EA029140B1 - Новый слитый fgfr3 - Google Patents
Новый слитый fgfr3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA029140B1 EA029140B1 EA201491655A EA201491655A EA029140B1 EA 029140 B1 EA029140 B1 EA 029140B1 EA 201491655 A EA201491655 A EA 201491655A EA 201491655 A EA201491655 A EA 201491655A EA 029140 B1 EA029140 B1 EA 029140B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- polypeptide
- gene
- tass3
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 172
- 101150025764 FGFR3 gene Proteins 0.000 title abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 445
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 430
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 429
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 343
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 211
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 190
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 153
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 153
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 117
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 111
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 90
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 42
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 23
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 400
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 124
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 124
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 97
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 86
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 75
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 75
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 74
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 claims description 67
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 claims description 66
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 66
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 55
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 51
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 51
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 30
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 28
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 28
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 27
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 claims description 25
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 claims description 25
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 claims description 25
- 229950005778 dovitinib Drugs 0.000 claims description 20
- KCOYQXZDFIIGCY-CZIZESTLSA-N (3e)-4-amino-5-fluoro-3-[5-(4-methylpiperazin-1-yl)-1,3-dihydrobenzimidazol-2-ylidene]quinolin-2-one Chemical group C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N\C(N2)=C/3C(=C4C(F)=CC=CC4=NC\3=O)N)C2=C1 KCOYQXZDFIIGCY-CZIZESTLSA-N 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 63
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 claims 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 abstract description 2
- 101100368705 Homo sapiens TACC3 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101000836150 Homo sapiens Transforming acidic coiled-coil-containing protein 3 Proteins 0.000 abstract 1
- 102100027048 Transforming acidic coiled-coil-containing protein 3 Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 212
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 97
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 90
- 239000002585 base Substances 0.000 description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 68
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 47
- 239000000047 product Substances 0.000 description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 35
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 32
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 29
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- -1 for example Proteins 0.000 description 26
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 25
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 21
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 17
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 17
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 14
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 11
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 11
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000052567 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc1 Subunit Human genes 0.000 description 9
- 108091006463 SLC25A24 Proteins 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 8
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 5-azido-2-[(e)-2-(4-azido-2-sulfophenyl)ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1S(O)(=O)=O XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101150117004 atg18 gene Proteins 0.000 description 5
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 5
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 4
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N oxidanium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound O.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000003217 anti-cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- GPAYUJZHTULNBE-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphine Chemical compound C=1C=CC=CC=1PC1=CC=CC=C1 GPAYUJZHTULNBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940125874 fusion protein inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L palladium(ii) acetate Chemical compound [Pd+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- LJXQPZWIHJMPQQ-UHFFFAOYSA-N pyrimidin-2-amine Chemical compound NC1=NC=CC=N1 LJXQPZWIHJMPQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- KKWMGIQEJSZJLI-UHFFFAOYSA-N (2,6-difluoro-3,5-dimethoxyphenyl)methanol Chemical compound COC1=CC(OC)=C(F)C(CO)=C1F KKWMGIQEJSZJLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XRMYOQARIBVACO-UHFFFAOYSA-N (2,6-difluoro-3,5-dimethoxyphenyl)methyl methanesulfonate Chemical compound COC1=CC(OC)=C(F)C(COS(C)(=O)=O)=C1F XRMYOQARIBVACO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LGJVQTYRJMIUTE-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-5-(oxan-2-yloxymethyl)pyrazol-3-amine Chemical compound CN1N=C(N)C=C1COC1OCCCC1 LGJVQTYRJMIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- MPEDHDUVHOZARG-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5-[(2,6-difluoro-3,5-dimethoxyphenyl)methoxy]pyrimidine Chemical compound COC1=CC(OC)=C(F)C(COC=2C=NC(Cl)=NC=2)=C1F MPEDHDUVHOZARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004195 4-methylpiperazin-1-yl group Chemical group [H]C([H])([H])N1C([H])([H])C([H])([H])N(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- BUDQDWGNQVEFAC-UHFFFAOYSA-N Dihydropyran Chemical compound C1COC=CC1 BUDQDWGNQVEFAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 239000012448 Lithium borohydride Substances 0.000 description 2
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 2
- 101150025129 POP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 239000004139 Sodium stearoyl fumarate Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 229940117229 cialis Drugs 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-XVFCMESISA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- OBATZBGFDSVCJD-LALPQLPRSA-N deslanoside Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@@H]1C)O[C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@@H]1C)O[C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@@H]1C)O[C@@H]1C[C@@H]2[C@]([C@@H]3[C@H]([C@]4(CC[C@@H]([C@@]4(C)[C@H](O)C3)C=3COC(=O)C=3)O)CC2)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OBATZBGFDSVCJD-LALPQLPRSA-N 0.000 description 2
- 229960001324 deslanoside Drugs 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009319 interchromosomal translocation Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODTXQKMLYIPFJY-UHFFFAOYSA-N methyl 2,6-difluoro-3,5-dimethoxybenzoate Chemical compound COC(=O)C1=C(F)C(OC)=CC(OC)=C1F ODTXQKMLYIPFJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXUIOVUOFQKWDM-UHFFFAOYSA-N methyl 3,5-dimethoxybenzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 YXUIOVUOFQKWDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]undecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N 0.000 description 2
- 239000011022 opal Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000011340 peptidyl-tyrosine autophosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 2
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N tadalafil Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@@H]2C3=C(C4=CC=CC=C4N3)C[C@H]3N2C(=O)CN(C3=O)C)=C1 WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- OZBKYTILKPDFDU-UHFFFAOYSA-N (2-methyl-5-nitropyrazol-3-yl)methanol Chemical compound CN1N=C([N+]([O-])=O)C=C1CO OZBKYTILKPDFDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFVIVFUPBWZTNO-UHFFFAOYSA-N 1-(oxan-2-yl)pyrazol-4-amine Chemical compound C1=C(N)C=NN1C1OCCCC1 WFVIVFUPBWZTNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 1-Methylpiperazine Chemical compound CN1CCNCC1 PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWWWXASHHUGWDN-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-nitro-5-(oxan-2-yloxymethyl)pyrazole Chemical compound CN1N=C([N+]([O-])=O)C=C1COC1OCCCC1 TWWWXASHHUGWDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- AXQLNAAVMSWBEQ-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminopyrazol-1-yl)ethanol Chemical compound NC=1C=NN(CCO)C=1 AXQLNAAVMSWBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDZZYOJYLLNBTD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[[5-[(2,6-difluoro-3,5-dimethoxyphenyl)methoxy]pyrimidin-2-yl]amino]pyrazol-1-yl]ethanol Chemical compound COC1=CC(OC)=C(F)C(COC=2C=NC(NC3=CN(CCO)N=C3)=NC=2)=C1F VDZZYOJYLLNBTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXPCHADDVFPRAO-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5-[(2,6-dichloro-3,5-dimethoxyphenyl)methoxy]pyrimidine Chemical compound COC1=CC(OC)=C(Cl)C(COC=2C=NC(Cl)=NC=2)=C1Cl FXPCHADDVFPRAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOGPIHXNWPTGNH-UHFFFAOYSA-N 2-chloropyrimidin-5-ol Chemical compound OC1=CN=C(Cl)N=C1 BOGPIHXNWPTGNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHPDGTZPYTWLTG-UHFFFAOYSA-N 3-methoxy-4-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl]aniline Chemical compound COC1=CC(N)=CC=C1N1CCC(N2CCN(C)CC2)CC1 JHPDGTZPYTWLTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MOZNZNKHRXRLLF-UHFFFAOYSA-N 4-(4-methylpiperazin-1-yl)aniline Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N)C=C1 MOZNZNKHRXRLLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLUMPXNBZQGDEZ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl]pyrimidin-2-amine Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(C=2N=C(N)N=CC=2)C=C1 QLUMPXNBZQGDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QQWUGDVOUVUTOY-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-N2-[2-methoxy-4-[4-(4-methyl-1-piperazinyl)-1-piperidinyl]phenyl]-N4-(2-propan-2-ylsulfonylphenyl)pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound COC1=CC(N2CCC(CC2)N2CCN(C)CC2)=CC=C1NC(N=1)=NC=C(Cl)C=1NC1=CC=CC=C1S(=O)(=O)C(C)C QQWUGDVOUVUTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111329 ACE-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100273858 Anopheles gambiae CecB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029721 DnaJ homolog subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100059603 Drosophila virilis Cec3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150080661 Ear1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000915428 Homo sapiens Death domain-associated protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000866018 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001055992 Homo sapiens Exosome complex component RRP42 Proteins 0.000 description 1
- 101000599816 Homo sapiens Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Proteins 0.000 description 1
- 101001087372 Homo sapiens Securin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002118 L01XE12 - Vandetanib Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101150081376 NR1D1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023170 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102100037864 Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001415849 Strigiformes Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N Tetrahydropyran Chemical compound C1CCOCC1 DHXVGJBLRPWPCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- ISLJZDYAPAUORR-UHFFFAOYSA-N ethyl n-[2-[(5-nitrothiophene-2-carbonyl)amino]thiophene-3-carbonyl]carbamate Chemical compound C1=CSC(NC(=O)C=2SC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=C1C(=O)NC(=O)OCC ISLJZDYAPAUORR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000004503 fine granule Substances 0.000 description 1
- 210000004905 finger nail Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229940125777 fusion inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 125000003037 imidazol-2-yl group Chemical group [H]N1C([*])=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUQUOGPMUUJORT-UHFFFAOYSA-N methyl 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound COS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 VUQUOGPMUUJORT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000030366 negative regulation of peptidyl-tyrosine autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 229940100688 oral solution Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000000770 propane-1,2-diol alginate Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 125000004353 pyrazol-1-yl group Chemical group [H]C1=NN(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N vandetanib Chemical compound COC1=CC(C(/N=CN2)=N/C=3C(=CC(Br)=CC=3)F)=C2C=C1OCC1CCN(C)CC1 UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000241 vandetanib Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
- A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение имеет целью выявить полинуклеотид в качестве нового гена, ответственного за рак, и имеет целью соответственно предоставить способ детектирования полинуклеотида и полипептида, кодируемого полинуклеотидом, и набор для детектирования, набор зондов и набор праймеров для детектирования. Целью настоящего изобретения также является предоставление фармацевтической композиции для лечения рака. Способ детектирует слитый ген, составленный из части гена FGFR3 и части гена ТАСС3, или слитый белок, кодируемый слитым геном. Набор праймеров, набор зондов или набор для детектирования содержит смысловой праймер и набор зондов, спроектированных по части, кодирующей FGFR3, и антисмысловой праймер и набор зондов, спроектированных по части, кодирующей ТАСС3. Поскольку ингибитор полипептида демонстрирует противоопухолевый эффект, предоставляется фармацевтическая композиция для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, либо по полипептиду.
