KR20200046135A - 신규 fgfr3 융합체 - Google Patents

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KR20200046135A
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마코토 아사우미
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고우이치 니시무라
아키후미 모리나카
도모히로 야마우치
마사야스 요시노
히로아키 요시자키
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아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

암의 새로운 원인 유전자인 폴리뉴클레오티드를 해명하고, 이에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그것이 코드하는 폴리펩티드의 검출 방법, 그 검출용 키트, 프로브 세트, 및 프라이머 세트를 제공하는 것 등을 과제로 한다. 또한, 암 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다. 상기 검출 방법에서는, FGFR3 유전자의 일부와 TACC3 유전자의 일부의 융합 유전자, 또는, 그것이 코드하는 융합 단백질을 검출한다. 상기 프라이머 세트, 프로브 세트 또는 검출용 키트는, FGFR3을 코드하는 부분으로부터 설계되는 센스 프라이머, 프로브 세트와, TACC3을 코드하는 부분으로부터 설계되는 안티센스 프라이머, 프로브 세트를 포함한다. 상기 폴리펩티드의 저해제가 항종양 효과를 나타낸 점에서, 상기 융합 유전자 양성 또는 상기 폴리펩티드 양성의 암 치료용 의약 조성물을 제공한다.

Description

신규 FGFR3 융합체{NOVEL FGFR3 FUSION PRODUCT}
본 발명은, FGFR3 키나아제 영역을 포함하는 신규의 융합 유전자 또는 각 융합 유전자에 의해 코드되는 융합 단백질의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 융합 단백질을 저해하는 물질을 함유하는, 상기 융합 유전자 양성 또는 상기 융합 단백질 양성의 암 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
파이브로블라스트 그로스 팩터 리셉터 3(섬유아세포 성장 인자 수용체(Fibroblast Growth Factor Receptor 3); FGFR3) 유전자는 염색체 4번 단완에 존재하고, 코드하는 단백질은 수용체형 티로신 키나아제이고, 중앙부에 세포막 관통 영역을 갖고, 그 카르복실 말단측에 티로신 키나아제 영역, 아미노 말단측에 세포외 영역을 갖는다. 아미노 말단측의 스플라이싱의 차이에 의해, FGFR3b 및 FGFR3c의 아이소폼이 알려져 있고, FGFR3b는 FGF-1 및 FGF-9, FGFR3c는 FGF-1, -2, -4, -8, -9, -17, -18, -23을 리간드로 하고, 2량체를 형성함으로써 자기의 티로신을 인산화하고 활성화한다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).
다발성 골육종에 있어서, FGFR3 유전자가 염색체간 전좌에 의해 IgH 유전자와 융합하고, 이 전좌에 의해 형성된 단백질의 이상에 의해 세포의 이상 증식이 일어나 연골 발육 부전증의 원인 유전자가 되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 또한, 말초성 T세포 악성 림프종에 있어서, 염색체간 전좌에 의해 FGFR3 유전자와 ETV6 유전자의 융합이 알려져 있다(비특허문헌 4). 또한 방광암 등에 있어서 FGFR3 유전자의 활성화 점변이가 알려져 있고, 이들 활성화 점변이 유전자를 마우스 정상 세포 NIH3T3 세포에 도입하면 암세포 모양으로 형질 전환하는 것이 알려져 있지만, 야생형의 FGFR3 단독으로는 형질 전환은 일어나지 않는 것이 알려져 있다(비특허문헌 5).
트랜스포밍 애시딕 코일드-코일 컨테이닝 프로테인 3(transforming, acidic coiled-coil containing protein 3; TACC3) 유전자는 FGFR3 유전자와 동일한 염색체 4번 단완에 존재하고 16개의 엑손으로 이루어진다. 코드하는 단백질은 스핀들 모터 단백질로서, 유사 분열 방추체의 안정화에 관련되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6).
비특허문헌 1 : 「시토킨·앤드·그로스 팩터·리뷰(Cytokine & Growth Factor Review), (영국), 2005년, 16권, p.139-149」 비특허문헌 2 : 「바이오케미컬·저널(Biochemical journal), ((영국), 2011년, 437권, p.199-213)」 비특허문헌 3 : 「블러드(Blood), ((미국), 2002년, 100권, p.1579-1583)」 비특허문헌 4 : 「캔서 리서치(Cancer Reserch), ((미국), 2001년, 61권, p.8371-8374)」 비특허문헌 5 : 「옹코진(Oncogene), ((영국), 2009년, 28권, p.4306-4316)」 비특허문헌 6 : 「트렌즈·인·셀 바이올로지(Trends in Cell Biology), ((영국), 2008년, 18권, p.379-388)」
암의 새로운 원인 유전자인 폴리뉴클레오티드를 해명하고, 이에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그것이 코드하는 폴리펩티드의 검출 방법, 및 그 검출용 키트, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 이들의 융합 단백질을 발현하는 암환자에 대한 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 약물의 제공을 과제로 한다.
본 발명은, 폐암 환자 및 방광암 환자 검체로부터 얻은 키나아제인 FGFR3의 일부와 TACC3 유전자의 일부가 융합한 신규의 융합 유전자를 단리 동정하고(실시예 1, 2, 3 및 23), 이들 융합 유전자가 폐암 환자 검체 및 방광암 환자 검체에 존재하는 것(실시예 4, 5, 6, 20 및 23), 또한 이들 융합 유전자를 발현시키기 위해 레트로바이러스를 제작하고(실시예 7, 10 및 24), 감염 세포가 종양 형성능을 갖고, 암의 원인 유전자인 것을 발견했다(실시예 8, 11 및 25). 상기 신규 융합 유전자 및 상기 신규 융합 유전자에 의해 코드되는 융합 단백질을 인간 방광암 환자 유래 세포주나 폐암 환자 검체 및 방광암 환자 검체로부터 검출하는 방법을 구축했다(실시예 4, 5, 6, 19, 20, 27 및 28). 또한, 상기 융합 유전자에 의해 코드되는 융합 단백질의 저해 작용을 갖는 약물이 감염 세포의 종양 형성능을 저해하는 점에서, 이 융합 단백질 또는 이것을 코드하는 융합 유전자를 발현하는 암환자(즉, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암환자)에 대하여 상기 융합 단백질의 저해제가 유효한 것을 발견했다(실시예 9, 12, 13, 14, 16, 22 및 30).
지금까지, 야생형의 FGFR3 단독으로는, 암세포로 형질 전환하지 않는 것으로 생각되고 있었지만, 야생형이라도 TACC3과 융합함으로써, 암세포로 형질 전환하는 것은, 매우 놀랄 만한 일이었다. 또한, 이 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질은, 놀랍게도, FGFR3 키나아제의 카르복시 말단측에서 융합되어 있는 것이 확인되었고, 현재까지 알려져 있는 아미노 말단에서의 융합 키나아제와는 상이한 구조를 하고 있었다.
본 발명자는, 이러한 지견으로부터, 이들 융합 유전자의 검출법을 구축하고, 그것을 위한 키트, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 제공하고, 이들 융합 유전자 또는 그것에 코드되는 융합 단백질을 검출함으로써, 융합 단백질의 저해제에 의한 약물 치료의 대상이 되는 암환자를 선별하는 것을 가능하게 했다. 또한, 상기 융합 단백질 저해제(특히, 화합물 A∼E, 도비티닙(Dovitinib), AZD4547, BGJ398 또는 LY2874455)가 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 활성을 저해하고, FGFR3과 TACC3의 융합 단백질을 발현하는(즉, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의) 암(예컨대 폐암이나 방광암) 등에 유효한 것을 발견했다.
즉, 본 발명은, 이하에 관한 것이다.
[1] 피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 파이브로블라스트 그로스 팩터 리셉터 3(FGFR3) 유전자와 트랜스포밍 애시딕 코일드-코일 컨테이닝 프로테인 3(TACC3) 유전자의 융합 유전자 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 검출 방법:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
[2] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [1]에 기재된 방법.
[4] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [1]에 기재된 방법.
[5] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, [1]에 기재된 방법.
[6] 하기에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계한 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자의 검출용 키트:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
[7] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [6]에 기재된 키트.
[8] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [6]에 기재된 키트.
[9] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [6]에 기재된 키트.
[10] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, [6]에 기재된 키트.
[11] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트로서, 하기 a)∼e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 세트:
a) 서열 번호 1에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 안티센스 프라이머 및 상기 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트,
b) 서열 번호 3에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 안티센스 프라이머 및 상기 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및
c) 서열 번호 5에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 안티센스 프라이머 및 상기 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트,
d) 서열 번호 25에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 안티센스 프라이머 및 상기 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트,
e) 서열 번호 27에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 안티센스 프라이머 및 상기 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는 센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
[12] 서열 번호 1의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 1의 염기 번호 2281∼2856의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
[13] 서열 번호 3의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 3의 염기 번호 2281∼2961의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
[14] 서열 번호 5의 염기 번호 1∼2368의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 5의 염기 번호 2369∼3003의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
[15] 서열 번호 25의 염기 번호 1∼2242의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 25의 염기 번호 2243∼3144의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
[16] 서열 번호 27의 염기 번호 1∼2233의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 27의 염기 번호 2234∼3135의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
[17] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 프로브 세트로서, 하기 a)∼c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 세트:
a) 서열 번호 1의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함), 및 서열 번호 1의 염기 번호 2281∼2856의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)를 포함하는 프로브 세트,
b) 서열 번호 3의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함), 및 서열 번호 3의 염기 번호 2281∼2961의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)를 포함하는 프로브 세트,
c) 서열 번호 5의 염기 번호 1∼2368의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함), 및 서열 번호 5의 염기 번호 2369∼3003의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수 종의 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)를 포함하는 프로브 세트.
[18] 상기 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정이, 피험자로부터 얻은 시료 및 [17]에 기재된 프로브 세트를 이용하여 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 하이브리다이제이션의 시그널을 증폭하는 공정, 및 상기한 시그널의 중복을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자의 검출 방법.
[19] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 [17]에 기재된 프로브 세트 및 하이브리다이즈한 시그널을 증폭하는 시약을 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자의 검출용 키트.
[20] 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정이, i) 피험자로부터 얻은 시료에 상기 폴리펩티드의 FGFR3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체) 및 상기 폴리펩티드의 TACC3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체)를 접촉시키는 공정, ii) 상기 1차 항체에 각각 결합하는, 올리고뉴클레오티드를 연결한 각각의 2차 항체를 첨가하는 공정, iii) 상기 2차 항체가 연결한 상기 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 상보적인 2종류의 올리고뉴클레오티드 및 이들이 근접했을 때에 라이게이션시켜 상기 2차 항체 사이에 고리형 구조를 형성할 수 있는 라이게이스를 함유하는 라이게이션 용액을 첨가하여, 라이게이션 반응시키는 공정, iv) 형성된 고리형 구조에 따라 핵산을 신장시키는 공정, v) 신장한 핵산에 하이브리다이즈할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정, 및 vi) 상기 표지 시그널을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 검출 방법.
[21] [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 검출 방법에서 사용하기 위한, 상기 융합 폴리펩티드의 FGFR3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체) 및 상기 융합 폴리펩티드의 TACC3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체), 상기 1차 항체에 각각 결합하는, 올리고뉴클레오티드를 연결한 2차 항체, 상기 2차 항체에 연결한 상기 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 상보적인 2종류의 올리고뉴클레오티드, 이들이 근접했을 때에 라이게이션시켜 상기 2차 항체 사이에 고리형 구조를 형성할 수 있는 라이게이스, 및 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 검출용 키트.
[22] 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질을 함유하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암 치료용 의약 조성물:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
[23] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[24] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[25] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[26] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[27] 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 [22]에 기재된 의약 조성물.
[28] 상기 폴리펩티드를 저해하는 물질이, 도비티닙, AZD4547, BGJ398 또는 LY2874455인, [22]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 암 치료용 의약 조성물.
[29] 상기 암이, 폐암 또는 방광암인, [22]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 암 치료용 의약 조성물.
[30] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암 치료용 의약 조성물의 제조를 위한, 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질의 용도:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
[31] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암의 치료를 위한, 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질의 용도:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
[32] FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암의 치료를 위한, 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
[33] 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질의 유효량을 대상에 투여하는 것으로 이루어지는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암의 치료 방법:
서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 존재의 검출 방법:
피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정,
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
상기 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정이, 피험자로부터 얻은 시료 및 상기 [17]에 기재된 표지 프로브 세트를 이용하여 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 및 상기 표지의 시그널의 중복을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 단락에 기재된 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 존재의 검출 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 진단 방법:
피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정,
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
상기 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정이, 피험자로부터 얻은 시료 및 상기 [17]에 기재된 표지 프로브 세트를 이용하여 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 및 상기 표지의 시그널의 중복을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 단락에 기재된 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 진단 방법에 관한 것이다.
또한, 다른 양태로서, 본 발명은, 상기 2가지 양태의 진단 방법에 의해 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)으로 진단된 환자에 대하여 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(어떤 양태에서는 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398 또는 화합물 LY2874455)을 투여하는 것을 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 존재의 검출 방법:
(1) 피험자로부터 얻은 시료를 주형으로 하고, 상기 [11]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 행하는 공정, 및
(2) PCR 산물의 존재를 검출하는 공정
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 진단 방법:
(1) 피험자로부터 얻은 시료를 주형으로 하고, 상기 [11]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 행하는 공정, 및
(2) PCR 산물의 존재를 검출하는 공정
에 관한 것이다.
또한, 다른 양태로서, 본 발명은, 상기한 진단 방법에 의해 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)으로 진단된 환자에 대하여 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(어떤 양태에서는 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398 또는 화합물 LY2874455)을 투여하는 것을 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 염색체의 재구성(genomic rearrangement)을 검출하는 방법:
피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정,
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 염색체의 재구성(genomic rearrangement)을 검출하는 방법:
(1) i) 피험자로부터 얻은 시료, ii) FGFR3 유전자를 코드하는 5'측 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제1 프로브), 및 iii) TACC3 유전자를 코드하는 3' 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제2 프로브)를 이용하여(여기서, 제1 프로브와 제2 프로브의 형광은 상이함), 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 및
(2) 상기 표지의 시그널의 중복을 검출하는 공정
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 존재의 검출 방법:
(1) i) 피험자로부터 얻은 시료, ii) FGFR3 유전자를 코드하는 5'측 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제1 프로브), 및 iii) TACC3 유전자를 코드하는 3' 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제2 프로브)를 이용하여(여기서, 제1 프로브와 제2 프로브의 형광은 상이함), 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 및
(2) 상기 표지의 시그널의 중복을 검출하는 공정
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 진단 방법:
(1) i) 피험자로부터 얻은 시료, ii) FGFR3 유전자를 코드하는 5'측 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제1 프로브), 및 iii) TACC3 유전자를 코드하는 3' 게놈 영역을 포함하는 형광 표지 프로브(제2 프로브)를 이용하여(여기서, 제1 프로브와 제2 프로브의 형광은 상이함), 인시츄 하이브리다이제이션을 행하는 공정, 및
(2) 상기 표지의 시그널의 중복을 검출하는 공정
에 관한 것이다.
또한, 다른 양태로서, 본 발명은, 상기한 진단 방법에 의해 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)으로 진단된 환자에 대하여 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(어떤 양태에서는 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398, 또는 화합물 LY2874455)을 투여하는 것을 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드(이하, 「본 발명의 폴리펩티드」라고도 함) 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드(이하, 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」라고도 함):
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, FGFR3과 TACC3의 융합 단백질의 검출 방법:
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 존재의 검출 방법:
피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정,
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 진단 방법:
피험자로부터 얻은 시료 중의, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정,
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947(또는 서열 번호 2), 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982(또는 서열 번호 4), 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996(또는 서열 번호 6), 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043(또는 서열 번호 26) 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040(또는 서열 번호 28)에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
에 관한 것이다.
또한, 다른 양태로서, 본 발명은, 상기한 진단 방법에 의해 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)으로 진단된 환자에 대하여, 상기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질(어떤 양태에서는 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398, 또는 화합물 LY2874455)을 투여하는 것을 포함하는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료 방법에 관한 것이다.
Science. 2012 Sep 7 ; 337(6099) : 1231-5. Epub 2012 Jul 26.에는, 암화능을 나타내는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자가 존재하는 것, FGFR 저해제 PD173074, AZD4547, BGJ398이 FGFR3-TACC3 융합 유전자 발현 세포의 증식을 저해하는 것, FGFR 저해 치료가 유익한 글리오블라스토마 환자군의 동정에 FGFR3-TACC3 융합 유전자 발현이 기여할 가능성을 시사하는 보고가 이루어져 있지만, 본원 최우선의 우선일(2012년 3월 8일) 후의 문헌이다. 상기 문헌에는, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v1 및 FGFR3-TACC3_v2와 융합점을 동일하게 하는 유전자 단편의 서열이 기재되어 있지만, 그 전체 길이는 밝혀져 있지 않고, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v3, FGFR3-TACC3_v5a, 및 FGFR3-TACC3_v5b나 그 검출 방법 프라이머 세트, 프로브 세트, 검출 키트는 전혀 개시도 시사도 되어 있지 않다. 또한, 폐암 및 방광암에 관한 기재도 시사도 없다.
또한, Hum Mol Genet. 2012. Nov21(Hum Mol Genet. 2013 Feb 15 ; 22(4) : 795-803)에는, 암화능을 갖는 FGFR3과 TACC3의 융합 유전자(본 발명의 FGFR3-TACC3_v1)가 방광암에 존재하는 것이 보고되어 있지만, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v1을 개시한 본원 최우선의 우선일(2012년 3월 8일) 및 본원 제2의 우선일(2012년 9월 5일) 후의 문헌이다. 상기 문헌에는, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v2, FGFR3-TACC3_v3, FGFR3-TACC3_v5a, 및 FGFR3-TACC3_v5b나 그 검출 방법 프라이머 세트, 프로브 세트, 검출 키트는 전혀 개시도 시사도 되어 있지 않다. 또한, 폐암에 관한 기재도 시사도 없다.
또한, J Clin Invest. 2013 February 1 ; 123(2) : 855_865.에는 몇가지의 암화능을 갖는 FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자가 글리오블라스토마에 존재하는 것이 보고되어 있지만, 본 문헌은, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v1 및 FGFR3-TACC3_v2를 개시한 본원 최우선의 우선일(2012년 3월 8일), 본원 제2의 우선일(2012년 9월 5일) 및 본원 제3의 우선일(2012년 12월 21일)보다 후에 출판된 문헌이다. 상기 문헌에는, 본 발명의 FGFR3-TACC3_v3, FGFR3-TACC3_v5a, 및 FGFR3-TACC3_v5b나 그 검출 방법 프라이머 세트, 프로브 세트, 검출 키트는 전혀 개시도 시사도 되어 있지 않다. 또한, 폐암 및 방광암에 관한 기재도 시사도 없다.
본 발명의 검출 방법은, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)을 검출하는 방법으로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 염색체의 재구성을 검출하는 방법으로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법에 의하면, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질에 의한 치료의 적용 대상자인지의 여부를 감별할 수 있다. 본 발명의 검출용 키트, 프라이머 세트 및 프로브 세트는, 본 발명의 검출 방법에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질은, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료용 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
<본 발명의 검출 방법>
본 발명의 검출 방법은, 융합 유전자 또는 융합 단백질을 검출하는 방법이고, 상기 방법은, 피험자로부터 얻은 시료 중의, 특정한 폴리뉴클레오티드, 또는, 폴리펩티드의 존재를 검출하는 공정을 포함한다. 피험자로부터 얻은 시료로는, 피험자로부터의 채취물(생체로부터 분리한 시료), 구체적으로는, 임의의 채취된 조직, 체액(바람직하게는 혈액), 폐포·기관지 세정액, 생검된 시료, 뇨 중 암세포, 객담 시료를 이용하지만, 적합하게는, 피험자의 폐 환부 또는 방광 환부의 생검 시료 또는 객담 시료를 이용한다. 시료로부터 게놈 DNA를 추출하여 이용할 수 있고, 또한 그 전사 산물(게놈이 전사 및 번역되는 결과로 생기는 산물 ; 예컨대 mRNA, cDNA, 단백질)을 이용할 수 있다. 특히 mRNA 또는 cDNA를 조제하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 시료를 포르말린 고정하고 파라핀에 포매하여 안정화시킨 표본(FFPE)을 이용할 수 있다. FFPE를 얇게 슬라이스한 FFPE 세그먼트 중을 이용해도 좋다. FFPE 세그먼트 중을 이용하면, 그곳에 존재하는 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드를 직접 검출할 수 있다.
융합 유전자의 검출 방법에서의 「폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정」에 있어서, 그 검출 대상이 되는 폴리뉴클레오티드(이하, 「검출 대상 폴리뉴클레오티드」라고 함)는, 「FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자」이고, 이것은, FGFR3 유전자의 일부와 TACC3 유전자의 일부를 포함하는 유전자이다.
「FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자」로는, FGFR3의 기능 도메인의 하나인 키나아제 도메인을 코드하는 서열과 TACC3의 기능 도메인의 하나인 코일드-코일 도메인을 코드하는 서열을 갖는 융합 유전자를 들 수 있다. 암을 일으키는 융합 유전자로서 PTC-RET(Clin. Cancer Res. 2009 ; 7119-7123), KIF5B-ALK(Clin. Cancer Res. 2009 ; 3143-3149), KIF5B-RET(Nature medicine 2012 ; Feb 12 ; Epub ahead of print, Nat Med. 2012 Feb 12 ; 18(3) : 375-7), EML4-ALK(Nature 2007 ; 561-566) 등이 알려져 있고, 이들 융합 유전자는 5' 말단측에 코일드-코일 도메인을 갖는 단백질의 유전자와 3' 말단측에 리간드 결합 부위를 결손한 키나아제 유전자가 결합한 융합 유전자이고, NIH3T3 세포에 강제적으로 발현시키면 형질 전환을 야기하는 것이 알려져 있다. 예컨대, 리간드 결합 부위를 갖지 않는 KIF5B-RET 융합 유전자를 발현시킨 3T3 세포는, 리간드 비의존적으로 RET 키나아제 활성화에 중요한 905번째의 티로신 자기 인산화가 야기되고 활성화된다. 이 자기 인산화는, RET 저해제인 반데타닙(Vandetanib)에 의해 저해되어 세포사를 야기하는 것이 알려져 있다(Nature medicine 2012 ; Feb 12 ; Epub ahead of print, Nat Med. 2012 Feb 12 ; 18(3) : 375-7). 또한, 마찬가지로 리간드 결합 부위를 갖지 않는 EML4-ALK 융합 유전자를 내재적으로 발현하고 있는 세포주에서도 ALK의 키나아제 활성에 중요한 1604번째의 인산화가 야기되어 있고, ALK에 저해 활성을 갖는 TAE684에 의해 인산화가 저해되고 증식이 저해되는 것이 알려져 있다(Clin. Cancer Res. 2008 ; 4275-4283). 또한, EML4-ALK 융합 유전자를 발현하고 있는 폐암 환자에 대하여, ALK 키나아제 저해제인 크리조티닙(Crizotinib)이 유효한 치료약인 것이 시사되어 있다(Drug Des. Devel. Ther. 2011 ; 471-485). 이들 융합 유전자에 코드되는 융합 단백질의 활성화 기구로서, 코일드-코일 도메인을 통한 호모 2량체화에 의해, 융합되어 있는 키나아제 도메인의 리간드 비의존적인 항상적 활성화가 야기되는 것이 시사되어 있다. 또한, 융합되어 있는 키나아제의 저해제를 사용함으로써, 이와 같이 융합 단백질의 기능을 저해할 수 있는 것이 시사되어 있다. 따라서, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자에 관해서도, FGFR3의 키나아제 도메인과 TACC3의 코일드-코일 도메인이 암화를 야기하는 중요한 도메인으로 예측된다. 따라서, 상기 「검출 대상 폴리뉴클레오티드」로는, 예컨대, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 중, FGFR3의 키나아제 도메인과 TACC3의 코일드-코일 도메인에 해당하는 서열을 코드하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 어떤 양태에 있어서, 이들의 영역 내의 부분을 검출하는 것에 의해서도, 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드[이하, 「상동 폴리펩티드」라고도 함],
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982, 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996, 서열 번호 26의 아미노산 번호 461∼1043 또는 서열 번호 28의 아미노산 번호 461∼1040에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드[이하, 「기능적 등가 개변체 폴리펩티드」라고도 함], 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
바람직한 상기 검출 대상 폴리뉴클레오티드로는, 하기 (1)∼(3)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
(1) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드,
(2) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는
(3) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
더욱 바람직한 상기 검출 대상 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 25 또는 서열 번호 27에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
서열 번호 1에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, FGFR3 유전자 배리언트 3(진뱅크(GenBank) 등록 번호 : NM_001163213.1)의 염기 번호 257(엑손 2의 퍼스트 메티오닌에 대응)로부터 2536(엑손 18의 3' 말단에 대응)과 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 염기 번호 2050(엑손 11의 5' 말단에 대응)으로부터 2625(엑손 16의 스톱 코돈에 대응)까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 1에 표시되는 염기 서열 중, 염기 번호 1∼2280의 서열은 FGFR3 유전자에서 유래되고, 염기 번호 2281∼2856의 서열은 TACC3 유전자에서 유래된다. 이 융합 폴리뉴클레오티드를 FGFR3-TACC3_v1이라고 한다. 서열 번호 1의 염기 번호 1∼2856은, 융합 단백질의 오픈 리딩 프레임(ORF)이고, 이 ORF에 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타낸다.
서열 번호 3에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, FGFR3 유전자 배리언트 3(진뱅크 등록 번호 : NM_001163213.1)의 염기 번호 257(엑손 2의 퍼스트 메티오닌에 대응)로부터 2536(엑손 18의 3' 말단에 대응)과 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 염기 번호 1945(엑손 10의 5' 말단에 대응)로부터 2625(엑손 16의 스톱 코돈에 대응)까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 3에 표시되는 염기 서열 중, 염기 번호 1∼2280의 서열은 FGFR3 유전자에서 유래되고, 염기 번호 2281∼2961의 서열은 TACC3 유전자에서 유래된다. 이 융합 폴리뉴클레오티드를 FGFR3-TACC3_v2라고 한다. 서열 번호 3의 염기 번호 1∼2961은, 융합 단백질의 ORF이고, 이 ORF에 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타낸다.
서열 번호 5에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, FGFR3 유전자 배리언트 3(진뱅크 등록 번호 : NM_001163213.1)의 염기 번호 257(엑손 2의 퍼스트 메티오닌에 대응)로부터 2624(엑손 19의 도중에 대응)와 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 인트론 59 염기를 사이에 두고, 염기 번호 2050(엑손 11의 5' 말단에 대응)으로부터 2625(엑손 16의 스톱 코돈에 대응)까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 5에 표시되는 염기 서열 중, 염기 번호 1∼2368의 서열은 FGFR3 유전자에서 유래되고, 염기 번호 2369∼2427의 서열은 TACC3의 게놈 서열에서 유래되고, 염기 번호 2428∼3003의 서열은 TACC3 유전자에서 유래된다. 이 융합 폴리뉴클레오티드를 FGFR3-TACC3_v3이라고 한다. 서열 번호 5의 염기 번호 1∼3003은, 융합 단백질의 ORF이고, 이 ORF에 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 6에 나타낸다.
서열 번호 25에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, FGFR3 유전자 배리언트 3(진뱅크 등록 번호 : NM_001163213.1)의 염기 번호 257로부터 2498(다만, 1980번째는 C가 아니라 G)과 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 염기 번호 1771로부터 2672까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 25에 표시되는 염기 서열 중, 염기 번호 1∼2242의 서열은 FGFR3 유전자에서 유래되고, 염기 번호 2243∼3144의 서열은 TACC3 유전자에서 유래된다. 이 융합 폴리뉴클레오티드를 FGFR3-TACC3_v5a라고 한다. 서열 번호 25의 염기 번호 1∼3144는, 융합 단백질의 ORF이고, 이 ORF에 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 26에 나타낸다.
서열 번호 27에 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, FGFR3 유전자 배리언트 3(진뱅크 등록 번호 : NM_001163213.1)의 염기 번호 257로부터 2498과 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 염기 번호 1771로부터 2672까지의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 다만, 일부에 폴리뉴클레오티드의 결실과 삽입이 존재한다. 결실되어 있는 부분은, FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 690번째부터 701번째(엑손 4의 3'측의 서열)에 상당한다. 삽입되어 있는 부분은, FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 1528번째와 1529번째 사이(엑손 10과 엑손 11 사이)에 상당하고, CAG라는 서열이 삽입되어 있다. 서열 번호 27에 표시되는 염기 서열 중, 염기 번호 1∼2233의 서열은 FGFR3 유전자에서 유래되고, 염기 번호 2234∼3135의 서열은 TACC3 유전자에서 유래된다. 이 융합 폴리뉴클레오티드를 FGFR3-TACC3_v5b라고 한다. 서열 번호 28의 염기 번호 1∼3135는, 융합 단백질의 ORF이고, 이 ORF에 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 28에 나타낸다.
FGFR3-TACC3_v1, FGFR3-TACC3_v2, FGFR3-TACC3_v3, FGFR3-TACC3_v5a, FGFR3-TACC3_v5b를 총칭하여 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드라고 한다.
다른 양태에서의 상기 검출 대상 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 1의 염기 번호 1381∼2841에 대응하는 FGFR3-TACC3_v1의 부분 서열, 서열 번호 3의 염기 번호 1381∼2946에 대응하는 FGFR3-TACC3_v2의 부분 서열, 서열 번호 5의 염기 번호 1381∼2988에 대응하는 FGFR3-TACC3_v3 등을 들 수 있다.
바람직한 「상동 폴리펩티드」로는, 「서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드」를 들 수 있지만, 상기 동일성이, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 특히 바람직하다.
바람직한 「기능적 등가 개변체 폴리펩티드」로는, 「서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개, 바람직하게는 1∼수개, 더욱 바람직하게는 1∼7개, 가장 바람직하게는 1∼5개의 아미노산이 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드」가 바람직하고, 「서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드」가 특히 바람직하다.
또, 본 명세서에서의 상기 「동일성」이란, NEEDLE 프로그램(J Mol Biol 1970 ; 48 : 443-453) 검색에 의해 디폴트로 준비되어 있는 파라미터를 이용하여 얻어진 값 일치도(Identity)를 의미한다. 상기한 파라미터는 이하와 같다.
갭 페널티(Gap penalty) = 10
익스텐드 페널티(Extend penalty) = 0.5
매트릭스(Matrix) = EBLOSUM62
어느 폴리펩티드가 「종양 형성능을 갖는」 것은, 하기 실시예 8에 기재되는 방법으로 확인한다. 구체적으로는, 상기 융합 유전자를 NIH3T3 세포에 도입하고, 스페로이드 플레이트를 이용하여 부착면에 비의존적인 세포 증식 작용을 확인하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 융합 유전자를 도입한 세포를 누드 마우스의 피하에 접종한 후, 일정 기간 관찰하여, 종양 형성을 확인하는 방법이어도 좋다.
본 발명의 검출 방법에서의 검출 대상 폴리뉴클레오티드로는, 「서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하고, 「서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 26 또는 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 가장 바람직하다.
본 발명의 융합 유전자의 검출 방법에서의 「폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 공정」은, 피험자로부터 얻은 시료의 게놈 중의 검출 대상 폴리뉴클레오티드(융합점을 포함하는 게놈 서열)의 존재를 검출하는 것, 피험자로부터 얻은 시료로부터 추출한 게놈 DNA의 전사 산물(예컨대 mRNA 또는 cDNA)을 조제하고, 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 대응하는 mRNA 또는 cDNA의 존재를 검출하는 것, 또는, 필요에 따라 전처리한 피험자로부터 얻은 시료 중의 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 존재를 인시츄 하이브리다이제이션에 의해 검출함으로써 실시한다.
게놈 DNA의 추출은 공지된 방법으로 행할 수 있고, 시판되는 DNA 추출 키트을 이용하여 간편히 행할 수 있다.
검출 공정은 공지된 유전자 해석법(예컨대, 유전자 검출법으로서 상용되는 PCR, LCR(Ligase chain reaction; 리가제 연쇄 반응), SDA(Strand displacement amplification; 가닥 치환 증폭), NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification; 핵산 순서 기반 증폭), ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids; 핵산의 등온 및 키메라 프라이머-개시된 증폭), LAMP 법(Loop-mediated isothermal amplification; 루프-매개된 등온 증폭), TMA법(Gen-Probe's TMA system; 겐-프로브의 TMA 시스템), 인시츄 하이브리다이제이션(ISH)법, 또한 마이크로어레이 등 주지된 방법)에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 핵산을 프로브로 한 하이브리다이제이션 기술, 또는, 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 DNA를 프라이머로 한 유전자 증폭 기술 등을 이용한다.
구체적으로는, 피험자로부터 얻은 시료 유래의 핵산, 예컨대, mRNA 등을 이용하여 측정한다. mRNA 량의 측정은, 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계한 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응 방법으로 측정한다. 본 발명의 검출 방법에 이용되는 프라이머, 또는, 검출용 키트에 포함되는 프라이머는, 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않고, 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 기초하여 설계한다. PCR 증폭 모니터법에서의 프라이머 설계는, 프라이머 설계 소프트웨어(예컨대, 프라이머 익스프레스(Primer Express); 어플라이드 바이오시스템즈사) 등을 이용하여 할 수 있다. 또한, PCR 산물의 사이즈가 커지면 증폭 효율이 나빠지기 때문에, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머는, mRNA 또는 cDNA를 대상으로 증폭했을 때의 증폭 산물의 크기가 1 kb 이하가 되도록 설정하는 것이 적절하다.
보다 구체적으로는, 센스 프라이머(5'-프라이머)를 FGFR3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(특히 cDNA)의 FGFR3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터, 안티센스 프라이머(3'-프라이머)를 TACC3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(특히 cDNA)의 TACC3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한다. 또는, 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머의 한쪽을, 상기 융합 폴리뉴클레오티드의 융합점(후술)을 포함하는 영역에 대응하도록 설계해도 좋다. 바람직하게는, 본 발명의 검출용 키트에 포함되는 프라이머 세트를 이용하고, 더욱 바람직하게는, 본 발명의 검출용 키트에 가장 적합하게 포함되는 프라이머 세트를 이용한다. PCR 증폭 모니터법에서는, 각 유전자에 대응한 상기 센스 프라이머를 섞음으로써, 1 반응액에 의해 모든 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 검출하는 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR)을 설계할 수도 있다. 각 증폭 기술에 알맞은 방법에 의해 목적으로 한 유전자(전체 또는 그 특이적 부분)가 증폭되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 예컨대, PCR 법에서는, PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분석하고, 에티듐 브로마이드 염색 등에 의해 목적으로 하는 사이즈의 증폭 단편이 얻어졌는지의 여부를 확인할 수 있다. 목적으로 하는 사이즈의 증폭 단편이 얻어진 경우에는, 피험자로부터 얻은 시료에 있어서, 검출 대상 폴리뉴클레오티드가 존재하고 있었던 것이 된다. 이와 같이, 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있다.
본 발명의 융합 유전자의 검출 방법으로는, 피험자로부터 얻은 시료 중의, 특정한 폴리뉴클레오티드의 존재를 유전자 증폭 반응에 의해 검출하는 공정에 더하여, 또한 목적으로 하는 사이즈의 증폭 단편이 얻어졌는지의 여부를 검출하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
하이브리다이제이션 기술을 이용한 검출은, 예컨대, 노던 하이브리다이제이션, 도트 블롯법, DNA 마이크로어레이법, RNA 프로텍션법 등을 사용하여 행한다. 하이브리다이제이션에 이용하는 프로브로는, 검출 대상 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄에 스트린젠트한 조건하에서(바람직하게는 보다 스트린젠트한 조건하에서) 하이브리다이즈하는 연속한 적어도 32 염기의 핵산 분자로서, 융합점을 중심으로 그 상류 및 하류의 각각 16 염기로 이루어지는 서열(구체적으로는, 서열 번호 1에 표시되는 염기 서열의 제2265번∼제2296번(제2280번/제2281번), 또는 서열 번호 3에 표시되는 염기 서열의 제2265번∼제2296번(제2280번/제2281번), 서열 번호 5에 표시되는 염기 서열의 제2353번∼제2384번(제2368번/제2369번), 서열 번호 25에 표시되는 염기 서열의 제2227번∼제2258번(제2242번/제2243번), 또는 서열 번호 27에 표시되는 염기 서열의 제2218번∼제2249번(제2233번/제2234번). 또, 괄호 내의 염기 번호는 융합점을 나타냄), 또는 이들의 상보쇄를 포함하는 프로브를 이용할 수 있다.
또, 본 명세서에서의 융합점이란, FGFR3 유전자 유래의 부분과 TACC3 유전자 유래의 부분이 융합한 점을 의미한다.
인시츄 하이브리다이제이션 기술을 이용한 검출은, 공지된 FISH 법(퓨전 아세이(fusion assay))에 따라 실시할 수 있다. 또는, 크로모제닉 인시츄 하이브리다이제이션(CISH)법과 실버 인시츄 하이브리다이제이션(SISH)법을 조합시킨 퓨전 아세이로 실시할 수 있다.
인시츄 하이브리다이제이션 기술을 이용한 검출은, 공지된 RNA FISH 법(J. Mol. Diagn. 2012 ; 22-29)에 따라 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 검출 프로브를 FGFR3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 FGFR3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터, 별도의 검출 프로브를 TACC3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 TACC3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한다. 피험자로부터 얻은 시료와 상기 프로브의 하이브리다이제이션을 행한다. 계속해서, 시그널을 증폭시키는 시약의 하이브리다이제이션을 행하고, 시그널을 증폭시킨다. FGFR3 유전자에서 유래되는 부분으로부터의 시그널과 TACC3 유전자에서 유래되는 부분으로부터의 시그널의 시그널의 중복을 검출한다. 상기 FGFR3 유전자에서 유래되는 부분으로부터 설계한 프로브와 TACC3 유전자에서 유래되는 부분으로부터 설계한 프로브를 검출하는 형광 시약 또는 발색 시약을 별도로 함으로써, 상기 유래가 상이한 2종의 프로브가 동일한 장소(동일 분자 내)에 있는지의 여부를 관찰할 수 있다. 상기 2종의 프로브가 동일한 장소(동일 분자 내)에 있는 것을 관찰함으로써, 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있다. 시그널을 증폭시키기 위해 이용하는 시약으로는, 전치증폭기 믹스(PreAmplifier Mix) QT(아피메트릭스(Affymetrix)사), 증폭기 믹스(Amplifier Mix) QT(아피메트릭스사), 라벨 프로브 믹스(Label Probe Mix)(아피메트릭스사), 및 라벨 프로브 희석제(Label Probe Diluent) QT(아피메트릭스사)를 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서의 「스트린젠트한 조건」이란, 하이브리다이제이션을 위한 조건으로서, 「5×SSPE, 5×덴하르트(Denhardt) 액, 0.5% 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), 50% 포름아미드, 200 ㎍/mL 연어 정자 DNA, 42℃ 오버나이트」, 세정을 위한 조건으로서, 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」의 조건이다. 「보다 스트린젠트한 조건」이란, 하이브리다이제이션을 위한 조건으로서, 「5×SSPE, 5×덴하르트 액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 200 ㎍/mL 연어 정자 DNA, 42℃ 오버나이트」, 세정을 위한 조건으로서, 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」의 조건이다.
또, RT-PCR 등의 유전자 증폭 기술을 이용할 수 있다. RT-PCR 법에 있어서는, 유전자의 증폭 과정에서 PCR 증폭 모니터(리얼타임 PCR)법(Genome Res., 6(10), 986, 1996)를 이용함으로써, 검출 대상 폴리뉴클레오티드의 존재에 관해, 보다 정량적인 해석을 행하는 것이 가능하다. PCR 증폭 모니터법으로는, 예컨대, ABI PRISM7900(어플라이드 바이오시스템즈사)을 이용할 수 있다. 리얼타임 PCR은 공지된 방법이고, 그것을 위한 장치 및 키트는 시판되고 있으며, 이들을 이용하여 간편히 행할 수 있다.
본 발명에서의 융합 유전자 또는 융합 단백질의 검출은, 피험자로부터 얻은 시료에서의, 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 코드되는 폴리펩티드(이하, 「검출 대상 폴리펩티드」라고 함)의 존재를 직접 검출함으로써 실시해도 좋다. 「FGFR3과 TACC3의 융합 단백질」은 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 코드되는 폴리펩티드(즉, 검출 대상 폴리펩티드)이다. 검출 대상 폴리펩티드 중, 서열 번호 2에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v1, 서열 번호 4에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v2, 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v3, 서열 번호 26에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v5a, 서열 번호 28에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v5b라고 한다. FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v1, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v2, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v3, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v5a, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v5b를 총칭하여 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드(FGFR3-TACC3 융합 단백질)라고 한다.
