398抑制FGFR3-TACC3融合基因表达细胞的增殖、并且给出了FGFR3-TACC3融合基因表达可 能有助于FGFR抑制治疗有用的胶质母细胞瘤患者组的鉴定的启示，但是其为本申请最先的优先权日(2012年3月8日)之后的文献。在该文献中记载了使融合点与本发明的FGFR3-TACC3_v1及FGFR3-TACC3_v2相同的基因片断的序列，但是其全长并未明确，并且其根本没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_v5b或其检测方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另外，也没有关于肺癌及膀胱癌的记载和启示。
另外，Hum Mol Genet.2012.Nov21(Hum Mol Genet.2013Feb15；22(4)：795-803)中报道了具有癌化能力的FGFR3和TACC3的融合基因(本发明的FGFR3-TACC3_v1)在膀胱癌中存在，但是该文献为公开了本发明的FGFR3-TACC3_v1的本申请最先的优先权日(2012年3月8日)及本申请第二优先权日(2012年9月5日)之后的文献。在该文献中，根本没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_v5b或其检测方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另外，也没有关于肺癌的记载和启示。
此外，J Clin Invest.2013February 1；123(2)：855_865.中报道了在胶质母细胞瘤中存在几个具有癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，但是该文献为在公开了本发明的FGFR3-TACC3_v1及FGFR3-TACC3_v2的本申请最先的优先权日(2012年3月8日)、本申请第二优先权日(2012年9月5日)及本申请第三优先权日(2012年12月21日)之后出版的文献。在该文献中，根本没有公开本发明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_v5b或其检测方法、引物组、探针组、检测试剂盒，也没有给出启示。另外，也没有关于肺癌及膀胱癌的记载和启示。
发明效果
本发明的检测方法可用作检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌(特别是肺癌 或膀胱癌)的方法。另外，本发明的检测方法可用作检测染色体重排的方法。另外，根据本发明的检测方法，可鉴别是否为利用抑制本发明的多肽的物质的治疗的适用对象。本发明的检测用试剂盒、引物组及探针组可用于本发明的检测方法。另外，抑制本发明的多肽的物质可用作FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或FGFR3和TACC3的融合蛋白阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗用医药组合物。
具体实施方式
<本发明的检测方法>
本发明的检测方法为检测融合基因或融合蛋白的方法，该方法包含检测从受试者得到的试样中的特定的多核苷酸或多肽的存在的步骤。作为从受试者得到的试样，使用来自受试者的采集物(从活体分离的试样)，具体而言，使用所采集的任意的组织、体液(优选血液)、肺泡或支气管清洗液、活检试样、尿中癌细胞、痰试样，优选使用受试者的肺患部或膀胱患部的活检试样或痰试样。可以从试样中提取基因组DNA来使用，另外，可以使用其转录产物(将基因组转录及翻译，结果产生的产物；例如mRNA、cDNA、蛋白质)。特别优选制备并使用mRNA或cDNA。另外，可以使用对试样进行福尔马林固定并包埋于石蜡中而稳定化的标本(FFPE)。也可以使用将FFPE薄切片后的FFPE切片。如果使用FFPE切片，则可以直接检测其中存在的多核苷酸或多肽。
在融合基因的检测方法中的“检测多核苷酸的存在的步骤”中，作为其检测对象的多核苷酸(以下称为“检测对象多核苷酸”)为“FGFR3基因和TACC3基因的融合基因”，其为含有FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的基因。
作为“FGFR3基因和TACC3基因的融合基因”，可列举这样的融合基因：其具有编码作为FGFR3的功能域之一的激酶区域的序列和编码作为TACC3的功能域之一的螺旋卷曲区域的序列。作为引起癌症的融合基因，已知有PTC-RET(Clin.Cancer Res.2009； 7119-7123)、KIF5B-ALK(Clin.Cancer Res.2009；3143-3149)、KIF5B-RET(Nature medicine2012；Feb 12；Epub ahead of print、Nat Med.2012Feb 12；18(3)：375-7)、EML4-ALK(Nature 2007；561-566)等，这些融合基因为在5’末端侧具有螺旋卷曲区域的蛋白质的基因与在3’末端侧缺损配体结合部位的激酶基因结合而成的融合基因，并且已知的是如果强制地在NIH3T3细胞中表达，则引起转化。例如，对于使不具有配体结合部位的KIF5B-RET融合基因表达了的3T3细胞而言，引起第905位的酪氨酸自我磷酸化从而被活化，其中该第905位的酪氨酸对配体非依赖性地RET激酶活化是重要的。已知该自我磷酸化被作为RET抑制剂的Vandetanib抑制，引起细胞死亡(Nature medicine 2012；Feb 12；Epub ahead ofprint、Nat Med.2012Feb 12；18(3)：375-7)。另外已知的是，对于使同样不具有配体结合部位的EML4-ALK融合基因内源性地表达的细胞株而言，也会引起对于ALK的激酶活性重要的第1604位的磷酸化，并且通过对ALK具有抑制活性的TAE684来抑制磷酸化，从而抑制增殖(Clin.Cancer Res.2008；4275-4283)。此外，还教导了作为ALK激酶抑制剂的Crizotinib对于表达了EML4-ALK融合基因的肺癌患者是有效的治疗药(Drug Des.Devel.Ther.2011；471-485)。作为这些融合基因所编码的融合蛋白的活化机制，教导了通过经由螺旋卷曲区域的均二聚化作用，引起融合的激酶区域的配体非依赖性地恒定的活化。此外，还教导了通过使用融合的激酶的抑制剂，可由此抑制融合蛋白的功能。因此，关于FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，也将FGFR3的激酶区域和TACC3的螺旋卷曲区域推测为引起癌化的重要的区域。因此，作为上述“检测对象多核苷酸”，例如可列举具有这样的序列的多核苷酸：该序列编码FGFR3基因和TACC3基因的融合基因当中对应于FGFR3的激酶区域和TACC3的螺旋卷曲区域的序列，即编码下述(1)～(3)中记载的多肽的多核苷酸。在某种方案中，即使通过检测这些区域内的一部分，也可以对检测对象多核苷酸的存在进行检测。
(1)含有与序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基 酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽[以下也称为“同源多肽”]；
(2)含有序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者含有在序列号2的氨基酸编号461～947、序列号4的氨基酸编号461～982、序列号6的氨基酸编号461～996、序列号26的氨基酸编号461～1043或序列号28的氨基酸编号461～1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽[以下也称为“功能性等效变体多肽”]；或者
(3)由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
作为优选的上述检测对象多核苷酸，可列举编码下述(1)～(3)中记载的多肽的多核苷酸。
(1)含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；
(2)含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽；或者
(3)由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
作为更优选的上述检测对象多核苷酸，可列举由序列号1、序列号3、序列号5、序列号25或序列号27所示的碱基序列构成的多核苷酸。
由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸为由从FGFR3基因突变3(GenBank注册编号：NM_001163213.1)的碱基编号257(与外显子2的第一个甲硫氨酸对应)到2536(与外显子18的3’末端对应))和从TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的碱基编号2050(与外显子11的5’末端对应)到2625(与外显子16的终止密码子对应)为止的碱基序列所构成的多核苷酸。序列号1所示的碱基序列中，碱基编号1～2280的序列源自FGFR3基因，碱基编号2281～2856的序列源自TACC3基因。将该融合多核苷酸称为FGFR3-TACC3_v1。序列号1的碱基编号1～2856为融合蛋白的开放阅读框(ORF)，该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号2。
由序列号3所示的碱基序列构成的多核苷酸为由从FGFR3基因突变3(GenBank注册编号：NM_001163213.1)的碱基编号257(与外显子2的第一甲硫氨酸对应)到2536(与外显子18的3’末端对应)和从TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的碱基编号1945(与外显子10的5’末端对应)到2625(与外显子16的终止密码子对应)为止的碱基序列所构成的多核苷酸。在序列号3所示的碱基序列中，碱基编号1～2280的序列源自FGFR3基因，碱基编号2281～2961的序列源自TACC3基因。将该融合多核苷酸称为FGFR3-TACC3_v2。序列号3的碱基编号1～2961为融合蛋白的ORF，将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号4。
由序列号5所示的碱基序列构成的多核苷酸为由从FGFR3基因突变3(GenBank注册编号：NM_001163213.1)的碱基编号257(与外显子2的第一甲硫氨酸对应)到2624(与外显子19的中部对应)和夹住TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的内含子59碱基并且从碱基编号2050(与外显子11的5’末端)到2625(与外显子16的终止密码子对应)为止的碱基序列所构成的多核苷酸。序列号5所示的碱基序列中，碱基编号1～2368的序列源自FGFR3基因，碱基编号2369～2427的序列源自TACC3的基因组序列，碱基编号2428～3003的序列源自TACC3基因。将该融合多核苷酸称为FGFR3-TACC3_v3。序列号5的碱基编号1～3003为融合蛋白的ORF， 将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号6。
由序列号25所示的碱基序列构成的多核苷酸为由从FGFR3基因突变3(GenBank注册编号：NM_001163213.1)的碱基编号257到2498(但是，第1980位不是C而是G)和从TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的碱基编号1771到2672为止的碱基序列所构成的多核苷酸。序列号25所示的碱基序列中，碱基编号1～2242的序列源自FGFR3基因，碱基编号2243～3144的序列源自TACC3基因。将该融合多核苷酸称为FGFR3-TACC3_v5a。序列号25的碱基编号1～3144为融合蛋白质的ORF，将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号26。
由序列号27所示的碱基序列构成的多核苷酸为由从FGFR3基因突变3(GenBank注册编号：NM_001163213.1)的碱基编号257到2498和从TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的碱基编号1771到2672为止的碱基序列所构成的多核苷酸。但是，一部分中存在多核苷酸的缺失和插入。缺失的部分相当于FGFR3基因(NM_001163213.1)的第690位到第701位(外显子4的3’侧的序列)。插入的部分相当于FGFR3基因(NM_001163213.1)的第1528位和第1529位之间(外显子10和外显子11之间)，插入有CAG这样的序列。序列号27所示的碱基序列中，碱基编号1～2233的序列源自FGFR3基因，碱基编号2234～3135的序列源自TACC3基因。将该融合多核苷酸称为FGFR3-TACC3_v5b。序列号28的碱基编号1～3135为融合蛋白的ORF，将该ORF所编码的氨基酸序列示于序列号28。
将FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、FGFR3-TACC3_v5b统称为FGFR3-TACC3融合多核苷酸。
作为其他方案中的所述检测对象多核苷酸，可列举：与序列号1的碱基编号1381～2841对应的FGFR3-TACC3_v1的部分序列、与序列号3的碱基编号1381～2946对应的FGFR3-TACC3_v2的部分序列、与序列号5的碱基编号1381～2988对应的FGFR3-TACC3_v3等。
作为优选的“同源多肽”，可列举：“含有与序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列的同源性为90％以上的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽”，更优选含有该同源性为95％以上、进一步优选为98％以上的氨基酸序列的多肽。
作为优选的“功能性等效变体多肽”，优选“含有在序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或插入1～10个、优选1～数个、进一步优选1～7个、最优选1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽”，特别优选“含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽”。
另外，本说明书中的上述“同源性”是指：通过NEEDLE program(J Mol Biol 1970；48：443-453)检索，采用通过默认值而准备的参数所得到的值Identity。上述参数如下所述。
Gap penalty＝10
Extend penalty＝0.5
Matrix＝EBLOSUM62
某种多肽“具有肿瘤形成能力”可通过后述实施例8中记载的方法来确认。具体而言，可列举将该融合基因导入到NIH3T3细胞中，使用球形板确认锚定非依赖性细胞增殖作用的方法。另外，也可以是将导入有该融合基因的细胞接种于裸鼠的皮下之后，观察一定期间，确认肿瘤形成的方法。
作为本发明检测方法中的检测对象多核苷酸，优选编码“含有序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列，并且具有肿瘤形成能力的多肽”的多核苷酸，最优选编码“由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽”的多核苷酸。
本发明的融合基因检测方法中的“检测多核苷酸的存在的步骤”这样实施：检测从受试者得到的试样的基因组中的检测对象多核苷酸(含有融合点的基因组序列)的存在，制备从受试者得到的试样中所 提取的基因组DNA的转录产物(例如mRNA或cDNA)并检测与检测对象多核苷酸对应的mRNA或cDNA的存在，或者通过原位杂交检测根据需要进行了前处理的从受试者所得到的试样中的检测对象多核苷酸的存在。
基因组DNA的提取可通过公知的方法来进行，可使用市售的DNA提取试剂盒来简便地进行。
检测步骤可根据公知的基因分析法(例如，作为基因检测法常用的PCR、LCR(Ligase chain reaction，连接酶链式反应)、SDA(Strand displacement amplification，链置换扩增)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，基于核酸序列的扩增)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleicacids，等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)、LAMP法(Loop-mediated isothermalamplification，环介导恒温扩增)、TMA法(Gen-Probe’s TMA system)、原位杂交(ISH)法、以及微阵列等公知的方法)来实施。例如，利用以与检测对象多核苷酸杂交的核酸作为探针的杂交技术、或者以与检测对象多核苷酸杂交的DNA作为引物的基因扩增技术等。