Description
Настоящее изобретение относится к способу детектирования нового слитого гена, включающего киназный домен РОРК3, и слитого белка, кодируемого каждым слитым геном. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вещества, ингибирующие слитые белки, для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, либо по слитому белку.
Предшествующий уровень техники
Рецептор 3 фактора роста фибробластов (РОРК3) представляет собой ген, расположенный на коротком плече хромосомы 4, и белок, кодируемый этим геном, является рецепторной тирозинкиназой. Этот белок имеет трансмембранный домен в центральной части, тирозинкиназный домен на карбоксильном конце и внеклеточный домен на аминоконце. РОРК.3, как известно, имеет изоформы, в том числе РОРКЗЬ и РОРКЗс, образуемые в результате альтернативного сплайсинга, проходящего на аминоконце. РОР-1 и РОР-9 являются лигандами РОРКЗЬ, и РОР-1, РОР-2, РОР-4, РОР-8, РОР-9, РОР-17, РОР-18 и РОР-23 являются лигандами РОРКЗс. Белок активируется с помощью автофосфорилирования своего остатка тирозина путем димеризации с другим белком РОРК3 (непатентный документ 1 и непатентный документ 2).
Известно, что в множественной остеосаркоме РОРК3 сливается с геном 1дН в результате межхромосомной транслокации, и аберрантный белок, транслируемый слитым геном, приводит к аномальной пролиферации клеток и ахондроплазии (непатентный документ 3). Кроме того, известно, что в периферической Т-клеточной злокачественной лимфоме РОРК3 слит с ЕТУб за счет межхромосомной транслокации (непатентный документ 4). Кроме того, известно, что в раке мочевого пузыря или подобном в РОРК3 детектируется активирующая точечная мутация. Кроме того, активирующие мутации РОРК3 детектируются, в основном, в образцах рака мочевого пузыря. Введение этих мутантных генов в нормальные клетки мыши, клетки ΝΙΗ3Τ3, индуцирует трансформацию клеток ΝΙΗ3Τ3 в злокачественные клетки, тогда как РОРК3 дикого типа не индуцирует трансформацию в тех же условиях (непатентный документ 5).
Трансформирующий кислый биспиральсодержащий белок 3 (ТАСС3) представляет собой ген, расположенный на коротком плече хромосомы 4, где также локализован РОРК3, и содержит 1б экзонов. Известно, что ТАСС3 кодирует двигательный белок шпинделя, который участвует в стабилизации митотического веретена (непатентный документ б).
Родственная область техники
Непатентный документ 1: Су(окше & Ого\\1к Рас(ог КсОс\у. (ИиКе' Кшдйот), 2005, Уо1. 1б, р. 139149.
Непатентный документ 2: Вюскетюа1 _)оита1, ((ИиКе' Кшдйот), 2011, Уо1. 437, р. 199-213).
Непатентный документ 3: В1оой ((ИиКей 8(а(ек), 2002, Уо1. 100, р. 1579-1583).
Непатентный документ 4: Сапсег КекеагсЬ, ((ИиКе' 8(а(ек), 2001, Уо1. б1, р. 8371-8374).
Непатентный документ 5: Опсодепе, ((Ипкей Ктд'от), 2009, Уо1. 28, р. 430б-431б).
Непатентный документ б: Тгепйк ш Се11 Вю1оду, ((ИпКей Кшд'от), 2008, Уо1. 18, р. 379-388). Раскрытие изобретения
Проблемы, которые следует решить при помощи изобретения
Настоящее изобретение имеет целью выявление полинуклеотида как нового гена, ответственного за рак, и имеет целью, таким образом, предоставление способа детектирования полинуклеотида и полипептида, кодируемого полинуклеотидом, и набора для детектирования, набора праймеров и набора зондов, которые используются в способе. Настоящее изобретение также направлено на предоставление лекарственного препарата для ингибирования полипептида по настоящему изобретению для пациентов с раком, экспрессирующим эти слитые белки.
Средства для решения проблем
В настоящем изобретении выделены и идентифицированы новые слитые гены, полученные из образцов пациентов с раком легкого и пациентов с раком мочевого пузыря, в котором часть РОРК3 в качестве киназы слита с частью гена ТАСС3 (примеры 1, 2, 3 и 23). Оказалось, что эти слитые гены присутствуют в образцах пациентов с раком легких и раком мочевого пузыря (примеры 4, 5, б, 20, 23). Кроме того, в настоящем изобретении были подготовлены ретровирусные частицы для экспрессии этих слитых генов (примеры 7, 10 и 24), и выяснилось, что инфицированные клетки приобрели канцерогенный потенциал и слитые гены были ответственны за этот потенциал (примеры 8, 11 и 25). Кроме того, в настоящем изобретении основан способ детектирования нового слитого гена и слитого белка, кодируемого этим новым слитым геном, в клеточных линиях, полученных от пациентов с раком мочевого пузыря, или образцах от пациентов с раком легких или образцах от пациентов с раком мочевого пузыря (примеры 4, 5, б, 19, 20, 27 и 28). Кроме того, было обнаружено, что ингибитор слитого белка является эффективным для лечения онкологических пациентов, экспрессирующих слитые белки или слитые гены, кодирующие слитые белки (то есть, больные раком, которые положительными либо по слитому гену, составленному из гена РОРК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из РОРК3 и ТАСС3), на основе открытия того, что препарат, который оказывает ингибирующее действие на слитый белок, кодируемый
- 1 029140 слитым геном, ингибирует канцерогенность инфицированной клетки (примеры 9, 12, 13, 14, 16, 22 и 30).
До сих пор считалось, что сам по себе РОРК3 дикого типа не обладает способностью трансформировать нормальные клетки в злокачественные клетки. Однако тот факт, что даже РОРК3 дикого типа приобретает такую способность через слияние с ТАСС3, является удивительной находкой. Более того изумительно, было подтверждено, что в этом слитом белке ТАСС3 был слит с карбоксильным концом РОРК3. Эта структура отличается от таковой слитых киназ, обнаруженных до сих пор, у которых киназные полипептиды были расположены на карбоксильном конце.
На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения основали способ детектирования этих слитых генов и предоставили набор, набор праймеров и набор зондов для этого способа. Таким образом, они получили возможность скринировать онкологических пациентов, подлежащих получать медикаментозное лечение с использованием ингибитора слитых белков, путем детектирования слитых генов или слитых белков, кодируемых слитыми генами. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что ингибитор слитых белков (особенно соединения от А до Е, довитиниб, ΆΖΌ4547, ВО1398 или ЬУ2874455) ингибирует активность слитого белка, составленного из РОРК3 и ТАСС3, и эффективен при раке (например, раке легких или раке мочевого пузыря), экспрессирующем слитый белок, составленный из РОРК3 и ТАСС3 (то есть рак, который является положительным либо по слитому гену, составленному из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, составленному из РОРК3 и ТАСС3) или тому подобное. То есть настоящее изобретение относится к следующему:
1. Способ детектирования слитого гена, составленного из гена рецептора 3 фактора роста фибробластов (РОРК3) и гена трансформирующего кислого биспиральсодержащего белка 3 (ТАСС3), или по слитому белку, составленному из РОРК3 и ТАСС3, который включает детектирование присутствия либо полинуклеотида, кодирующего следующий полипептид, либо полипептида в образце, полученном от испытуемого индивидуума: полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО N0: 28.
2. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, обладающий канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО N0: 28.
3. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной БЕЦ ГО N0: 2, БЕЦ ГО N0: 4, БЕЦ ГО N0: 6, БЕЦ ГО N0: 26 или БЕЦ ГО N0: 28.
4. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную БЕЦ ГО N0: 2, БЕЦ ГО N0: 4, БЕЦ ГО N0: 6, БЕЦ ГО N0: 26 или БЕЦ ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной БЕЦ ГО N0: 2, БЕЦ ГО N0: 4, БЕЦ ГО N0: 6, БЕЦ ГО N0: 26 или БЕЦ ГО N0: 28.
5. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную БЕЦ ГО N0: 2, БЕЦ ГО N0: 4, БЕЦ ГО N0: 6, БЕЦ ГО N0: 26 или БЕЦ ГО N0: 28.
6. Набор для детектирования слитого гена, составленного из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, который содержит смысловой праймер и антисмысловой праймер, спроектированные так, чтобы быть способными специфически амплифицировать полинуклеотид, кодирующий следующий полипептид: полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО N0: 28.
7. Набор по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ 5 ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит амино- 2 029140 кислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28.
8. Набор по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 81%) ГО N0: 28.
9. Набор по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 8ЕЦ ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 81%) ГО N0: 26 или 81%) ГО N0: 28.
10. Набор по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленный 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 81%) ГО N0: 28.
11. Набор праймеров для детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, который выбран из группы, состоящей из следующих от а) до е):
a) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 1, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,
b) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 3, в жестких условиях и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,
c) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 5, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,
б) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 25, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,
е) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 27, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях.
12. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 1 и 2280 8ЕЦ ГО N0: 1; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 2281 и 2856 81%) ГО N0: 1.
13. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 1 и 2280 8ЕЦ ГО N0: 3; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 2281 и 2961 81%) ГО N0: 3.
14. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 1 и 2368 8ЕЦ ГО N0: 5; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 2369 и 3003 81%) ГО N0: 5.
15. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 1 и 2242 8ЕЦ ГО N0: 25; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду,
- 3 029140 по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 2243 и 3144 8ЕЦ ГО N0: 25.
16. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 1 и 2233 8ЕЦ ГО N0: 27; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов 2234 и 3135 8ЕЦ ГО N0: 27.
17. Наборы зондов для детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, которые выбраны из группы, состоящей из следующих от а)-с).
a) Наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 1 и 2280 8ЕЦ ГО N0: 1, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 2281 и 2856 8ЕЦ ГО N0: 1.
b) Наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 1 и 2280 8ЕЦ ГО N0: 3, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 2281 и 2961 8ЕЦ ГО N0: 3.
c) Наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 1 и 2368 8ЕЦ ГО N0: 5, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом, и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов 2369 и 3003 8ЕЦ ГО N0: 5.
18. Способ детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, по любому из пп.1-5, где стадия детектирования присутствия полинуклеотида включает проведение гибридизации ίη δίΐιι с использованием образцов, полученных от испытуемого индивидуума, и наборов зондов в соответствии с 17, амплификацию сигналов гибридизации и детектирование наложения сигналов.