예컨대, 검출 대상 폴리펩티드를 검출하는 공정에서, 검출은, 피험자로부터 얻은 시료(예컨대, 피험자로부터 얻은 암조직이나 세포) 유래의 가용화액을 조제하고, 그 중에 포함되는 검출 대상 폴리펩티드를, 융합 폴리펩티드를 구성하는 각 단백질에 대한 항체(예컨대, FGFR3에 대한 항체와 TACC3에 대한 항체)를 조합시키는 것에 의한 면역학적 측정법 및 효소 활성 측정법을 조합시킨 방법 등에 의해 실시해도 좋다. 또한, 적절하게 전처리(예컨대, 파라핀의 제거)해 놓은 피험자로부터 얻은 시료(예컨대, FFPE 세그먼트)에 포함되는 검출 대상 폴리펩티드를, 융합 폴리펩티드를 구성하는 각 단백질에 대한 항체(예컨대, FGFR3에 대한 항체와 TACC3에 대한 항체)를 조합시키는 것에 의한 면역 조직 염색 기술에 의해 검출을 실시해도 좋다. 이들 수법으로는, 검출 대상 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 이용한, 효소 면역 측정법, 2항체 샌드위치 ELISA 법, 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법, 웨스턴 블로팅법, 면역 조직 염색 등의 수법을 들 수 있다.
면역 조직 염색 기술을 이용한 검출은, 1분자 단위로 목적 폴리펩티드를 특이적으로 검출하는 공지된 기술 근접 라이게이션 분석(Proximity Ligation Assay)(Nat. Methods. 2006 ; 995-1000)에 따라 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 융합 폴리펩티드의 FGFR3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체와, 상기 융합 폴리펩티드의 TACC3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체를 이용하여, 상기 2개의 항체가 동일 분자를 인식하고 있는 것을 상기 기술에 의해 검출함으로써, 검출 대상 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 검출은, i) 피험자로부터 얻은 시료에 상기 융합 폴리펩티드의 FGFR3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체) 및 상기 융합 폴리펩티드의 TACC3 유전자 유래 부분을 인식하는 항체(1차 항체)를 접촉시키는 공정, ii) 상기 1차 항체에 각각 결합하는, 올리고뉴클레오티드가 연결된 2차 항체를 첨가하는 공정, iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 연결한 2차 항체, 2차 항체에 연결한 상기 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 상보적인 2종류의 올리고뉴클레오티드 및 이들이 근접했을 때에 라이게이션시켜 상기 2차 항체 사이에 고리형 구조를 형성할 수 있는 라이게이스를 함유하는 용액을 첨가하여, 라이게이션 반응시키는 공정, iv) 형성된 고리형 구조에 따라 핵산을 신장시키는 공정, v) 신장한 핵산에 하이브리다이즈할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정, vi) 상기 표지 시그널을 검출하는 공정에 의해, 실시할 수 있다. 어떤 양태로서는, PLA 프로브나 듀올린크(Duolink) II 시약 키트 및 듀올린크 II 명시야(Bright field) 시약 키트(올린크(Olink)사)에 포함되는 시약을 이용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서의 검출 대상 폴리뉴클레오티드 또는 검출 대상 폴리펩티드가, 피험자로부터 얻은 시료로부터 검출된 경우에는, 상기 피험자는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리펩티드 양성의 암을 갖는 대상(환자)이고, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(어떤 양태에서는 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398 또는 화합물 LY2874455)에 의한 치료의 적용 대상이 된다.
<본 발명의 검출용 키트, 본 발명의 프라이머 세트, 본 발명의 프로브 세트>
본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 검출용 키트에는, 적어도, 본 발명의 검출 방법에서의 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계한 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머(프라이머 세트라고도 함)가 포함된다. 본 발명의 프라이머 세트는, 검출 대상 폴리뉴클레오티드 증폭용의 프라이머로서 기능하는 폴리뉴클레오티드의 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트에는,
FGFR3 유전자에서 유래되는 부분으로부터 설계되는 센스 프라이머 및 TACC3 유전자에서 유래되는 부분으로부터 설계되는 안티센스 프라이머를 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트로서, 상기 안티센스 프라이머는 「검출 대상 폴리뉴클레오티드」에 스트린젠트한 조건하(바람직하게는, 보다 스트린젠트한 조건하)에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자(바람직하게는, 적어도 16 염기의 핵산 분자)로 이루어지고, 상기 센스 프라이머는 「검출 대상 폴리뉴클레오티드」의 상보쇄에 스트린젠트한 조건(바람직하게는, 보다 스트린젠트한 조건하)에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자(바람직하게는, 적어도 16 염기의 핵산 분자)로 이루어지는, 프라이머 세트가 포함된다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머의 한쪽을, 상기 융합 폴리뉴클레오티드의 융합점(상술)을 포함하는 부분에 대응하도록 설계해도 좋다.
본 발명의 프라이머 세트의 구체적인 양태로서, 이하 (1)∼(5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 세트를 들 수 있다 :
(1) 서열 번호 1의 염기 번호 1 내지 2280 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 1의 염기 번호 2281 내지 2856 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
(2) 서열 번호 3의 염기 번호 1 내지 2280 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 3의 염기 번호 2281 내지 2961 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
(3) 서열 번호 5의 염기 번호 1 내지 2368 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 5의 염기 번호 2369 내지 3003 사이의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
(4) 서열 번호 25의 염기 번호 1∼2242의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 25의 염기 번호 2243∼3144의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트,
(5) 서열 번호 27의 염기 번호 1∼2233의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 센스 프라이머 및 서열 번호 27의 염기 번호 2234∼3135의 임의의 연속하는 적어도 16 염기의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 안티센스 프라이머의 프라이머 세트.
상기 프라이머 세트에 있어서는, 센스 프라이머와 안티센스센스 프라이머의 선택 위치의 간격이 1 kb 이하이거나, 또는 센스 프라이머와 안티센스센스 프라이머에 의해 증폭되는 증폭 산물의 크기가 1 kb 이하인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 프라이머는, 통상, 15∼40 염기, 바람직하게는 16∼24 염기, 더욱 바람직하게는 18∼24 염기, 특히 바람직하게는 20∼24 염기의 쇄길이를 갖는다.
본 발명의 프라이머 세트는, 본 발명의 검출 방법에 있어서, 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 증폭 및 검출하기 위해 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 화학 합성법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트를 포함하는 검출용 키트에는, 적어도, 본 발명의 검출 방법에서의 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있도록 설계한, FGFR3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 FGFR3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한 프로브 세트 및 TACC3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 TACC3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한 프로브 세트(프로브 세트라고도 함) 및 하이브리다이즈한 시그널을 증폭하는 시약이 포함된다. 상기 프로브 세트는, 검출 대상 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 프로브 세트로서 기능하는 폴리뉴클레오티드의 세트이다.
본 발명의 프로브 세트에는,
FGFR3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 FGFR3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한 프로브와 TACC3 유전자에서 유래되는 부분(예컨대, 상기 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 TACC3 유전자 영역 내의 임의의 부분)으로부터 설계한 프로브를 포함하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 프로브 세트로서, 각 프로브는 「검출 대상 폴리뉴클레오티드」에 하이브리다이즈하는 핵산 분자로 이루어지는, 프로브 세트가 포함된다.
어떤 양태에서는, 각 프로브는, 분기 DNA 프로브(branched DNA probe)이고, 서열 정보에 기초한 분기 DNA 프로브는 아피메트릭스사로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트의 구체적인 양태로서, 이하 (1)∼(3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 세트를 들 수 있다.
(1) 서열 번호 1의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함), 및 서열 번호 1의 염기 번호 2281∼2856의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)을 포함하는 프로브 세트,
(2) 서열 번호 3의 염기 번호 1∼2280의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함) 및 서열 번호 3의 염기 번호 2281∼2961의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)을 포함하는 프로브 세트,
(3) 서열 번호 5의 염기 번호 1∼2368의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함) 및 서열 번호 5의 염기 번호 2369∼3003의 임의의 연속하는 적어도 16 염기에 대하여 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트를 복수 종(바람직하게는, 20종의 프로브 세트를 포함함)을 포함하는 프로브 세트.
여기서, 인접한 프로브 페어로 이루어지는 프로브 세트는, 많은 쪽이 시그널이 얻어지기 쉽기 때문에, 바람직하다. 어떤 양태에서는, 20종 정도가 이용된다.
본 발명의 프로브 세트는, 본 발명의 검출 방법에 있어서, 검출 대상 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브 세트에 포함되는 각 프로브는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 화학 합성법에 의해 제조할 수 있다.
<본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료용 의약 조성물>
암환자의 검체로부터 단리 동정한 융합 폴리뉴클레오티드(실시예 1∼3)는, 암의 원인 유전자인 것이 밝혀지고(실시예 8, 실시예 11), 일부의 폐암 또는 방광암 환자에서 융합 폴리뉴클레오티드의 존재가 검출되었다(실시예 4∼6). 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및/또는 발현을 저해함으로써 부착면에 비의존성인 세포 증식이 저해된다(즉 항암 작용이 나타난다)라는 본 발명자들이 발견한 신규한 지견(실시예 9, 실시예 12, 실시예 13, 실시예 14, 실시예 16)으로부터, 본 발명의 폴리펩티드를 저해(본 발명의 폴리펩티드의 활성 및/또는 발현을 저해)하는 물질은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.
본 발명에는, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(예컨대, 후술하는 의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법 중 어느 것에 의해 얻어진 물질[예컨대, 2중쇄 핵산(siRNA를 포함함), 단백질(항체 또는 항체 단편을 포함함), 펩티드, 또는 그것 이외의 화합물])을 유효 성분으로 하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료용 의약 조성물이 포함된다.
본 발명의 의약 조성물에서의 유효 성분은, 후술하는 의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 의해 선택할 수 있다. 예컨대 후술하는 실시예 9에 기재된 화합물 도비티닙(Clinical Cancer Reserach 2011; 17:7451-7461에 기재된 화합물, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일]퀴놀린-2(1H)-온), AZD4547(WO2008075068 실시예 154와 AACR2011, 포스터 3568; 타이틀: 「Characterization of AZD4547 : An orally bioavailable, potent and selective inhibitor of FGFR tyrosine kinases 1, 2 and 3」에 기재된 화합물, N-{5-[2-(3,5-디메톡시페닐)에틸]-2H-피라졸-3-일}-4-[(3R,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]벤즈아미드), 및 BGJ398(Journal of Medicinal Chemistry 2011; 54; 7066-7083에 기재된 화합물, 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일), 실시예 21에 기재된 화합물 LY2874455(WO2010129509 실시예 1; Mol Cancer Ther, 2011, 10, 2200-2210; (R)-(E)-2-{4-[2-{5-[1-(3,5-디클로로피리딘-4-일)에톡시]-1H-인다졸-3-일}비닐]-1H-피라졸-1-일}에탄올)을 들 수 있다. 또한, 제조예 1 내지 5, 실시예 29 및 실시예 30에 기재된 화합물인, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{3-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}피리미딘-2-아민(화합물 A), 2-[4-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1H-피라졸-1-일]에탄올(화합물 B), (2R)-3-[4-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1H-피라졸-1-일]프로판-1,2-디올(화합물 C), 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]피리미딘-2-아민(화합물 D), 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{1-메틸-5-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]-1H-피라졸-3-일}피리미딘-2-아민(화합물 E)을 들 수 있다.
또한, 공지된 FGFR3 저해 활성을 갖는 저분자 화합물(FGFR3 저해제)로부터 후술하는 의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 의해 선택한 화합물을 본 발명의 의약 조성물에서의 유효 성분으로서 이용할 수 있다. 특히, 화합물 AZD4547, 화합물 도비티닙, 화합물 BGJ398 및 화합물 LY2874455를 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 예시되는 2중쇄 핵산은, 2중쇄의 핵산(RNA 또는 DNA) 부분과, 바람직하게는 센스쇄 및 안티센스쇄의 3' 말단의 오버행으로 이루어지고, RNAi를 유도한다. RNAi는 진화적으로 보존된 현상으로, RNaseIII 엔도뉴클레아제에 의해 생기는 21∼23 염기의 2중쇄 핵산을 통해 발생한다(Genes Dev. 15, 485-490, 2001). 3'측의 오버행은 각각 1 또는 2 염기의 임의의 핵산이지만, 2 염기가 바람직하다. 또, 상기 염기수(21∼23 염기)는, 오버행을 포함하는 센스쇄 또는 안티센스쇄의 각각의 염기수이다. 또한, 센스쇄 및 안티센스쇄는, 동일한 염기수일 수도 있고, 상이한 염기수일 수도 있지만, 동일한 염기수인 것이 바람직하다.
2중쇄 핵산의 3'측 오버행을 구성하는 리보핵산으로는, 예컨대, U(우리딘), A(아데노신), G(구아노신), 또는 C(시티딘)를 이용할 수 있고, 3'측의 오버행을 구성하는 데옥시 리보핵산으로는, 예컨대, dT(데옥시티미딘), dA(데옥시아데노신), dG(데옥시구아노신), 또는 dC(데옥시시티딘)를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 2중쇄 핵산은, 2중쇄 부분이 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 기재된 염기에 기초하여 설계되는, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 저해 활성을 갖는 2중쇄 핵산이다.
본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질(예컨대, 후술하는 의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 의해 얻어진 물질[예컨대, 2중쇄 핵산, 단백질(항체 또는 항체 단편을 포함함), 펩티드, 또는 그것 이외의 화합물])을 유효 성분으로 하는 제제는, 상기 유효 성분의 타입에 따라, 이들의 제제화에 통상 이용되는 약리학상 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 그 밖의 첨가제를 이용하여, 의약 조성물로서 조제할 수 있다.
투여로는, 예컨대, 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제, 또는 경구용 액제 등에 의한 경구 투여, 또는, 정맥 주사(점적을 포함함), 근육 주사, 또는 피하 주사 등의 주사제, 좌제, 경피 투여제, 또는 방광내 주입이나 경점막 투여제 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다. 특히 위에서 소화되는 펩티드에 있어서는, 정맥 주사 등의 비경구 투여가 바람직하다.
경구 투여를 위한 고체 조성물에 있어서는, 1 또는 그 이상의 활성 물질과, 적어도 하나의 불활성인 희석제, 예컨대, 젖당, 만니톨, 포도당, 미결정 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 메타규산알루민산마그네슘 등과 혼합할 수 있다. 상기 조성물은, 통상법에 따라, 불활성인 희석제 이외의 첨가제, 예컨대, 활택제, 붕괴제, 안정화제, 또는 용해 또는 용해 보조제 등을 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 당의 또는 위용성 또는 장용성 물질 등의 필름으로 피복할 수 있다.
경구를 위한 액체 조성물은, 예컨대, 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 또는 엘릭시르제를 포함할 수 있고, 일반적으로 이용되는 불활성인 희석제, 예컨대, 정제수 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 불활성인 희석제 이외의 첨가제, 예컨대, 습윤제, 현탁제, 감미제, 방향제, 또는 방부제를 함유할 수 있다.
비경구를 위한 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 또는 유탁제를 포함할 수 있다. 수용성의 용액제 또는 현탁제에는, 희석제로서, 예컨대, 주사용 증류수 또는 생리용 식염수 등을 포함할 수 있다. 비수용성의 용액제 또는 현탁제의 희석제로는, 예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물유(예컨대, 올리브유), 알콜류(예컨대, 에탄올), 또는 폴리솔베이트 80 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 또한 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 용해 또는 용해 보조제, 또는 방부제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 예컨대, 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합, 또는 조사에 의해 무균화할 수 있다. 또한, 무균의 고체 조성물을 제조하고, 사용시에, 무균수 또는 그 밖의 무균용 주사용 매체에 용해시켜, 사용할 수도 있다.
투여량은, 유효 성분 즉 의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 의해 얻어진 물질의 활성의 강도, 증상, 투여 대상의 연령, 또는 성별 등을 고려하여, 적절히 결정할 수 있다. 바람직하게는, 종양 부근의 혈중 농도 또는 종양내 농도가 약제가 본 발명의 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 50% 저해하는 농도의 3∼30배, 예컨대, 10배가 되는 양으로, 투여량은 경로에 따라 산출할 수 있다. 예컨대, 경구 투여의 경우, 그 투여량은, 통상, 성인(체중 60 kg으로 하여)에 있어서, 1일에 약 0.1∼100 mg, 바람직하게는 0.1∼50 mg이다. 비경구 투여의 경우, 주사제의 형태로는, 1일에 0.01∼50 mg, 바람직하게는 0.01∼10 mg이다.
본 발명의 의약 조성물에 의한 치료 대상은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 존재가 검출된 피험자(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암환자)이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암화된 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질에 의해 사멸하는 점에서, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 유효한 치료제가 된다.
이하에, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 화합물 D, 및 화합물 E의 제조법을 나타낸다. 또, 문장 중에 있어서, 「ESI+」는 질량 분석에서의 m/z값(이온화법 ESI, (M+H)+)을, 「APCI/ESI+」는 질량 분석에서의 m/z값(이온화법 APCI와 ESI의 동시 측정, (M+H)+)을, 「NMR1」은 디메틸설폭시드-d6 중의 1H-NMR에서의 δ(ppm)를, 「NMR2」는 CDCl3 중의 1H-NMR에서의 δ(ppm)를 각각 나타낸다.
제조예 1 화합물 A의 제조
(1) 3,5-디메톡시안식향산메틸(1 g)과 아세토니트릴(20 mL)의 혼합물을 빙랭하고, N-플루오로-N'-(클로로메틸)트리에틸렌디아민비스(테트라플루오로보레이트)(4.09 g)를 첨가하고, 실온에서 철야 교반했다. 반응 혼합물에 포화 중조수를 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수황산나트륨 및 염기성 실리카겔을 첨가하고, 30분간 교반한 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸/헥산)로 정제하여, 2,6-디플루오로-3,5-디메톡시안식향산메틸(292 mg)을 얻었다.
ESI+:233.
(2) 2,6-디플루오로-3,5-디메톡시안식향산메틸(10 g)과 테트라히드로푸란 (50 mL)의 혼합물을 빙랭하고, 수소화붕소리튬(3.0 M 테트라히드로푸란 용액, 43 mL)을 첨가한 후, 실온에서 65시간 교반했다. 반응 혼합물을 다시 빙랭하고, 또한 수소화붕소리튬(3.0 M 테트라히드로푸란 용액, 14 mL)을 첨가하고, 실온에서 22시간 교반했다. 반응 혼합물을 빙랭하고, 빙수(300 mL) 속에 천천히 첨가했다. 또한 농염산(25 mL)을 천천히 첨가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 톨루엔/초산에틸(1 : 1)로 추출하고, 유기층을 포화 중조수 및 포화 식염수로 세정 후, 무수황산나트륨으로 건조시키고, 여과했다. 여과액을 감압 농축하여, (2,6-디플루오로-3,5-디메톡시페닐)메탄올(8.67 g)을 얻었다.
ESI+:205.
(3) (2,6-디플루오로-3,5-디메톡시페닐)메탄올(1.71 g), 트리에틸아민(2.57 mL) 및 테트라히드로푸란(34 mL)의 혼합물을 빙랭하고, 메탄술포닐클로라이드(716 μL)을 첨가한 후, 1시간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축하여, 2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질메탄술포네이트(2.32 g)를 얻었다.
NMR2:3.04(3H,s),3.88(6H,s),5.34(2H,s),6.72(1H,t,J=8.2Hz).
(4) 2-클로로-5-히드록시피리미딘(4.38 g), 탄산칼륨(9.27 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(79 mL)의 혼합물에, 2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질메탄술포네이트(7.89 g)를 첨가한 후, 60℃에서 1시간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 생긴 고체를 여과 채취하고, 물로 세정한 후, 감압 건조하여, 2-클로로-5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘(8.53 g)을 얻었다.
APCI/ESI+:317.
(5) 아르곤 분위기하, 2-클로로-5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘(1.03 g), 3-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]아닐린(1.29 g), 1,1'-비나프탈렌-2,2'-디일비스(디페닐포스핀)(609 mg), 탄산세슘(3.19 g) 및 디옥산(20.6 mL)의 혼합물에, 초산팔라듐(146 mg)을 실온에서 첨가하고, 100℃에서 4시간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올/농암모니아수), 계속해서 염기성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸)로 정제한 후, 초산에틸, 계속해서 에탄올로 재결정하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{3-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}피리미딘-2-아민(화합물 A : 830 mg)을 얻었다.
ESI+:585.
NMR1:1.45-1.60(2H,m),1.73-1.84(2H,m),2.14(3H,s),2.17-2.58(11H,m),3.24-3.36(2H,m),3.75(3H,s),3.87(6H,s),5.16(2H,s),6.79(1H,d,J=8.8Hz),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.24(1H,dd,J=8.8,2.4Hz),7.32(1H,d,J=2.4Hz),8.29(2H,s),9.21(1H,s).