具体而言，使用源自从受试者得到的试样的核酸(例如mRNA等)进行测定。mRNA量的测定采用以能够特异性地扩增检测对象多核苷酸的方式所设计的引物并利用基因扩增反应方法来测定。本发明的检测方法中所使用的引物、或者检测用试剂盒中所含的引物只要能够特异性地扩增检测对象多核苷酸即可，没有特别限定，可基于检测对象多核苷酸的碱基序列进行设计。PCR扩增监测法中的引物设计可利用引物设计软件(例如PrimerExpress；ァプラィドバィシステムズ公司)等。另外，如果PCR产物的尺寸变大，则扩增效率变差，因此，适当地设定正义引物和反义引物使得以mRNA或cDNA作为对象扩增时的扩增产物的大小为1kb以下。
更具体而言，从源自FGFR3基因的部分(例如上述融合多核苷酸(特别是cDNA)的FGFR3基因区域内的任意部分)设计正义引物(5’-引物)，由源自TACC3基因的部分(例如上述融合多核苷酸 (特别是cDNA)的TACC3基因区域内的任意部分)设计反义引物(3’-引物)。或者，也可以以与含有该融合多核苷酸的融合点(后述)的区域对应的方式来设计正义引物或反义引物的一者。优选使用本发明的检测用试剂盒中所含的引物组，进一步优选使用本发明的检测用试剂盒中最优选含有的引物组。在PCR扩增监测法中，也可以通过掺混与各基因对应的上述正义引物来设计多重PCR(Multiplex PCR)，所述多重PCR利用一种反应液来测定全部的检测对象多核苷酸。可通过适于各扩增技术的方法来确认目标基因(整体或其特异性部分)是否被扩增。例如，在PCR法中，可通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，并通过溴化乙锭染色等确认是否得到了目标尺寸的扩增片断。当得到了目标尺寸的扩增片断时，在从受试者得到的试样中存在检测对象多核苷酸。由此可检测出检测对象多核苷酸的存在。
作为本发明的融合基因的检测方法，除了通过基因扩增反应检测从受试者得到的试样中的特定多核苷酸的存在的步骤以外，优选还包括检测是否得到了目标尺寸的扩增片断的步骤。
利用杂交技术的检测采用(例如)northern杂交、斑点杂交法、DNA微阵列法、RNA保护法等来进行。作为用于杂交的探针，可以使用含有在严格条件下(优选更严格条件下)与检测对象多核苷酸或其互补链杂交的连续的至少32个碱基的核酸分子，即由以融合点为中心在其上游及下游的各16个碱基所构成的序列(具体而言，为序列号1所示的碱基序列的第2265位～第2296位(第2280位/第2281位)、或序列号3所示的碱基序列的第2265位～第2296位(第2280位/第2281位)、序列号5所示的碱基序列的第2353位～第2384位(第2368位/第2369位)、序列号25所示的碱基序列的第2227位～第2258位(第2242位/第2243位)、或序列号27所示的碱基序列的第2218位～第2249位(第2233位/第2234位)。需要说明的是，括号内的碱基编号表示融合点。)、或含有它们的互补链的探针。
需要说明的是，本说明书中的融合点是指源自FGFR3基因的部分和源自TACC3基因的部分融合的点。
利用原位杂交技术的检测可以根据公知的FISH法(fusion assay，融合方法)来实施。或者可通过显色原位杂交(CISH)法和银染原位杂交(SISH)法组合的融合检测方法来实施。
利用原位杂交技术的检测可根据公知的RNA FISH法(J.Mol.Diagn.2012；22-29)来实施。更具体而言，从源自FGFR3基因的部分(例如，上述融合多核苷酸(mRNA)的FGFR3基因区域内的任意部分)设计检测探针，从源自TACC3基因的部分(例如，上述融合多核苷酸(mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分)设计其他检测探针。与从受试者得到的试样进行该探针的杂交。接下来，进行使信号放大的试剂的杂交，从而将信号放大。检测源自FGFR3基因的部分的信号和源自TACC3基因的部分的信号的信号重叠。通过区别检测上述由源自FGFR3基因的部分所设计的探针和由源自TACC3基因的部分所设计的探针的荧光试剂或发色试剂，可以观察该来源不同的二种探针是否处于相同场所(同一分子内)。通过观察到该二种探针处于相同场所(同一分子内)，可检测出检测对象多核苷酸的存在。作为用于放大信号的试剂，可以使用PreAmplifier Mix QT(Affymetrix公司)、Amplifier Mix QT(Affymetrix公司)、Label Probe Mix(Affymetrix公司)、及Label Probe Diluent QT(Affymetrix公司)。
另外，本说明书中的“严格条件”是指：作为用于杂交的条件，为“5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate、SDS)、50％甲酰胺、200μg/mL鲑鱼精子DNA、42℃过夜”这样的条件，作为用于清洗的条件，为“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”这样的条件。“更严格条件”是指：作为用于杂交的条件，为“5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5％SDS、50％甲酰胺、200μg/mL鲑鱼精子DNA、42℃过夜”这样的条件，作为用于清洗的条件，为“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”这样的条件。
此外，可以利用RT-PCR等基因扩增技术。对于RT-PCR法，通过在基因的扩增过程中使用PCR扩增监测(实时PCR)法(Genome Res.,6(10),986,1996)，可对检测对象多核苷酸的存在进一步进 行定量的分析。作为PCR扩增监测法，例如可以使用ABI PRISM7900(ァプラィドバィシステムズ公司)。实时PCR为公知的方法，市售有用于其的装置及试剂盒，可利用它们简便地进行。
本发明中的融合基因或融合蛋白的检测可通过直接检测从受试者得到的试样中的检测对象多核苷酸所编码的多肽(以下称为“检测对象多肽”)的存在来实施。“FGFR3和TACC3的融合蛋白”为检测对象多核苷酸所编码的多肽(即，检测对象多肽)。检测对象多肽中，将由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽称为FGFR3-TACC3融合多肽v1，将由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽称为FGFR3-TACC3融合多肽v2，将由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽称为FGFR3-TACC3融合多肽v3，将由序列号26所示的氨基酸序列构成的多肽称为FGFR3-TACC3融合多肽v5a，将由序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽称为FGFR3-TACC3融合多肽v5b。将FGFR3-TACC3融合多肽v1、FGFR3-TACC3融合多肽v2、FGFR3-TACC3融合多肽v3、FGFR3-TACC3融合多肽v5a、FGFR3-TACC3融合多肽v5b统称为FGFR3-TACC3融合多肽(FGFR3-TACC3融合蛋白)。
例如，在对检测对象多肽进行检测的步骤中，检测也可以通过将免疫学测定法及酶活性测定法组合后的方法等来实施，其中所述免疫学测定法通过制备源自从受试者得到的试样(例如从受试者得到的癌组织或细胞)的可溶化液，并将其中所含的检测对象多肽与相对于构成融合多肽的各蛋白质的抗体(例如，相对于FGFR3的抗体和相对于TACC3的抗体)进行组合来进行。另外，也可以通过免疫组织染色技术来实施检测，其中所述免疫组织染色技术通过将进行了适宜前处理(例如除去石蜡)的由某受试者得到的试样(例如FFPE切片)中所含的检测对象多肽与构成融合多肽的各蛋白质的抗体(例如相对于FGFR3的抗体和相对于TACC3的抗体)进行组合来进行。作为这些方法，可列举：将特异性的单克隆抗体或多克隆抗体用于检测对象多肽的酶免疫测定法、双抗体夹心ELISA法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、Western印迹法、免疫组织染色等方法。
利用免疫组织染色技术的检测可根据以一分子单位特异性地检测目标多肽的公知的技术Proximity Ligation Assay(Nat.Methods.2006；995-1000)来实施。更具体而言，使用识别上述融合多肽的源自FGFR3基因的部分的抗体和识别上述融合多肽的源自TACC3基因的部分的抗体，并利用上述技术检测该二个抗体识别同一分子，从而对检测对象多肽的存在进行检测。更具体而言，检测可通过如下步骤实施：i)使识别所述融合多肽的源自FGFR3基因的部分的抗体(一次抗体)及识别所述融合多肽的源自TACC3基因的部分的抗体(一次抗体)与从受试者得到的试样相接触的步骤；ii)添加与该一次抗体分别结合的并且连结有寡核苷酸的二次抗体的步骤；iii)添加溶液从而进行连接反应的步骤，其中该溶液含有连结有该寡核苷酸的二次抗体所、与该二次抗体所连结的该寡核苷酸部分互补的二种寡核苷酸、以及在它们接近时使其连接从而在该二次抗体间可形成环状结构的连接酶；iv)沿所形成的环状结构使核酸伸长的步骤；v)使能够与伸长的核酸杂交的经标记的寡核苷酸探针杂交的步骤；vi)检测该标记信号的步骤。作为某种方案，可以使用PLA探针或DuolinkII试剂试剂盒以及Duolink II Bright field试剂试剂盒(Olink公司)中所含的试剂。
在从由受试者得到的试样中检测出本发明检测方法中的检测对象多核苷酸或检测对象多肽的情况下，该受试者为具有该多核苷酸或该多肽阳性的癌的对象(患者)，因此成为通过抑制本发明多肽的物质(在某种方案中为化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物LY2874455)进行治疗的适用对象。
<本发明的检测用试剂盒、本发明的引物组、本发明的探针组>
含有本发明的引物组的检测用试剂盒中至少含有以能够特异性地扩增本发明检测方法中的检测对象多核苷酸的方式所设计的正义引物及反义引物(也称为引物组)。本发明的引物组为起到检测对象多核苷酸扩增用的引物作用的多核苷酸组。
本发明的引物组包括这样的引物组，其含有根据源自FGFR3基因的部分设计的正义引物以及根据源自TACC3基因的部分设计的反 义引物，并且是用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，其中，该反义引物由在严格条件下(优选更严格条件下)与“检测对象多核苷酸”杂交的核酸分子(优选至少16个碱基的核酸分子)构成，该正义引物由在严格条件下(优选更严格条件下)与“检测对象多核苷酸”的互补链杂交的核酸分子(优选至少16个碱基的核酸分子)构成。
在本发明的引物组中，也可以以与含有该融合多核苷酸的融合点(上述)的部分对应的方式来设计正义引物或反义引物的一者。
作为本发明的引物组的具体的方案，可列举选自由以下(1)～(5)构成的组中的引物组：
(1)由序列号1的碱基编号1到2280间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成的正义引物以及由与序列号1的碱基编号2281到2856间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成的反义引物的引物组；
(2)由序列号3的碱基编号1到2280间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成的正义引物以及由与序列号3的碱基编号2281到2961间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成的反义引物的引物组；
(3)由序列号5的碱基编号1到2368间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成的正义引物以及由与序列号5的碱基编号2369到3003间任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成的反义引物的引物组；
(4)由序列号25的碱基编号1～2242中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成的正义引物以及由与序列号25的碱基编号2243～3144中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成的反义引物的引物组；
(5)由序列号27的碱基编号1～2233中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成的正义引物以及由与序列号27的碱基编号2234～3135中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成的反义引物的引物组。
在上述引物组中，优选的是，正义引物和反义引物的选择位置的间隔为1kb以下，或者由正义引物和反义引物扩增的扩增产物的大小为1kb以下。
另外，本发明的引物通常具有15～40个碱基、优选具有16～24个碱基、进一步优选具有18～24个碱基、特别优选具有20～24个碱基的链长。
在本发明的检测方法中，本发明的引物组可用于检测对象多核苷酸的扩增及检测。另外，本发明的引物组中所含的各引物没有特别限定，例如，可通过化学合成法来制造。
含有本发明的探针组的检测用试剂盒中至少含有以能够特异性地与本发明检测方法中的检测对象多核苷酸杂交的方式设计的、根据源自FGFR3基因的部分(例如，上述融合多核苷酸(mRNA)的FGFR3基因区域内的任意部分)设计的探针组以及根据源自TACC3基因的部分(例如，上述融合多核苷酸(mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分)设计的探针组(也称为探针组)，以及将杂交后的信号放大的试剂。该探针组为起到与检测对象多核苷酸杂交的探针组作用的多核苷酸的组。
本发明的探针组包括这样的探针组，该探针组含有根据源自FGFR3基因的部分(例如上述融合多核苷酸(mRNA)的FGFR3基因区域内的任意部分)设计的探针和根据源自TACC3基因的部分(例如上述融合多核苷酸(mRNA)的TACC3基因区域内的任意部分)设计的探针，所述探针组用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，其中各探针由与“检测对象多核苷酸”杂交的核酸分子构成。
在某种方案中，各探针为分支DNA探针(branched DNA probe)，基于序列信息的分支DNA探针可以从Affymetrix公司获得。
作为本发明的探针组的具体的方案，可列举选自由以下(1)～(3)构成的组中的探针组：
(1)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸；以及多 种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸；
(2)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸；以及多种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸；
(3)探针组，其含有：多种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸；以及多种由邻接的探针对所构成的探针组(优选含有20种探针组)，其中该邻接的探针对含有与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸。
在此，由邻接的探针对所构成的探针组多的情况下容易获得信号，故优选。在某种方案中，可使用20种左右。
在本发明的检测方法中，本发明的探针组可用于检测对象多核苷酸的检测。另外，本发明的探针组中所含的各探针没有特别限定，例如可通过化学合成法来制造。
<本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌的治疗用医药组合物>
从癌症患者的检体中分离鉴定的融合多核苷酸(实施例1～3)表现为癌的致病基因(实施例8、实施例11)，在一部分肺癌或膀胱癌症患者中检测到融合多核苷酸的存在(实施例4～6)。此外，基于本发明人等发现的通过抑制本发明的多肽的活性和/或表达来抑制锚定非依赖性细胞增殖(即显示抗癌作用)这样的新见解(实施例9、实施例12、实施例13、实施例14、实施例16)可知，抑制本发明的多肽(抑制本发明的多肽的活性和/或表达)的物质具有治疗本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌的效果。
本发明中包括本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌的治疗用医药组合物，该医药组合物以抑制本发明的多肽的物质(例如，通过任意一种筛选方法从后述的医药组合物的有效成分所得到的物质[例如双链核酸(包含siRNA)、蛋白质(包含抗体或抗体片断)、肽、或除此以外的化合物])为有效成分。