19. Набор для детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающий наборы зондов для детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, в соответствии с п.17; и реагент для амплификации сигналов гибридизации.
20. Способ детектирования слитого белка, составленного из РСРК3 и ТАСС3, в соответствии с любым из пп.1-5, где стадия детектирования присутствия полипептида включает в себя ί) приведение антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена РСРК3 полипептида, и антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена ТАСС3 полипептида, в контакт с образцом, полученным от испытуемого индивидуума, ίί) добавление вторичных антител, которые конъюгированы с олигонуклеотидами и соответственно связываются с первичными антителами, ίίί) вызывание реакции лигирования с помощью добавления лигирующего раствора, содержащего два вида олигонуклеотидов, которые частично комплементарны олигонуклеотидам, конъюгированным со вторичными антителами, и лигазы, которая может образовывать циклическую структуру между вторичными антителами путем вызывания лигирования, когда два вида олигонуклеотидов сближаются друг с другом, ίν) элонгацию последовательности нуклеиновой кислоты вдоль образованной циклической структуры, ν) гибридизацию меченого олигонуклеотидного зонда, который может гибридизоваться с элонгированной последовательностью нуклеиновых кислот и νι) детектирование сигналов метки.
21. Набор для детектирования слитого белка, составленного из РСРК3 и ТАСС3, который используется для способа детектирования слитого белка, составленного из РСРК3 и ТАСС3, в соответствии с любым из пп.1-5, включающий антитело (первичное антитело), которое узнает часть, полученную от гена РСРК3 слитого полипептида;
антитело (первичное антитело), которое узнает часть, полученную от гена ТАСС3 слитого полипептида;
- 4 029140 вторичные антитела, которые конъюгированы с олигонуклеотидами и соответственно связываются с первичными антителами;
два вида олигонуклеотидов, которые частично комплементарны олигонуклеотидам, конъюгированным со вторичными антителами;
лигазу, которая может формировать циклическую структуру между вторичными антителами путем вызывания лигирования, когда два вида олигонуклеотидов сближаются друг с другом; и меченый олигонуклеотидный зонд.
22. Фармацевтическая композиция для лечения рака, которая включает вещество, ингибирующее следующий полипептид, и который является положительным либо для слитого гена, составленного из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо для слитого белка, составленного из РОРК3 и ТАСС3:
полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6.
23. фармацевтическая композиция по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6; или полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4, или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6.
24. Фармацевтическая композиция по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6.
25. Фармацевтическая композиция по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной §ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 4 или §ЕЦ ГО N0: 6.
26. Фармацевтическая композиция по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 4 или §ЕЦ ГО N0: 6; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной §ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 4 или §ЕЦ ГО N0: 6.
27. Фармацевтическая композиция по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной §ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 4 или §ЕЦ ГО N0: 6.
28. Фармацевтическая композиция для лечения рака по любому из пп.22-27, где вещество, ингибирующее полипептид, представляет собой довитиниб, ΑΖΌ4547, ВО1398 или ЬУ2874455.
29. Фармацевтическая композиция для лечения рака по любому из пп.22-27, где рак представляет собой рак легких или рак мочевого пузыря.
30. Применение вещества, ингибирующего следующий полипептид, при изготовлении фармацевтической композиции для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, составленному из Р0РК3 и ТАСС3:
полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6.
31. Применение вещества, ингибирующего следующий полипептид для лечения рака, который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из Р0РК3 и ТАСС3:
полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 §ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 §ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 §ЕЦ ГО N0: 6.
32. Вещество, ингибирующее следующий полипептид для лечения рака, который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из Р0РК3 и ТаСс3:
в полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последователь- 5 029140 ность, обладающую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6.
33. Способ лечения рака, который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из РСРК3 и ТАСС3, включающий введение индивидууму эффективного количества вещества, ингибирующего следующий полипептид, полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу детектирования рака (в частности, рака легких или рак мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающий детектирование присутствия полинуклеотида, кодирующего полипептид в соответствии со следующими от 1 до 3 в образце, полученном от испытуемого индивидуума:
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислоткислотной последовательности, представленной номерами аминокислот от 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 94 7 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 51+) ГО N0: 28 (или 51+) ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, 51+) ГО N0: 4, 51+) ГО N0: 6, 51+) ГО N0: 26 или 51+) ГО N0: 28.
Настоящее изобретение относится к способу детектирования рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, описанному в настоящем параграфе, в котором стадия детектирования присутствия полинуклеотида включает проведение гибридизации ίη δίίυ с использованием образца, полученного от испытуемого индивидуума, и меченого зонда, образованного в соответствии с [17], и детектирование наложения сигналов метки.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака (в частности, рака легких или рак мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающий детектирование присутствия полинуклеотида, кодирующего полипептид в соответствии со следующими пп.1-3, в образце, полученном от исследуемого индивидуума:
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с 90% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 51+) ГО N0: 28 (или 51+) ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 51+) ГО N0: 28 (или 51+) ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО
- 6 029140
N0: 2, ЗЕЦ ΙΌ N0: 4, ЗЕЦ ΙΌ N0: 6, ЗЕЦ ΙΌ N0: 26 или ЗЕЦ ΙΌ N0: 28.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, описанному в настоящем пункте, в котором стадия детектирования присутствия полинуклеотида включает в себя проведение гибридизации ίη δίίπ с использованием образца, полученного от испытуемого индивидуума, и меченого зонда, образованного в соответствии с п.17, и детектирование наложения сигналов метки.
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения рака (особенно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, включающему введение вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению (в варианте осуществления вещество представляет собой соединение ΆΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВО1398 или соединение ЬУ2874455), пациенту с диагнозом рак (особенно рак легких или мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, по способу диагностики вышеупомянутых двух вариантов осуществления.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования наличия рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, включающему:
1) проведение ПЦР с использованием образца, полученного от испытуемого индивидуума, в качестве матрицы, и с использованием набора праймеров в соответствии с любым из пп.11-16, и
2) детектирование наличия ПЦР-продукта.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, включающему:
1) проведение ПЦР с использованием образца, полученного от испытуемого индивидуума, в качестве матрицы, и с использованием набора праймеров в соответствии с любым из пп.11-16, и
2) детектирование наличия ПЦР-продукта.
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, включающий введение вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению (в варианте осуществления, вещество представляет собой соединение ΆΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВО1398 или соединение ЬУ2874455), пациенту с диагнозом рак (особенно рак легких или мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена Р0РК3 и гена ТАСС3, по способу диагностики.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования геномной перестройки хромосом, включающий детектирование присутствия полинуклеотида, кодирующего полипептид в соответствии со следующими пп.1-3 в образце, полученном от испытуемого индивидуума:
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕЦ ГО N0: 2 (или ЗЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 (или ЗЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕЦ ГО N0: 6 (или ЗЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕЦ ГО N0: 26 (или ЗЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕЦ ГО N0: 28 (или ЗЕЦ ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕЦ ГО N0: 2 (или ЗЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 (или ЗЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕЦ ГО N0: 6 или (ЗЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕЦ ГО N0: 28 (или ЗЕЦ ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, ЗЕЦ ГО N0: 4, ЗЕЦ ГО N0: 6, ЗЕЦ ГО N0: 26 или ЗЕЦ ГО N0: 28.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования геномной перестройки хромосом, включающему:
1) проведение гибридизации ίη δίΐιι с использованием ί) образца, полученного от испытуемого индивидуума, ίί) флюоресцентно меченого зонда (первого зонда), включающего 5'-сторону геномной области, кодирующей ген Р0РК3, и ίίί) флюоресцентно меченого зонда (второго зонда), включающего 3'сторону геномной области, кодирующей ген ТАСС3 (в настоящем документе, флуоресценция первого
- 7 029140 зонда отличается от флуоресценции второго зонда), и
2) детектирование наложения сигналов метки.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования наличия рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающему:
1) проведение гибридизации ίη δίΐπ с использованием ί) образца, полученного от испытуемого индивидуума, ίί) флюоресцентно меченого зонда (первого зонда), включающего 5'-сторону геномной области, кодирующей ген РСРК3, и ίίί) флюоресцентно меченого зонда (второго зонда), включающего 3'сторону геномной области, кодирующей ген ТАСС3 (в настоящем документе, флуоресценция первого зонда отличается от флуоресценции второго зонда), и
2) детектирование наложения сигналов метки.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающему:
1) проведение гибридизации ίη δίΐπ с использованием ί) образца, полученного от испытуемого индивидуума, ίί) флюоресцентно меченого зонда (первого зонда), включающего 5'-сторону геномной области, кодирующей ген РСРК3, и ίίί) флюоресцентно меченого зонда (второго зонда), включающего 3'сторону геномной области, кодирующей ген ТАСС3 (в настоящем документе, флуоресценция первого зонда отличается от флуоресценции второго зонда), и
2) детектирование наложения сигналов метки.
Кроме того, в другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающему введение вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению (в варианте осуществления, вещество представляет собой соединение ΑΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВС1398 или соединение ЬУ2874455), пациенту с диагнозом рак (особенно рак легких или рак мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РСРК3 и гена ТАСС3, по вышеприведенному способу диагностики.
Настоящее изобретение также относится к полипептиду в соответствии со следующими пп.1-3 (далее также именуется ''полипептид по настоящему изобретению'') или полинуклеотиду, кодирующему полипептид (далее также именуется ''полинуклеотид по настоящему изобретению''):
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 ЗЕО ГО N0: 2 (или ЗЕО ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕО ГО N0: 4 (или ЗЕО ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕО ГО N0: 6 (или ЗЕО ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕО ГО N0: 26 (или ЗЕО ГО N0: 1026) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕО ГО N0: 28 (или ЗЕО ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕО ГО N0: 2 (или ЗЕО ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕО ГО N0: 4 (или ЗЕО ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕО ГО N0: 6 (или ЗЕО ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕО ГО N0: 26 (или ЗЕО ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕО ГО N0: 28 (или ЗЕО ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕО ГО N0: 2 (или ЗЕО ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ГО N0 ЗЕО: 4 (или ЗЕО ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕО ГО N0: 6 (или ЗЕО ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕО ГО N0: 26 (или ЗЕО ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕО ГО N0: 28 (или ЗЕО ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 4, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 26 или ЗЕО ГО N0: 28.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования слитого белка, составленного из РСРК3 и ТАСС3, включающему детектирование присутствия полипептида в соответствии со следующими пп.1-3 в образце, полученном от испытуемого индивидуума:
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕО ГО N0: 2 (или ЗЕО ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕО ГО N0: 4 (или ЗЕО ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕО ГО N0: 6 (или ЗЕО ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕО ГО N0: 26 (или ЗЕО ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 ЗЕО ГО N0: 28 (или ЗЕО ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 ЗЕО ГО N0: 2 (или ЗЕО ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 ЗЕО ГО N0: 4 (или ЗЕО ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 ЗЕО ГО N0: 6 (или ЗЕО ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 ЗЕО ГО N0: 26 (или ЗЕО ГО N0: 26),
- 8 029140 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ 5 ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО N0: 28 (или 8ЕО ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ 10 ГО N0: 2, 8ЕС) ГО N0: 4, 8ЕС) ГО N0: 6, 8ЕС) ГО N0: 26 или 8ЕС) ГО N0: 28.