제조예 2 화합물 B의 제조
(1) 아르곤 분위기하, 제조예 1의 (4)와 동일한 방법으로 제조한 2-클로로-5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘(800 mg), 2-(4-아미노-1H-피라졸-1-일)에탄올(642 mg), 1,1'-비나프탈렌-2,2'-디일비스(디페닐포스핀)(472 mg), 탄산세슘(2.47 g) 및 디옥산(16 mL)의 혼합물에, 초산팔라듐(113 mg)을 실온에서 첨가하고, 100℃에서 6시간 교반했다. 반응 혼합물에 물과 클로로포름을 첨가하고, 불용물을 셀라이트 여과로 여과 분리한 후, 여과액을 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올)로 정제하여, 2-[4-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1H-피라졸-1-일]에탄올(화합물 B : 139 mg)을 얻었다.
ESI+:408.
NMR1:3.69(2H,dd,J=11.0,5.6Hz),3.87(6H,s),4.07(2H,t,J=5.6Hz),4.83(1H,t,J=5.4Hz),5.14(2H,s),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.45(1H,d,J=0.6Hz),7.88(1H,d,J=0.6Hz),8.26(2H s),9.20(1H,s).
제조예 3 화합물 C의 제조
(1) 아르곤 분위기하, 제조예 1의 (4)와 동일한 방법으로 제조한 2-클로로-5-[(2,6-디클로로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘(1.33 g), 1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-피라졸-4-아민(913 mg), 1,1'-비나프탈렌-2,2'-디일비스(디페닐포스핀)(785 mg), 탄산세슘(4.11 g) 및 디옥산(26.6 mL)의 혼합물에, 초산팔라듐(189 mg)을 실온에서 첨가하고, 100℃에서 4시간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸/헥산)로 정제하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-[1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리미딘-2-아민(1.73 g)을 얻었다.
APCI/ESI+:448.
(2) 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-[1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리미딘-2-아민(3.59 g) 및 메탄올(20 mL)의 혼합물에, 4 M 염화수소/디옥산 용액(40 mL)을 첨가하고, 실온에서 6시간 교반했다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사에 포화 중조수를 첨가했다. 생긴 고체를 여과 채취하고, 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 건조하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-(1H-피라졸-4-일)피리미딘-2-아민(2.9 g)을 얻었다.
APCI/ESI+:364.
(3) 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-(1H-피라졸-4-일)피리미딘-2-아민(50 mg), 탄산칼륨(57 mg) 및 N,N-디메틸포름아미드(1 mL)의 혼합물에 [(4S)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메틸4-메틸벤젠술포네이트(118 mg)를 첨가하고, 60℃에서 1시간, 110℃에서 4일간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸/헥산)로 정제하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-(1-{[(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메틸}-1H-피라졸-4-일)피리미딘-2-아민(39 mg)을 얻었다.
APCI/ESI+:478.
(4) 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-(1-{[(4R)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일]메틸}-1H-피라졸-4-일)피리미딘-2-아민(45 mg) 및 테트라히드로푸란(2 mL)의 혼합물에 1 M 염산(1 mL)을 첨가하고, 50℃에서 3시간 교반했다. 반응 혼합물에 포화 중조수를 첨가하고, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올)로 정제한 후, 초산에틸로 고화하여, (2R)-3-[4-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1H-피라졸-1-일]프로판-1,2-디올(화합물 C : 25 mg)을 얻었다.
ESI+:438.
NMR1: 3.23-3.38(2H,m), 3.72-3.80(1H,m), 3.84-3.96(7H,m), 4.15(1H,dd,J=13.8,4.1Hz), 4.67(1H,t,J=5.6Hz), 4.91(1H,d,J=5.3Hz), 5.14(2H,s), 7.06(1H,t,J=8.4Hz), 7.45(1H,d,J=0.6Hz), 7.87(1H,d,J=0.6Hz), 8.26(2H,s), 9.21(1H,s).
제조예 4 화합물 D의 제조
(1) 제조예 1의 (5)와 동일하게 하여, 4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린, 및 제조예 1의 (4)와 동일한 방법으로 제조한 2-클로로-5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘을 원료로서 이용하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]피리미딘-2-아민(화합물 D)을 얻었다.
ESI+:472.
NMR1: 2.21(3H,s), 2.41-2.48(4H,m), 2.98-3.08(4H,m), 3.87(6H,s), 5.15(2H,s), 6.81-6.90(2H,m), 7.07(1H,t,J=8.4Hz), 7.47-7.55(2H,m), 8.26(2H,s), 9.15(1H,s).
제조예 5 화합물 E의 제조
(1) (1-메틸-3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올(398 mg), 3,4-디히드로-2H-피란(459 μL) 및 초산에틸(8 mL)의 혼합물에, p-톨루엔술폰산 1수화물(96 mg)을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반했다. 또한 3,4-디히드로-2H-피란(459 μL) 및 p-톨루엔술폰산 1수화물(96 mg)을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 초산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/초산에틸)로 정제하여, 1-메틸-3-니트로-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸(487 mg)을 얻었다.
APCI/ESI+:242.
(2) 아르곤 분위기하, 1-메틸-3-니트로-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸(487 mg), 테트라히드로푸란(4.9 mL) 및 에탄올(4.9 mL)의 혼합물에, 10% 팔라듐-탄소(50 mg)를 첨가했다. 수소 분위기하, 12시간 교반한 후, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거했다. 여과액을 감압 농축하여, 1-메틸-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸-3-아민(426 mg)을 얻었다.
APCI/ESI+:212.
(3) 제조예 3의 (1)과 동일하게 하여, 1-메틸-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸-3-아민, 및 제조예 1의 (4)와 동일한 방법으로 제조한 2-클로로-5-[(2,6-디클로로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘을 원료로서 이용하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{1-메틸-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸-3-일}피리미딘-2-아민을 얻었다.
APCI/ESI+:492.
(4) 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{1-메틸-5-[(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)메틸]-1H-피라졸-3-일}피리미딘-2-아민(706 mg)과 메탄올(8 mL)의 혼합물에 4 M 염화수소/디옥산 용액(8 mL)을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사에 포화 중조수를 첨가하고, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸/헥산)로 정제하여, [3-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피라졸-5-일]메탄올(444 mg)을 얻었다.
ESI+:408.
(5) [3-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피라졸-5-일]메탄올(350 mg), 트리에틸아민(359 μL), 디클로로메탄(7 mL) 및 테트라히드로푸란(7 mL)의 혼합물을 빙랭하고, 메탄술포닐클로라이드(120 μL)를 첨가한 후, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 혼합물에 물 및 초산에틸을 첨가하고, 생긴 고체를 여과 채취한 후, 감압 건조하여, [3-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피라졸-5-일]메틸메탄술포네이트(218 mg)를 얻었다.
NMR2:2.96(3H,s),3.85(3H,s),3.89(6H,s),5.16(2H,s),5.25(2H,s),6.68(1H,t,J=8.0Hz),6.91(1H,s),7.63(1H,brs),8.24(2H,s).
(6) [3-({5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]피리미딘-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피라졸-5-일]메틸메탄술포네이트(795 mg)와 N-메틸피롤리돈(15.9 mL)의 혼합물에, 1-메틸피페라진(901 μL)을 첨가하고, 80℃에서 2시간 교반했다. 반응 혼합물에 물 및 포화 중조수를 첨가하고, 생긴 고체를 여과 채취한 후, 여과액을 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조 후, 여과했다. 여과액을 감압 농축하고, 잔사를 먼저 여과 채취한 고체와 합친 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올), 계속해서 염기성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸/메탄올)로 정제한 후, 에탄올/디이소프로필에테르로 고화하여, 5-[(2,6-디플루오로-3,5-디메톡시벤질)옥시]-N-{1-메틸-5-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]-1H-피라졸-3-일}피리미딘-2-아민(화합물 E : 168 mg)을 얻었다.
ESI+:490.
NMR1:2.14(3H,s),2.18-2.53(8H,m),3.45(2H,s),3.67(3H,s),3.87(6H,s),5.15(2H,s),6.46(1H,s),7.06(1H,t,J=8.4Hz),8.26(2H,s),9.42(1H,s).
<의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법>
의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에는, [1] 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법과, [2] 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제를 스크리닝하는 방법이 포함된다.
[1] 본 발명의 폴리펩티드를 저해(본 발명의 폴리펩티드의 활성 및/또는 발현을 저해)하는 물질을 스크리닝하는 방법
본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질의 스크리닝 방법은, 하기 공정 (i)∼(iii)을 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다 :
(i) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포에 시험 물질을 접촉시키는 공정,
(ii) 상기 폴리펩티드가 저해되는지의 여부를 분석하는 공정, 및
(iii) 상기 폴리펩티드를 저해하는 물질을 선택하는 공정.
본 스크리닝 방법에는, 이하의 방법이 포함된다.
(a) 인비트로(in vitro)형 스크리닝 방법 ;
(1) 본 발명의 폴리펩티드에 시험 물질을 접촉시키는 공정, (2) 상기 폴리펩티드의 활성이 저해되는지의 여부를 분석하는 공정, 및 (3) 상기 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법.
(b) 세포형 스크리닝 방법 ;
(1) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포에 시험 물질을 접촉시키는 공정, (2) 상기 폴리펩티드의 활성이 저해되는지의 여부를 분석하는 공정, 및 (3) 상기 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법.
(c) 발현 저해형 스크리닝 방법 ;
(1) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포에 시험 물질을 접촉시키는 공정, (2) 상기 폴리펩티드의 발현이 저해되는지의 여부를 분석하는 공정, 및 (3) 상기 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법.
각 스크리닝 방법에 관해 이하에 설명한다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포에는, 본 발명의 폴리펩티드를 천연으로 발현하고 있는 세포와, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 세포를 형질 전환함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 세포가 포함되지만, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포로는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 세포를 형질 전환함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 세포가 바람직하다.
(a) 인비트로형 스크리닝 방법
인비트로형 스크리닝 방법에는, 정제한 본 발명의 폴리펩티드에 시험 물질을 첨가하여 접촉시키고(접촉시키는 공정), 상기 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되었는지의 여부를, 시험 물질을 접촉시키지 않은 경우의 본 발명의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 분석하고(분석하는 공정), 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제)을 선택하는 방법이 포함된다.
의약 조성물의 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 있어서, 각 공정은, 구체적으로는, 예컨대, 이하와 같이 실시할 수 있다. 정제한 본 발명의 폴리펩티드에 시험 물질을 첨가하여 접촉시킨 후, ATP를 첨가하고, 상기 폴리펩티드의 활성을 측정한다. 컨트롤로서, 상기 정제한 폴리펩티드와 시험 물질의 용매(예컨대 DMSO)를 혼합하여 접촉시킨 후, ATP를 첨가하고, 상기 폴리펩티드의 활성을 측정한다. 백그라운드 컨트롤로서, ATP를 첨가하지 않는 조건을 설정할 수 있다. 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되었는지의 여부를 분석한다. 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성(즉 자기 인산화 활성)이 저해되었는지의 여부는, 시험 물질에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 티로신 인산화 레벨의 변화를 분석함으로써 판정할 수 있다. 즉, 용매 컨트롤 첨가(즉 접촉)시와 비교하여, 시험 물질 첨가(즉 접촉)시에 본 발명의 폴리펩티드의 활성(즉 자기 인산화 활성)이 저해되어 있었던 경우, 그 시험 물질을, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제)로서 선택한다. 상기 공정에서, ATP를 첨가하기 전에 펩티드 기질을 첨가하여 혼합하는 것, 및 상기 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 본 발명의 폴리펩티드의 활성으로서 분석하는(즉, 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되었는지의 여부를, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 펩티드 기질의 인산화 레벨의 변화를 분석함으로써 판정하는) 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 행하는 스크리닝 방법도, 본 발명의 인비트로형 스크리닝 방법에 포함된다. 상기에 기재된 방법으로, 50% 이상 활성을 저해하는 농도가 10 μM 이하, 바람직하게는 1 μM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 이하의 것을 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질로서 선택한다. 예컨대, 실시예 21의 방법을 본 발명의 인비트로형 스크리닝 방법으로서 이용할 수 있다.
(b) 세포형 스크리닝 방법
세포형 스크리닝 방법에는, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포와 시험 물질을 혼합(즉 첨가)하여 접촉시키고(접촉시키는 공정), 상기 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되었는지의 여부를, 시험 물질을 접촉시키지 않은 경우의 본 발명의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 분석하고(분석하는 공정), 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제)을 선택하는 방법이 포함된다. 구체적으로는, 예컨대 이하와 같이 실시할 수 있다.
우선, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포와 시험 물질 또는 용매 컨트롤(예컨대 DMSO)을 각각 접촉시킨다. 일정 시간 세포를 배양한 후, 배양한 세포를 용해하여 조제한 세포 용해액을 이용하고, 공지된 SDS 전기 영동법 및 항인산화 FGFR3 항체(예컨대 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)사)를 이용한 이뮤노 블로팅에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성(즉 자기 인산화 활성)을 측정함으로써, 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성(즉 자기 인산화 활성)이 저해되었는지의 여부를 분석한다. 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되었는지의 여부는, 시험 물질에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 티로신 인산화 레벨의 변화를 분석함으로써 판정할 수 있다. 즉, 용매 컨트롤 첨가(즉 접촉)시와 비교하여, 시험 물질 첨가(즉 접촉)시에 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 저해되어 있었던 경우, 그 시험 물질을, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제)로서 선택한다.
(c) 발현 저해형 스크리닝 방법
발현 저해형 스크리닝 방법에는, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포와 시험 물질을 혼합(즉 첨가)하여 접촉시키고(접촉시키는 공정), 상기 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 저해되었는지의 여부를, 시험 물질을 접촉시키지 않은 경우의 본 발명의 폴리펩티드의 발현과 비교하여 분석하고(분석하는 공정), 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암) 치료제)을 선택하는 방법이 포함된다. 구체적으로는, 예컨대 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 있는 임의의 세포와 시험 물질 또는 용매 컨트롤(예컨대 DMSO)을 각각 접촉시킨다. 배양 후, 세포의 추출물을 조제하고, 계속해서, 추출물을 이용하여, 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 저해되었는지의 여부를 분석한다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 저해되었는지의 여부는, 본 발명의 폴리펩티드의 mRNA 또는 단백질의 발현이 저해되었는지의 여부에 의해 분석할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 세포 추출액에 존재하는 본 발명의 폴리펩티드의 mRNA 또는 단백질의 양을 공지된 발현량 분석 방법, 예컨대, 노던 블롯법이나 정량적 PCR 법 또는 이뮤노 블롯법이나 ELISA 법 등으로 동정한다. 시험 물질에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 저해되었는지의 여부는, 시험 물질에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 발현량의 변화를 분석함으로써 판정할 수 있다. 즉, 용매 컨트롤 접촉시와 비교하여, 시험 물질 접촉시에 본 발명의 폴리펩티드의 발현량(mRNA 또는 단백질량)이 저하되어 있었던 경우, 그 시험 물질을, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질(즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제)로서 선택한다.
[2] 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료제를 스크리닝하는 방법
본 발명의 폴리펩티드를 저해(본 발명의 폴리펩티드의 활성 및/또는 발현을 저해)하는 물질을 스크리닝하는 방법은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(바람직하게는 폐암 또는 방광암) 치료제를 스크리닝하는 방법으로서 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료제를 스크리닝하는 방법은, 상기 [1] 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법의 i), ii) 및 iii)을 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료제를 스크리닝하는 방법에서는, 시험 물질이 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는지의 여부를 분석하고, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질을 선택한 후, 선택된 시험 물질이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암) 치료 활성을 갖는 것을 확인하는 공정을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
선택된 시험 물질이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암 치료 활성을 갖는 것을 확인하는 공정 ;
선택된 물질이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암) 치료 활성을 갖는 것을 확인하는 공정으로는, 공지된 평가 방법 또는 그것을 개량한 방법, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드를 발현한 배양 세포나 종양 모델 동물에 선택된 물질을 처치하여 분석하는 방법을 실시하는 공정을 들 수 있다(임상 종양학 세컨드 에디션, 암과 화학 요법사).
선택된 물질이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암) 치료 활성을 갖는 것을 확인하는 공정으로서 바람직한 것은, (1) 인간 암(특히 폐암 또는 방광암) 유래의 내재적으로 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 암세포를 이용하여, 선택된 시험 물질이 상기 세포의 증식 저해 작용 및/또는 세포사 유도 작용을 갖는 것을 확인하는 공정, (2) 선택된 시험 물질이 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 형질 전환 세포의 부착면에 비의존적인 증식에 대한 저해 작용을 갖는 것을 확인하는 공정, 및/또는, (3) 선택된 시험 물질이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포를 누드 마우스에 접종하여 형성한 종양 증식에 대한 저해 작용을 갖는 것을 확인하는 공정이다.
상기 누드 마우스를 이용한 방법에서는, 본 발명의 폴리펩티드를 내재성으로 발현하는 암세포나, 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 의해 형질 전환시킨 세포를 피하, 피내, 복강이나 각 장기에 이식한 종양 모델 동물인 담암(擔癌) 모델 동물(예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨 NIH3T3 세포를 이식한 누드 마우스 등)을 이용할 수 있다.
의약 조성물의 유효 성분의 스크리닝법에서 사용하는 시험 물질로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 시판되는 화합물(펩티드를 포함함), 케미컬 파일에 등록되어 있는 여러가지 공지된 화합물(펩티드를 포함함), 콤비너트리얼·케미스트리 기술(N. Terrett et al., Drug Discov. Today, 4(1):41,1999)에 의해 얻어진 화합물군, 미생물의 배양 상청, 식물이나 해양 생물 유래의 천연 성분, 동물 조직 추출물, 2중쇄 핵산, 항체 또는 항체 단편, 또는, 의약 조성물의 유효 성분의 스크리닝법에 의해 선택된 화합물(펩티드를 포함함)을 화학적 또는 생물학적으로 수식한 화합물(펩티드를 포함함)을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 서술하지만, 본 발명은 상기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또, 특별히 언급이 없는 경우에는, 공지된 방법에 따라 실시 가능하다. 또한, 시판되는 시약이나 키트 등을 이용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시 가능하다.
[실시예 1] FGFR3-TACC3_v1의 단리
폐암 임상 검체(미국 아스테란드사) 200 검체에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트(SuperScript)III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 랜덤 프라이머(랜덤 프라이머즈, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 7로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_F 및 서열 번호 8로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(TaKaRa Ex Taq; 다카라 바이오 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 10초, 55℃ 15초, 68℃ 1분 30초를 30 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 9로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_F 및 서열 번호 10으로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 1분을 30 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 샘플 Lg344만으로, 약 500 염기쌍 (bp)의 PCR 산물을 얻었다.
그 후, PCR 산물을 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, 약 500 bp의 PCR 산물은, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 코딩 시퀀스(이하 CDS)의 엑손 18의 3' 말단이, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 11의 5' 말단과 융합하고 있는 서열인 것이 밝혀졌다.
편평 상피 폐암 환자 폐암 조직 유래 RNA(미국 아스테란드사) Lg344 검체 RNA에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 올리고(dT) 프라이머(올리고(dT) 20 프라이머, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 11로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_F 및 서열 번호 12로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2 ; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 60℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 13으로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F 및 서열 번호 14로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 약 2.9 kbp의 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝했다. 인서트는 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열을 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, 약 2.9 kbp의 PCR 산물에서는, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 5' 말단으로부터 엑손 18의 3' 말단까지가, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 11의 5' 말단으로부터 CDS의 3' 말단까지와 융합하고 있는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v1)(서열 번호 1)이 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 서열 번호 1에 의해 코드되는 폴리펩티드를 서열 번호 2에 나타낸다.
또한, FGFR3-TACC3_v1의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하기 위해, 상기 클로닝 벡터를 제한 효소 BamHI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제하고, 또한 EcoRI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제했다. 이 ORF를 포함하는 DNA 단편을 발현 벡터(pMXs-puro; 코스모 바이오사)의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 BamHI 및 EcoRI 사이트에 클로닝하여 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro)를 구축했다.
[실시예 2] FGFR3-TACC3_v2의 단리
방광암 임상 검체(미국 아스테란드사) 59 검체에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 랜덤 프라이머(랜덤 프라이머즈, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 7로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_F 및 서열 번호 8로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(TaKaRa Ex Taq; 다카라 바이오 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 10초, 55℃ 15초, 68℃ 1분 30초를 30 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 9로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_F 및 서열 번호 10으로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 1분을 30 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 샘플 Bd106 검체로, 약 600 bp의 PCR 산물을 얻은 것을 알 수 있었다.
그 후, PCR 산물을 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, 약 600 bp의 PCR 산물은, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 엑손 18의 3' 말단이, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 10의 5' 말단과 융합하고 있는 서열인 것이 밝혀졌다.