本发明的医药组合物中的有效成分可通过对后述的医药组合物的有效成分进行筛选的方法来选择。例如，可列举后述的实施例9记载的化合物Dovitinib(ClinicalCancer Reserach 2011；17:7451-7461中记载的化合物、4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基]喹啉-2(1氢)-酮)、AZD4547(WO2008075068实施例154和AACR2011，海报3568；标题：“Characterization of AZD4547：An orally bioavailable,potent and selective inhibitor of FGFR tyrosine kinases 1,2and 3”中记载的化合物、N-{5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基}-4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺)、及BGJ398(Journal of Medicinal Chemistry 2011；54；7066-7083中记载的化合物、3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)、实施例21中记载的化合物LY2874455(WO2010129509实施例1；Mol Cancer Ther,2011,10,2200-2210；(R)-(E)-2-{4-[2-{5-[1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基}乙烯基]-1H-吡唑-1-基}乙醇)。另外，可列举：制造例1～5、实施例29及实施例30中所记载的化合物，即5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(化合物A)、2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇(化合物B)、(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇(化合物C)、5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺(化合物D)、5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺(化合物E)。
另外，可以将从公知的具有FGFR3抑制活性的低分子化合物(FGFR3抑制剂)中通过后述的筛选医药组合物的有效成分的方法 所选出的化合物用作本发明的医药组合物中的有效成分。特别是可示出化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398及化合物LY2874455。
作为本发明的医药组合物的有效成分所示出的双链核酸由双链的核酸(RNA或DNA)部分和优选为正义链及反义链的3'末端的突出(ォ一バ一ハング)构成，并且衍生RNAi。RNAi为进化性保存的现象，经由利用RNaseIII内切酶产生的21～23个碱基的双链核酸而产生(Genes Dev.15,485-490,2001)。3'侧的突出分别为1或2个碱基的任意的核酸，但优选为2个碱基。需要说明的是，上述碱基数(21～23个碱基)为包含突出在内的正义链或反义链各自的碱基数。另外，正义链及反义链可以为相同的碱基数，也可以为不同的碱基数，但优选为相同的碱基数。
作为构成双链核酸的3'侧突出的核糖核酸，例如可以使用U(尿嘧啶)、A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、或C(胞嘧啶)，并且作为构成3'侧的突出的脱氧核糖核酸，例如可以使用dT(脱氧胸腺嘧啶)、dA(脱氧腺嘌呤)、dG(脱氧鸟嘌呤)、或dC(脱氧胞嘧啶)。
可用作本发明的医药组合物的有效成分的双链核酸为这样的双链核酸：其双链部分基于序列号1、序列号3及序列号5中记载的碱基设计，并且具有抑制本发明的多肽表达的活性。
以抑制本发明的多肽的物质(例如，通过后述的医药组合物的有效成分筛选的方法所得到的物质[例如双链核酸、蛋白质(包含抗体或抗体片断)、肽、或除此以外的化合物])为有效成分的制剂，可以根据上述有效成分的类型，使用它们的制剂化中通常使用的药理学上容许的载体、赋形剂和/或其他添加剂来制备成医药组合物。
作为给药，例如可列举：利用片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、或口服液体制剂等的经口给药，或者利用静脉注射(包含点滴)、肌肉注射、或者皮下注射等注射剂、栓剂、经皮给药制剂、或膀胱内注入或经粘膜给药制剂等的非经口给药。特别是对于在胃中消化的肽来说，优选静脉注射等非经口给药。
在用于经口给药的固体组合物中，可以混合1种以上的活性物 质和至少一种惰性的稀释剂，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、或偏硅酸铝酸镁等。根据常规方法，上述组合物可以含有除惰性稀释剂以外的添加剂，例如润滑剂、崩解剂、稳定剂、或者溶解剂或助溶剂等。片剂或丸剂可以根据需要用糖衣或者胃溶性或肠溶性物质等的膜包覆。
用于经口的液体组合物可以包括(例如)乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、或酏剂，并且可以含有通常所使用的惰性的稀释剂，例如精制水或乙醇。上述组合物可以含有除惰性稀释剂以外的添加剂，例如湿润剂、混悬剂、甜味剂、芳香剂、或防腐剂。
作为用于非经口的注射剂，可以包括无菌的水性或者非水性的溶液制剂、混悬剂、或乳剂。水溶性的溶液制剂或混悬剂中可以含有(例如)注射用蒸馏水或生理盐水等作为稀释剂。作为非水溶性的溶液制剂或混悬剂的稀释剂，例如可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、醇类(例如乙醇)、或聚山梨醇酯80等。上述组合物可进一步含有湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解剂或者助溶剂、或防腐剂等。上述组合物可利用(例如)通过细菌截留滤器的过滤、配合杀菌剂、或照射来进行无菌化。另外，在制造无菌的固体组合物并使用时，也可以溶解于无菌水或其他无菌用注射用介质中来使用。
给药量可考虑有效成分(即通过医药组合物的有效成分的筛选方法所得到的物质)的活性强弱、症状、给药对象的年龄、或性别等来适宜确定。优选的是，肿瘤附近的血中浓度或肿瘤内浓度为药剂能够50％抑制本发明的多肽的活性或表达时的浓度的3～30倍、例如10倍这样的量，并且给药量可根据途径而算出。例如，在经口给药的情况下，通常对于成人(以体重60kg计)来说其给药量每天约为0.1～100mg，优选0.1～50mg。在非经口给药的情况下，对于注射剂的形态而言，每天为0.01～50mg，优选为0.01～10mg。
本发明的医药组合物的治疗对象为检测到本发明的多核苷酸和/或本发明的多肽的存在的受试者(即，本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌症患者)。因本发明的多核苷酸而癌化的细胞被抑 制本发明的多肽的物质杀灭，因此，抑制本发明的多肽的物质成为本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的有效治疗剂。
以下示出化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、及化合物E的制造方法。需要说明的是，在本文中，“ESI+”表示质量分析中的m/z值(离子化法ESI、(M+H)+)，“APCI/ESI+”表示质量分析中的m/z值(同时测定离子化法APCI和ESI、(M+H)+)，“NMR1”表示二甲基亚砜-d6中1H-NMR的δ(ppm)，“NMR2”表示CDCl3中的1H-NMR的δ(ppm)。
制造例1化合物A的制造
(1)将3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(1g)和乙腈(20mL)的混合物冰冷却，加入N-氟-N'-(氯甲基)三乙二胺双(四氟硼酸盐)(4.09g)，在室温下彻夜搅拌。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水，用醋酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水清洗后，加入无水硫酸钠及碱性硅胶，搅拌30分钟后过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣用硅胶柱层析(醋酸乙酯/己烷)精制，得到2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(292mg)。
ESI+：233.
(2)将2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(10g)和四氢呋喃(50mL)的混合物冰冷却，加入硼氢化锂(3.0M四氢呋喃溶液，43mL)后，在室温下搅拌65小时。将反应混合物再次冰冷却，再加入硼氢化锂(3.0M四氢呋喃溶液，14mL)，在室温下搅拌22小时。将反应混合物冰冷却，缓慢地加入到冰水(300mL)中。再缓慢地加入浓盐酸(25mL)，在室温下搅拌1小时。用甲苯/醋酸乙酯(1：1)萃取，将有机层用饱和碳酸氢钠水以及饱和食盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液减压浓缩，得到(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(8.67g)。
ESI+：205.
(3)将(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(1.71g)、三乙胺(2.57mL)及四氢呋喃(34mL)的混合物冰冷却，加入甲磺酰氯(716μL) 后，搅拌1小时。在反应混合物中加入水，用醋酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，得到2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基甲磺酸酯(2.32g)。
NMR2：3.04(3H,s)、3.88(6H,s)、5.34(2H,s)、6.72(1H,t,J＝8.2Hz).
(4)在2-氯-5-羟基嘧啶(4.38g)、碳酸钾(9.27g)及N,N-二甲基甲酰胺(79mL)的混合物中加入2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基甲磺酸酯(7.89g)，之后在60℃下搅拌1小时。在反应混合物中加入水，滤取所产生的固体，用水清洗后，减压干燥，得到2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(8.53g)。
APCI/ESI+：317.
(5)在氩气氛下，在室温下向2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(1.03g)、3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(1.29g)、1,1'-联萘-2,2'-二基双(二苯基膦)(609mg)、碳酸铯(3.19g)及二噁烷(20.6mL)的混合物中加入醋酸钯(146mg)，在100℃下搅拌4小时。在反应混合物中加入水，用醋酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸镁干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)精制、接着用碱性硅胶柱层析(醋酸乙酯)精制后，用醋酸乙酯、接着用乙醇重结晶，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(化合物A：830mg)。
ESI+：585.
NMR1：1.45-1.60(2H,m)、1.73-1.84(2H,m)、2.14(3H,s)、2.17-2.58(11H,m)、3.24-3.36(2H,m)、3.75(3H,s)、3.87(6H,s)、5.16(2H,s)、6.79(1H,d,J＝8.8Hz)、7.07(1H,t,J＝8.4Hz)、7.24(1H,dd,J＝8.8、2.4Hz)、7.32(1H,d,J＝2.4Hz)、8.29(2H,s)、9.21(1H,s).
制造例2化合物B的制造
(1)在氩气氛下，在室温下向通过与制造例1(4)同样的方法所制造的2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(800mg)、2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)乙醇(642mg)、1,1'-联萘-2,2'-二基双(二苯 基膦)(472mg)、碳酸铯(2.47g)及二噁烷(16mL)的混合物中加入醋酸钯(113mg)，在100℃下搅拌6小时。在反应混合物中加入水和氯仿，通过硅藻土过滤滤除不溶物后，利用氯仿对滤液进行萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸镁干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用硅胶柱层析(氯仿/甲醇)精制，得到2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇(化合物B：139mg)。
ESI+：408.
NMR1：3.69(2H,dd,J＝11.0、5.6Hz)、3.87(6H,s)、4.07(2H,t,J＝5.6Hz)、4.83(1H,t,J＝5.4Hz)、5.14(2H,s)、7.07(1H,t,J＝8.4Hz)、7.45(1H,d,J＝0.6Hz)、7.88(1H,d,J＝0.6Hz)、8.26(2H s)、9.20(1H,s)。
制造例3化合物C的制造
(1)在氩气氛下，在室温下向通过与制造例1(4)同样的方法制造的2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(1.33g)、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-胺(913mg)、1,1'-联萘-2,2'-二基双(二苯基膦)(785mg)、碳酸铯(4.11g)及二噁烷(26.6mL)的混合物中加入醋酸钯(189mg)，在100℃下搅拌4小时。在反应混合物中加入水，用醋酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用硅胶柱层析(醋酸乙酯/己烷)精制，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(1.73g)。
APCI/ESI+：448.
(2)在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(3.59g)及甲醇(20mL)的混合物中加入4M氯化氢/二噁烷溶液(40mL)，在室温下搅拌6小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中加入饱和碳酸氢钠水。滤取所产生的固体，用二乙醚清洗后，减压干燥，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(2.9g)。
APCI/ESI+：364.
(3)在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(50mg)、碳酸钾(57mg)及N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中加入4-甲基苯磺酸[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲酯(118mg)，在60℃下搅拌1小时，然后在110℃下搅拌4天。在反应混合物中加入水，用醋酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸镁干燥后过滤。将滤液减压浓缩后，将得到的残渣用硅胶柱层析(醋酸乙酯/己烷)精制，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1-{[(4R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(39mg)。
APCI/ESI+：478.
(4)在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1-{[(4R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(45mg)及四氢呋喃(2mL)的混合物中加入1M盐酸(1mL)，在50℃下搅拌3小时。在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水，用氯仿萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣用硅胶柱层析(氯仿/甲醇)精制后，用醋酸乙酯固化，得到(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇(化合物C：25mg)。
ESI+：438.
NMR1：3.23-3.38(2H,m)、3.72-3.80(1H,m)、3.84-3.96(7H,m)、4.15(1H,dd,J＝13.8、4.1Hz)、4.67(1H,t,J＝5.6Hz)、4.91(1H,d,J＝5.3Hz)、5.14(2H,s)、7.06(1H,t,J＝8.4Hz)、7.45(1H,d,J＝0.6Hz)、7.87(1H,d,J＝0.6Hz)、8.26(2H,s)、9.21(1H,s)。
制造例4化合物D的制造
(1)与制造例1(5)同样地将4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺、以及通过与制造例1(4)同样的方法制造的2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶用作原料，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺(化合物D)。
ESI+：472.