Настоящее изобретение также относится к способу детектирования наличия рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому белку, составленному из РСРК3 и ТАСС3, включающему детектирование присутствия полипептида в соответствии со следующими пп.1-3 в образце, полученном от испытуемого индивидуума:
(1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8Е0 ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО N0: 28 (или 8ЕО ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8Е0 ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8Е0 ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО N0: 28 (или 8ЕО ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ 35 ГО N0: 2, 8ЕО ГО N0: 4, 8ЕО ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 26 или 8ЕО ГО N0: 28.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака (особенно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому белку, составленному из РСРК3 и ТАСС3, включающему детектирование присутствия полипептида в соответствии со следующими пп.1-3 в образце, полученном от испытуемого индивидуума:
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8Е0 ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26) или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО N0: 28 (или 8ЕО ГО N0: 28);
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8ЕЦ ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8Е0 ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28 (или 8ЕЦ ГО N0: 28); или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2 (или 8ЕЦ ГО N0: 2), номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 (или 8Е0 ГО N0: 4), номерами аминокислот с 461 по 996 из 8ЕЦ ГО N0: 6 (или 8ЕЦ ГО N0: 6), номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 (или 8ЕЦ ГО N0: 26), или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО N0: 28 (или 8ЕО ГО N0: 28); или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕО ГО N0: 4, 8ЕО ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 26 или 8ЕО ГО N0: 28.
Кроме того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака (особенно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому белку, составленному из РСРК3 и ТАСС3, включающему введение вещества, ингибирующего полипептид в соответствии с пп.1-3 (в варианте осуществления вещество представляет собой соединение ΑΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВСЙ398 или соединение ЬУ2874455) пациенту с диагнозом рак (особенно рак легких или рак мочевого пузыря), который является положительным по слитому белку, составленному из РСРК3 и ТАСС3, по способу диагностики.
- 9 029140
В статье 8аепсе. 2012 8ер 7; 337 (6099): 1231-5, ЕриЬ 1и1 26 2012 сообщалось о существовании онкогенного слитого гена, составленного из гена РОРК3 и гена ТАСС3, ингибитор РОРК, такой как ΡΌ173074, ΑΖΌ4547 или ВО1398, ингибировал пролиферацию клеток, экспрессирующих слитый ген РОРК3-ТАСС3, и экспрессия слитого гена РОРК3-ТАСС3 может способствовать идентификации группы пациентов с глиобластомой, которые получают пользу от лечения РОРК-ингибиторами. Однако статья была опубликована после самой ранней даты приоритета (8 марта 2012) настоящего приложения. В статье описывается последовательность фрагмента гена, имеющего ту же точку слияния, что и РОРК3ТАСС3_у1 и РОРК3-ТАСС3_у2 настоящего изобретения. Однако она не ясно описывает всю длину последовательности. Кроме того, статья не раскрывает и не свидетельствует о существовании РОРК3ТАСС3_у3, РОРК3-ТАСС3_у5а и РОРК3-ТАСС3_у5Ь, способа детектирования гена, и набора праймеров, набора зондов и набора для детектирования по настоящему изобретению. Кроме того, документ не включает в себя какое-либо описание или предложение в отношении рака легких или рака мочевого пузыря.
Кроме того, в статье Нит Мо1 ОепеР 2012. Νον21 (Нит Мо1 ОепеР 2013 РеЬ 15; 22 (4): 795-803), сообщалось, что онкогенный слитый ген, составленный из гена РОРК3 и гена ТАСС3 (тот же ген, что и РОРР3-ТАСС3_\'1 по настоящему изобретению), присутствует в раке мочевого пузыря, но статья была опубликована после самой ранней даты приоритета (8 марта 2012), в котором был раскрыт РОРК3ТАСС3^1 по настоящему изобретению, и даты второго приоритета (5 сентября 2012) настоящего приложения. Статья не раскрывает и не свидетельствует о существовании РОРР3-ТАСС3_\'2. РОРК3ТАСС3^3, РОРР3-ТАСС3_\'5а и РОРВ3-ТАСС3_\'5Ь, способе детектирования гена, и наборе праймеров, наборе зондов и наборе для детектирования по настоящему изобретению. Кроме того, статья не включает в себя описание или предложение в отношении рака легких.
Кроме того, в статье 1 С1ш 1пуе81. 2013 РеЬгиагу 1; 123 (2): 855-865, сообщалось, что несколько онкогенных слитых генов, составленных из гена РОРК3 и гена ТАСС3, встречаются в глиобластоме. Однако статья была опубликована после самой ранней даты приоритета (8 марта 2012), где были раскрыты РОРР3-ТАСС3_\'1 и РОРР3-ТАСС3_\'2 по настоящему изобретению, второй даты приоритета (5 сентября 2012) и третьей даты приоритета (21 декабря 2012) настоящего приложения. Статья не раскрывает и не свидетельствует о существовании РОРК3-ТАСС3^3, РОРР3-ТАСС3_\'5а и РОРК3-ТАСС3^5Ь, способе детектирования гена и наборе праймеров, наборе зондов и наборе для детектирования по настоящему изобретению. Кроме того, статья не включает в себя описание или предложение в отношении рака легких или рака мочевого пузыря.
Эффекты изобретения
Способ детектирования по настоящему изобретению может быть использован в качестве способа детектирования рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РОРК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из РОРК3 и ТАСС3. Более того, способ детектирования по настоящему изобретению может быть использован в качестве способа детектирования геномной перестройки хромосом. Кроме того, в зависимости от способа детектирования по настоящему изобретению можно определить, является ли пациент индивидуумом, подлежащим лечению веществом, ингибирующим полипептид по настоящему изобретению. Набор для детектирования, набор праймеров и набор зондов по настоящему изобретению могут быть использованы для способа детектирования по настоящему изобретению. Кроме того, вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению, может быть использовано в качестве фармацевтической композиции для лечения рака (особенно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РОРК3 и гена ТАСС3, или по слитому белку, составленному из РОРК3 и ТАСС3.
Варианты осуществления изобретения Способ детектирования по настоящему изобретению Способ детектирования по настоящему изобретению является способом детектирования слитого гена или слитого белка. Способ включает детектирование присутствия конкретного полинуклеотида или полипептида в образце, полученного от испытуемого индивидуума. В качестве образца, полученного от испытуемого индивидуума, используют вещества, собранные от испытуемого индивидуума (образцы, отделенные от биологического тела), в частности, любой тип собранных тканей и жидкостей организма (предпочтительно крови), бронхоальвеолярных лаважных жидкостей, биоптатов, раковых клеток в моче и мокроты. Тем не менее, предпочтительно использовать биопсийные материалы, полученные из пораженного участка легкого или мочевого пузыря испытуемого индивидуума, или использовать мокроту. Может использоваться геномная ДНК, выделенная из образцов, и могут использоваться продукты транскрипции (продукты, которые образовались из генома в результате транскрипции и трансляции; например, мРНК, кДНК и белки). Особенно предпочтительна подготовка и использование мРНК или кДНК. Также можно использовать стабилизированный препарат, полученный путем фиксации образца с помощью формалина и погружения его в парафин (РРРЕ). Кроме того, можно использовать РРРЕ-срез, полученный путем разрезания РРРЕ на тонкие срезы. Если используется РРРЕ-срез, можно непосредственно детектировать в срезе присутствие полинуклеотида или полипептида.
В ''детектировании присутствия полинуклеотида'' в способе детектирования слитого гена, детекти- 10 029140 руемый полинуклеотид (далее именуется ''полинуклеотид как мишень детектирования'') представляет собой ''слитый ген, составленный из гена РОРК3 и гена ТАСС3'', и он включает в себя часть гена РСРК3 и часть гена ТАСС3.
Примеры ''слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3'', включают гены, содержащие последовательность, которая кодирует киназный домен в качестве одного из функциональных доменов РСРК3, и последовательность, которая кодирует биспиральный домен в качестве одного из функциональных доменов ТАСС3. В качестве вызывающих рак слитых генов известны РТС-КЕТ (СПп. 35 Сапсег Кее. 2009; 7119-7123), К1Р5В-АЬК (С1ш. Сапсег Кее. 2009; 3143-3149), К1Р5В - КЕТ (ХаПие тебюше 2012; 12 РеЬгиагу; ЕриЬ акеаб оГ рппр Ыа1 Меб. 2012 фев 12; 18 (3): 375-7), ЕМЬ4-АЬК (ЫаШге 2007; 561566) и тому подобное. Эти слитые гены являются слитыми генами, в которых гены белков, содержащих биспиральный домен на 5'-конце, связаны с киназными генами, из которых лиганд-связывающий участок на 3'-конце удален. Эти слитые гены, как известно, вызывают трансформацию, когда принудительно экспрессируются в клетках ΝΙΗ3Τ3. Например, клетки 3Т3, подверженные экспрессии слитого гена К1Р5ВКЕТ без участка связывания лиганда, активируют автофосфорилирование его 905-го остатка тирозина, который является важным для лиганд-независимой активации КЕТ-киназы. Известно, что обработка клеток вандетанибом, КЕТ-ингибитором, ослабляла автофосфорилирование белка и индуцировала гибель клеток (№Диге тебюше 2012; 12 РеЬгиагу; ЕриЬ акеаб оГ ргшр N1 Меб. 2012 РеЬ 12; 18 (3): 375-7). Кроме того, известно, что в клеточной линии, природно экспрессирующей слитый ген ЕМЬ4-АЬК без лигандсвязывающего домена, происходит фосфорилирование 1604-го остатка, который важен для киназной активности АЬК, и фосфорилирование ингибируется ТАЕ684, обладающим ингибирующей активностью в отношении АЬК, тем самым рост клеток ингибируется (С1ш. Сапсег Кее. 2008; 4275-4283). Кроме того, полагают, что кризотиниб, который является ингибитором АЬК-киназы, может быть эффективным препаратом для лечения пациентов с раком легких, экспрессирующим слитый ген ЕМЬ4-АЕК (Эгид Эев. Эеее1. Ткег. 2011; 471-485). В качестве механизма действия их слитых белков, кодируемых этими слитыми генами, предполагается, что гомодимеризация через свой собственный биспиральный домен вызывает лиганд-независимую автоактивацию киназных доменов их слитых белков. Кроме того, предлагается, что использование ингибитора киназы слияния позволяет ингибировать функцию слитых белков, как описано выше. Таким образом, ожидается также, что киназный домен РСРК3 и биспиральный домен ТАСС3 являются важными доменами, вызывающими рак, в слитом гене, составленном из гена РСРК3 и гена ТАСС3. Следовательно, из всех слитых генов, составленных из гена РСРК3 и гена ТАСС3, примеры ''полинуклеотида как мишени детектирования'' включают полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды в соответствии с следующими пп.1-3, которые имеют последовательность, кодирующую киназный домен РОРК3 и биспиральный домен ТАСС3. В варианте осуществления, наличие полинуклеотида как мишени детектирования может быть также выявлено путем детектирования части внутри этих доменов этого.
1) Полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕС ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕС ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕС ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕС ГО ΝΟ: 28 [далее именуется как ''гомологичный полипептид''];
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕС ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕС ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕС ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕС ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕС ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕС ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕС ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕС ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕС ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 5 1040 8ЕС ГО ΝΟ: 28 [далее именуется как ''полипептид как функционально эквивалентный вариант''; или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕС ГО ΝΟ: 2, 5РС) ГО ΝΟ: 4, 51Р) ГО ΝΟ: 6, 51Р) ГО ΝΟ: 26 или 5РС ГО ΝΟ: 28.
Предпочтительные примеры полинуклеотида как мишени детектирования включают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды в соответствии со следующими от (1) до (3):
1) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющий 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной 5РС ГО ΝΟ: 2, 51Р) ГО ΝΟ: 4, 5РС ГО ΝΟ: 6, 51Р) ГО ΝΟ: 26 или 5РС ГО ΝΟ: 28;
2) полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 5>ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕС ГО ΝΟ: 4, 8ЕС ГО ΝΟ: 6, 8ЕС ГО ΝΟ: 26 или 8ЕС ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности,
- 11 029140 представленной δΕΟ ΙΌ N0: 2, δΕΟ ΙΌ N0: 4, δΕΟ ΙΌ N0: 6, δΕΟ ΙΌ N0: 26 или δΕΟ ΙΌ N0: 28; или
3) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную δΕΟ ΙΌ N0: 2, δΕΟ ΙΌ N0: 4, δΕΟ ΙΌ N0: 6, δΕΟ ΙΌ N0: 26 или δΕΟ ΙΌ N0: 28.
Более предпочтительные примеры полинуклеотида как мишени детектирования включают полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, представленную δΕΟ ΙΌ N0: 1, δΕΟ ΙΌ N0: 3, δΕΟ ΙΌ N0: 5, δΕΟ ΙΌ N0: 25 или δΕΟ ΙΌ N0: 27.
Полинуклеотид, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 1, является полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 257 (соответствующего первому метионину на экзоне 2) до 2536 (соответствующего З'-концу экзона 18) варианта 3 гена РСРК3 (входящий номер СепВапк: NΜ_001163213.1) и нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 2050 (соответствующих 5'-концу экзона 11) до 2625 (соответствующего стоп-кодону в экзоне 16) гена ТАСС3 (входящий номер СепВапк: ПМ_006342.1). В нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 1, последовательность с положениями нуклеотидов от 1 до 2280 получена из гена РСРК3, и последовательность с положениями нуклеотидов от 2281 до 2856 получена из гена ТАСС3. Этот слитый полинуклеотид обозначается как РСРК3-ТАСС3_у1. Положения нуклеотидов от 1 до 2856 δΕΟ ΙΌ N0: 1 образуют открытую рамку считывания (0КР) слитого белка, и аминокислотная последовательность, кодируемая 0КР, показана в δΕΟ ΙΌ N0: 2.
Полинуклеотид, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 3, представляет собой полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 257 (соответствующему первому метионину в экзоне 2) до 2536 (соответствующему 3'концу экзона 18) варианта 3 гена РСРК3 (входящий номер СепВапк: ПМ_001163213.1) и нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 1945 (соответствующему 5'-концу экзона 10) до 2625 (соответствующему стоп-кодону экзона 16) гена ТАСС3 (входящий номер СепВапк: NМ_006342.1). В нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 3, последовательность от положения нуклеотидов 1 до 2280 получена из гена РСРК3, и последовательность от положения нуклеотидов 2281 до 2961 получена из гена ТАСС3. Этот слитый полинуклеотид обозначается как РСРК3-ТАСС3_у2. Положения нуклеотидов от 1 до 2961 δΕΟ ΙΌ N0: 3 образуют 0КР слитого белка, и аминокислотная последовательность, кодируемая 0КР, показана в δΕΟ ΙΌ N0: 4.
Полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 5, представляет собой полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 257 (соответствующему первому метионину экзона 2) до 2624 (соответствующему середине экзона 19) варианта 3 гена РСРК3 (Входящий номер СепВапк: NМ_001163213.1), нуклеотидной последовательности от положения нуклеотидов 2050 (соответствующего 5'-концу экзона 11) до 2625 (соответствующего стоп-кодону экзона 16) гена ТАСС3 (входящий номер СепВапк: ПМ_006342.1), и 59 оснований интрона гена ТАСС3, занимающего промежуточное положение между последовательностями. В нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 5, последовательность от положения нуклеотидов 1 до 2368 получена от гена РСРК3, последовательность от положения нуклеотидов 2369 до 2427 получена от геномной последовательности ТАСС3-области, и последовательность от положения нуклеотидов 2428 до 3003 получена от гена ТАСС3. Слитый полинуклеотид обозначается как РСРК3ТЛСС3_у3. Положения нуклеотидов от 1 до 3003 δΕΟ ΙΌ N0: 5 образуют 0КР слитого белка, и аминокислотная последовательность, кодируемая 0КР, показана в δΕΟ ΙΌ N0: 6.
Полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 25, представляет собой полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 257 до 2498 (в настоящем документе 1980-е основание представляет собой С, а не С) вариант 3 гена РСРК3 (входящий номер СепВапк: ПМ_001163213.1) и нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 1771 до 2672 гена ТАСС3 (входящий номер СепВапк: ПМ_006342.1). В нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 25, последовательность от положения нуклеотидов 1 до 2242 получена от гена РСРК3, и последовательность от положения нуклеотидов 2243 до 3144 получена от гена ТАСС3. Слитый полинуклеотид обозначается как РСРК3-ТАСС3_у5а. Нуклеотидные положения от 1 до 3144 δΕΟ ΙΌ N0: 25 образуют 0КР слитого белка, и аминокислотная последовательность, кодируемая 0КР, показана в δΕΟ ΙΌ N0: 26.
Полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 27, представляет собой полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 257 до 2498 варианта 3 гена РСРК3 (Входящий номер СепВапк: NМ_001163213.1) и нуклеотидной последовательности с положениями нуклеотидов от 1771 до 2672 гена ТАСС3 (Входящий номер СепВапк: ПМ_006342.1). В настоящем документе, в части полинуклеотида произошла делеция и инсерция. Делетированная область соответствует положениям нуклеотидов от 690-го основания до 701го основания (последовательность 3' - стороны экзона 4) гена РСРК3 (ПМ_001163213.1). Точка инсерции расположена между 1528-м основанием и 1529-м основанием (между экзоном 10 и экзоном 11) гена РСРК3 (ПМ_001163213.1), и встроенная последовательность представляет собой САС. В нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ N0: 27, последовательность с положениями нуклеотидов от 1 до 2233 получена от гена РСРК3 и последовательность с положениями нуклеотидов от 2234 до 3135
- 12 029140 получена от гена ТАСС3. Слитый полинуклеотид обозначается как ЕСЕК3-ТАСС3_у5Ь. Положения нуклеотидное от 1 до 3135 8ЕЦ ГО N0: 28 образуют ОКЕ слитого белка, и аминокислотная последовательность, кодируемая геном ОКЕ, показана в 8ЕЦ ГО N0: 28.
ЕСЕК3-ТАСС3_у1, ЕСЕК3-ТАСС3_у2, ЕСЕК3-ТАСС3_у3, ЕСЕК3-ТАСС3_у5а и ЕСЕК3ТАСС3_у5Ь совместно обозначены как слитые полинуклеотиды ЕСЕК3-ТАСС3.
Примеры полинуклеотида как мишени детектирования в другом варианте осуществления включают частичную последовательность ЕСЕК3-ТАСС3_у1, соответствующую положениям нуклеотидов от 1381 до 2841 8ЕЦ ГО N0: 1, частичную последовательность ЕСЕК3-ТАСС3_у2, соответствующую положениям нуклеотидов от 1381 до 2946 8ЕЦ ГО N0: 3, ЕСЕК3-ТАСС3_у3, соответствующую положениям нуклеотидов от 1381 до 2988 8ЕЦ ГО N0: 5, и тому подобное.
Предпочтительные примеры ''гомологичного полипептида'' включают ''полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 8ЕЦ ГО N0: 28''. Однако в качестве гомологичного полипептида особенно предпочтительным является полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, более предпочтительно имеющую 95% или больше идентичности и даже более предпочтительно имеющую 98% или более идентичности.
В качестве предпочтительного ''функционально эквивалентного вариантного полипептида'' особенно предпочтительным является ''полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот, предпочтительно от 1 до нескольких аминокислот, более предпочтительно от 1 до 7 аминокислот и наиболее предпочтительно от 1 до 5 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, ГОО ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 8ЕЦ ГО N0: 28'' предпочтительнее, и ''полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную ГОО ГО N0: 2, ГОГ) ГО N0: 4, ГОГ) ГО N0: 6, ГОГ) ГО N0: 26 или ГОГ) ГО N0: 28''.
В настоящей спецификации идентичность означает Идентичность, которая представляет собой значение, полученное с помощью поиска в программе НЕЕОБЕ (1 Μοί Βίοί 1970; 48: 443-453) с использованием параметров по умолчанию. Параметры представляют собой следующие.
Сар репаИу (Штраф за пропуск в последовательности) = 10.
Ех1епбеб репаЪу (Увеличенный штраф) = 0,5.
Майтх (Матрикс) = ЕВЬ08иМ62.