방광암 환자 방광암 조직 유래 RNA(미국 아스테란드사) Bd106 검체 RNA에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 올리고(dT) 프라이머(올리고(dT) 20 프라이머, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 11로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_F 및 서열 번호 12로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2 ; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 60℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 13으로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F 및 서열 번호 14로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 약 3.0 kbp의 PCR 산물을 얻은 것을 알 수 있었다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝했다. 인서트는 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열을 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; 라이프 테크놀로지즈). 이 결과, 약 3.0 kbp의 PCR 산물에서는, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 5' 말단으로부터 엑손 18의 3' 말단까지가, TACC3(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 10의 5' 말단으로부터 CDS의 3' 말단까지와 융합하고 있는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v2)(서열 번호 3)이 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 서열 번호 3에 의해 코드되는 폴리펩티드를 서열 번호 4에 나타낸다.
또한, FGFR3-TACC3_v2의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하기 위해, 상기 클로닝 벡터를 제한 효소 BamHI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제하고, 또한 EcoRI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제했다. 이 ORF를 포함하는 DNA 단편을 발현 벡터(pMXs-puro; 코스모 바이오사)의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 BamHI 및 EcoRI 사이트에 클로닝하여 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro)를 구축했다.
[실시예 3] FGFR3-TACC3_v3의 단리
방광암 임상 검체(미국 아스테란드사) 59 검체에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 랜덤 프라이머(랜덤 프라이머즈, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 7로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_F 및 서열 번호 8로 표시되는 FGFR3_TACC3_RT_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(TaKaRa Ex Taq; 다카라 바이오 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 10초, 55℃ 15초, 68℃ 1분 30초를 30 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 9로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_F 및 서열 번호 10으로 표시되는 FGFR3_TACC3_nested_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 1분을 30 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 샘플 Bd021 검체로, 약 650 bp의 PCR 산물을 얻은 것을 알 수 있었다.
그 후, PCR 산물을 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, 약 650 bp의 PCR 산물은, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 엑손 19의 도중 서열이, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 인트론 10-11의 일부에 융합하고, 또한 TACC3 유전자의 CDS의 엑손 11의 5' 말단과 융합하고 있는 서열인 것이 밝혀졌다.
방광암 환자 방광암 조직 유래 RNA(미국 아스테란드사) Bd021 검체 RNA에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 올리고(dT) 프라이머(올리고(dT) 20 프라이머, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 11로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_F 및 서열 번호 12로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 60℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 13으로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F 및 서열 번호 14로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 약 3.0 kbp의 PCR 산물을 얻은 것을 알 수 있었다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝했다. 인서트는 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열을 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, 약 3.0 kbp의 PCR 산물에서는, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 5' 말단으로부터 엑손 19의 도중 서열이, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 인트론 10-11의 일부에 융합하고, 또한 TACC3의 CDS의 엑손 11의 5' 말단으로부터 CDS의 3' 말단까지와 융합하고 있는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v3)(서열 번호 5)이 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 서열 번호 5에 의해 코드되는 폴리펩티드를 서열 번호 6에 나타낸다.
또한, FGFR3-TACC3_v3의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하기 위해, 상기 클로닝 벡터를 제한 효소 BamHI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제하고, 또한 EcoRI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제했다. 이 ORF를 포함하는 DNA 단편을 발현 벡터(pMXs-puro; 코스모 바이오사)의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 BamHI 및 EcoRI 사이트에 클로닝하여 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro)를 구축했다.
[실시예 4] FGFR3-TACC3_v1의 검출
폐암 임상 검체 유래 RNA(미국 아스테란드사) 200 샘플로부터 cDNA를 제작하고, cDNA를 기질로 하고, 서열 번호 15로 표시되는 FGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_F 및 서열 번호 16으로 표시되는 FGFR3-TACC3(F18T11)_qPCR_R을 프라이머 세트로 하고, 정량적 PCR 키트(Power SYBR Green PCR Master Mix; 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하고, 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 시스템으로, 정량 PCR(95℃ 10분 후, 95℃ 15초, 59℃ 60초를 45 사이클)을 행하여 유전자 발현량을 측정했다. 그 결과, 폐암 검체에 있어서는 상술한 샘플 Lg344만에서 증폭이 확인되었다. 또한, 방광암 임상 검체 유래 RNA(미국 아스테란드사) 59 샘플로부터 cDNA를 제작하고, cDNA를 기질로 하여 동일하게 실시하여, 복수의 검체로부터 증폭이 확인되었다.
[실시예 5] FGFR3-TACC3_v2의 검출
방광암 임상 검체 유래 RNA(미국 아스테란드사) 59 샘플로부터 cDNA를 제작하고, cDNA를 기질로 하고, 서열 번호 17로 표시되는 FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_F 및 서열 번호 18로 표시되는 FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_R을 프라이머 세트로 하고, 정량적 PCR 키트(Power SYBR Green PCR Master Mix; 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하고, 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 시스템으로, 정량 PCR(95℃ 10분 후, 95℃ 15초, 59℃ 60초를 45 사이클)을 행하여 유전자 발현량을 측정했다. 그 결과, 방광암 검체에 있어서 복수의 검체로부터 증폭이 확인되었다.
[실시예 6] FGFR3-TACC3_v3의 검출
방광암 임상 검체 유래 RNA(미국 아스테란드사) 59 샘플로부터 cDNA를 제작하고, cDNA를 기질로 하고, 서열 번호 19로 표시되는 FGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_F 및 서열 번호 20으로 표시되는 FGFR3-TACC3(F19T11)_qPCR_R을 프라이머 세트로 하고, 정량적 PCR 키트(Power SYBR Green PCR Master Mix; 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하고, 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 시스템으로, 정량 PCR(95℃ 10분 후, 95℃ 15초, 59℃ 60초를 45 사이클)을 행하여 유전자 발현량을 측정했다. 그 결과, 방광암 검체에 있어서 복수의 검체로부터 증폭이 확인되었다.
[실시예 7] FGFR3-TACC3_v1의 레트로바이러스 용액의 제작
FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro(실시예 1)를 9 ㎍, 트랜스펙션 시약(FUGENE(등록 상표) HD, 로슈(Roche)사)을 이용하여, Platinum-E 세포에 트랜스펙션을 실시했다. 트랜스펙션 24시간 후에 10% 소혈청(니치레이 바이오 사이언스사)을 포함하는 D-MEM 배지(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium); 인비트로젠사)를 교환하고, 또한 24시간의 배지 상청을 채취하여 레트로바이러스 용액을 제작했다.
[실시예 8] FGFR3-TACC3_v1의 부착면에 비의존적인 증식 항진 작용의 검토
실시예 7에 있어서 FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro를 이용하여 제작한 바이러스 용액에 폴리브렌(Polybrene; 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)사)을 4 ㎍/mL의 농도로 첨가한 후, NIH3T3 세포에 첨가하여 감염시켰다. 첨가 6시간 후에 10% 소혈청(니치레이 바이오 사이언스사)을 포함하는 D-MEM 배지로 교환하고, 감염 1일 후에 10% 소혈청(니치레이 바이오 사이언스사) 및 1 ㎍/mL의 퓨로마이신(시그마-알드리치사)을 포함하는 D-MEM 배지(인비트로젠사)로 교환하고, 5% CO2 존재하, 37℃에서 4주간 배양을 계속하여, FGFR3-TACC3_v1을 안정 발현하는 NIH3T3 세포를 취득했다. (FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포라고 명명함)
FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포의 부착면 비의존적 증식 항진능을 검토하기 위해, 96웰 스페로이드 플레이트(스미론 셀타이트 스페로이드 96U ; 스미토모 베이크라이트사)에 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포 및 공벡터인 pMXs-puro를 감염시킨 NIH3T3 세포(Mock/NIH3T3 세포)를, 각각 1웰당 1×103개가 되도록 10% 소혈청(니치레이 바이오 사이언스사)을 포함하는 D-MEM 배지(인비트로젠사)에서 파종했다. 5% CO2 존재하, 37℃에서 배양 후, 다음날(1일째(Day 1)) 및 4일 후(4일째(Day 4))의 세포수를 세포수 측정 시약(CELLTITER-GloTM 발광 세포 생존능 분석(Luminescent Cell Viability Assay); 프로메가(Promega)사)을 이용하여 매뉴얼의 방법에 따라 측정했다. 검출에는 발광 측정 장치를 이용했다. Mock/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 세포수의 카운트는 증가하지 않은 반면 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 약 3.1배의 세포수의 카운트의 증가가 확인되었다. 이상의 점에서, FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포는 부착면 비의존적 세포 증식을 나타내는 것이 밝혀졌다.
[실시예 9] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포에 대한 융합 폴리펩티드 저해제의 부착면 비의존적 세포 증식 저해 작용
부착면에 비의존적인 세포 증식의 측정(콜로니법 등)은, 화합물의 항암 작용(약리 효과)을 검토하는 계로서 알려져 있다(임상 종양학 세컨드 에디션, 암과 화학 요법사). 콜로니법을 대신하는 세포 비접착성의 증식을 측정하는 방법으로서, 상술한 바와 같은 스페로이드 플레이트를 이용하는 방법이 있다.
96웰 스페로이드 플레이트(스미론 셀타이트 스페로이드 96U ; 스미토모 베이크라이트사)에, FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포를, 1웰당 1×103개가 되도록 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 파종했다. 또한, 포지티브 컨트롤용으로 배지만 첨가한 웰을 조제했다. 5% CO2 존재하, 37℃에서 하룻밤 배양 후, 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398을 최종 농도 100 nM로 첨가했다. 네거티브 컨트롤로서 화합물의 용매인 DMSO를 화합물 첨가시와 동일 농도(0.1%)가 되도록 첨가했다. 그 후, 5% CO2 존재하, 37℃에서 4일간 배양하고, 세포수 측정 시약(CellTiter-GloTM 발광 세포 생존능 분석; 프로메가사)을 첨가하여 20분 교반한 후, 발광 측정 장치를 이용하여 측정했다. 포지티브 컨트롤, 네거티브 컨트롤의 값을 각각 100% 저해치, 0% 저해치로 하여 각 화합물의 증식 저해%를 산출했다. 그 결과, 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398의 저해%는 각각 40%, 74%, 92%였다.
이상의 결과는, FGFR3-TACC3_v1을 발현하는 암세포나 종양의 증식을 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 저해제가 저해할 수 있는 것을 나타내고 있다.
본 발명의 폴리펩티드 저해제에 의한 치료의 유효성이 기대되는 적용 대상자를 본 발명의 검출 방법에 의해 식별함으로써, 테일러 메이드 의료를 실천할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 10] FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3의 레트로바이러스 용액의 제작
실시예 2 및 3에서 제작한 FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro 및 FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro를 이용하여, 실시예 7의 방법에 따라 레트로바이러스 용액을 제작했다.
[실시예 11] FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3의 부착면 비의존적 증식 항진 작용의 검토
실시예 10에 있어서 FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro 및 FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro를 이용하여 제작한 바이러스 용액을 이용하여, 실시예 8의 방법에 따라 FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3을 안정 발현하는 NIH3T3 세포를 취득했다. (각각 FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포라고 명명함)
FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포의 부착면 비의존적 증식 항진능을 검토하기 위해, 실시예 8과 동일한 방법으로 검토했다. Mock/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 세포수의 카운트는 증가하지 않은 반면, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 약 2.8배의 세포수의 카운트의 증가가 확인되었다. 또한, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 약 2.3배의 세포수의 카운트의 증가가 확인되었다. 이상의 점에서, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포는 부착면 비의존적 세포 증식을 나타내는 것이 밝혀졌다.
[실시예 12] FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대한 본 발명의 폴리펩티드 저해제의 부착면 비의존적 세포 증식 저해 작용
실시예 9와 동일한 방법으로 FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포 증식 저해 작용의 평가를 행했다. 그 결과, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포에 대한 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398의 저해%는 각각 21%, 60%, 90%였다. 또한, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대한 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398의 저해%는 각각 32%, 51%, 87%였다.
이상의 결과는, FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3을 발현하는 암세포나 종양의 증식을 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제가 저해할 수 있는 것을 나타내고 있다.
FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제에 의한 치료의 유효성이 기대되는 적용 대상자를 본 발명의 검출 방법에 의해 식별함으로써, 테일러 메이드 의료를 실천할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 13] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대한 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제의 항종양 시험
인산 완충 생리 식염수(Phosphate buffered saline, PBS)에 현탁한 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포 3×106개를 4주령의 웅성 cann.Cg-Foxn1Nu/Crlcrlj(Nu/Nu) 누드 마우스(니혼 찰스리버사)의 등부 피하에 주사하여 이식했다. 이식 3일 후에 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제인 AZD4547 및 BGJ398의 투여를 시작했다. 시험은 용매군 및 화합물군을 각 4마리 내지 5마리로 행하고, 0.5% 메틸셀룰로오스(methylCELLULOSE, 신에츠 화학 공업 주식회사)/99.5% 증류수의 조성의 용매에 AZD4547 및 BGJ398을 현탁하고, 각각 30 mg/kg을 경구 투여했다. 투여는 11일간 1일 1회 행하고, 체중 및 종양 직경을 2일 내지 3일마다 측정했다. 종양 체적의 산출에는 이하의 식을 이용했다.
[종양 체적(mm3)]=[종양의 장직경(mm)]×[종양의 단직경(mm)]2×0.5
화합물 투여 개시일 및 투여 종료일의 용매군의 종양 체적을 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여 AZD4547 및 BGJ398의 저해율을 산출했다. 그 결과, AZD4547 및 BGJ398은 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포(종양)의 증식을 각각 51%, 90% 저해했다. FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대한 항종양 작용도 동일하게 검토했다. 그 결과, AZD4547 및 BGJ398은, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포(종양)의 증식을 각각 61% 및 90% 저해했다. 또한 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포(종양)의 증식을 각각 73% 및 88% 저해했다.
[실시예 14] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포 종양에 대한 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제 투여에 의한 키나아제 저해 작용
하기 이외에는 실시예 13과 동일하게 하여, AZD4547 및 BGJ398의 키나아제 저해 작용을 관찰했다. FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포 3×106개를 이식하고, 이식 3일 후에 AZD4547 및 BGJ398의 투여를 시작했다. 시험은 용매군 및 화합물군 각 5마리로 행하고, 최종 투여 4시간 후에 해부하여 종양을 적출했다. 그 후, 용해액(세포 용해 버퍼; 셀 시그널링 테크놀로지사, 포스파타제 저해제 칵테일; 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)사, 컴플리트(Complete); 로슈사)을 이용하여 종양의 단백질 추출액을 조속히 조제하고, 종양 내의 총FGFR3 및 인산화 FGFR3의 측정을 ELISA 키트(R&D사)를 이용하여 실시했다. ELISA는 첨부의 순서서에 따라 실시했지만, 검출은 화학 발광 시약(BM 케미루미네선스 ELISA 기질; 로슈사) 및 발광 측정 장치(ARVO; 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사)에 의한 화학 발광의 검출로 변경했다.
인산화 FGFR3치를 총FGFR3치로 보정한 값(인산화 FGFR3/총FGFR3)을 인산화 레벨로 하고, 용매군의 인산화 레벨을 0% 저해, 절대치 0을 100% 저해로 하여 각 화합물군의 티로신 자기 인산화 저해율을 산출했다. 그 결과, AZD4547 및 BGJ398군에서는 용매군과 비교하여 종양 내의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v1의 티로신 자기 인산화가 각각 58%, 77% 감소되어 있었다.
FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대해서도 동일하게 검토한 결과, AZD4547 및 BGJ398군에서는 용매군과 비교하여, 종양 내의 FGFR3-TACC3_v2의 티로신 자기 인산화가 각각 54%, 66% 감소되어 있었다. 또한, 종양 내의 FGFR3-TACC3_v3의 티로신 자기 인산화가 각각 78%, 85% 감소되어 있었다.
이들 결과로부터, 상기 동물 모델에서의 AZD4547 및 BGJ398의 항종양 작용이 종양 내의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 키나아제 활성을 저해하는 작용에 기초하는 것이 확인되었다.
[실시예 15] 방광암 환자 유래 세포주 RT-112로부터의 FGFR3-TACC3_v1의 단리
방광암 환자 유래 세포주 RT-112(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입)로부터 정제한 RNA에 대하여, 역전사 효소(수퍼스크립트III, 라이프 테크놀로지즈사) 및 올리고(dT) 프라이머(올리고(dT) 20 프라이머, 라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여, 키트의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, 서열 번호 11로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_F 및 서열 번호 12로 표시되는 FGFR3-TACC3_cloning_R의 프라이머를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2 ; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 60℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. 그 후, 10배 희석한 상술한 PCR 산물을 주형으로 하고, 서열 번호 13으로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F 및 서열 번호 14로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R의 프라이머를 이용하고, 동일한 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 25 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 결과, 약 2.9 kbp의 PCR 산물이 얻어졌다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝하고, 인서트를 다이데옥시 시퀀스법(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 의해 서열을 결정한 결과, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 5' 말단으로부터 엑손 18의 3' 말단까지가, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 11의 5' 말단으로부터 CDS의 3' 말단까지와 융합하고 있는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v1)(서열 번호 1)과 동일한 것이 밝혀졌다.
[실시예 16] 방광암 환자 유래 세포주 RT-112에 대한 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제의 부착면 비의존적 세포 증식 저해 작용
96웰 스페로이드 플레이트(스미론 셀타이트 스페로이드 96U ; 스미토모 베이크라이트)에, RT-112 세포를, 1웰당 2×103개가 되도록 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지로 파종했다. 또한, 포지티브 컨트롤용으로 배지만 첨가한 웰을 조제했다. 5% CO2 존재하, 37℃에서 하룻밤 배양 후, 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398을 최종 농도 100 nM로 각각 첨가했다. 네거티브 컨트롤로서 화합물의 용매인 DMSO를 화합물 첨가시와 동일 농도(0.1%)가 되도록 첨가했다. 그 후, 5% CO2 존재하, 37℃에서 5일간 배양하고, 세포수 측정 시약(CellTiter-GloTM 발광 세포 생존능 분석; 프로메가사)을 첨가하여 20분 교반한 후, 발광 측정 장치를 이용하여 측정했다. 포지티브 컨트롤, 네거티브 컨트롤의 값을 각각 100% 저해치, 0% 저해치로 하여 각 화합물의 증식 저해%를 산출했다. 그 결과, 도비티닙, AZD4547 및 BGJ398의 저해%는 각각 80%, 90%, 90%였다.
[실시예 17] FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 검출
세포 중의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드를 검출하는 방법을 이하와 같이 구축했다. FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포 및 네거티브 컨트롤로서 NIH3T3 세포를 배양했다. PBS로 1회 세정 후, 세포를 용해액(세포 용해 버퍼; 셀 시그널링 테크놀로지사, 포스파타제 저해제 칵테일; 써모 사이언티픽사, 컴플리트; 로슈사)으로 빙상에서 10분 용해시켰다. 원심 후 얻어진 상청에 대하여 항FGFR3 항체(시그마-알드리치사)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 프로테인 G 비즈(프로테인 G 세파로스 4 패스트 플로우; 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)사)를 첨가하고 4시간 면역 침강을 행했다. 원심 후에 침강물을 세정액(조성은 상술한 용해액과 동일)으로 4회 세정하고, SDS 용액 첨가 후 5분간 끓여 침전물을 현탁했다. 원심 후 이 상청에 대하여 항TACC3 항체(알 앤 디 시스템즈(R and D systems)사)를 이용한 이뮤노 블로팅을 행했다. 그 결과, FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포의 면역 침강물에서는, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v1이 검출되었지만, NIH3T3 세포에서는 검출되지 않았다. FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대해서도 동일하게 검토한 결과, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포의 면역 침강물에 있어서, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v2 및 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v3이 각각 검출되었다. 또한, RT-112 세포에 대해서도 동일한 방법으로 검토한 결과, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 v1이 검출되었다.
이상의 결과로부터, 항FGFR3 항체 및 항TACC3 항체를 조합시켜 이용함으로써, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드를 발현하고 있는 암세포나 암조직 중의 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 것이 가능해져, 본 발명의 폴리펩티드 양성 암환자를 판정하는 것이 가능한 것이 밝혀졌다.
[실시예 18] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 세그먼트에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 인시츄 하이브리다이제이션(ISH)법에 의한 검출
FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 또는 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포를 4주령 웅성 누드 마우스(CAnN·Cg-Foxn1nu/CrlCrlj(nu/nu), 니혼 찰스리버)의 피하에 3×106개로 이식하고, 15일 후, 세포 덩어리의 증식을 확인하여 담암 마우스를 제작했다.