NMR1：2.21(3H,s)、2.41-2.48(4H,m)、2.98-3.08(4H,m)、 3.87(6H,s)、5.15(2H,s)、6.81-6.90(2H,m)、7.07(1H,t,J＝8.4Hz)、7.47-7.55(2H,m)、8.26(2H,s)、9.15(1H,s)。
制造例5化合物E的制造
(1)在(1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-基)甲醇(398mg)、3,4-二氢-2H-吡喃(459μL)及醋酸乙酯(8mL)的混合物中加入对甲苯磺酸一水合物(96mg)，在室温下搅拌1.5小时。再加入3,4-二氢-2H-吡喃(459μL)及对甲苯磺酸一水合物(96mg)，在室温下搅拌1.5小时。在反应混合物中加入水，用醋酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，然后将残渣用硅胶柱层析(己烷/醋酸乙酯)精制，得到1-甲基-3-硝基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑(487mg)。
APCI/ESI+：242.
(2)在氩气氛下，在1-甲基-3-硝基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑(487mg)、四氢呋喃(4.9mL)及乙醇(4.9mL)的混合物中加入10％钯-碳(50mg)。在氢气氛下搅拌12小时后，通过硅藻土过滤除去不溶物。将滤液减压浓缩，得到1-甲基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑-3-胺(426mg)。
APCI/ESI+：212.
(3)与制造例3(1)同样地将1-甲基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑-3-胺、以及通过与制造例1(4)同样的方法制造的2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶用作原料，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺。
APCI/ESI+：492.
(4)在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺(706mg)和甲醇(8mL)的混合物中加入4M氯化氢/二噁烷溶液(8mL)，在室温下搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中加入饱和碳酸氢钠水，用氯仿萃取。有机层用无水硫酸钠干燥后过滤。将残渣用硅胶柱层析(醋酸乙酯/己烷)精制，获得3-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧 基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]甲醇(444mg)。
ESI+：408.
(5)将[3-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]甲醇(350mg)、三乙胺(359μL)、二氯甲烷(7mL)及四氢呋喃(7mL)的混合物冰冷却，加入甲磺酰氯(120μL)后，在室温下搅拌3小时。向反应混合物中加入水及醋酸乙酯，滤取所产生的固体后，减压干燥，得到甲磺酸[3-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]甲酯(218mg)。
NMR2：2.96(3H,s)、3.85(3H,s)、3.89(6H,s)、5.16(2H,s)、5.25(2H,s)、6.68(1H,t,J＝8.0Hz)、6.91(1H,s)、7.63(1H,brs)、8.24(2H,s).
(6)在甲磺酸[3-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]甲酯(795mg)和N-甲基吡咯烷酮(15.9mL)的混合物中加入1-甲基哌嗪(901μL)，在80℃下搅拌2小时。在反应混合物中加入水以及饱和碳酸氢钠水，滤取所产生的固体后，将滤液用氯仿萃取。有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣与之前滤取的固体合并后，利用硅胶柱层析(氯仿/甲醇)精制，接着利用碱性硅胶柱层析(醋酸乙酯/甲醇)精制后，用乙醇/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺(化合物E：168mg)。
ESI+：490.
NMR1：2.14(3H,s)、2.18-2.53(8H,m)、3.45(2H,s)、3.67(3H,s)、3.87(6H,s)、5.15(2H,s)、6.46(1H,s)、7.06(1H,t,J＝8.4Hz)、8.26(2H,s)、9.42(1H,s)。
<医药组合物的有效成分的筛选方法>
医药组合物的有效成分的筛选方法包括[1]抑制本发明的多肽的物质的筛选方法和[2]本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂的筛选方法。
[1]抑制本发明的多肽(抑制本发明的多肽的活性和/或表达)的物质的筛选方法
抑制本发明的多肽的物质的筛选方法只要包括下述步骤(i)～(iii)即可，没有特别限定：
(i)使试验物质与本发明的多肽或表达本发明的多肽的细胞接触的步骤；
(ii)分析该多肽是否被抑制了的步骤；以及
(iii)选择抑制该多肽的物质的步骤。
本筛选方法包括以下的方法。
(a)体外(in vitro)型筛选方法；
抑制本发明的多肽的活性的物质筛选方法，其特征在于，包含：(1)使试验物质与本发明的多肽接触的步骤；(2)分析该多肽的活性是否被抑制了的步骤；以及(3)选择抑制该多肽的活性的物质的步骤。
(b)细胞型筛选方法；
抑制本发明的多肽的活性的物质筛选方法，其特征在于，包含：(1)使试验物质与表达本发明的多肽的细胞接触的步骤；(2)分析该多肽的活性是否被抑制了的步骤；以及(3)选择抑制该多肽的活性的物质的步骤。
(c)表达抑制型筛选方法
抑制本发明的多肽的表达的物质筛选方法，其特征在于，包含：(1)使试验物质与表达本发明的多肽的细胞接触的步骤；(2)分析该多肽的表达是否被抑制了的步骤；以及(3)选择抑制该多肽的表达的物质的步骤。
以下对各筛选方法进行说明。表达本发明的多肽的细胞包括天然表达本发明的多肽的细胞、以及通过用含有本发明的多核苷酸的载体对细胞进行转化从而表达了本发明的多肽的细胞，但是作为表达本发明的多肽的细胞，优选通过用含有本发明的多核苷酸的载体对细胞进行转化从而使本发明的多肽得以表达的细胞。
(a)体外型筛选方法
体外型筛选方法包括这样的方法：在精制后的本发明的多肽中添加试验物质使其接触(接触步骤)、与未接触试验物质时的本发明的多肽的活性进行比较从而分析通过该试验物质是否抑制了本发明的多肽的活性(分析步骤)、选择抑制本发明的多肽的活性的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。
具体而言，在医药组合物的有效成分的筛选方法中，各步骤(例如)可如下实施。在精制后的本发明的多肽中添加试验物质使其接触后，添加ATP并测定该多肽的活性。作为对照，使该精制后的多肽与试验物质的溶剂(例如DMSO)混合接触后，添加ATP并测定该多肽的活性。作为背景对照，可以设定未添加ATP的条件。分析本发明的多肽的活性是否通过试验物质受到抑制。本发明的多肽的活性(即自我磷酸化活性)是否通过试验物质受到抑制，可通过分析由试验物质引起的本发明的多肽的酪氨酸磷酸化水平的变化来判定。即，与添加(即接触)溶剂对照时比较，在添加(即接触)试验物质时本发明的多肽的活性(即自我磷酸化活性)受到抑制的情况下，将该试验物质选择为抑制本发明的多肽的活性的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。在上述步骤中，在添加ATP之前添加肽基质并混合、以及将相对于该肽基质的磷酸化活性作为本发明的多肽的活性进行分析(即，通过分析由本发明的多肽引起的肽基质的磷酸化水平的变化来判定通过试验物质本发明的多肽的活性是否受到抑制)，除此以外，按照与上述同样的方式进行的筛选方法也包含在本发明的体外型筛选方法中。在上述方法中，将抑制50％以上活性时的浓度为10μM以下、优选为1μM以下、进一步优选为0.1μM以下的物质选择为抑制本发明的多肽的活性的物质。例如，可以将实施例21的方法用作本发明的体外型筛选方法。
(b)细胞型筛选方法
细胞型筛选方法包括这样的方法：将表达本发明的多肽的细胞与试验物质混合(即添加)使其接触(接触步骤)、与未接触试验物 质时的本发明的多肽的活性进行比较从而分析通过该试验物质是否抑制了本发明的多肽的活性(分析步骤)、选择抑制本发明的多肽的活性的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。具体而言，例如可如下实施。
首先，使表达本发明的多肽的细胞与试验物质或溶剂对照(例如DMSO)分别接触。将细胞培养一定时间后，使用将培养的细胞溶解而制备的细胞溶解液，通过使用了公知的SDS电泳法及抗磷酸化FGFR3抗体(例如Cell Signaling Technology公司)的免疫印迹来测定本发明的多肽的活性(即自我磷酸化活性)，由此分析通过试验物质是否抑制了本发明的多肽的活性(即自我磷酸化活性)。通过试验物质是否抑制了本发明的多肽的活性，可通过分析由试验物质引起的本发明的多肽的酪氨酸磷酸化水平的变化来判定。即，与添加(即接触)溶剂对照时进行比较，在添加(即接触)试验物质时抑制了本发明的多肽的活性的情况下，选择该试验物质作为抑制本发明的多肽的活性的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。
(c)表达抑制型筛选方法
表达抑制型筛选方法包括这样的方法：将表达本发明的多肽的细胞与试验物质混合(即添加)使其接触(接触步骤)、与未接触试验物质时的本发明的多肽的表达进行比较从而分析通过该试验物质是否抑制了本发明的多肽的表达(分析步骤)、选择抑制本发明的多肽的表达的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。具体而言，例如可如下实施。
使表达本发明的多肽的任意细胞与试验物质或溶剂对照(例如DMSO)分别接触。培养后，制备细胞的提取物，接着，使用提取物分析通过试验物质是否抑制了本发明的多肽的表达。是否抑制了本发明的多肽的表达可通过是否抑制了本发明的多肽的mRNA或蛋白质的表达来分析。更具体而言，通过公知的表达量分析方法、例如northern印迹法、定量的PCR法或免疫印迹法、ELISA法等来鉴定存在于上述细胞提取液中的本发明的多肽的mRNA或蛋白质的量。 通过试验物质是否抑制了本发明的多肽的表达可通过分析由试验物质引起的本发明的多肽的表达量的变化来判定。即，与溶剂对照接触时比较，在试验物质接触时本发明的多肽的表达量(mRNA或蛋白质量)降低的情况下，将该试验物质选择为抑制本发明的多肽的表达的物质(即本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂)。
[2]本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌治疗剂的筛选方法
抑制本发明的多肽(抑制本发明的多肽的活性和/或表达)的物质的筛选方法可用作本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(优选肺癌或膀胱癌)的治疗剂的筛选方法。即，本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌的治疗剂的筛选方法包括上述[1]中抑制本发明的多肽的物质的筛选方法中的i)、ii)及iii)。
在本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌的治疗剂的筛选方法中，优选还包括以下步骤：分析试验物质是否抑制了本发明的多肽、并选择抑制本发明的多肽的物质，然后确认所选试验物质具有本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)治疗活性。
确认所选试验物质具有本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌治疗活性的步骤；
作为确认所选物质具有本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)治疗活性的步骤，可列举实施公知的评价方法或其改良后的方法的步骤，例如实施对表达了本发明的多肽的培养细胞或肿瘤模型动物用所选物质进行处置并分析的方法(临床肿瘤学第二版、癌和化学疗法公司)。
作为确认所选物质具有本发明的多核苷酸阳性或本发明的多肽阳性的癌(特别是肺癌或膀胱癌)治疗活性的步骤，优选的是，(1)使用源自人类癌症(特别是肺癌或膀胱癌)的内源性地表达本发明的多肽的癌细胞，确认所选试验物质具有该细胞的增殖抑制作用和/或细胞凋亡诱导作用的步骤、(2)确认所选试验物质对表达了本发明 的多肽的转化细胞的锚定非依存性增殖具有抑制作用的步骤、和/或(3)确认所选试验物质对将表达本发明的多核苷酸的细胞接种于裸鼠而形成的肿瘤增殖具有抑制作用的步骤。
在上述的使用裸鼠的方法中，可以使用将内源性地表达本发明的多肽的癌细胞、或通过本发明的多肽的表达而转化的细胞移植于皮下、皮内、腹腔或各脏器而得到的肿瘤模型动物，即荷癌模型动物(例如移植了NIH3T3细胞的裸鼠等，该NIH3T3细胞表达了本发明的多肽)。
作为医药组合物的有效成分的筛选方法中所使用的试验物质，没有特别限定，例如可列举市售的化合物(包括肽)、化学文件中所登记的各种公知化合物(包括肽)、通过组合化学技术(N.Terrett et al.,Drug Discov.Today,4(1)：41,1999)得到的化合物组、微生物的培养上清液、源自植物或海洋生物的天然成分、动物组织提取物、双链核酸、抗体或抗体片断、或者对通过医药组合物的有效成分的筛选法所选择的化合物(包括肽)进行化学或生物学修饰后的化合物(包括肽)。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行详述，但本发明并不受限于该实施例。另外，在没有特别说明的情况下，可依据公知的方法进行实施。另外，在使用市售的试剂或试剂盒等的情况下，可根据市售品的指导书进行实施。
[实施例1]FGFR3-TACC3_v1的分离
对于肺癌临床检体(美国ァステランド公司)200检体，使用逆转录酶(SuperScriptIII，lifetechnologies公司)及随机引物(随机引物，lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述得到的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；Takara-Bio株式会社)进行PCR (将98℃10秒、55℃15秒、68℃1分钟30秒进行30次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃1分钟进行30次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果仅在样品Lg344中得到约500个碱基对(bp)的PCR产物。
然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，约500bp的PCR产物为NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的编码序列(以下CDS)的外显子18的3'末端与TACC3基因(NM_006342.1)的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于源自扁平上皮肺癌患者肺癌组织的RNA(美国ァステランド公司)Lg344检体RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及oligo(dT)引物(oligo(dT)20引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、60℃15秒、68℃3分钟30秒进行25次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号14所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分钟30秒进行25次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2.9kbp的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；lifetechnologies公司)中。插入物通过双脱氧测序法来确定序列(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，在约2.9kbp的PCR产物中，存在NCBI中所登记 的FGFR3基因(NM_001163213.1)的从CDS的5'末端到外显子18的3'末端与TACC3基因(NM_006342.1)的从CDS的外显子11的5’末端到CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列号1)。将由序列号1编码的多肽示于序列号2。
另外，为了将FGFR3-TACC3_v1的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，从而对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应，从而对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒(FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro)。
[实施例2]FGFR3-TACC3_v2的分离
对于膀胱癌临床检体(美国ァステランド公司)59检体，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及随机引物(随机引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；Takara-Bio株式会社)进行PCR(将98℃10秒、55℃15秒、68℃1分钟30秒进行30次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃1分钟进行30次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果可知，在样品Bd106检体中得到约600bp的PCR产物。
然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，约600bp的PCR产物为NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的CDS的外显子18的3'末端与TACC3基因(NM_006342.1)的CDS的外显子10的5’末端融合的序列。
对于源自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国ァステランド公司)Bd106检体RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及oligo(dT)引物(oligo(dT)20引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，从而合成cDNA。
接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒进行25次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号14所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒进行25次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果可知得到约3.0kbp的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；lifetechnologies公司)中。插入物通过双脱氧测序法来确定序列(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，在约3.0kbp的PCR产物中，存在NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的从CDS的5'末端到外显子18的3'末端与TACC3(NM_006342.1)的从CDS的外显子10的5’末端到CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v2)(序列号3)。将由序列号3编码的多肽示于序列号4。
另外，为了将FGFR3-TACC3_v2的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒(FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro)。