То, что определенный полипептид имеет ''канцерогенность'', подтверждается способом, описанным в примере 8, описанном ниже. В частности, способ включает стадии введения соответствующего слитого гена в клетки №Н3Т3 и подтверждения анкоридж-независимого потенциала роста клеток с помощью планшета для культуры шаровидных клеток. Кроме того, канцерогенность можно подтвердить с помощью способа, включающего стадии прививки клетки, экспрессирующей слитый ген, в кожу лысой мыши и подтверждение формирования опухоли в течение определенного периода времени.
Для полинуклеотида как мишени детектирования в способе детектирования по настоящему изобретению полинуклеотид, кодирующий ''полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или ГОО ГО N0: 28'', является предпочтительным, и полинуклеотид, кодирующий ''полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, ГОО ГО N0: 6, ГОО ГО N0: 26 или 8ЕЦ ГО N0: 28'', является наиболее предпочтительным.
''Детектирование присутствия полинуклеотида'' в способе детектирования слитого гена по настоящему изобретению осуществляется путем детектирования присутствия полинуклеотида как мишени детектирования (геномной последовательности, содержащей точку слияния) в геноме образца, полученного от испытуемого индивидуума, детектирования присутствия продуктов транскрипции (например, мРНК или кДНК), соответствующих полинуклеотиду как мишени детектирования, полученых из геномной ДНК путем экстрагирования продуктов из образца, полученного от испытуемого индивидуума, или, при необходимости, детектирования присутствия полинуклеотида как мишени детектирования в предварительно обработанном образце, полученном от испытуемого индивидуума с помощью гибридизации ίη 8Йи.
Экстрагирование геномной ДНК можно выполнить с помощью общеизвестных способов, и это можно легко выполнить, используя коммерчески доступный набор для выделения ДНК.
Стадия детектирования может быть выполнена в соответствии с общеизвестными способами генетического анализа (например, хорошо известные способы, которые обычно используются в способах детектирования генов, такие как ПЦР, лигазная цепная реакция (ЬСК), амплификация с замещением цепей (ГОА), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (КАГОА). амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая изотермическими и химерными праймерами (1САЫ), способ петле-обусловленной изотермической амплификации (ЬАМР), способ ТМА (Сеп-РтоЬе'8 ТМА 8у81ет), способ гибридизации ίη δίίπ (18Н) и микроматричный анализ). Например, методика гибридизации, в которой в качестве зонда используется нуклеиновая кислота, предназначенная для гибридизации с поли- 13 029140 нуклеотидом как мишенью детектирования, методика генной амплификации, в которой в качестве праймера используется ДНК, предназначенная для гибридизации с полинуклеотидом как мишенью детектирования.
В частности, детектирование осуществляют с помощью нуклеиновой кислоты, например, мРНК, полученной из образцов, полученных от испытуемого индивидуума. Количество мРНК измеряется с помощью способа реакции генной амплификации с использованием праймера, спроектированного для того, чтобы быть способным специфически амплифицировать полинуклеотид как мишень детектирования. Праймер, используемый в способе детектирования по настоящему изобретению, или праймер, включенный в набор для детектирования, не является особенно ограниченным, при условии, что праймер может специфически амплифицировать полинуклеотид как мишень детектирования. Праймер проектируют на основе нуклеотидной последовательности полинуклеотида как мишени детектирования. Для проектирования праймера, используемого в способе мониторинга при помощи ПЦР-амплификации, можно использовать программное обеспечение для дизайна праймеров (к примеру, Рпшег Ехргезз; Аррйей ВюхуЫепъ) и подобное. Чем больше размер ПЦР-продукта, тем слабее становится эффективность амплификации. Следовательно, целесообразно проектировать смысловой праймер и антисмысловой праймер так, чтобы размер продукта амплификации, полученного путем амплификации мРНК или кДНК, был в пределах 1 т.п.н.
Конкретнее, смысловой праймер (5'-праймер) проектируют из части, полученной от гена РОРК3 (например, любая его часть, в пределах домена гена РОРК3 слитого полинуклеотида (в частности, кДНК)), и антисмысловой праймер (З'-праймер) проектируют из части, полученной от гена ТАСС3 (например, любая его часть, в пределах домена гена ТАССЗ слитого полинуклеотида (в частности, кДНК)). В качестве альтернативы, либо смысловой праймер, либо антисмысловой праймер может быть спроектирован так, что он соответствует области, содержащей точку слияния (описано позже) слитого полинуклеотида. Предпочтительно использовать набор праймеров, входящий в набор для детектирования по настоящему изобретению и более предпочтительно использовать набор праймеров, который наиболее предпочтительно входит в набор для детектирования по настоящему изобретению. В способе мониторинга при помощи ПЦР-амплификации, если смысловые праймеры, соответствующие соответствующим генам, смешивают вместе, возможна разработка мультиплексного ПЦР-способа детектирования всех полинуклеотидов как мишеней детектирования в одной реакционной жидкости. При помощи способа, подходящего для каждой из технологий амплификации, можно подтвердить, был ли амплифицирован генмишень (полноразмерный или частичный). Например, в ПЦР-способе можно проверить, амплифицировались ли фрагменты с заданным размером, с помощью агарозного гель-электрофореза и окрашивания бромидом этидия, или подобного. Если получаются амплифицированные фрагменты с предполагаемым размером, можно заключить, что в образце, полученном от испытуемого индивидуума, присутствует полинуклеотид как мишень детектирования. Таким образом можно обнаружить присутствие полинуклеотида как мишени детектирования.
В дополнение к детектированию присутствия конкретного полинуклеотида в образце, полученном от испытуемого индивидуума с помощью реакции генной амплификации, способ детектирования слитого гена по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включает стадии проверки того, обладают ли амплифицированные фрагменты предполагаемым размером.
Для детектирования при помощи методики гибридизации используют, например, нозернгибридизацию, способ дот-блоттинга, способ ДНК-микроматричного анализа, способ РНК-защиты и другие. Для зонда, используемого для гибридизации, можно использовать молекулу нуклеиновых кислот, состоящую, по меньшей мере, из 32 последовательных оснований, гибридизующуюся с полинуклеотидом как мишенью детектирования или его комплементарной цепью в жестких условиях (предпочтительно более жестких условиях) и имеющую последовательность, состоящую из 16 оснований на каждой из сторон, расположенных вверх и вниз по течению от точки слияния в качестве центра (в частности, последовательность включает в себя основания с 2265-го по 2296-е (2280-е основание/2281-е основание) нуклеотидной последовательности, представленной 5>Еф ГО N0: 1, основания с 2265-го по 2296-ое (2280ое основание/2281-е основание) нуклеотидной последовательности, представленной 5>Еф ГО N0: 3, основания с 2353-го по 2384-ое (2368-е основание/2369-е основание) нуклеотидной последовательности, представленной 5>Еф ГО N0: 5, основания с 2227-го по 2258-е (2242-е основание/2243-е основание) нуклеотидной последовательности, представленной 5>Еф ГО N0: 25, или основания с 2218-го по 2249-ое (2233-е основание/2234-е основание) нуклеотидной последовательности, представленной 5>Еф ГО N0: 27; в настоящем документе количество оснований в скобках обозначает точку слияния) или ее комплементарную цепь.
В настоящей спецификации, ''точка слияния'' означает точку, в которой часть, полученная от гена РСРК3, слита с частью, полученной от гена ТАСС3.
Детектирование с использованием техники гибридизации ίη-δίίπ может быть выполнено в соответствии с общеизвестным ΡΙδΗ-способом (тест на слияние). Альтернативно, детектирование можно проводить при помощи теста на слияние как комбинации способа хромогенной гибридизации ίη δίίπ (С18Н) и способа серебряной гибридизации ίη δίΐιι (δΙδΗ).
- 14 029140
Детектирование с использованием техники гибридизации ίη δίΐιι может быть выполнено в соответствии с общеизвестным способом РНК ΡΙδΗ (1. Μοί. Ωίαβη, 2012; 22-29). Конкретнее, детектирующий зонд проектируют из части, полученной из гена РОРК3 (например, любая часть внутри области гена РОРК3 слитого полинуклеотида (мРНК)), а другой детектирующий зонд проектируют из части, полученной из гена ТАСС3 (например, любая часть в области гена ТАСС3 слитого полинуклеотида (мРНК)). Образец, полученный от испытуемого индивидуума, гибридизуют с зондом, сигналы амплифицируют с помощью реагента для амплификации сигнала и детектируют наложение сигнала от части, полученной из гена РОРК.3, и сигнала от части, полученной из гена ТАСС3. С помощью различных флуорогенных и хромогенных субстратов для детектирования зонда, спроектированного по части, полученной от гена РОРК3 и зонда, спроектированного по части, полученной от гена ТАСС3, можно наблюдать, не находятся ли в одном сайте два типа зондов, полученных из разных генов (на одной и той же молекуле). В результате наблюдения за состоянием двух типов зондов в одном и том же участке (на одной и той же молекуле) можно обнаружить присутствие полинуклеотида как мишени детектирования. В качестве реагента для амплификации сигнала можно использовать РтеАтрййет Μίχ ЦТ (АГГутейтх, 1пс.), Атрййет Μίχ ЦТ (АГГутейтх, 1пс.), ЬаЬе1 РгоЬе Μίχ (АГГутейтх, 1пс.) и ЬаЬе1 РгоЬе БОиеШ ЦТ (АГГутейтх, 1пс.). В настоящей спецификации термин ''жесткие условия'' подразумевает условия: ''5х 88РЕ, 5х раствор ОепНагйб 0,5% додецилсульфат натрия (δΌδ), 50% формамид, 200 мкг/мл ДНК спермы лосося и инкубация в течение ночи при 42°С'', как условия для гибридизации, а ''0,5х §§С, 0,1% δΌδ и 42°С'', как условия для отмывки. Термин ''более жесткие условия'' подразумевает условия: ''5х §§РЕ, 5х раствор ОепНагйб 0,5% δΌδ, 50% формамид, 200 мкг/мл ДНК спермы лосося и инкубация в течение ночи при 42°С'', как условия для гибридизации, а ''0,2х §§С, 0,1% δΌδ и 65°С'', как условия для отмывки.
Кроме того, может быть использована методика генной амплификации, такая как КТ-РСК. В способе КТ-РСК, можно анализировать присутствие полинуклеотида как мишени детектирования более количественно способом мониторинга при помощи ПЦР-амплификации (способ ПЦР в режиме реального времени) (Оепоте Кек., 6 (10), 986, 1996) в процессе амплификации гена. Для способа мониторинга при помощи ПЦР-амплификации, например, может быть использован ΛΒΙ РКIδΜ7900 (Аррйей ВюклъЮтЦ. Способ ПЦР в режиме реального времени является широко известным способом, и приборы и наборы для этого способа являются коммерчески доступными. Поэтому ПЦР в реальном времени можно просто выполнить с использованием этих материалов.