제작한 담암 마우스로부터, 증식한 암세포를 포함하는 조직을 추출하고, 생리 식염수로 세정 후, 10% 중성 완충 포르말린(시그마-알드리치사)으로 실온에서 48∼144시간 고정하고, 자동 포매 장치(티슈-테크 VIP, 사쿠라 파인테크 재팬 주식회사)를 이용하여 정법에 따라 탈수한 후, 파라핀(티슈프레프, 주식회사 파르마)에 포매했다. 파라핀 포매 후의 조직 샘플을 두께 5 ㎛로 추출하여 FFPE 세그먼트로 했다.
준비한 FFPE 세그먼트를 히트 블록(MG-2200 ; 도쿄 리카 기계 주식회사) 상에서 60℃, 15분간 가열한 후, 10% 포르말린(와코 쥰야쿠 공업 주식회사)으로 실온, 30분간 고정했다. PBS(인비트로겐사)로 3회 세정, 완전히 건조하고, 크실렌(와코 쥰야쿠 공업 주식회사)으로 실온, 10분간 처리했다. 다음으로, FFPE 세그먼트를 PBS로 3회 세정하고, 전처리 용액(아피메트릭스사)으로 100℃, 10분간 끓였다. 또한, 정제수로 2회, PBS로 1회 세정하고, 프로테아제 용액(아피메트릭스사)으로 인큐베이터(HybEZ 하이브리다이제이션 시스템; 어드반스드 셀 다이아그노스틱스(Advanced Cell Diagnostics)사) 내에서 40℃, 20분간 처리했다. 그 후, PBS로 3회 세정하고, 4% 포르말린(와코 쥰야쿠 공업 주식회사)으로 실온, 5분간 고정하고, PBS로 3회 세정했다. FGFR3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_000142.3)의 염기 서열 중, 모든 배리언트에 공통되는 염기 번호 2851∼4281에 특이적인 branced DNA 프로브(QuantiGene View RNA Probe Set Type 4; 아피메트릭스사), 및 TACC3 유전자(진뱅크 등록 번호 : NM_006342.1)의 염기 서열 중 염기 번호 2200∼2838에 특이적인 branced DNA 프로브(QuantiGene View RNA Probe Set Type 1; 아피메트릭스사)를, 프로브 세트 희석제 QT(아피메트릭스사)로 40배 희석하여, 프로브 세트 용액을 제작했다. 본 용액을 FFPE 세그먼트에 첨가하고, 인큐베이터 내에서 40℃, 2시간 반응시키고, 폴리뉴클레오티드(mRNA)에 하이브리다이제이션시켰다. 그 후, FFPE 세그먼트를 세척 버퍼(아피메트릭스사)로 3회 세정하고, 전치증폭기 믹스 QT(아피메트릭스사)로 인큐베이터 내에서 40℃, 25분간 반응시켰다. 또한, FFPE 세그먼트를 세척 버퍼로 3회 세정하고, 증폭기 믹스 QT(아피메트릭스사)로 인큐베이터 내에서 40℃, 15분간 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세정하고, 라벨 프로브 믹스(아피메트릭스사)를 25분의 1 용량 포함하는 라벨 프로브 희석제 QT(아피메트릭스사)로 인큐베이터 내에서 40℃, 30분간 반응시켰다. 다음으로, 세척 버퍼로 2회, PBS로 1회 세정하고, 형광 색소 DAPI(아피메트릭스사)를 포함하는 PBS로 실온, 15분간 반응시켰다. PBS로 2회 세정한 후, 봉입제 EcoMount(바이오케어 메디컬(Biocare Medical)사)로 봉입하고, 공초점 레이저 현미경(LSM700; 칼자이스(Carl Zeiss)사)으로 형광 관찰했다. FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포의 FFPE 세그먼트 중 어느 것에 있어서도 FGFR3의 시그널 및 TACC3의 시그널이 검출되고, 또한 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널의 대부분이 공국재(共局在)했다. 이에 따라 FGFR3-TACC3 융합 유전자를 강제적으로 발현시킨 세포를 포함하는 FFPE 세그먼트에서는, FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널이 공국재하는 것이 밝혀졌다.
[실시예 19] RT-112 세포에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 ISH 법에 의한 검출
실시예 18과 동일한 순서로 인간 방광암 환자 유래 세포주 RT-112 세포 및 인간 위암 환자 유래 세포주 HSC-39 세포의 FFPE 표본을 제작하고, ISH 법에 의한 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 검출을 행했다. 실시예 18의 히트 블록에 의한 처리 이후의 방법으로 처리하고, 봉입 후의 표본을 형광 관찰했다. 취득한 화상을 IN Cell Analyzer 2000(지이 헬쓰케어사)으로 해석한 바, FGFR3-TACC3_v1을 발현하는 RT-112 세포(실시예 15)의 FFPE 세그먼트에서는 공국재하는 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널이 다수 검출된 반면, 실시예 23에 기재된 RT-PCR에 의해 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)를 발현하지 않은 것을 확인한 HSC-39 세포의 FFPE 세그먼트에서는 공국재하는 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널은 거의 검출되지 않았다. 이에 따라, FGFR3-TACC3 융합 유전자를 내재적으로 발현하는 세포를 포함하는 FFPE 세그먼트에 있어서 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널이 공국재하고, FGFR3-TACC3 융합 유전자를 발현하지 않은 세포에서는 공국재하지 않는 점에서, 이러한 공국재 시그널을 측정함으로써, FGFR3-TACC3 융합 유전자의 유무를 판정할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 20] 방광암 환자 유래 FFPE 세그먼트에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)의 ISH 법에 의한 검출
미국 아스테란드사로부터 구입한 방광암 환자 유래 조직의 FFPE 세그먼트를, 실시예 18의 히트 블록에 의한 처리 이후의 방법으로 처리하고, 봉입 후의 세그먼트를 형광 관찰했다. 취득한 화상을 IN Cell Analyzer 2000(지이 헬쓰케어사)으로 해석한 바, FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)를 발현하지 않는 것을 실시예 23에 기재된 RT-PCR 법에 의해 확인한 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트와 비교하여, FGFR3-TACC3_v2를 발현하는 것을 실시예 23에 기재된 RT-PCR 법에 의해 확인한 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에서는, 공국재하는 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널의 수가 분명히 많았다.
영국 티슈 솔루션즈사로부터 구입한 복수의 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에 관해서도 동일한 방법으로, FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널의 공국재를 조사했다. 그 결과, FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)를 발현하지 않는 것을 실시예 23에 기재된 RT-PCR 법에 의해 확인한 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트와 비교하여, FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드(mRNA)를 발현하는 것을 상술한 실시예에 기재된 RT-PCR 법에 의해 확인한 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에서는, 공국재하는 FGFR3의 시그널과 TACC3의 시그널의 수가 분명히 많았다.
이에 따라, 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에 있어서도, 공국재하는 시그널을 관찰함으로써, FGFR3-TACC3 융합 유전자의 유무를 판정할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 21] FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성에 대한 화합물의 저해 작용
(1) FLAG 태그 융합 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+), FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+) 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))의 구축
5' 말단에 FLAG 태그를 융합시킨 FGFR3-TACC3 융합 폴리뉴클레오티드를 취득하기 위해, 실시예 1, 2 및 3에서 클로닝한 벡터를 주형으로서 이용하여, 5' 말단에 FLAG 태그를 부가시키는 PCR을 실시했다. 서열 번호 21로 표시되는 FGFR3_N_FLAG_BamHI 및 서열 번호 14로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R의 프라이머 및 DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2 ; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 12 사이클)을 행했다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝했다. 인서트는 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열을 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, PCR 산물은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 기재되어 있는 서열 중, 퍼스트 메티오닌을 코드하는 3 염기(ATG)가 삭제되고, 개시 코돈과 FLAG 태그를 코드하는 핵산 서열(서열 번호 22)이 5' 말단에 부가된 핵산 서열인 것을 확인했다. 이들에 의해 코드되는 폴리펩티드를, 각각 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드라고 하고, 이들을 총칭하여 FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드라고 한다. 또한, 이들 FLAG 서열을 부가한 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG), FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하는 발현 벡터 구축을 위해, 상기 클로닝 벡터를 제한 효소 BamHI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제하고, 또한 EcoRI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제했다. 이 ORF를 포함하는 DNA 단편을 발현 벡터(pcDNA3.1/Zeo(+) ; 라이프 테크놀로지즈사)의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 BamHI 및 EcoRI 사이트에 클로닝하여 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+), FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+) 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))를 구축했다.
(2) FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 취득
트랜스펙션 실시 전일에, 콜라겐 코트된 15 cm 디시 1장당 0.5×107개의 HEK293 세포를 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지를 이용하여 10장 배양했다. 트랜스펙션 당일에, FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+), FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+) 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)를 각각 디시 1장당 27 ㎍, 트랜스펙션 시약(FUGENE(등록 상표) HD; 로슈사)을 81 μL 이용하여, HEK293 세포에 트랜스펙션을 실시했다. 트랜스펙션 24시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 3회 세정하고, 1 mL의 PBS를 첨가하고 셀 스크레이퍼(코닝사)에 의해 세포를 박리한 후, 폴리프로필렌제 튜브에 회수했다. 1200 rpm으로 5분간 원심한 후, 상청을 제거하고 150 μL의 세포 용해액(50 mM Tris HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 프로테아제 저해제 칵테일 컴플리트(로슈·다이아그노스틱스 주식회사))를 첨가하고 빙상에서 30분간 인큐베이션하고 세포를 용해시켰다. 원심 후 얻어진 상청 중에 존재하는 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드를 각각 M2 항체 어피니티겔(ANTI-FLAG M2 Affinity Gel; 시그마-알드리치사)을 이용하여 제품 정보에 기재된 방법에 따라 정제했다. 세정 및 용출은 세정액(50 mM Tris HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 프로테아제 저해제 칵테일 컴플리트(로슈·다이아그노스틱스 주식회사)), 용출액(20 mM Tris HCl(pH 7.4), 10 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 0.5 mg/mL FLAG 펩티드)을 각각 사용하여, 100 μL의 용출액을 얻었다. FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드가 얻어진 것을 용출액에 대하여 항FGFR3 항체(셀 시그널링 테크놀로지사) 및 항FLAG M2 항체(시그마-알드리치사)를 이용한 이뮤노 블로팅 및 은 염색을 행하여, 확인했다.
(3) FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성의 검출
상기에서 정제한 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 키나아제 활성 검출 키트(HTRF KinEASE-TK; 시스바이오(Cisbio)사)를 이용하여 검토했다. 384웰의 저용적 블랙 플레이트(Low-volume Black plate)(코닝사)를 이용하고, 상기 용출액의 1배 희석 용액, 3배 희석 용액 또는 10배 희석 용액의 각 1 μL를 효소원으로 하고, 키트 동봉의 5×키나아제 버퍼에 DTT 및 Mg2+를 각각 최종 농도 1 mM 및 5 mM이 되도록 첨가하여 반응 용액으로 했다. 기질로서, 키트 동봉의 TK 기질을 최종 농도가 2.0 μM이 되도록, ATP 미첨가 및 ATP의 최종 농도가 100 μM이 되도록 첨가하고, 최종 용량 5.0 μL로 하여 각각 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 키트 장려의 방법에 따라 Sa-XL665 및 TK 항체-Eu(K) 용액을 조제하고, 각각 2.5 μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응 후, HTRF의 카운트(즉 펩티드 기질의 인산화)를 검출했다. 그 결과, ATP 미첨가에 대하여 ATP 첨가에서는, HTRF의 카운트가, 상기 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 또는 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드를 포함하는 각 용출액 1배 희석 용액 1 μL를 첨가했을 때에는, 각각 약 38배, 약 40배 및 약 38배 증가, 상기 용출액 3배 희석 용액 1 μL를 첨가했을 때에는, 각각 약 27배, 34배, 31배, 상기 용출액 10배 희석 용액 1 μL를 첨가했을 때에는, 각각 5배, 18배, 11배로 증가되어 있는 것이 밝혀졌다.
이상과 같이, 키나아제 활성 검출 키트를 이용함으로써, FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성을 검출하는 것이 가능했다.
(4) FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성에 대한 화합물의 저해 작용
FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성에 대한 화합물 도비티닙, AZD4547, BGJ398 및 LY2874455의 저해 작용을 상기 키나아제 활성 검출 키트 및 동일한 384웰 플레이트를 이용하여 검토했다. 1.0 μL의 각 화합물 용액을, DMSO의 최종 농도가 0.1%, 화합물의 최종 농도가 도비티닙은 1 μM, 100 nM, 10 nM, AZD4547 및 BGJ398은 각각 100 nM, 10 nM, 1 nM, LY2874455는 10 nM, 1 nM, 0.1 nM이 되도록 첨가하고, 또는 컨트롤로서 DMSO를 0.1%가 되도록 첨가하고, FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드에 관해서는 상기 용출액 2배 희석 용액 1 μL, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드에 관해서는 상기 용출액 3배 희석 용액 1 μL, 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드에 관해서는 상기 용출액 3배 희석 용액 1 μL를 첨가했다. 이어서, 기질로서, 키트 동봉의 TK 기질을 최종 농도가 2.0 μM이 되도록 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 다음으로, ATP 미첨가 및 ATP의 최종 농도가 100 μM이 되도록 첨가하고, 최종 용량 5.0 μL로 하여 각각 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 밖에는, 상술한 (3)의 방법과 동일하게 조제한 Sa-XL665 및 TK 항체-Eu(K) 용액을 각각 2.5 μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응 후, HTRF의 카운트를 검출했다. 화합물 비존재하(DMSO를 화합물 첨가시와 동일 농도인 0.1%)에서의 ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 화합물에 의한 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 키나아제 활성의 저해%를 이하의 식으로부터 산출했다.
[화합물에 의한 키나아제 활성 저해(%)]=(1-[화합물 첨가 ATP 첨가시의 인산화의 카운트-화합물 미첨가 ATP 미첨가시의 인산화의 카운트]/[화합물 미첨가 ATP 첨가시의 인산화의 카운트-화합물 미첨가 ATP 미첨가시의 인산화의 카운트])×100
그 결과, 정제 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 화합물 도비티닙, AZD4547, BGJ398 및 LY2874455가 저해하는 것을 발견했다. 각 화합물의 각각의 최종 농도에서의 펩티드 기질에 대한 저해 비율(%)을 표 1에 나타낸다.
Figure pat00001
[실시예 22] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 대한 LY2874455 화합물의 부착면 비의존적 세포 증식 저해 작용
LY2874455 화합물의 최종 농도가 10 nM이 되도록 한 것 이외에는, 실시예 9와 동일한 방법을 이용하여 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포 증식 저해 작용의 평가를 행했다. 그 결과, LY2874455의 저해%는 각각 88%, 90%, 89%였다.
이상의 결과는, FGFR3-TACC3_v1, FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3을 발현하는 암세포나 종양의 증식을 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드 저해제인 LY2874455가 저해할 수 있는 것을 나타내고 있다.
[실시예 23] 인간 침윤성 방광암 검체로부터의 FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b의 단리
인간 침윤성 방광암 검체(영국 티슈 솔루션사)에 대하여, 역전사 효소 키트(수퍼스크립트 III 퍼스트 스트랜드 신세테이스 수퍼믹스 ; 라이프 테크놀로지즈사)의 프로토콜에 따라, 올리고 dT 프라이머를 이용하여 역전사 반응을 행하여, cDNA를 합성했다.
다음으로, FGFR3_F002 프라이머(서열 번호 23) 및 TACC3_R002 프라이머(서열 번호 24)를 이용하고, 상기에서 얻은 cDNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라아제(Prime STAR ; 다카라 바이오 주식회사)를 이용하여 PCR(94℃ 2분 후, 98℃ 10초, 68℃ 3.5분을 40 사이클)을 행했다.
이들 프라이머는 각각 FGFR3 유전자의 5' UTR 및 TACC3의 3' UTR에 해당하기 때문에, FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 존재하면, 배리언트를 불문하고 모든 융합 유전자를 검출할 수 있다.
얻어진 PCR 산물을 클로닝 벡터(Zero blunt TOPO PCR Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝하고, 인서트를 다이데옥시 시퀀스법(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 의해 서열을 결정했다. 그 결과, NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 CDS의 5'로부터 엑손 18의 도중까지(257번째로부터 2498번째)가, TACC3 유전자(NM_006342.1)의 CDS의 엑손 7의 도중(1771번째로부터 2672번째)과 융합하고 있는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v5a)과 1 염기를 제외하고 동일한 것이 밝혀졌다(서열 번호 25). 그 1 염기는 NCBI에 등록되어 있는 FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 1980번째에 있고, 등록에서는 C이지만 결정한 서열은 G였다. 또한, 동시에, FGFR3 유전자(NM_001163213.1)의 엑손 4의 3'측의 서열(690번째로부터 701번째)이 결실되고, 또한, 엑손 10과 엑손 11 사이에 CAG 서열이 삽입된 서열을 갖는 전사 산물(FGFR3-TACC3_v5b)(서열 번호 27)도 존재하는 것이 밝혀졌다. 서열 번호 25에 의해 코드되는 폴리펩티드를 서열 번호 26에, 서열 번호 27에 의해 코드되는 폴리펩티드를 서열 번호 28에 나타낸다.
[실시예 24] FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b의 레트로바이러스 용액의 제작
FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하기 위해, 레트로바이러스 용액 제작용 발현 플라스미드를 이하와 같이 구축했다. 실시예 23에서 제작한, 클로닝한 벡터를 각각 주형으로서 이용하고, 서열 번호 7로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F 및 서열 번호 8로 표시되는 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_F의 프라이머, 및 DNA 폴리머라아제(KOD -plus- Ver.2 ; 도요 방적 주식회사)를 이용하여 PCR(98℃ 15초, 55℃ 15초, 68℃ 3분 30초를 15 사이클)을 행했다. PCR 반응 후, 전기 영동한 바, 각각 목적 사이즈의 PCR 산물이 얻어졌다. PCR 산물을 클로닝 벡터(TOPO XL PCR Cloning Kit ; 라이프 테크놀로지즈사)에 클로닝했다. 인서트는 다이데옥시 시퀀스법에 의해 서열을 결정했다(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ; 라이프 테크놀로지즈사). 이 결과, PCR 산물은, 각각, 서열 번호 25 또는 서열 번호 27을 포함하는 것을 확인했다. FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b의 ORF 전체 길이를 단백질로서 발현하기 위해, 상기 클로닝 벡터를 제한 효소 BamHI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제하고, 또한 EcoRI로 37℃, 3시간의 효소 반응을 행하여 제한 효소 처리한 DNA 단편을 정제했다. 이 ORF를 포함하는 DNA 단편을 발현 벡터(pMXs-puro ; 코스모 바이오사)의 멀티클로닝 사이트에 존재하는 BamHI 및 EcoRI 사이트에 클로닝하여 발현 플라스미드(FGFR3-TACC3_v5a/pMXs-puro 및 FGFR3-TACC3_v5b/pMXs-puro)를 구축했다.
이들 구축 벡터를 이용하여 실시예 7의 방법에 따라 레트로바이러스 용액을 제작했다.
[실시예 25] FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b의 부착면 비의존적 증식 항진 작용의 검토
실시예 24에 있어서 FGFR3-TACC3_v5a/pMXs-puro 및 FGFR3-TACC3_v5b/pMXs-puro를 이용하여 제작한 바이러스 용액을 이용하여, 실시예 8의 방법에 따라 FGFR3-TACC3_v5a 및 FGFR3-TACC3_v5b를 안정 발현하는 NIH3T3 세포를 취득했다. (각각 FGFR3-TACC3_v5a 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v5b 발현/NIH3T3 세포라고 명명함)
FGFR3-TACC3_v5a 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v5b 발현/NIH3T3 세포의 부착면 비의존적 증식 항진능을 검토하기 위해, 실시예 8과 동일한 방법으로 검토했다. Mock/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 세포수의 카운트는 증가하지 않은 반면, FGFR3-TACC3_v5a 발현/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 약 2.6배의 세포수의 카운트의 증가가 확인되었다. 또한, FGFR3-TACC3_v5b 발현/NIH3T3 세포는 1일째부터 4일째까지에서 약 2.7배의 세포수의 카운트의 증가가 확인되었다. 이상의 점에서, FGFR3-TACC3_v5a 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v5b 발현/NIH3T3 세포는 부착면 비의존적 세포 증식 항진 작용을 나타내는 것이 밝혀졌다.
[실시예 26] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포의 포르말린 고정 표본에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 면역 염색법에 의한 검출
(1) 샘플 조제
실시예 8에서 제작된 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포 및 NIH3T3 세포를 커버 글라스 상에서 하룻밤 배양했다. 다음날 배양액을 제거한 후, 3.7% 포름알데히드로 실온 10분간 반응시키고 세포를 고정했다. PBS로 세정 후, 0.2% 트리톤 X-100(나카라이사)으로 실온 10분간 반응시킨 후, 0.5% SDS로 실온 25분간 반응시켰다. PBS로 세정 후, 블로킹 용액(올린크사)으로 블로킹했다.