[实施例3]FGFR3-TACC3_v3的分离
对于膀胱癌临床检体(美国ァステランド公司)59检体，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及随机引物(随机引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，从而合成cDNA。
接着，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；Takara-Bio株式会社)进行PCR(将98℃10秒、55℃15秒、68℃1分钟30秒进行30次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列号10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃1分钟进行30次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果可知在样品Bd021检体中得到约650bp的PCR产物。
然后，通过双脱氧测序法对PCR产物进行序列确定(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，约650bp的PCR产物为NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的CDS的外显子19的中间序列与TACC3基因(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，再与TACC3基因的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于源自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国ァステランド公司)Bd021检体RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及oligo(dT)引物(oligo(dT)20引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、60℃15秒、68℃3分钟30秒进行25次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号14所示的 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分钟30秒进行25次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果可知得到约3.0kbp的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR CloningKit；lifetechnologies公司)中。插入物通过双脱氧测序法确定序列(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果可知，在约3.0kbp的PCR产物中，存在NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的从CDS的5'末端到外显子19的中间序列与TACC3基因(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，再与TACC3的从CDS的外显子11的5’末端到CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v3)(序列号5)。将由序列号5编码的多肽示于序列号6。
另外，为了将FGFR3-TACC3_v3的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒(FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro)。
[实施例4]FGFR3-TACC3_v1的检测
从源自肺癌临床检体的RNA(美国ァステランド公司)200样品制作cDNA，以cDNA作为基质，以序列号15所示的FGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_F及序列号16所示的FGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒(Power SYBR Green PCR Master Mix；lifetechnologies公司)，通过应用生物系统7900HT系统进行定量PCR(95℃10分钟之后，将95℃15秒、59℃60秒进行45次循环)，测定基因表达量。结果，在肺癌检体中，仅在上述的样品Lg344中确认到扩增。另外，由源自膀胱癌临床检体的RNA(美国ァステランド公司)59样品制作cDNA，以cDNA作为基质按同样方式实施，结果从多个检体确认到扩增。
[实施例5]FGFR3-TACC3_v2的检测
由源自膀胱癌临床检体的RNA(美国ァステランド公司)59样品制作cDNA，以cDNA作为基质，以序列号17所示的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_F及序列号18所示的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒(Power SYBR Green PCR MasterMix；lifetechnologies公司)，通过应用生物系统7900HT系统进行定量PCR(95℃10分钟之后，将95℃15秒、59℃60秒进行45次循环)，测定基因表达量。结果，在膀胱癌检体中，从多个检体确认到扩增。
[实施例6]FGFR3-TACC3_v3的检测
由源自膀胱癌临床检体的RNA(美国ァステランド公司)59样品制作cDNA，以cDNA作为基质，以序列号19所示的FGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_F及序列号20所示的FGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_R作为引物组，使用定量PCR试剂盒(Power SYBR Green PCR MasterMix；lifetechnologies公司)，通过应用生物系统7900HT系统进行定量PCR(95℃10分钟之后，将95℃15秒、59℃60秒进行45次循环)，测定基因表达量。结果，在膀胱癌检体中，从多个检体确认到扩增。
[实施例7]FGFR3-TACC3_v1的逆转录酶病毒溶液的制作
使用FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro(实施例1)9μg、转染试剂(FUGENE(注册商标)HD、Roche公司)对Platinum-E细胞实施转染。转染24小时后，交换含有10％牛血清(NICHIREIBIOSCIENCE公司)的D-MEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium培养基；Invitrogen公司)，进一步采集24小时的培养基上清液，以制作逆转录酶病毒溶液。
[实施例8]FGFR3-TACC3_v1的锚定非依赖性增殖亢进作用的研究
在实施例7中的使用FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro制作的病毒溶液中以4μg/mL的浓度添加Polybrene(Polybrene；SIGMA-ALDRICH公司)后，添加到NIH3T3细胞中使其感染。添加 6小时后，交换为含有10％牛血清(NICHIREI BIOSCIENCE公司)的D-MEM培养基，感染1天后，交换为含有10％牛血清(NICHIREI BIOSCIENCE公司)及1μg/mL的嘌呤霉素(SIGMA-ALDRICH公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)，在5％CO2存在下、在37℃下继续培养4周，获得稳定表达FGFR3-TACC3_v1的NIH3T3细胞。(命名为FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞。)
为了研究FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性增殖亢进能力，将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞及感染有作为空载体的pMXs-puro的NIH3T3细胞(Mock/NIH3T3细胞)分别以每一个孔为1×103个的方式用含有10％牛血清(NICHIREI BIOSCIENCE公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)接种到96孔球形板(Sumilon CelltightSpheloid96U；住友Bakelite公司)中。在5％CO2存在下、在37℃下培养后，使用细胞数测定试剂(CELLTITER-GloTM Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)并依据手册的方法测定次日(Day1)及四日后(Day4)的细胞数。检测时使用了发光测定装置。从Day1到Day4为止，Mock/NIH3T3细胞的细胞数的计数未增加，与此相对，从Day1到Day4为止，确认到FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞的细胞数的计数增加约3.1倍。由上可知，FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞显示锚定非依赖性细胞增殖。
[实施例9]融合多肽抑制剂对于FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性细胞增殖抑制作用
锚定非依赖性细胞增殖的测定(菌落法等)已知作为研究化合物抗癌作用(药理效果)的体系(临床肿瘤学第二版，癌和化学疗法公司)。作为代替菌落法的测定细胞非粘接性增殖的方法，有使用如上所述的球形板的方法。
将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞以每一个孔为1×103个的方式用含有10％牛胎儿血清的DMEM培养基接种于96孔球形板(Sumilon Celltight Spheloid96U；住友Bakelite公司)中。另外，作为阳性对照用，准备了仅添加有培养基的孔。在5％CO2存在下、在 37℃下培养一晩后，添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使最终浓度为100nM。作为阴性对照，以与化合物添加时浓度(0.1％)相同的方式添加化合物的溶剂即DMSO。然后，在5％CO2存在下、在37℃下培养4天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-GloTM Luminescent CellViability Assay；Promega公司)并搅拌20分钟后，使用发光测定装置测定。将阳性对照、阴性对照的值分别设为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。结果，Dovitinib、AZD4547及BGJ398的抑制％分别为40％、74％、92％。
以上的结果说明，FGFR3-TACC3融合多肽的抑制剂能够抑制表达FGFR3-TACC3_v1的癌细胞或肿瘤的增殖。
这说明，可通过本发明的检测方法辨别适用对象来实行定制医疗，其中，该适用对象预期利用本发明的多肽抑制剂进行治疗是有效的。
[实施例10]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的逆转录酶病毒溶液的制备
使用实施例2及3中制作的FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro并依据实施例7的方法制备逆转录酶病毒溶液。
[实施例11]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的锚定非依赖性增殖亢进作用的研究
使用实施例10中的利用FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro制备的病毒溶液，依据实施例8的方法获得稳定表达FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的NIH3T3细胞。(分别命名为FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞。)
为了研究FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性增殖亢进能力，通过与实施例8同样的方法进行研究。从Day1到Day4为止，Mock/NIH3T3细胞的细胞数的计数未增加，与此相对，从Day1到Day4为止，确认到FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞的细胞数的 计数增加约2.8倍。另外，从Day1到Day4为止，确认到FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的细胞数的计数增加约2.3倍。由上可知，FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞表现出锚定非依赖性细胞增殖。
[实施例12]本发明的多肽抑制剂对于FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性细胞增殖抑制作用
通过与实施例9同样的方法进行FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞增殖抑制作用的评价。结果，Dovitinib、AZD4547及BGJ398对FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞的抑制％分别为21％、60％、90％。另外，Dovitinib、AZD4547及BGJ398对FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的抑制％分别为32％、51％、87％。
以上结果说明，FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂能够抑制表达FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的癌细胞或肿瘤的增殖。
这说明，可通过本发明的检测方法辨别适用对象来实行定制医疗，其中，该适用对象可预期利用FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂进行治疗是有效的。
[实施例13]FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的抗肿瘤试验
将悬浮于磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline、PBS)中的FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞3×106个注射移植于4周岁的雄性cann.Cg-Foxn1Nu/Crlcrlj(Nu/Nu)裸鼠(日本Charles River公司)的背部皮下。移植3天后，开始给予作为FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂的AZD4547及BGJ398。溶剂组及化合物组以各4只到5只进行试验，将AZD4547及BGJ398悬浮在0.5％甲基纤维素(methylCELLULOSE、信越化学工业株式会社)/99.5％蒸馏水组成的溶剂中，分别经口给药30mg/kg。给药在11天内1天进行1次，从第二天开始每3天测定体重及肿瘤直径。使用下式计算肿瘤体积。
[肿瘤体积(mm3)]＝[肿瘤的长径(mm)]×[肿瘤的短径(mm)]2×0.5
将化合物给药开始日以及给药结束日的溶剂组的肿瘤体积分别设为100％抑制、0％抑制，算出AZD4547及BGJ398的抑制率。结果，AZD4547及BGJ398将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞(肿瘤)的增殖分别抑制了51％、90％。
同样地研究了对于FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的抗肿瘤作用。结果，AZD4547及BGJ398将FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞(肿瘤)的增殖分别抑制了61％及90％。另外，将FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞(肿瘤)的增殖分别抑制了73％及88％。
[实施例14]通过FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂给药对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞肿瘤的激酶抑制作用
除了下述以外，与实施例13同样地观察AZD4547及BGJ398的激酶抑制作用。移植FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞3×106个，在移植3天后开始给予AZD4547及BGJ398。溶剂组及化合物组各以5只进行试验，在最终给药4小时后解剖，摘出肿瘤。然后，使用溶解液(Cell Lysis Buffer；Cell Signaling Technology公司、Phosphatase InhibitorCocktail；Thermo Scientific公司、Complete；Roche公司)迅速地制备肿瘤的蛋白质提取液，使用ELISA试剂盒(R&D公司)实施肿瘤内的总FGFR3及磷酸化FGFR3的测定。ELISA依据随附的步骤书来实施，但是检测改为利用化学发光试剂(BM化学发光ELISA基质；Roche公司)及发光测定装置(ARVO；PerkinElmer公司)进行的化学发光检测。
将用总FGFR3值对磷酸化FGFR3值进行修正后的值(磷酸化FGFR3/总FGFR3)设为磷酸化水平，将溶剂组的磷酸化水平设为0％抑制、以绝对值0作为100％抑制，从而算出各化合物组的酪氨酸自我磷酸化抑制率。结果，与溶剂组相比，AZD4547及BGJ398组中肿瘤内的FGFR3-TACC3融合多肽v1的酪氨酸自我磷酸化分别减少了 58％、77％。
对于FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞也同样地进行了研究，结果，与溶剂组相比，AZD4547及BGJ398组中肿瘤内的FGFR3-TACC3_v2的酪氨酸自我磷酸化分别减少了54％、66％。另外，肿瘤内的FGFR3-TACC3_v3的酪氨酸自我磷酸化分别减少了78％、85％。
由这些结果可确认，上述动物模型中的AZD4547及BGJ398的抗肿瘤作用是基于抑制肿瘤内的FGFR3-TACC3融合多肽的激酶活性的作用。
[实施例15]从源自膀胱癌患者的细胞株RT-112中分离FGFR3-TACC3_v1
对于由源自膀胱癌患者的细胞株RT-112(从Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH购入)精制的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、lifetechnologies公司)及oligo(dT)引物(oligo(dT)20引物、lifetechnologies公司)并依据试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列号11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列号12所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、60℃15秒、68℃3分钟30秒进行25次循环)。然后，以10倍稀释后的上述PCR产物作为模板，使用序列号13所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号14所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物并使用相同的DNA聚合酶进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒进行25次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2.9kbp的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；lifetechnologies公司)中，通过双脱氧测序法(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；lifetechnologies公司)确定插入物的序列，结果可知，与NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的从CDS的 5'末端到外显子18的3'末端和TACC3基因(NM_006342.1)的从CDS的外显子11的5’末端到CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列号1)相同。