В настоящем изобретении, детектирование слитого гена или слитого белка может осуществляться путем непосредственного детектирования присутствия полипептида, кодируемого полинуклеотидом как мишенью детектирования (далее именуются ''полипептид как мишенью детектирования'') в образце, полученном от испытуемого индивидуума. ''Слитый белок, составленный из РОРК3 и ТАСС3'', представляет собой полипептид, кодируемый полинуклеотидом как мишенью детектирования (то есть полипептид, как мишень детектирования). Среди полипептидов как мишеней детектирования полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2, обозначается как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν1; полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 4, обозначается как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν2; полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 6, обозначается как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν3; полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 26, обозначается как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 у5а; и полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 28, обозначается как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 у5Ь. Слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν1, слитый полипептид РОРК3ТАСС3 ν2, слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν3, слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 у5а и слитый полипептид РОРК3-ТАСС3 ν5Ь совместно обозначаются как слитые полипептиды РОРК3-ТАСС3 (слитые белки РОРК3-ТАСС3).
Например, в стадиях детектирования полипептида как мишени детектирования детектирование может быть выполнено способом, как комбинацией иммуноанализа и анализ ферментативной активности, в котором подготавливается лизат, полученный из образца, полученного от испытуемого индивидуума (например, раковая ткань или раковые клетки, полученные от испытуемого индивидуума), и полипептид как мишень детектирования, содержащийся в лизате, комбинируют с антителами против соответствующих белков, составляющих слитый полипептид (например, антитело против РОРК3 и антитело против ТАСС3). Более того, детектирование можно выполнять при помощи методики иммуногистохимического окрашивания, в которой полипептид как мишени детектирования, содержащийся в образце (например, РРРЕ-срезе), полученном от испытуемого индивидуума, который подвергся предварительной обработке (например, удалению парафина), соответствующим образом комбинируют с антителами против соответствующих белков, составляющих слитый полипептид (например, антитело против РОРК3 и антитело против ТАСС3). Примеры этих методик включают ферментативный иммуноанализ, двуслойный иммуноферментный анализ с двойными антителами, флуоресцентный иммуноанализ, радиоиммуноанализ, вестерн-блоттинг и иммуногистохимическое окрашивание, в котором используется моноклональное антитело или поликлональное антитело, специфичное к полипептиду как мишени детектирования.
- 15 029140
Детектирование с использованием методики иммуногистохимического окрашивания может быть выполнено в соответствии со способом близкого лигирования (ΝαΙ. МеОюбу 2006; 995-1000), который является широко известной методикой специфического детектирования представляющего интерес полипептида единой молекулой как единицей измерения. Конкретнее, с использованием антитела, узнающего часть, полученную от гена РОРК3 слитого полипептида, и антитела, узнающего часть, полученную от гена ТАСС3 слитого полипептида, состояние, при котором два антитела узнают одну и ту же молекулу, определяется вышеупомянутой методикой, в соответствии с которой можно детектировать присутствие полипептида как мишени детектирования. Более конкретно, детектирование может быть выполнено путем ί) приведения антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена РОРК3 слитого полипептида и антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена ТАСС3 слитого полипептида, в контакт с образцом, полученным от испытуемого индивидуума, ίί) добавления вторичных антител, которые конъюгированы с олигонуклеотидами и соответственно связываются с первичными антителами, ίίί), вызывания реакции лигирования путем добавления лигирующего раствора, содержащего два вида олигонуклеотидов, которые частично комплементарны олигонуклеотидам, конъюгированным со вторичными антителами, и лигазы, которая может образовывать циклическую структуру между вторичными антителами путем вызывания реакции лигирования, когда два вида олигонуклеотидов сближаются друг с другом, ίν), элонгации последовательности нуклеиновой кислоты вдоль образованной циклической структуры, ν) гибридизации меченого олигонуклеотидного зонда, который может гибридизоваться с элонгированной последовательностью нуклеиновой кислоты, и νί) детектирования сигналов метки. В варианте осуществления, можно использовать зонд РЬА и реагенты, включенные в набор реагентов ИиоБик II и набор реагентов Ииойик II ВгщЫ йе1б (О1шк Вюзаепсе).
Когда полинуклеотид как мишень детектирования или полипептид как мишень детектирования в способ детектирования по настоящему изобретению обнаруживается в образце, полученном от испытуемого индивидуума, это означает, что испытуемый индивидуум является индивидуумом (пациентом) с раком, который является положительным либо по полинуклеотиду, либо по полипептиду, и индивидууму следует пройти лечение веществом, ингибирующим полипептид по настоящему изобретению (в варианте осуществления, вещество представляет собой соединение ΑΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВО1398 или соединение БУ2874455). Набор для детекции по настоящему изобретению, набор праймеров по настоящему изобретению и набор зондов по настоящему изобретению
Набор для детекции по настоящему изобретению содержит набор праймеров, включающий, по меньшей мере, смысловой праймер и антисмысловой праймер (также называемый как ''набор праймеров''), спроектированные так, чтобы иметь способность специфически амплифицировать полинуклеотид как мишень детектирования в способе детектирования по настоящему изобретению. Набор праймеров по настоящему изобретению представляет собой набор полинуклеотидов, функционирующих как праймеры для амплификации полинуклеотида как мишени детектирования.
Набор праймеров по настоящему изобретению содержит набор праймеров для детектирования слитого гена, составленного из гена РОРК3 и гена ТАСС3, включающий смысловой праймер, спроектированный по части, полученной от гена РОРК3, и антисмысловой праймер, спроектированный по части, полученной от гена ТАСС3, в котором антисмысловой праймер состоит из молекул нуклеиновых кислот (предпочтительно молекул нуклеиновых кислот по меньшей мер из 16 оснований), гибридизующихся с ''полинуклеотидом как мишенью детектирования'' в жестких условиях (предпочтительно в более жестких условиях), и смысловой праймер состоит из молекул нуклеиновых кислот (предпочтительно молекул нуклеиновых кислот по меньшей мере из 16 оснований), гибридизующихся с комплементарной цепью ''полинуклеотида как мишени детектирования'' в жестких условиях (предпочтительно в более жестких условиях).
В наборе праймеров по настоящему изобретению, либо смысловой праймер, либо антисмысловой праймер может быть спроектирован так, что он соответствует части, включающей точку слияния (описанную выше) слитого полинуклеотида.
Примеры конкретных вариантов осуществления набора праймеров по настоящему изобретению включают набор праймеров, выбранный из группы, состоящей из следующих 1)-5):
1) Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 1 до 2280 БЕЦ ГО ΝΟ: 1, и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 2281 до 2856 БЕЦ ГО ΝΟ: 1.
2) Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 1 до 2280 БЕЦ ГО ΝΟ: 3, и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 2281 и 2961 БЕЦ ГО ΝΟ: 3.
3) Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 1 до 2368 БЕЦ ГО ΝΟ: 5, и
- 16 029140 антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 2369 и 3003 8ЕО ГО N0: 5.
4) Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 1 до 2242 8Е0 ГО N0: 25 и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 2243 и 3144 8ЕС) ГО N0: 25.
5) Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 1 до 2233 8Е0 ГО N0: 27, и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между положениями нуклеотидов от 2234 и 3135 8ЕО ГО N0: 27.
В наборе праймеров, расстояние между выбранными положениями для смыслового праймера и антисмыслового праймера предпочтительно составляет до 1 т.п.н., или размер продукта, амплифицированного со смыслового праймера и антисмыслового праймера, предпочтительно составляет до 1 т.п.н.
Кроме того, праймер по настоящему изобретению, как правило, имеет длину от 15 до 40 оснований, предпочтительно имеет длину от 16 до 24 оснований, более предпочтительно имеет длину от 18 до 24 оснований и, в частности, предпочтительно имеет длину от 20 до 24 оснований.
Набор праймеров по настоящему изобретению может быть использован для амплификации и детектирования полинуклеотида как мишени детектирования в способе детектирования по настоящему изобретению. Кроме того, каждый из праймеров, входящих в набор праймеров по настоящему изобретению, не является особенно ограниченным, и, например, может быть подготовлен при помощи способа химического синтеза.
Набор для детекции, включающий набор зондов по настоящему изобретению, содержит, по меньшей мере, набор зондов, который спроектирован по части, полученной от гена РСРК3 (например, любая часть внутри области гена РСРК3 слитого полинуклеотида (мРНК)), и набор зондов, который спроектирован по части, полученной от гена ТАСС3 (например, любая часть внутри области гена ТАСС3 слитого полинуклеотида (мРНК)), которые были спроектированы так, чтобы быть в состоянии специфически гибридизоваться с полинуклеотидом как мишенью детектирования в способе детектирования по настоящему изобретению (также называемый ''набор зондов''), и реагент, амплифицирующий сигнал гибридизации. Набор зондов представляет собой коллекцию полинуклеотидов, функционирующих как набор зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом как мишенью детектирования.
Набор зондов по настоящему изобретению включает в себя набор зондов, который включает зонд, спроектированный по части, полученной от гена РСРК3 (например, любая часть внутри области гена РСРК3 слитого полинуклеотида (мРНК)) и зонд, спроектированный по части, полученной от гена ТАСС3 (например, любая часть зонда, спроектированная по части, полученной от гена ТАСС3 слитого полинуклеотида (мРНК)) и предназначен для детектирования слитого гена, составленного из гена РСРК3 и гена ТАСС3, в котором каждый из зондов содержит молекулы нуклеиновых кислот, гибридизующиеся с ''полинуклеотидом как мишенью детектирования''. В варианте осуществления каждый из зондов является разветвленным ДНК-зондом, и разветвленный ДНК-зонд на основе информации о последовательности доступен от ЛГГутс1п.\. 1пс.
Примеры конкретных вариантов осуществления набора зондов по настоящему изобретению включают в себя наборы зондов, выбранные из группы, состоящей из следующих от (1) до (3):
1) Наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 1 до 2280 8Е0 ГО N0: 1, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 2281 до 2856 8Е0 ГО N0: 1.
2) Наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 1 до 2280 8Е0 ГО N0: 3, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 2281 до 2961 8Е0 ГО N0: 3.