(2) 목적 융합 폴리펩티드의 검출
상기 (1)에서 조제한 샘플을, 캔 겟 시그널 면역염색 용액(Can Get Signal immunostain Solution) A(도요 방적 주식회사)로 희석한 FGFR3 항체(숙주 : 마우스 산타크루즈(Santacruz)사)와 TACC3 항체(숙주 : 염소 R&D사)로, 4℃, 하룻밤 인큐베이트했다.
다음날 세척 버퍼 A(올린크사)로 세정 후, 캔 겟 시그널 면역염색 용액 A로 희석을 한 듀올린크 인시츄 PLA 프로브 항마우스 마이너스(Duolink InSitu PLA probe anti-Mouse MINUS)와 듀올린크 인시츄 PLA 프로브 항염소 플러스(Duolink InSitu PLA probe anti-Goat PLUS)(모두 올린크사)로 커버 글라스를 실온, 1시간 침지했다. 세척 버퍼 A로 세정한 후, 듀올린크 II 시약 키트의 라이게이션-리가제 용액(올린크사)에 침지하고, 37℃, 30분간 인큐베이트했다. 이 공정에 의해 충분히 근접한 위치에 있는 2종류의 인시츄 PLA 프로브 항체 사이에 고리형 올리고뉴클레오티드가 형성된다. 세척 버퍼 A로 세정한 후, 동키트의 증폭-폴리머라아제 용액(올린크사)을 첨가하고, 37℃에서 100분간 인큐베이트했다. 이 공정에 의해 고리형 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 핵산이 신장하며, 또한 그 신장한 핵산에 형광 표지된 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈한다. 세척 버퍼 B(올린크사)로 2회, 세척 버퍼 B를 물로 100배 희석한 용액으로 1회 세정한 후, DAPI를 갖는 듀올린크 마운팅 배지(올린크사)로 봉입하고, 공초점 레이저 현미경(LSM700; 칼자이스사)을 이용하여 형광 관찰했다. FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포에서는 다수의 형광 도트가 존재하는 세포가 관찰되는 반면, NIH3T3 세포에 있어서는 형광 도트는 거의 관찰되지 않았다. 이 형광 도트는 고리형 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 신장한 핵산에 하이브리다이즈한 형광 표지 올리고뉴클레오티드에서 유래되고, 2종류의 항원 즉 FGFR3과 TACC3이 충분히 근접한 상태 즉 동일 분자 내에 존재하고 있는 것에서 유래된다. 따라서 본 실시예의 방법으로, 형광 도트의 유무를 관찰함으로써, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 존재의 유무를 판정(검출)할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 27] RT-112 세포에서의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 표본에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 면역 염색법에 의한 검출
(1) 샘플 조제
실시예 19에서 제작한, FGFR3-TACC3_v1을 발현하는 RT-112 세포와 발현하지 않는 HSC-39 세포의 FFPE 표본을 크실렌과 에탄올에 각각 3회, 각 8분간 침지함으로써 파라핀을 제거하고, 이뮤노세이버(닛신 EM 주식회사)에 침지하여 끓였다. PBS로 세그먼트를 세정한 후, 0.2% 트리톤 X-100으로 실온 10분간 반응시켰다. PBS로 세정 후 무혈청 프로테인 블록(Protein Block Serum-Free)(다코(Dako)사)로 블로킹했다.
(2) 목적 융합 폴리펩티드의 검출
실시예 26의 (2)와 동일한 순서로 면역 염색법에 의한 검출을 행하고, 형광 관찰했다. FGFR3-TACC3_v1을 발현하는 RT-112 세포에서는 다수의 형광 도트가 관측된 반면, FGFR3-TACC3_v1을 발현하지 않은 HSG-39 세포에서는 그와 같은 형광 도트는 거의 관측되지 않았다. 이에 따라, FGFR3-TACC3 융합 유전자를 내재적으로 발현하는 세포를 포함하는 FFPE 세그먼트에 있어서 형광 도트를 관찰함으로써, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 존재의 유무를 판정(검출)할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 28] 방광암 환자 유래 FFPE 세그먼트에서의 FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 면역 염색에 의한 검출
(1) 샘플 조제
영국 티슈 솔루션즈사로부터 구입한 방광 폐암 임상 검체의 FFPE 세그먼트를 크실렌과 에탄올에 각각 3회, 각 8분간 침지함으로써 파라핀을 제거하고, 이뮤노세이버(닛신 EM 주식회사)에 침지하여 끓였다. Milli-Q수로 FFPE 세그먼트를 세정한 후, 3% 과산화수소수로 30분 실온에서 인큐베이트했다. PBS로 세정 후, 0.2% 트리톤 X-100으로 실온 10분간 반응시킨 후, 0.5% SDS 용액으로 20분 반응시켰다. PBS로 세정 후 무혈청 프로테인 블록(다코사)로 블로킹했다.
(2) 목적 융합 폴리펩티드의 검출
캔 겟 시그널 면역염색 용액 A(도요보)로 희석한 FGFR3 항체(숙주: 마우스 산타크루즈사)와 TACC3 항체(숙주: 염소 R&D사)로 FFPE 세그먼트를 4℃ 하룻밤 인큐베이트했다.
다음날 세척 버퍼 A(올린크사)로 세정 후, 캔 겟 시그널 면역염색 용액 A로 희석을 한 듀올린크 인시츄 PLA 프로브 항마우스 마이너스와 듀올린크 인시츄 PLA 프로브 항염소 플러스(모두 올린크사)로 FFPE 세그먼트를 실온에서 1시간 침지했다. 세척 버퍼 A로 세정한 후, 듀올린크 II 명시야 시약 키트의 라이게이션-리가제 용액(올린크사)에 침지하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트했다. 이 공정에서 실시예 26, 27과 동일하게 고리형 올리고뉴클레오티드가 형성된다. 세척 버퍼 A로 세정 후, 동키트의 증폭-폴리머라아제 용액(올린크사)으로 37℃에서 120분간 인큐베이트했다. 이 공정에 의해 고리형 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 핵산이 신장한다. 세척 버퍼 A로 세정 후 동키트의 검출 명시야 용액에 침지하여 실온에서 1시간 침지했다. 이 공정에 의해, 앞의 공정에서 신장한 핵산에 홀스래디시 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP) 표지된 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈한다. 세척 버퍼 A로 세정 후, 동키트의 기질 용액을 첨가하고, 실온에서 10분 내지 15분 반응시켰다. Milli-Q수로 세정한 후, 동키트의 핵 염색 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 반응시킨 후, 수돗물로 세정했다. 그 후 에탄올과 크실렌을 이용하여 탈수와 투철을 한 후, 봉입했다.
현미경(BZ-9000; KEYENCE사)에 의해 명시야로 관찰하면, FGFR3-TACC3_v1을 발현하는 것이 실시예 23의 방법으로 확인된 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에서는 빨간 염색이 관찰되어 있는 반면, 실시예 23의 방법으로 FGFR3과 TACC3의 융합 유전자의 발현이 확인되지 않은 환자 조직 유래 세그먼트에서는 빨간 염색이 관찰되지 않았다. 이 빨간 염색은 고리형 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 신장한 핵산에 하이브리다이즈한 HRP 표지 올리고뉴클레오티드에서 유래되고, 실시예 26 및 27과 동일하게 FGFR3과 TACC3이 동일 분자 내에 존재하고 있는 것에서 유래된다. 따라서 빨간 염색이 관찰된 세그먼트에 있어서 FGFR3과 TACC3이 융합한 상태로 존재하는 것이 밝혀졌다. 이에 따라, 본 실시예의 방법으로, 방광암 환자 조직 유래 FFPE 세그먼트에 있어서도, 빨간 염색을 관찰함으로써, FGFR3-TACC3 융합 폴리펩티드의 존재의 유무를 판정(검출)할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 29] FGFR3-TACC3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성에 대한 화합물 A, B, C, D 및 E의 저해 작용
실시예 21의 (4)의 방법에 따라, 화합물 A, B, C, D 및 E의 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 인비트로 키나아제 활성에 대한 저해 작용을 검토했다. 다만, 각 화합물의 최종 농도는 100 nM, 10 nM, 1 nM이 되도록 첨가했다.
그 결과, 정제 FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG) 융합 폴리펩티드, FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG) 융합 폴리펩티드 및 FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG) 융합 폴리펩티드의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 화합물 A, B, C, D 및 E가 저해하는 것을 발견했다. 각 화합물의 각각의 최종 농도에서의 펩티드 기질에 대한 저해 비율(%)을 표 2에 나타낸다.
Figure pat00002
[실시예 30] FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포, 및 방광암 환자 유래 세포주 RT-112에 대한 화합물 A, B, C, D 및 E의 부착면 비의존적 세포 증식 저해 작용
FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포 및 FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포에 관해서는, 실시예 9와 동일한 배지를 이용하고, 방광암 환자 유래 세포주 RT-112에 관해서는, 1웰당 1×103개가 되도록 10% 소태아 혈청 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 RPMI1640 배지로 파종했다. 또한, 각 화합물의 최종 농도는 100 nM, 10 nM, 1 nM이 되도록 첨가했다. 그 밖의 조건은 실시예 9와 동일한 방법을 이용하여, 화합물 A, B, C, D 및 E의 FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포 및 방광암 환자 유래 세포주 RT-112의 증식 저해 작용의 평가를 행했다. 그 결과, 화합물 A, B, C, D 및 E는, FGFR3-TACC3_v1 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v2 발현/NIH3T3 세포, FGFR3-TACC3_v3 발현/NIH3T3 세포 및 방광암 환자 유래 세포주 RT-112의 부착면 비의존적 증식 항진 작용를 저해하는 것을 발견했다. 각 화합물의 각각의 최종 농도에서의 세포 증식에 대한 저해 비율(%)을 표 3에 나타낸다.
이상의 결과에 의해, FGFR3-TACC3_v1, FGFR3-TACC3_v2 및 FGFR3-TACC3_v3을 발현하는 암세포나 종양의 증식을, 화합물 A, B, C, D, E 및 F에 의해 저해할 수 있는 것이 밝혀졌다.
Figure pat00003
산업상 이용 가능성
본 발명의 검출 방법은, 본 명세서의 융합 유전자 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암환자의 판정에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출용 키트, 프라이머 세트 및 프로브 세트는, 상기 검출 방법에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 저해하는 물질은, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 본 발명의 폴리펩티드 양성의 암(특히 폐암 또는 방광암)의 치료용 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
이하의 서열표의 숫자 색인 <223>에는, 「인공 서열(Artificial Sequence)」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열표의 서열 번호 13, 14, 및 21로 표시되는 각 염기 서열은, 인공적으로 합성한 프라이머 서열이다. 서열표의 서열 번호 22로 표시되는 각 염기 서열은, 인공적으로 합성한 FLAG 태그 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> A novel FGFR3 fusion <130> A13008A00 <150> JP2012-052147 <151> 2012-03-08 <150> JP2012-195451 <151> 2012-09-05 <150> JP2012-280325 <151> 2012-12-21 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2856 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2856) <400> 1 atg ggc gcc cct gcc tgc gcc ctc gcg ctc tgc gtg gcc gtg gcc atc 48 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 gtg gcc ggc gcc tcc tcg gag tcc ttg ggg acg gag cag cgc gtc gtg 96 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 ggg cga gcg gca gaa gtc ccg ggc cca gag ccc ggc cag cag gag cag 144 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln 35 40 45 ttg gtc ttc ggc agc ggg gat gct gtg gag ctg agc tgt ccc ccg ccc 192 Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro 50 55 60 ggg ggt ggt ccc atg ggg ccc act gtc tgg gtc aag gat ggc aca ggg 240 Gly Gly Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly 65 70 75 80 ctg gtg ccc tcg gag cgt gtc ctg gtg ggg ccc cag cgg ctg cag gtg 288 Leu Val Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val 85 90 95 ctg aat gcc tcc cac gag gac tcc ggg gcc tac agc tgc cgg cag cgg 336 Leu Asn Ala Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg 100 105 110 ctc acg cag cgc gta ctg tgc cac ttc agt gtg cgg gtg aca gac gct 384 Leu Thr Gln Arg Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala 115 120 125 cca tcc tcg gga gat gac gaa gac ggg gag gac gag gct gag gac aca 432 Pro Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr 130 135 140 ggt gtg gac aca ggg gcc cct tac tgg aca cgg ccc gag cgg atg gac 480 Gly Val Asp Thr Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp 145 150 155 160 aag aag ctg ctg gcc gtg ccg gcc gcc aac acc gtc cgc ttc cgc tgc 528 Lys Lys Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys 165 170 175 cca gcc gct ggc aac ccc act ccc tcc atc tcc tgg ctg aag aac ggc 576 Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly 180 185 190 agg gag ttc cgc ggc gag cac cgc att gga ggc atc aag ctg cgg cat 624 Arg Glu Phe Arg Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His 195 200 205 cag cag tgg agc ctg gtc atg gaa agc gtg gtg ccc tcg gac cgc ggc 672 Gln Gln Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly 210 215 220 aac tac acc tgc gtc gtg gag aac aag ttt ggc agc atc cgg cag acg 720 Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr 225 230 235 240 tac acg ctg gac gtg ctg gag cgc tcc ccg cac cgg ccc atc ctg cag 768 Tyr Thr Leu Asp Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln 245 250 255 gcg ggg ctg ccg gcc aac cag acg gcg gtg ctg ggc agc gac gtg gag 816 Ala Gly Leu Pro Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu 260 265 270 ttc cac tgc aag gtg tac agt gac gca cag ccc cac atc cag tgg ctc 864 Phe His Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu 275 280 285 aag cac gtg gag gtg aat ggc agc aag gtg ggc ccg gac ggc aca ccc 912 Lys His Val Glu Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro 290 295 300 tac gtt acc gtg ctc aag tcc tgg atc agt gag agt gtg gag gcc gac 960 Tyr Val Thr Val Leu Lys Ser Trp Ile Ser Glu Ser Val Glu Ala Asp 305 310 315 320 gtg cgc ctc cgc ctg gcc aat gtg tcg gag cgg gac ggg ggc gag tac 1008 Val Arg Leu Arg Leu Ala Asn Val Ser Glu Arg Asp Gly Gly Glu Tyr 325 330 335 ctc tgt cga gcc acc aat ttc ata ggc gtg gcc gag aag gcc ttt tgg 1056 Leu Cys Arg Ala Thr Asn Phe Ile Gly Val Ala Glu Lys Ala Phe Trp 340 345 350 ctg agc gtt cac ggg ccc cga gca gcc gag gag gag ctg gtg gag gct 1104 Leu Ser Val His Gly Pro Arg Ala Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala 355 360 365 gac gag gcg ggc agt gtg tat gca ggc atc ctc agc tac ggg gtg ggc 1152 Asp Glu Ala Gly Ser Val Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly 370 375 380 ttc ttc ctg ttc atc ctg gtg gtg gcg gct gtg acg ctc tgc cgc ctg 1200 Phe Phe Leu Phe Ile Leu Val Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu 385 390 395 400 cgc agc ccc ccc aag aaa ggc ctg ggc tcc ccc acc gtg cac aag atc 1248 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gtg tct gag atg 1584 Lys Asp Asp Ala Thr Asp Lys Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met 515 520 525 gag atg atg aag atg atc ggg aaa cac aaa aac atc atc aac ctg ctg 1632 Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu 530 535 540 ggc gcc tgc acg cag ggc ggg ccc ctg tac gtg ctg gtg gag tac gcg 1680 Gly Ala Cys Thr Gln Gly Gly Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala 545 550 555 560 gcc aag ggt aac ctg cgg gag ttt ctg cgg gcg cgg cgg ccc ccg ggc 1728 Ala Lys Gly Asn Leu Arg Glu Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly 565 570 575 ctg gac tac tcc ttc gac acc tgc aag ccg ccc gag gag cag ctc acc 1776 Leu Asp Tyr Ser Phe Asp Thr Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr 580 585 590 ttc aag gac ctg gtg tcc tgt gcc tac cag gtg gcc cgg ggc atg gag 1824 Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu 595 600 605 tac ttg gcc tcc cag aag tgc atc cac agg gac ctg gct gcc cgc aat 1872 Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 610 615 620 gtg ctg gtg acc gag gac aac 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artificially synthesized primer sequence <400> 13 ggatccgcca ccatgggcgc ccctgcc 27 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 14 gaattctcag atcttctcca tcttgg 26 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ggacctggac cgtgtcctta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tctcctcctg tgtcgccttt 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ctggaccgtg tccttac 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ccttctggct gtactgg 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ctttcgagca gtactcc 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 aggccacacc caagtcagca 20 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 21 ggatccgcca ccatggacta caaggacgac gatgacaagg gcgcccctgc ctgcgccctc 60 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized FLAG tag sequence <400> 22 atggactaca aggacgacga tgacaag 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cctgaggacg ccgcggcccc cgccccc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gcggggacag cggctccgtg gaggtca 27 <210> 25 <211> 3144 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3144) <400> 25 atg ggc gcc cct gcc tgc gcc ctc gcg ctc tgc gtg gcc gtg gcc atc 48 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 gtg gcc ggc gcc tcc tcg gag tcc ttg ggg acg gag cag cgc gtc gtg 96 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 ggg cga gcg gca gaa gtc ccg ggc cca gag ccc ggc cag cag gag cag 144 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln 35 40 45 ttg gtc ttc ggc agc ggg gat gct gtg gag ctg agc tgt ccc ccg ccc 192 Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro 50 55 60 ggg ggt ggt ccc atg ggg ccc act 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gag gtg aat ggc agc aag gtg ggc ccg gac ggc aca ccc 912 Lys His Val Glu Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro 290 295 300 tac gtt acc gtg ctc aag tcc tgg atc agt gag agt gtg gag gcc gac 960 Tyr Val Thr Val Leu Lys Ser Trp Ile Ser Glu Ser Val Glu Ala Asp 305 310 315 320 gtg cgc ctc cgc ctg gcc aat gtg tcg gag cgg gac ggg ggc gag tac 1008 Val Arg Leu Arg Leu Ala Asn Val Ser Glu Arg Asp Gly Gly Glu Tyr 325 330 335 ctc tgt cga gcc acc aat ttc ata ggc gtg gcc gag aag gcc ttt tgg 1056 Leu Cys Arg Ala Thr Asn Phe Ile Gly Val Ala Glu Lys Ala Phe Trp 340 345 350 ctg agc gtt cac ggg ccc cga gca gcc gag gag gag ctg gtg gag gct 1104 Leu Ser Val His Gly Pro Arg Ala Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala 355 360 365 gac gag gcg ggc agt gtg tat gca ggc atc ctc agc tac ggg gtg ggc 1152 Asp Glu Ala Gly Ser Val Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly 370 375 380 ttc ttc ctg ttc atc ctg gtg gtg gcg gct gtg acg ctc tgc cgc ctg 1200 Phe Phe Leu Phe Ile Leu Val Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu 385 390 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1045 <210> 27 <211> 3135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3135) <400> 27 atg ggc gcc cct gcc tgc gcc ctc gcg ctc tgc gtg gcc gtg gcc atc 48 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 gtg gcc ggc gcc tcc tcg gag tcc ttg ggg acg gag cag cgc gtc gtg 96 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 ggg cga gcg gca gaa gtc ccg ggc cca gag ccc ggc cag cag gag cag 144 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln 35 40 45 ttg gtc ttc ggc agc ggg gat gct gtg gag ctg agc tgt ccc ccg ccc 192 Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro 50 55 60 ggg ggt ggt ccc atg ggg ccc act gtc tgg gtc aag gat ggc aca ggg 240 Gly Gly Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly 65 70 75 80 ctg gtg ccc tcg gag cgt gtc ctg gtg ggg ccc cag cgg ctg cag gtg 288 Leu Val Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val 85 90 95 ctg aat gcc tcc cac gag gac tcc ggg gcc tac agc tgc cgg cag cgg 336 Leu Asn Ala Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg 100 105 110 ctc acg cag cgc gta ctg tgc cac ttc agt gtg cgg gtg aca gac gct 384 Leu Thr Gln Arg Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala 115 120 125 cca tcc tcg gga gat gac gaa gac ggg gag gac gag gct gag gac aca 432 Pro Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr 130 135 140 ggg gcc cct tac tgg aca cgg ccc gag cgg atg gac aag aag ctg ctg 480 Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu 145 150 155 160 gcc gtg ccg gcc gcc aac acc gtc cgc ttc cgc tgc cca gcc gct ggc 528 Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly 165 170 175 aac ccc act ccc tcc atc tcc tgg ctg aag aac ggc agg gag ttc cgc 576 Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg 180 185 190 ggc gag cac cgc att gga ggc atc aag ctg cgg cat cag cag tgg agc 624 Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser 195 200 205 ctg gtc atg gaa agc gtg gtg ccc tcg gac cgc ggc aac tac acc tgc 672 Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys 210 215 220 gtc gtg gag aac aag ttt ggc agc atc cgg cag acg tac acg ctg gac 720 Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp 225 230 235 240 gtg ctg gag cgc tcc ccg cac cgg ccc atc ctg cag gcg ggg ctg ccg 768 Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro 245 250 255 gcc aac cag acg gcg gtg ctg ggc agc