[实施例16]FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂对源自膀胱癌患者的细胞株RT-112的锚定非依赖性细胞增殖抑制作用
将RT-112细胞以每一个孔为2×103个的方式用含有10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基接种于96孔球形板(Sumilon Celltight Spheloid96U；住友Bakelite公司)中。另外，作为阳性对照用，准备了仅添加有培养基的孔。在5％CO2存在下、在37℃下培养一晩后，分别添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使得最终浓度为100nM。作为阴性对照，以与化合物添加时的浓度(0.1％)相同的方式添加化合物的溶剂即DMSO。然后，在5％CO2存在下、在37℃下培养5天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-GloTM Luminescent Cell ViabilityAssay；Promega公司)并搅拌20分钟后，使用发光测定装置测定。将阳性对照、阴性对照的值分别设为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。结果，Dovitinib、AZD4547及BGJ398的抑制％分别为80％、90％、90％。
[实施例17]FGFR3-TACC3融合多肽的检测
如下构建检测细胞中的FGFR3-TACC3融合多肽的方法。培养FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞以及作为阴性对照的NIH3T3细胞。用PBS清洗1次后，将细胞用溶解液(CellLysis Buffer；Cell Signaling Technology公司、Phosphatase Inhibitor Cocktail；Thermo Scientific公司、Complete；Roche公司)在冰上溶解10分钟。离心后向得到的上清液中添加抗FGFR3抗体(SIGMA-ALDRICH公司)，在4℃下反应一晩。然后，添加蛋白G微珠(Protein G Sepharose 4Fast Flow；GE Healthcare公司)并进行4小时免疫沈降。离心后用清洗液(组成与上述的溶解液相同)将沉降物清洗4次，添加SDS溶液后煮沸5分钟从而使沉淀物悬浮。离心后对该上清液进行了使用抗TACC3抗体(R and D systems公司)的免疫印迹。结果，在FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞的免疫沈降物中检测到了 FGFR3-TACC3融合多肽v1，但在NIH3T3细胞中没有检测到。对FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞也同样地进行了研究，结果，在FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的免疫沈降物中，分别检测到FGFR3-TACC3融合多肽v2及FGFR3-TACC3融合多肽v3。另外，还通过同样的方法对RT-112细胞进行研究，结果检测到FGFR3-TACC3融合多肽v1。
由以上的结果可知，通过组合使用抗FGFR3抗体及抗TACC3抗体，可检测在表达FGFR3-TACC3融合多肽的癌细胞或癌组织中的本发明的多肽的存在，并且可判定本发明的多肽阳性的癌症患者。
[实施例18]利用原位杂交(ISH)法检测FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片中的FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)
将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞或FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以3×106个移植于4周岁雄性裸鼠(CAnN·Cg-Foxn1nu/CrlCrlj(nu/nu)、日本Charles River)的皮下，15天后，确认细胞块的增殖，从而制作荷癌小鼠。
从所制作的荷癌小鼠中切出含有增殖的癌细胞的组织，用生理盐水清洗后，用10％中性缓冲福尔马林(SIGMA-ALDRICH公司)在室温下固定48～144小时，使用自动包埋装置(Tissue-Tek VIP、Sakura Finetek Japan株式会社)依据常规方法脱水后，包埋于石蜡(Tissue Prep、株式会社Falma)中。将石蜡包埋后的组织样品切成5μm厚的FFPE切片。
将准备的FFPE切片在微量恒温仪(heat block)(MG-2200；东京理化器械株式会社)上在60℃下加热15分钟后，用10％福尔马林(和光纯药工业株式会社)在室温下固定30分钟。用PBS(Invitrogen公司)清洗3次，完全干燥，用二甲苯(和光纯药工业株式会社)在室温下处理10分钟。接着，将FFPE切片用PBS清洗3次，用预处 理液(Affymetrix公司)在100℃下煮沸10分钟。进而用精制水清洗2次，用PBS清洗1次，用蛋白酶溶液(Affymetrix公司)在培养器(HybEZ Hybridization System；Advanced Cell Diagnostics公司)内在40℃下处理20分钟。然后，用PBS清洗3次，用4％福尔马林(和光纯药工业株式会社)在室温下固定5分钟，用PBS清洗3次。将相对于FGFR3基因(GenBank注册编号：NM_000142.3)的碱基序列中与全部突变共通的碱基编号2851～4281为特异性的brancedDNA探针(QuantiGene ViewRNAProbe Set Type4；Affymetrix公司)、以及相对于TACC3基因(GenBank注册编号：NM_006342.1)的碱基序列中碱基编号2200～2838为特异性的brancedDNA探针(QuantiGeneViewRNA Probe Set Type1；Affymetrix公司)用Probe Set Diluent QT(Affymetrix公司)稀释40倍，制作Probe Set Solution。将本溶液添加至FFPE切片，在培养器内在40℃下反应2小时，使其与多核苷酸(mRNA)杂交。然后，将FFPE切片用Wash Buffer(Affymetrix公司)清洗3次，用PreAmplifier Mix QT(Affymetrix公司)在培养器内在40℃下反应25分钟。进而将FFPE切片用Wash Buffer清洗3次，用Amplifier Mix QT(Affymetrix公司)在培养器内在40℃下反应15分钟。用Wash Buffer清洗3次，用含有25分之1容量的Label Probe Mix(Affymetrix公司)的Label Probe Diluent QT(Affymetrix公司)在细胞培养器内在40℃下反应30分钟。接着，用Wash Buffer清洗2次，用PBS清洗1次，用含有荧光色素DAPI(Affymetrix公司)的PBS在室温下反应15分钟。用PBS清洗2次后，用封入剂EcoMount(Biocare Medical公司)封入，用共聚焦激光显微镜(LSM700；Carl Zeiss公司)进行荧光观察。FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的FFPE切片的任意一者中均检测到FGFR3的信号及TACC3的信号，而且，FGFR3的信号和TACC3的信号几乎共位(共局在)。由此说明，在含有强制地表达了FGFR3-TACC3融合基因的细胞的FFPE切片中，FGFR3的信号和TACC3的信号共位。
[实施例19]利用ISH法检测RT-112细胞中的FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)
按与实施例18同样的步骤制作源自人膀胱癌患者的细胞株RT-112细胞及源自人胃癌患者的细胞株HSC-39细胞的FFPE标本，利用ISH法进行FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)的检测。采用实施例18中利用微量恒温仪的处理之后的方法进行处理，并荧光观察封入后的标本。利用IN Cell Analyzer 2000(GE Healthcare公司)对获得的图像进行解析，结果，在表达FGFR3-TACC3_v1的RT-112细胞(实施例15)的FFPE切片中检测到多个共位的FGFR3的信号和TACC3的信号，与此相对，在通过实施例23记载的RT-PCR确认到未表达FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)的HSC-39细胞的FFPE切片中，几乎未检测到共位的FGFR3的信号和TACC3的信号。由此说明，在含有内源性地表达FGFR3-TACC3融合基因的细胞的FFPE切片中，FGFR3的信号和TACC3的信号共位，而在未表达FGFR3-TACC3融合基因的细胞中未共位，因此，通过测定这样的共位信号，可以判定有无FGFR3-TACC3融合基因。
[实施例20]利用ISH法检测源自膀胱癌患者的FFPE切片中的FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)
将源自购自美国ァステランド公司的膀胱癌患者组织的FFPE切片通过实施例18中的利用微量恒温仪的处理之后的方法进行处理，并且荧光观察封入后的切片。利用INCell Analyzer 2000(GE Healthcare公司)对获得的图像进行分析，结果，与通过实施例23记载的RT-PCR法确认到未表达FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)的源自膀胱癌患者组织的FFPE切片相比，在通过实施例23记载的RT-PCR法确认了表达FGFR3-TACC3_v2的源自膀胱癌患者组织的FFPE切片中，共位的FGFR3的信号和TACC3的信号数量明显较多。
对于购自英国Tissue Solutions公司的多个源自膀胱癌患者组织的FFPE切片，也通过同样的方法研究FGFR3的信号和TACC3的信号的共位。结果，与通过实施例23记载的RT-PCR法确认到未表达FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)的源自膀胱癌患者组织的 FFPE切片相比，在通过前述实施例记载的RT-PCR法确认了表达FGFR3-TACC3融合多核苷酸(mRNA)的源自膀胱癌患者组织的FFPE切片中，共位的FGFR3的信号和TACC3的信号数明显较多。
由此说明，在源自膀胱癌患者组织的FFPE切片中，通过观察共位的信号，也可判定有无FGFR3-TACC3融合基因。
[实施例21]化合物对FGFR3-TACC3融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
(1)FLAG标签融合表达质粒
(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))的构建
为了获得在5’末端融合有FLAG标签的FGFR3-TACC3融合多核苷酸，使用实施例1、2及3中克隆的载体作为模板，实施在5’末端附加FLAG标签的PCR。使用序列号21所示的FGFR3_N_FLAG_BamHI及序列号14所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物以及DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分钟30秒进行12次循环)。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；lifetechnologies公司)中。通过双脱氧测序法确定插入物的序列(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果确认了：PCR产物为在序列号1、序列号3及序列号5中所记载的序列中删除了编码第一甲硫氨酸的3个碱基(ATG)并在5’末端附加有编码起始密码子和FLAG标签的核酸序列(序列号22)而得到的核酸序列。将由此编码的多肽分别称为FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，并将它们总称为FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽。另外，为了构建将附加有这些FLAG序列的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)的ORF全长表达为蛋白质的表达载体， 将上述克隆载体用限制酶BamHI在37℃下进行3小时的酶反应，对经限制酶处理了的DNA片断进行精制，再用EcoRI在37℃下进行3小时的酶反应，并对经限制酶处理了的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体(pcDNA3.1/Zeo(+)；lifetechnologies公司)的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))。
(2)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的获得
在实施转染前一天，将每张涂布有胶原的15cm盘中的0.5×107个HEK293细胞用含有10％牛胎儿血清的D-MEM培养基培养10张。转染当天，FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)分别在每张盘中为27μg、并使用转染试剂(FUGENE(注册商标)HD；Roche公司)81μL，对HEK293细胞实施转染。转染24小时后，去除培养基，用PBS清洗3次，加入1mL的PBS，利用细胞刮铲(Corning公司)剥离细胞后，回收于聚丙烯制管中。以1200rpm离心5分钟后，去除上清液，加入150μL的细胞溶解液(50mM Tris HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1％NP-40、1mM EDTA、蛋白酶抑制剂cocktail complete(Roche-Diagnostics株式会社))并在冰上培养30分钟使细胞溶解。将离心后得到的上清液中存在的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽分别使用M2抗体亲和凝胶(ANTI-FLAG M2Affinity Gel；SIGMA-ALDRICH公司)并依据制品信息中所记载的方法进行精制。清洗及溶出分别使用清洗液(50mM Tris HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1％NP-40、1mM EDTA、蛋白酶抑制剂cocktail complete(Roche-Diagnostics株式会社))、溶出液(20mM Tris HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、10mM MnCl2、0.5mg/mL FLAG peptide)，得到100μL的溶出液。对于溶出液进行使用了抗FGFR3抗体(Cell Signaling Technology公司)及抗FLAG M2抗体(SIGMA-ALDRICH公司)的免疫印迹以及银染色，从而确认了可得到FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽。
(3)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的检测
使用激酶活性检测试剂盒(HTRF KinEASE-TK；Cisbio公司)对相对于上述精制的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的肽基质的磷酸化活性进行研究。使用384孔的Low-volume Blackplate(Corning公司)，以上述溶出液的1倍稀释溶液、3倍稀释溶液或10倍稀释溶液各1μL作为酶源，向试剂盒随附的5×Kinase buffer中分别以最终浓度为1mM及5mM的方式添加DTT及Mg2+，作为反应溶液。进行添加使得作为基质的试剂盒随附的TK Substrate的最终浓度为2.0μM、并且未添加ATP或者ATP的最终浓度为100μM，最终容量为5.0μL，并分别在室温下反应1小时。反应后，依据试剂盒推荐的方法制备Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，分别添加2.5μL，在室温下反应1小时后，检测HTRF的计数(即肽基质的磷酸化)。结果可知，相对于未添加ATP而言，添加ATP时，HTRF的计数在添加含有上述FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽或FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的各溶出液1倍稀释溶液1μL时，分别增加了约38倍、约40倍及约38倍；在添加上述溶出液3倍稀释溶液1μL时，分别增加了约27倍、34倍、31倍；在添加上述溶出液10倍稀释溶液1μL时，分别增加了5倍、18倍、11倍。
如上所述，通过使用激酶活性检测试剂盒，可以检测FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性。
(4)化合物对FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
使用上述激酶活性检测试剂盒及同样的384孔板来研究化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及LY2874455对 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用。将1.0μL的各化合物溶液以DMSO的最终浓度为0.1％、化合物的最终浓度中Dovitinib为1μM、100nM、10nM、AZD4547及BGJ398分别为100nM、10nM、1nM、LY2874455为10nM、1nM、0.1nM的方式进行添加，或者作为对照，添加DMSO使其为0.1％，对于FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液2倍稀释溶液1μL；对于FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液1μL；以及对于FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液1μL。接着，以最终浓度为2.0μM的方式添加作为基质的试剂盒随附的TK Substrate，在室温下反应15分钟。接着，以未添加ATP或者ATP的最终浓度为100μM的方式添加，最终容量为5.0μL，并分别在室温下反应一小时。此外，分别添加2.5μL的与上述(3)的方法同样制备的Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，在室温下反应1时间后，检测HTRF的计数。将不存在化合物下(将DMSO设为与添加化合物时的浓度相同即0.1％)的未添加ATP及添加ATP时的磷酸化的计数分别设为100％抑制、0％抑制，由下式算出由化合物引起的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的激酶活性的抑制％。
[化合物的激酶活性抑制(％)]＝(1-[添加化合物且添加ATP时的磷酸化的计数-未添加化合物且未添加ATP时的磷酸化的计数]/[未添加化合物但添加ATP时的磷酸化的计数-未添加化合物且未添加ATP时的磷酸化的计数])×100
结果，发现化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及LY2874455抑制了精制FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对于肽基质的磷酸化活性。各化合物的各个最终浓度下的对于肽基质的抑制比例(％)示于表1。
[表1]
[实施例22]LY2874455化合物对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性细胞增殖抑制作用
使LY2874455化合物的最终浓度为10nM，除此以外，采用与实施例9同样的方法进行FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞增殖抑制作用的评价。结果，LY2874455的抑制％分别为88％、90％、89％。
以上结果说明，作为FGFR3-TACC3融合多肽抑制剂的LY2874455能够抑制表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的癌细胞或肿瘤的增殖。
[实施例23]自人浸润性膀胱癌检体分离FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b
对于人浸润性膀胱癌检体(英国Tissue solution公司)，依据逆转录酶试剂盒(Super-Script III first strand synth Super-Mix；lifetechnologies公司)的说明书并使用oligo dT引物进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用FGFR3_F002引物(序列号23)及TACC3_R002引物(序列号24)，以上述得到的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶(PrimeSTAR；Takara-Bio株式会社)进行PCR(94℃2分钟之后， 将98℃10秒、68℃3.5分钟进行40次循环)。
这些引物分别相当于FGFR3基因的5’UTR及TACC3的3’UTR，因此，如果存在FGFR3和TACC3的融合基因，则不论突变与否，均可检测全部的融合基因。
将得到的PCR产物克隆到克隆载体(Zero blunt TOPO PCR Kit；lifetechnologies公司)中，通过双脱氧测序法(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；lifetechnologies公司)确定插入物的序列。结果可知，除了一个碱基以外，与NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的从CDS的5’到外显子18的中部(第257位到2498位)和TACC3基因(NM_006342.1)的CDS的外显子7的中部(第1771位到第2672位)融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v5a)相同(序列号25)。所述一个碱基位于NCBI中所注册的FGFR3基因(NM_001163213.1)的第1980位，在注册中为C，但是在所确定的序列中为G。另外，同时明确的是，FGFR3基因(NM_001163213.1)的外显子4的3’侧的序列(从第690位到第701位)缺失，另外，还存在具有在外显子10和外显子11之间插入有CAG序列这样的序列的转录产物(FGFR3-TACC3_v5b)(序列号27)。将由序列号25编码的多肽示于序列号26，将由序列号27编码的多肽示于序列号28。
[实施例24]FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b的逆转录酶病毒溶液的制备
为了将FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b的ORF全长表达为蛋白质，如下构建用于制作逆转录酶病毒溶液的表达质粒。分别使用实施例23中制作的经克隆的载体作为模板，使用序列号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_F的引物、以及DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺织株式会社)进行PCR(将98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒进行15次循环)。PCR反应后，进行电泳，结果分别得到目标尺寸的PCR产物。将PCR产物克隆到克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；lifetechnologies公司)中。插入物通过双脱氧测序法确定序列(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；lifetechnologies公司)。结果确认了PCR产物分别含有序列号25或序列号27。为了将FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b的ORF全长表达为蛋白质，将上述克隆载体用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，对经限制酶处理的DNA片断进行精制，再用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应，从而对经限制酶处理的DNA片断进行精制。将含有该ORF的DNA片断克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点中的BamHI及EcoRI位点中，从而构建表达质粒(FGFR3-TACC3_v5a/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v5b/pMXs-puro)。
使用这些构建载体并依据实施例7的方法制作逆转录酶病毒溶液。
[实施例25]FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b的锚定非依赖性增殖亢进作用的研究
使用实施例24中使用FGFR3-TACC3_v5a/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v5b/pMXs-puro所制作的病毒溶液，依据实施例8的方法获得了稳定表达FGFR3-TACC3_v5a及FGFR3-TACC3_v5b的NIH3T3细胞。(分别命名为FGFR3-TACC3_v5a表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v5b表达/NIH3T3细胞。)
为了研究FGFR3-TACC3_v5a表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v5b表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性增殖亢进能力，通过与实施例8同样的方法进行研究。从Day1到Day4为止Mock/NIH3T3细胞的细胞数的计数未增加，与此相对，从Day1到Day4为止确认到FGFR3-TACC3_v5a表达/NIH3T3细胞的细胞数的计数增加约2.6倍。另外，从Day1到Day4为止确认到FGFR3-TACC3_v5b表达/NIH3T3细胞的细胞数的计数增加约2.7倍。由上可知，FGFR3-TACC3_v5a表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v5b表达/NIH3T3细胞显示出锚定非依赖性细胞增殖亢进作用。
[实施例26]利用免疫染色法检测FGFR3-TACC3_v1表达 /NIH3T3细胞的福尔马林固定标本中的FGFR3-TACC3融合多肽
(1)样品制备
将实施例8中制作的FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞及NIH3T3细胞在盖玻片上培养一晚。次日除去培养液后，用3.7％甲醛在室温下反应10分钟以将细胞固定。用PBS清洗后，用0.2％Triton X-100(Nacalai公司)在室温下反应10分钟后，用0.5％SDS在室温下反应25分钟。用PBS清洗后，用Blocking solution(Olink公司)阻断。
(2)目标融合多肽的检测
将上述(1)中制备的样品在用Can Get Signal immunostain SolutionA(东洋纺株式会社)稀释了的FGFR3抗体(宿主：小鼠，Santacruz公司)和TACC3抗体(宿主：山羊，R&D社)中在4℃下培养一晩。
次日，用Wash buffer A(Olink公司)清洗后，使用被Can Get Signalimmunostain SolutionA稀释了的Duolink InSitu PLA probe anti-Mouse MINUS和Duolink InSitu PLA probe anti-Goat PLUS(均为Olink公司)将盖玻片在室温下浸渍1小时。用Wash buffer A清洗后，浸渍于Duolink II试剂试剂盒的Ligation-Ligase溶液(Olink公司)中，在37℃下培养30分钟。通过该步骤，处于充分接近的位置上的2种InSituPLA probe抗体之间形成环状寡核苷酸。用Wash buffer A清洗后，添加同一试剂盒的Amplification-Polymerase溶液(Olink公司)，在37℃下培养100分钟。通过该步骤，以环状寡核苷酸为模板核酸延长，且该延长的核酸与荧光标记的寡核苷酸杂交。用Wash buffer B(Olink公司)清洗2次，并且用将Wash buffer B用水稀释了100倍后的溶液清洗1次后，用Duolink Mounting Medium with DAPI(Olink公司)封入，用共聚焦激光显微镜(LSM700；Carl Zeiss公司)进行荧光观察。在FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞中，观察到存在多个荧光点的细胞，与此相对，在NIH3T3细胞中，几乎未观察到荧光点。该荧光点源自与以环状寡核苷酸为模板伸长的核酸杂交的荧光标记寡核苷酸，并且源自2种抗原(即FGFR3和TACC3) 充分接近的状态(即存在于同一分子内)。因此，这说明在本实施例的方法中，通过观察有无荧光点，可判定(检测)有无FGFR3-TACC3融合多肽的存在。
[实施例27]利用免疫染色法检测RT-112细胞中福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中的FGFR3-TACC3融合多肽
(1)样品制备
将实施例19中制作的表达FGFR3-TACC3_v1的RT-112细胞和不表达的HSC-39细胞的FFPE标本在二甲苯和乙醇中分别浸渍3次，每次浸渍8分钟从而除去石蜡，浸渍在ImmunoSaver(日新EM株式会社)中并煮沸。用PBS清洗切片后，用0.2％Triton X-100在室温下反应10分钟。用PBS清洗后，用Protein Block Serum-Free(Dako公司)阻断。
(2)目标融合多肽的检测
按照与实施例26(2)相同的步骤进行免疫染色法检测，并进行荧光观察。在表达FGFR3-TACC3_v1的RT-112细胞中，观测到多个荧光点，与此相对，在不表达FGFR3-TACC3_v1的HSG-39细胞中，几乎未观测到这样的荧光点。由此说明，在含有内源性地表达FGFR3-TACC3融合基因的细胞的FFPE切片中，通过观察荧光点，可判定(检测)有无FGFR3-TACC3融合多肽的存在。
[实施例28]利用免疫染色检测源自膀胱癌患者的FFPE切片中的FGFR3-TACC3融合多肽
(1)样品制备
将购自英国Tissue Solutions公司的膀胱肺癌临床检体的FFPE切片分别在二甲苯和乙醇中浸渍3次，每次浸渍8分钟，由此除去石蜡，浸渍在Immuno Saver(日新EM株式会社)中并煮沸。用Milli-Q水清洗FFPE切片后，用3％过氧化氢水在室温下培养30分钟。用PBS清洗后，在0.2％Triton X-100中在室温下反应10分钟后，在0.5％SDS溶液中反应20分钟。用PBS清洗后，用Protein Block Serum-Free(Dako公司)阻断。
(2)目标融合多肽的检测
将FFPE切片在用Can Get Signal immunostain SolutionA(东洋纺)稀释了的FGFR3抗体(宿主：小鼠，Santacruz公司)和TACC3抗体(宿主：山羊，R&D公司)中在4℃下培养一晩。
次日用Wash buffer A(Olink公司)清洗后，将FFPE切片在被Can Get Signalimmunostain SolutionA稀释了的Duolink InSitu PLA probe anti-Mouse MINUS和Duolink InSitu PLA probe anti-Goat PLUS(均为Olink公司)中在室温下浸渍1小时。用Wash buffer A清洗后，浸渍在Duolink II Bright field试剂试剂盒的Ligation-Ligase溶液(Olink公司)中，在37℃下培养30分钟。在该步骤中，与实施例26、27同样地形成了环状寡核苷酸。用Wash buffer A清洗后，用同一试剂盒的Amplification-Polymerase溶液(Olink公司)在37℃下培养120分钟。通过该步骤，以环状寡核苷酸为模板，核酸伸长。用Wash buffer A清洗后，浸渍在同一试剂盒的Detection Bright Field solution中并在室温下浸渍1小时。通过该步骤，Horseradish peroxidase(HRP)标记的寡核苷酸与前一步骤中伸长的核酸杂交。用Wash buffer A清洗后，添加同一试剂盒的Substrate solution，在室温下反应10分钟至15分钟。用Milli-Q水清洗后，添加同一试剂盒的Nuclear stainsolution，在室温下反应2分钟后，用自来水清洗。然后，使用乙醇和二甲苯进行脱水使其清澈后，封入。
用显微镜(BZ-9000；KEYENCE公司)观察明视野时，在通过实施例23的方法确认到表达了FGFR3-TACC3_v1的源自膀胱癌患者组织的FFPE切片中，观察到红色的染色，与此相对，在通过实施例23的方法未确认到FGFR3和TACC3的融合基因的表达的源自患者组织的切片中未观察到红色的染色。该红色的染色源自与以环状寡核苷酸作为模板伸长的核酸杂交的HRP标记寡核苷酸，并且与实施例26及27一样也是源自FGFR3和TACC3存在于同一分子内。因此，说明在观察到红色染色的切片中，FGFR3和TACC3以融合的状态存在。由此说明，在本实施例的方法中，在源自膀胱癌患者组织的FFPE切片中，也可以通过观察红色染色，来判定(检测)有无FGFR3-TACC3融合多肽的存在。
[实施例29]化合物A、B、C、D及E对FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
依据实施例21(4)的方法，研究化合物A、B、C、D及E对FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用。其中，各化合物以最终浓度为100nM、10nM、1nM的方式进行添加。
结果发现，化合物A、B、C、D及E抑制了精制FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对肽基质的磷酸化活性。各化合物在各个最终浓度下对于肽基质的抑制比例(％)示于表2。
[表2]
[实施例30]化合物A、B、C、D及E对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、及源自膀胱癌患者的细胞株RT-112的锚定非依赖性细胞增殖抑制作用
对于FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞及FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞，使用与实施例9同样的培养基；对于源自膀胱癌患者的细胞株RT-112，以 每一个孔为1×103个的方式接种在含有10％牛胎儿血清及2mM L-glutamine的RPMI1640培养基中。另外，各化合物以最终浓度为100nM、10nM、1nM的方式进行添加。其他条件采用与实施例9同样的方法进行化合物A、B、C、D及E的FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞及源自膀胱癌患者的细胞株RT-112的增殖抑制作用评价。结果发现，化合物A、B、C、D及E抑制了FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞及源自膀胱癌患者的细胞株RT-112的锚定非依赖性增殖亢进作用。各化合物在各最终浓度下的对于细胞增殖的抑制比例(％)示于表3。
由以上的结果可知，通过化合物A、B、C、D、E及F，能够抑制表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的癌细胞或肿瘤的增殖。
[表3]
工业实用性
本发明的检测方法可用于判定本说明书的融合基因阳性或本发明的多肽阳性的癌症患者。另外，本发明的检测用试剂盒、引物组及探针组可用于上述检测方法。另外，抑制本发明的多肽的物质可用作FGFR3基因和TACC3基因的融合基因阳性或本发明的多肽阳性的癌 (特别是肺癌或膀胱癌)的治疗用医药组合物。
序列表文本
以下序列表的数字标识符<223>中记载了“人工序列(Artificial Sequence)”的说明。具体而言，序列表的序列号13、14、及21中所示的各碱基序列为人工合成的引物序列。序列表的序列号22中所示的各碱基序列为人工合成的FLAG标签序列。

Claims (5)

1.检测编码下述多肽的多核苷酸的存在的引物组在制备用于检测从受试者得到的试样中的纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)基因和转化酸性卷曲螺旋含蛋白3(TACC3)基因的融合基因的检测试剂盒中的应用：
所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
2.检测编码下述多肽的多核苷酸的存在的探针组在制备用于检测从受试者得到的试样中的纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)基因和转化酸性卷曲螺旋含蛋白3(TACC3)基因的融合基因的检测试剂盒中的应用：
所述多肽为由序列号2、序列号4、序列号6、序列号26或序列号28所示的氨基酸序列构成的多肽。
3.用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，所述融合基因编码的多肽为通过FGFR3的羧基末端侧和TACC3的氨基末端侧的融合而形成的多肽，所述引物组选自由下述a)～c)所构成的组：
a)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成；
b)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成；以及
c)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
4.用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物组，所述融合基因编码的多肽为通过FGFR3的羧基末端侧和TACC3的氨基末端侧的融合而形成的多肽，所述引物组选自由下述a)～c)所构成的组：
a)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的16至40个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16至40个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成；
b)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的16至40个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16至40个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成；以及
c)正义引物和反义引物的引物组，所述正义引物由序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的16至40个碱基的寡核苷酸构成，所述反义引物由与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16至40个碱基的寡核苷酸互补的寡核苷酸构成。
5.用于检测FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探针组，所述融合基因编码的多肽为通过FGFR3的羧基末端侧和TACC3的氨基末端侧的融合而形成的多肽，所述探针组选自由下述a)～c)构成的组：
a)探针组，其包含由含有与序列号1的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的邻接的探针对构成的多种探针组、以及由含有与序列号1的碱基编号2281～2856中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的邻接的探针对构成的多种探针组；
b)探针组，其包含由含有与序列号3的碱基编号1～2280中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组、以及由含有与序列号3的碱基编号2281～2961中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组；以及