gac gtg gag ttc cac tgc aag 816 Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys 260 265 270 gtg tac agt gac gca cag ccc cac atc cag tgg ctc aag cac gtg gag 864 Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu 275 280 285 gtg aat ggc agc aag gtg ggc ccg gac ggc aca ccc tac gtt acc gtg 912 Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val 290 295 300 ctc aag tcc tgg atc agt gag agt gtg gag gcc gac gtg cgc ctc cgc 960 Leu Lys Ser Trp Ile Ser Glu Ser Val Glu Ala Asp Val Arg Leu Arg 305 310 315 320 ctg gcc aat gtg tcg gag cgg gac ggg ggc gag tac ctc tgt cga gcc 1008 Leu Ala Asn Val Ser Glu Arg Asp Gly Gly Glu Tyr Leu Cys Arg Ala 325 330 335 acc aat ttc ata ggc gtg gcc gag aag gcc ttt tgg ctg agc gtt cac 1056 Thr Asn Phe Ile Gly Val Ala Glu Lys Ala Phe Trp Leu Ser Val His 340 345 350 ggg ccc cga gca gcc gag gag gag ctg gtg gag gct gac gag gcg ggc 1104 Gly Pro Arg Ala Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu Ala Gly 355 360 365 agt gtg tat gca ggc atc ctc agc tac ggg gtg ggc ttc ttc ctg ttc 1152 Ser Val Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe Leu Phe 370 375 380 atc ctg gtg gtg gcg gct gtg acg ctc tgc cgc ctg cgc agc ccc ccc 1200 Ile Leu Val Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser Pro Pro 385 390 395 400 aag aaa ggc ctg ggc tcc ccc acc gtg cac aag atc tcc cgc ttc ccg 1248 Lys Lys Gly Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg Phe Pro 405 410 415 ctc aag cga cag cag gtg tcc ctg gag tcc aac gcg tcc atg agc tcc 1296 Leu Lys Arg Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Ser 420 425 430 aac aca cca ctg gtg cgc atc gca agg ctg tcc tca ggg gag ggc ccc 1344 Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly Pro 435 440 445 acg ctg gcc aat gtc tcc gag ctc gag ctg cct gcc gac ccc aaa tgg 1392 Thr Leu Ala Asn Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys Trp 450 455 460 gag ctg tct cgg gcc cgg ctg acc ctg ggc aag ccc ctt ggg gag ggc 1440 Glu Leu Ser Arg Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly 465 470 475 480 tgc ttc ggc cag gtg gtc atg gcg gag gcc atc ggc att gac aag gac 1488 Cys Phe Gly Gln Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys Asp 485 490 495 cgg gcc gcc aag cct gtc acc gta gcc gtg aag atg ctg aaa gac gat 1536 Arg Ala Ala Lys Pro Val Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp 500 505 510 gcc act gac aag gac ctg tcg gac ctg gtg tct gag atg gag atg atg 1584 Ala Thr Asp Lys Asp Leu Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met 515 520 525 aag atg atc ggg aaa cac aaa aac atc atc aac ctg ctg ggc gcc tgc 1632 Lys Met Ile Gly Lys His Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys 530 535 540 acg cag ggc ggg ccc ctg tac gtg ctg gtg gag tac gcg gcc aag ggt 1680 Thr Gln Gly Gly Pro Leu Tyr Val Leu Val Glu Tyr Ala Ala Lys Gly 545 550 555 560 aac ctg cgg gag ttt ctg cgg gcg cgg cgg ccc ccg ggc ctg gac tac 1728 Asn Leu Arg Glu Phe Leu Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Leu Asp Tyr 565 570 575 tcc ttc gac acc tgc aag ccg ccc gag gag cag ctc acc ttc aag gac 1776 Ser Phe Asp Thr Cys Lys Pro Pro Glu Glu Gln Leu Thr Phe Lys Asp 580 585 590 ctg gtg tcc tgt gcc tac cag gtg gcc cgg ggc atg gag tac ttg gcc 1824 Leu Val Ser Cys Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala 595 600 605 tcc cag aag tgc atc cac agg gac ctg gct gcc cgc aat gtg ctg gtg 1872 Ser Gln Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val 610 615 620 acc gag gac aac gtg atg aag atc gca gac ttc ggg ctg gcc cgg gac 1920 Thr Glu Asp Asn Val Met Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp 625 630 635 640 gtg cac aac ctc gac tac tac aag aag aca acc aac ggc cgg ctg ccc 1968 Val His Asn Leu Asp Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro 645 650 655 gtg aag tgg atg gcg cct gag gcc ttg ttt gac cga gtc tac act cac 2016 Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His 660 665 670 cag agt gac gtc tgg tcc ttt ggg gtc ctg ctc tgg gag atc ttc acg 2064 Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr 675 680 685 ctg ggg ggc tcc ccg tac ccc ggc atc cct gtg gag gag ctc ttc aag 2112 Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys 690 695 700 ctg ctg aag gag ggc cac cgc atg gac aag ccc gcc aac tgc aca cac 2160 Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His 705 710 715 720 gac ctg tac atg atc atg cgg gag tgc tgg cat gcc gcg ccc tcc cag 2208 Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Gln 725 730 735 agg ccc acc ttc aag cag ctg gtg gat tac ctg gag cag ttt gga act 2256 Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Asp Tyr Leu Glu Gln Phe Gly Thr 740 745 750 tcc tcg ttt aag gag tcg gcc ttg agg aag cag tcc tta tac ctc aag 2304 Ser Ser Phe Lys Glu Ser Ala Leu Arg Lys Gln Ser Leu Tyr Leu Lys 755 760 765 ttt gac ccc ctc ctg agg gac agt cct ggt aga cca gtg ccc gtg gcc 2352 Phe Asp Pro Leu Leu Arg Asp Ser Pro Gly Arg Pro Val Pro Val Ala 770 775 780 acc gag acc agc agc atg cac ggt gca aat gag act ccc tca gga cgt 2400 Thr Glu Thr Ser Ser Met His Gly Ala Asn Glu Thr Pro Ser Gly Arg 785 790 795 800 ccg cgg gaa gcc aag ctt gtg gag ttc gat ttc ttg gga gca ctg gac 2448 Pro Arg Glu Ala Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala Leu Asp 805 810 815 att cct gtg cca ggc cca ccc cca ggt gtt ccc gcg cct ggg ggc cca 2496 Ile Pro Val Pro Gly Pro Pro Pro Gly Val Pro Ala Pro Gly Gly Pro 820 825 830 ccc ctg tcc acc gga cct ata gtg gac ctg ctc cag tac agc cag aag 2544 Pro Leu Ser Thr Gly Pro Ile Val Asp Leu Leu Gln Tyr Ser Gln Lys 835 840 845 gac ctg gat gca gtg gta aag gcg aca cag gag gag aac cgg gag ctg 2592 Asp Leu Asp Ala Val Val Lys Ala Thr Gln Glu Glu Asn Arg Glu Leu 850 855 860 agg agc agg tgt gag gag ctc cac ggg aag aac ctg gaa ctg ggg aag 2640 Arg Ser Arg Cys Glu Glu Leu His Gly Lys Asn Leu Glu Leu Gly Lys 865 870 875 880 atc atg gac agg ttc gaa gag gtt gtg tac cag gcc atg gag gaa gtt 2688 Ile Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Val Tyr Gln Ala Met Glu Glu Val 885 890 895 cag aag cag aag gaa ctt tcc aaa gct gaa atc cag aaa gtt cta aaa 2736 Gln Lys Gln Lys Glu Leu Ser Lys Ala Glu Ile Gln Lys Val Leu Lys 900 905 910 gaa aaa gac caa ctt acc aca gat ctg aac tcc atg gag aag tcc ttc 2784 Glu Lys Asp Gln Leu Thr Thr Asp Leu Asn Ser Met Glu Lys Ser Phe 915 920 925 tcc gac ctc ttc aag cgt ttt gag aaa cag aaa gag gtg atc gag ggc 2832 Ser Asp Leu Phe Lys Arg Phe Glu Lys Gln Lys Glu Val Ile Glu Gly 930 935 940 tac cgc aag aac gaa gag tca ctg aag aag tgc gtg gag gat tac ctg 2880 Tyr Arg Lys Asn Glu Glu Ser Leu Lys Lys Cys Val Glu Asp Tyr Leu 945 950 955 960 gca agg atc acc cag gag ggc cag agg tac caa gcc ctg aag gcc cac 2928 Ala Arg Ile Thr Gln Glu Gly Gln Arg Tyr Gln Ala Leu Lys Ala His 965 970 975 gcg gag gag aag ctg cag ctg gca aac gag gag atc gcc cag gtc cgg 2976 Ala Glu Glu Lys Leu Gln Leu Ala Asn Glu Glu Ile Ala Gln Val Arg 980 985 990 agc aag gcc cag gcg gaa gcg ttg gcc ctc cag gcc agc ctg agg aag 3024 Ser Lys Ala Gln Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gln Ala Ser Leu Arg Lys 995 1000 1005 gag cag atg cgc atc cag tcg ctg gag aag aca gtg gag cag aag 3069 Glu Gln Met Arg Ile Gln Ser Leu Glu Lys Thr Val Glu Gln Lys 1010 1015 1020 act aaa gag aac gag gag ctg acc agg atc tgc gac gac ctc atc 3114 Thr Lys Glu Asn Glu Glu Leu Thr Arg Ile Cys Asp Asp Leu Ile 1025 1030 1035 tcc aag atg gag aag atc tga 3135 Ser Lys Met Glu Lys Ile 1040 <210> 28 <211> 1044 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln 35 40 45 Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro 50 55 60 Gly Gly Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly 65 70 75 80 Leu Val Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val 85 90 95 Leu Asn Ala Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg 100 105 110 Leu Thr Gln Arg Val Leu Cys His Phe Ser Val Arg Val Thr Asp Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Gly Glu Asp Glu Ala Glu Asp Thr 130 135 140 Gly Ala Pro Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Arg Met Asp Lys Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Pro Thr Pro Ser Ile Ser Trp Leu Lys Asn Gly Arg Glu Phe Arg 180 185 190 Gly Glu His Arg Ile Gly Gly Ile Lys Leu Arg His Gln Gln Trp Ser 195 200 205 Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Asn Tyr Thr Cys 210 215 220 Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Ser Ile Arg Gln Thr Tyr Thr Leu Asp 225 230 235 240 Val Leu Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro 245 250 255 Ala Asn Gln Thr Ala Val Leu Gly Ser Asp Val Glu Phe His Cys Lys 260 265 270 Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Val Glu 275 280 285 Val Asn Gly Ser Lys Val Gly Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Val Thr Val 290 295 300 Leu Lys Ser Trp Ile Ser Glu Ser Val Glu Ala Asp Val Arg Leu Arg 305 310 315 320 Leu Ala Asn Val Ser Glu Arg Asp Gly Gly Glu Tyr Leu Cys Arg Ala 325 330 335 Thr Asn Phe Ile Gly Val Ala Glu Lys Ala Phe Trp Leu Ser Val His 340 345 350 Gly Pro Arg Ala Ala Glu Glu Glu Leu Val Glu Ala Asp Glu Ala Gly 355 360 365 Ser Val Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Gly Val Gly Phe Phe Leu Phe 370 375 380 Ile Leu Val Val Ala Ala Val Thr Leu Cys Arg Leu Arg Ser Pro Pro 385 390 395 400 Lys Lys Gly Leu Gly Ser Pro Thr Val His Lys Ile Ser Arg Phe Pro 405 410 415 Leu Lys Arg Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Ser 420 425 430 Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ser Gly Glu Gly Pro 435 440 445 Thr Leu Ala Asn Val Ser Glu Leu Glu Leu Pro Ala Asp Pro Lys Trp 450 455 460 Glu Leu Ser Arg Ala Arg Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly 465 470 475 480 Cys Phe Gly Gln Val Val Met Ala Glu Ala Ile Gly Ile Asp Lys Asp 485 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700 Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr His 705 710 715 720 Asp Leu Tyr Met Ile Met Arg Glu Cys Trp His Ala Ala Pro Ser Gln 725 730 735 Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Asp Tyr Leu Glu Gln Phe Gly Thr 740 745 750 Ser Ser Phe Lys Glu Ser Ala Leu Arg Lys Gln Ser Leu Tyr Leu Lys 755 760 765 Phe Asp Pro Leu Leu Arg Asp Ser Pro Gly Arg Pro Val Pro Val Ala 770 775 780 Thr Glu Thr Ser Ser Met His Gly Ala Asn Glu Thr Pro Ser Gly Arg 785 790 795 800 Pro Arg Glu Ala Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala Leu Asp 805 810 815 Ile Pro Val Pro Gly Pro Pro Pro Gly Val Pro Ala Pro Gly Gly Pro 820 825 830 Pro Leu Ser Thr Gly Pro Ile Val Asp Leu Leu Gln Tyr Ser Gln Lys 835 840 845 Asp Leu Asp Ala Val Val Lys Ala Thr Gln Glu Glu Asn Arg Glu Leu 850 855 860 Arg Ser Arg Cys Glu Glu Leu His Gly Lys Asn Leu Glu Leu Gly Lys 865 870 875 880 Ile Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Val Tyr Gln Ala Met Glu Glu Val 885 890 895 Gln Lys Gln Lys Glu Leu Ser Lys Ala Glu Ile Gln Lys Val Leu Lys 900 905 910 Glu Lys Asp Gln Leu Thr Thr Asp Leu Asn Ser Met Glu Lys Ser Phe 915 920 925 Ser Asp Leu Phe Lys Arg Phe Glu Lys Gln Lys Glu Val Ile Glu Gly 930 935 940 Tyr Arg Lys Asn Glu Glu Ser Leu Lys Lys Cys Val Glu Asp Tyr Leu 945 950 955 960 Ala Arg Ile Thr Gln Glu Gly Gln Arg Tyr Gln Ala Leu Lys Ala His 965 970 975 Ala Glu Glu Lys Leu Gln Leu Ala Asn Glu Glu Ile Ala Gln Val Arg 980 985 990 Ser Lys Ala Gln Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gln Ala Ser Leu Arg Lys 995 1000 1005 Glu Gln Met Arg Ile Gln Ser Leu Glu Lys Thr Val Glu Gln Lys 1010 1015 1020 Thr Lys Glu Asn Glu Glu Leu Thr Arg Ile Cys Asp Asp Leu Ile 1025 1030 1035 Ser Lys Met Glu Lys Ile 1040

Claims (9)

  1. 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질을 함유하는, FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암 치료용 의약 조성물:
    서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입되거나 또는 조합된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, 의약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, 의약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, 의약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드, 또는, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입되거나 또는 조합된 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드인, 의약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인, 의약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 저해하는 물질이, 도비티닙(Dovitinib), AZD4547, BGJ398 또는 LY2874455인, 암 치료용 의약 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이, 폐암 또는 방광암인, 암 치료용 의약 조성물.
  9. FGFR3 유전자와 TACC3 유전자의 융합 유전자 양성 또는 FGFR3과 TACC3의 융합 단백질 양성의 암의 치료를 위한, 하기에 기재된 폴리펩티드를 저해하는 물질:
    서열 번호 2의 아미노산 번호 461∼947, 서열 번호 4의 아미노산 번호 461∼982 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 461∼996에 표시되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 더구나 종양 형성능을 갖는 폴리펩티드.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201007286D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201118652D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201118654D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Astex Therapeutics Ltd New compounds
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GB201209613D0 (en) 2012-05-30 2012-07-11 Astex Therapeutics Ltd New compounds
US20150203589A1 (en) 2012-07-24 2015-07-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
KR102132149B1 (ko) 2012-07-24 2020-07-09 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 융합 단백질 및 그의 방법
CN107501413A (zh) 2012-09-27 2017-12-22 中外制药株式会社 Fgfr3融合基因和以其作为标靶的药物
US11230589B2 (en) * 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof
US20160052926A1 (en) * 2013-03-15 2016-02-25 Hutchison Medipharma Limited Novel pyrimidine and pyridine compounds and usage thereof
WO2014165710A2 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Life Technologies Corporation Gene fusions
TW201605452A (zh) * 2013-08-28 2016-02-16 安斯泰來製藥股份有限公司 以嘧啶化合物作爲有效成分之醫藥組成物
CN105980555A (zh) * 2013-12-19 2016-09-28 日本国立癌症研究中心 作为胃癌的责任因子的新型融合基因
EP3098312B1 (en) * 2014-01-24 2023-07-19 Japanese Foundation For Cancer Research Novel fusant and method for detecting same
WO2015120094A2 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method of identifying tyrosine kinase receptor rearrangements in patients
AU2015238301B2 (en) 2014-03-26 2020-06-25 Astex Therapeutics Ltd Combinations
JO3512B1 (ar) 2014-03-26 2020-07-05 Astex Therapeutics Ltd مشتقات كينوكسالين مفيدة كمعدلات لإنزيم fgfr كيناز
DK3122359T3 (da) 2014-03-26 2021-03-08 Astex Therapeutics Ltd Kombinationer af en fgfr-inhibitor og en igf1r-hæmmer
JOP20200201A1 (ar) 2015-02-10 2017-06-16 Astex Therapeutics Ltd تركيبات صيدلانية تشتمل على n-(3.5- ثنائي ميثوكسي فينيل)-n'-(1-ميثيل إيثيل)-n-[3-(ميثيل-1h-بيرازول-4-يل) كينوكسالين-6-يل]إيثان-1.2-ثنائي الأمين
US10478494B2 (en) * 2015-04-03 2019-11-19 Astex Therapeutics Ltd FGFR/PD-1 combination therapy for the treatment of cancer
JP6524833B2 (ja) * 2015-07-17 2019-06-05 コニカミノルタ株式会社 蛍光体集積ナノ粒子を用いたｆｉｓｈまたは免疫染色スライドの封入方法
AU2016328692B2 (en) 2015-09-23 2021-03-11 Janssen Pharmaceutica Nv New compounds
MX2018003564A (es) 2015-09-23 2018-06-18 Janssen Pharmaceutica Nv 1,4-benzodiazepinas biheteroarilo sustituidas y usos de las mismas para el tratamiento del cancer.
CN111424081B (zh) * 2020-04-13 2023-04-25 广东省妇幼保健院 基于多重荧光定量pcr技术检测软骨发育不全fgfr3基因突变的引物、探针和试剂盒
EP4200019A1 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Genzyme Corporation Fgfr3 antibodies and methods of use

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1878766B (zh) * 2003-11-07 2011-08-17 诺华疫苗和诊断公司 合成喹啉酮化合物的方法
ES2486240T3 (es) 2003-11-07 2014-08-18 Novartis Ag Sales de lactato de compuestos de quinolinona y su uso farmacéutico
US7737149B2 (en) 2006-12-21 2010-06-15 Astrazeneca Ab N-[5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-2H-pyrazol-3-yl]-4-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzamide and salts thereof
AR078411A1 (es) 2009-05-07 2011-11-09 Lilly Co Eli Compuesto de vinil imidazolilo y composicion farmaceutica que lo comprende
US20130096021A1 (en) 2011-09-27 2013-04-18 Arul M. Chinnaiyan Recurrent gene fusions in breast cancer
ES2746288T3 (es) 2012-02-28 2020-03-05 Astellas Pharma Inc Compuesto heterocíclico aromático que contiene nitrógeno
KR102132149B1 (ko) * 2012-07-24 2020-07-09 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 융합 단백질 및 그의 방법
CN107501413A (zh) 2012-09-27 2017-12-22 中外制药株式会社 Fgfr3融合基因和以其作为标靶的药物
US11230589B2 (en) * 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1 : 「시토킨·앤드·그로스 팩터·리뷰(Cytokine & Growth Factor Review), (영국), 2005년, 16권, p.139-149」
비특허문헌 2 : 「바이오케미컬·저널(Biochemical journal), ((영국), 2011년, 437권, p.199-213)」
비특허문헌 3 : 「블러드(Blood), ((미국), 2002년, 100권, p.1579-1583)」
비특허문헌 4 : 「캔서 리서치(Cancer Reserch), ((미국), 2001년, 61권, p.8371-8374)」
비특허문헌 5 : 「옹코진(Oncogene), ((영국), 2009년, 28권, p.4306-4316)」
비특허문헌 6 : 「트렌즈·인·셀 바이올로지(Trends in Cell Biology), ((영국), 2008년, 18권, p.379-388)」

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