c)探针组，其包含由含有与序列号5的碱基编号1～2368中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组、以及由含有与序列号5的碱基编号2369～3003中任意的连续的至少16个碱基互补的寡核苷酸的多种邻接的探针对构成的探针组。
CN201380012774.XA 2012-03-08 2013-03-07 新型fgfr3融合体 Active CN104379740B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012052147 2012-03-08
JP2012-052147 2012-03-08
JP2012-195451 2012-09-05
JP2012195451 2012-09-05
JP2012280325 2012-12-21
JP2012-280325 2012-12-21
PCT/JP2013/056225 WO2013133351A1 (ja) 2012-03-08 2013-03-07 新規ｆｇｆｒ３融合体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104379740A CN104379740A (zh) 2015-02-25
CN104379740B true CN104379740B (zh) 2019-05-14

Family

ID=49116820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380012774.XA Active CN104379740B (zh) 2012-03-08 2013-03-07 新型fgfr3融合体

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9481911B2 (zh)
EP (1) EP2824181B1 (zh)
JP (1) JP6107812B2 (zh)
KR (4) KR20220017512A (zh)
CN (1) CN104379740B (zh)
AU (1) AU2013228389A1 (zh)
BR (1) BR112014021897B1 (zh)
CA (1) CA2865388C (zh)
EA (1) EA029140B1 (zh)
ES (1) ES2702305T3 (zh)
HK (1) HK1205528A1 (zh)
MX (1) MX365214B (zh)
PH (1) PH12014501918A1 (zh)
PL (1) PL2824181T3 (zh)
PT (1) PT2824181T (zh)
WO (1) WO2013133351A1 (zh)
ZA (1) ZA201406570B (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201007286D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201118656D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201118652D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201118654D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201209613D0 (en) 2012-05-30 2012-07-11 Astex Therapeutics Ltd New compounds
JP6382194B2 (ja) * 2012-07-24 2018-08-29 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 融合タンパク質およびその方法
US20150203589A1 (en) 2012-07-24 2015-07-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2902489B9 (en) 2012-09-27 2018-02-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fgfr3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same
US11230589B2 (en) * 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof
WO2014139145A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Hutchison Medipharma Limited Novel pyrimidine and pyridine compounds and usage thereof
WO2014165710A2 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Life Technologies Corporation Gene fusions
TW201605452A (zh) * 2013-08-28 2016-02-16 安斯泰來製藥股份有限公司 以嘧啶化合物作爲有效成分之醫藥組成物
CN105980555A (zh) * 2013-12-19 2016-09-28 日本国立癌症研究中心 作为胃癌的责任因子的新型融合基因
US10048277B2 (en) 2014-01-24 2018-08-14 Japanese Foundation For Cancer Research Method for detecting an FGFR3/TACC3 fusion protein, or encoding gene thereof
WO2015120094A2 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method of identifying tyrosine kinase receptor rearrangements in patients
KR102479693B1 (ko) 2014-03-26 2022-12-22 아스텍스 테라퓨틱스 리미티드 조합물
WO2015144808A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Astex Therapeutics Ltd Combinations of an fgfr inhibitor and an igf1r inhibitor
JO3512B1 (ar) 2014-03-26 2020-07-05 Astex Therapeutics Ltd مشتقات كينوكسالين مفيدة كمعدلات لإنزيم fgfr كيناز
JOP20200201A1 (ar) 2015-02-10 2017-06-16 Astex Therapeutics Ltd تركيبات صيدلانية تشتمل على n-(3.5- ثنائي ميثوكسي فينيل)-n'-(1-ميثيل إيثيل)-n-[3-(ميثيل-1h-بيرازول-4-يل) كينوكسالين-6-يل]إيثان-1.2-ثنائي الأمين
US10478494B2 (en) * 2015-04-03 2019-11-19 Astex Therapeutics Ltd FGFR/PD-1 combination therapy for the treatment of cancer
JP6524833B2 (ja) * 2015-07-17 2019-06-05 コニカミノルタ株式会社 蛍光体集積ナノ粒子を用いたｆｉｓｈまたは免疫染色スライドの封入方法
RU2747644C2 (ru) 2015-09-23 2021-05-11 Янссен Фармацевтика Нв Бигетероарил-замещенные 1,4-бензодиазепины и пути их применения для лечения рака
KR20180052623A (ko) 2015-09-23 2018-05-18 얀센 파마슈티카 엔.브이. 신규 화합물
CN111424081B (zh) * 2020-04-13 2023-04-25 广东省妇幼保健院 基于多重荧光定量pcr技术检测软骨发育不全fgfr3基因突变的引物、探针和试剂盒
EP4200019A1 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Genzyme Corporation Fgfr3 antibodies and methods of use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1976706A (zh) * 2003-11-07 2007-06-06 希龙公司 抑制fgfr3及治疗多发性骨髓瘤

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005046589A2 (en) 2003-11-07 2005-05-26 Chiron Corporation Pharmaceutically acceptable salts of quinolinone compounds having improved pharmaceutical properties
US7737149B2 (en) 2006-12-21 2010-06-15 Astrazeneca Ab N-[5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-2H-pyrazol-3-yl]-4-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzamide and salts thereof
AR078411A1 (es) 2009-05-07 2011-11-09 Lilly Co Eli Compuesto de vinil imidazolilo y composicion farmaceutica que lo comprende
US20130096021A1 (en) 2011-09-27 2013-04-18 Arul M. Chinnaiyan Recurrent gene fusions in breast cancer
CA2866611C (en) 2012-02-28 2020-01-07 Astellas Pharma Inc. Nitrogen-containing aromatic heterocyclic compound
JP6382194B2 (ja) * 2012-07-24 2018-08-29 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 融合タンパク質およびその方法
EP2902489B9 (en) 2012-09-27 2018-02-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fgfr3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same
US11230589B2 (en) * 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1976706A (zh) * 2003-11-07 2007-06-06 希龙公司 抑制fgfr3及治疗多发性骨髓瘤

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Novel, Selective Inhibitor of Fibroblast Growth Factor Receptors That Shows a Potent Broad Spectrum of Antitumor Activity in Several Tumor Xenograft Models;Zhao等;《Mol Cancer Ther》;20110907;第10卷(第11期);摘要部分 *
Fusion of EVT6 to fibroblast growth factor receptor 3 in peripheral T-cell lymphoma with a t(4;12)(p16;p13) chromosomal translocation;YAGASAKI等;《Cancer Res》;20011231;第61卷(第23期);全文 *
High incidence of translations t(11;14)(q13;132) and t(4;14)(p16;q32) in patients with plasma cell malignancies;AVET-LOISEAU等;《Cancer Res》;19981231;第58卷(第24期);全文 *
Oncogenic FGFR3 gene fusions in bladder cancer;Williams等;《Human Molecular Genetics》;20121121;第22卷(第4期);摘要部分 *
Targeting Mutant Fibroblast Growth Factor Receptors in Cancer;Heidi等;《Trends Mol Med》;20110530;第17卷(第5期);表2 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102106962B1 (ko) 2020-05-07
KR20140140070A (ko) 2014-12-08
US9481911B2 (en) 2016-11-01
MX365214B (es) 2019-05-27
EA029140B1 (ru) 2018-02-28
EP2824181A4 (en) 2015-07-15
CA2865388A1 (en) 2013-09-12
EP2824181A1 (en) 2015-01-14
JPWO2013133351A1 (ja) 2015-07-30
KR20200046135A (ko) 2020-05-06
EA201491655A1 (ru) 2015-01-30
JP6107812B2 (ja) 2017-04-05
ZA201406570B (en) 2015-12-23
US20160375023A1 (en) 2016-12-29
BR112014021897B1 (pt) 2022-06-14
ES2702305T3 (es) 2019-02-28
KR20220017512A (ko) 2022-02-11
HK1205528A1 (zh) 2015-12-18
PH12014501918A1 (en) 2014-11-24
PL2824181T3 (pl) 2019-02-28
EP2824181B1 (en) 2018-11-14
AU2013228389A1 (en) 2014-09-25
PT2824181T (pt) 2018-12-20
WO2013133351A1 (ja) 2013-09-12
MX2014010823A (es) 2015-03-19
US20150031703A1 (en) 2015-01-29
CN104379740A (zh) 2015-02-25
KR20230111270A (ko) 2023-07-25
CA2865388C (en) 2022-01-04
BR112014021897A2 (pt) 2017-07-11
US10004739B2 (en) 2018-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104379740B (zh) 新型fgfr3融合体
Corless et al. PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors: frequency, spectrum and in vitro sensitivity to imatinib
EP2094850B1 (en) Cancer-related protein kinases
Berglund et al. Functional role of the Ca2+-activated Cl− channel DOG1/TMEM16A in gastrointestinal stromal tumor cells
US20150057335A1 (en) Novel fusion genes identified in lung cancer
CN108048567A (zh) 用于确定抵抗雄激素受体疗法的方法和组合物
JP2009100783A (ja) Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子
JP5131946B2 (ja) がんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法
US20130137111A1 (en) Detection method of novel ret fusion
JP2018027019A (ja) 胆道がんにおける新規治療標的融合遺伝子
CN102041316A (zh) miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用
Andrianifahanana et al. ERBB receptor activation is required for profibrotic responses to transforming growth factor β
Cilloni et al. Aberrant activation of ROS1 represents a new molecular defect in chronic myelomonocytic leukemia
CN102365372B (zh) 预测和监控对于Aurora激酶B抑制剂疗法的应答的标记
WO2005018673A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or remedying cardiac hypertrophy and cardiocascular disease caused thereby
Schwarzbach et al. Comparable transforming capacities and differential gene expression patterns of variant FUS/CHOP fusion transcripts derived from soft tissue liposarcomas
Wang et al. Enhanced capacitative calcium entry and TRPC channel gene expression in human LES smooth muscle
WO2008093886A1 (ja) Ｍｃｆ７由来細胞
Ryu et al. Identification of pyridinyltriazine derivatives as potent panFGFR inhibitors against gatekeeper mutants for overcoming drug resistance
Kupzig et al. Studying the Spatial and Temporal Regulation of Ras GTPase‐Activating Proteins
TWI491730B (zh) 穩定表現類大麻素受體ｃｂ２之細胞株及其應用
Lo Functional characterization of the CNPY4 and PEAK3 proteins as regulators of cell signaling
Yun et al. Cellular assays for evaluating calcium-dependent translocation of cPLA2α to membrane
Zakrys Mechanistic and functional analysis of Slit-Robo proteins
Kellner Autoregulation of c-Fes by intramolecular interaction of the F-BAR and SH2 domains: a novel role for the unique N-terminal region

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1205528

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1205528

Country of ref document: HK