3) Набор зондов, включающий несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат
- 17 029140 олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 1 до 2368 §ЕЦ ГО N0: 5, и наборы зондов, включающие несколько видов наборов зондов (предпочтительно включающие 20 видов наборов зондов), состоящие из пар зондов, которые являются смежными друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между положениями нуклеотидов от 2369 до 3003 §ЕЦ ГО N0: 5.
В настоящем документе большинство наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые являются смежными друг с другом, позволяет облегчать получение сигналов, и такие являются предпочтительными. В варианте осуществления, используется приблизительно 20 видов наборов зондов.
Набор зондов по настоящему изобретению можно использовать для детектирования полинуклеотида как мишени детектирования в способе детектирования по настоящему изобретению. Каждый из зондов, содержащихся в наборе зондов по настоящему изобретению, не является особенно ограниченным, и, например, может быть получен при помощи способа химического синтеза.
Фармацевтическая композиция для лечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению или по полипептиду по настоящему изобретению
Слитые полинуклеотиды, выделенные и идентифицированные из образцов от пациентов с раком (примеры 1-3), как было обнаружено, являются генами, вызывающими рак (примеры 8 и 11), и присутствие слитых полинуклеотидов детектировали у части пациентов с раком легких или раком мочевого пузыря (примеры 4 и 6). Кроме того, опираясь на новые результаты, выявленные с помощью авторов настоящего изобретения и показывающие, что ингибирование активности и/или экспрессии полипептида по настоящему изобретению подавляло анкоридж-независимый пролиферационный потенциал клеток (то есть он продемонстрировал противоопухолевую активность) (примеры 9, 12, 13, 14 и 16), ожидается, что вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению (ингибирование активности и/или экспрессии полипептида по настоящему изобретению), оказывает эффект излечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для лечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, содержащую в качестве активного ингредиента вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению (например, вещество [например, двуцепочечная нуклеиновая кислота (в том числе δίΚΝΑ), белок (в том числе антитело или фрагмент антитела), пептид или соединение, отличное от этих], полученное любым из способов скрининга активного ингредиента фармацевтической композиция, описанной далее).
Активный ингредиент в фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть выбран способом скрининга активного ингредиента фармацевтической композиция, описанным позже. Примеры активного ингредиента включают довитиниб (соединение, описанное в СНшса1 Сапсег Кехеагск 2011; 17: 7451-7461, 4-амино-5-фтор-3-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-бензо[й]имидазол-2-ил]хинолин2(1Н)-он), ΑΖΌ4547 (соединение, описанное в \У0 2008075068 примера 154 и ААСК2011, постер 3568; название: СкагасЮп/аЦоп οί ΑΖΌ4547: Ап ога11у ЪюауаПаЫе. ро1еп( апй 5с1есОуе тЫЪПог οί РОРК 1уго51пе ктахе 1, 2, апб 3'', ^{5-[2-(3,5-диметоксифенил)этил]-2Н-пиразол-3-ил}-4-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]бензамид) и ВС1398 (соединение, описанное в 1оита1 οί МеШста1 СкепщЦу 2011; 54; 7066-7083, 3-(2,6-дихлор-3,5-диметоксифенил)-1-{6-[4-(4-этилпиперазин-1-ил), которые представляют собой соединения, описанные в примере 9, описанном ниже, и ЬУ2874455 (\У0 2010129509 примера 1; Мо1 Сапсег ТЬег, 2011, 10, 2200-2210; (К)-(Е)-2-{4-[2-{5-[1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этокси]-1Н-индазол3-ил}винил]-1Н-пиразол-1-ил}этанол), которое является соединением, описанным в примере 21. Примеры также включают 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]Х-{3-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1ил)пиперидин-1-ил]фенил}пиримидин-2-амин (соединение А), 2-[4-({5-[2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил]окси}пиримидин-2-ил}амино)-1Н-пиразол-1-ил]этанол (соединение В), (2К)-3-[4-({5-[(2,6-дифтор3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1Н-пиразол-1-ил]пропан-1,2-диол (соединение С), 5[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]Х-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]пиримидин-2-амин (соединение Ό) и 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]Х-{1-метил-5-[(4-метилпиперазин-1-ил)метил]-1Нпиразол-3-ил}пиримидин-2-амин (соединение Е), которые являются соединениями, описанными в подготовительных примерах от 1 до 5 и примерах 29 и 30.
В дополнение, соединение, выбранное из широко известных низкомолекулярных соединений, имеющих ингибирующую активность против РОРК3 (РОРК3-ингибиторы), при помощи способа скрининга активного ингредиента фармацевтической композиция, описанного ниже, может быть использовано в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В частности, примеры соединения включают соединение ΑΖΌ4547, соединение довитиниб, соединение ВС1398 и соединение ЬУ2874455.
Двухцепочечная нуклеиновая кислота, служащая примером активного ингредиента фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) и предпочтительно 3'-концевые выступы смысловой цепи и антисмысловой цепи, кото- 18 029140 рая индуцирует РНК-интерференцию. РНК-интерференция представляет собой феномен, который является эволюционно консервированным и происходит при помощи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей от 21 до 23 оснований, сформированных РНКаза III эндонуклеазой (Сепек Эсу. 15, 485-490, 2001). Каждый из выступов с 3'-стороны представляет собой любую нуклеиновую кислоту, состоящую из 1 или 2 оснований, однако предпочтительна нуклеиновая кислота, состоящая из 2 оснований. В настоящем документе, число оснований (от 21 до 23 оснований) представляет собой полную длину либо смысловой цепи, либо антисмысловой цепи, содержащей выступ. Более того, число оснований, образующих смысловую цепь, и число оснований, образующих антисмысловую цепь, может быть одинаковым или отличаться друг от друга, но числа являются предпочтительно одинаковыми для обеих.
Для рибонуклеотида, составляющего выступ с 3'-стороны двухцепочечной нуклеиновой кислоты, например, может быть использован и (уридин), А (аденозин), С (гуанозин) или С (цитидин). В качестве дезоксирибонуклеотида, составляющего выступ с 3'-стороны, например, может быть использован 'Т (дезокситимидин), 'А (дезоксиаденозин), 'С (дезоксигуанозин) или 'С (дезоксицитидин).
Двухцепочечная нуклеиновая кислота, которая может быть использована в качестве активного ингредиента фармацевтической композиция по настоящему изобретению, представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, в которой двухцепочечная часть проектируется на основе ЗЕЦ ГО N0: 1, ЗЕЦ ГО N0: 3 и ЗЕЦ ГО N0: 5 и которая демонстрирует ингибирующую активность в отношении экспрессии полипептида по настоящему изобретению.
Препарат, который включает в качестве активного ингредиента вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению (например, вещество, полученное с помощью способа скрининга активного ингредиента фармацевтической композиции, описанной позднее [например, двуцепочечная нуклеиновая кислота, белок (в том числе антитело или фрагмент антитела), пептид или соединение, отличное от этого]), может быть подготовлен в виде фармацевтической композиции, используя носитель, наполнитель и/или другие добавки, которые обычно используются для изготовления препарата и которые являются фармацевтически приемлемыми, в зависимости от типа активного ингредиента.
Примеры способа введения фармацевтической композиции включают пероральное введение с помощью таблетки, пилюли, капсулы, гранулы, мелких гранул, порошка или раствора для приема внутрь или парентеральное введение с помощью инъекций для внутривенного введения (в том числе внутривенно капельно), внутримышечно, подкожно или подобное, суппозитория, средства для трансдермального введения, внутрипузырной инъекции или средства для введения через слизистую. В частности, когда речь идет о пептиде, расщепляемом в желудке, предпочтительным является парентеральное введение путем внутривенной инъекции или подобного.
В твердой композиции для перорального применения одно или несколько активных веществ может быть смешано по меньшей мере с одним неактивным разбавителем, таким как молочная кислота, маннитол, глюкоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, крахмал, поливинилпирролидон или магния алюминийметасиликаты. В соответствии с общим способом, композиция может содержать добавки, кроме неактивного разбавителя, такие как смазывающее вещество, средство, вызывающее дезинтеграцию, стабилизатор, растворитель и солюбилизирующий компонент. Таблетки или пилюли могут быть покрыты при необходимости сахаром или пленкой вещества для желудка или кишечника.
Жидкая композиция для перорального введения может содержать, например, вещество, придающее опаловый оттенок, раствор, суспензию, сироп или эликсир и может содержать обычно используемый неактивный разбавитель, такой как очищенная вода или этанол. Композиция может содержать добавки, отличные от неактивного разбавителя, такие как увлажняющий крем, суспензия, подсластитель, ароматическое вещество и консервант.
Инъекция для парентерального введения может содержать водный или неводный стерильный раствор, суспензию или вещество, придающее опаловый оттенок. Водорастворимый раствор или суспензия может содержать, например, дистиллированную воду для инъекций или физиологический раствор в качестве разбавителя. Примеры разбавителя водонерастворимых растворов или суспензий включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло (например, оливковое масло), спирты (например, этанол), полисорбат 80 и тому подобное. Композиция может дополнительно содержать увлажнитель, эмульгатор, диспергатор, стабилизатор, растворитель, солюбилизирующие агент, консервант и т.п. Композиция может быть стерилизована фильтрованием через бактериальный задерживающий фильтр, смешиванием с бактерицидным средством или облучением светом. Более того, после подготовки стерилизованная твердая композиция может применяться путем растворения в стерильной воде или других носителях для стерильной инъекции при использовании.
Дозировка может быть соответствующим образом определена при рассмотрении эффективности активности вещества, полученного способом скрининга активного ингредиента, то есть активного ингредиента фармацевтической композиции, симптомов, возраста или пола индивидуума, которому проводится введение, и тому подобное. Предпочтительно доза может быть рассчитана в соответствии со способом введения, так, что концентрация препарата в крови вокруг опухоли или концентрация препарата в опухоли становится в 3-30 раз превышающей концентрацию, например, в 10 раз превышающей концентра- 19 029140 цию, ингибирующую активность или экспрессию полипептида по настоящему изобретению на 50%. Например, в случае перорального введения, суточная доза этого для взрослого (с массой тела 60 кг), как правило, составляет примерно от 0,1 до 100 мг и предпочтительно от 0,1 до 50 мг. В случае парентерального введения, суточная доза этого в виде инъекции составляет 0,01 до 50 мг и предпочтительно от 0,01 до 10 мг.
Индивидуумом, получающим фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, является испытуемый индивидуум, чей образец детектируется на наличие полинуклеотида по настоящему изобретению и/или полипептида по настоящему изобретению (то есть, пациент с раком, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению). Вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению, убивает клетки, которые приобрели канцерогенный потенциал за счет полинуклеотида по настоящему изобретению. Соответственно вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению, является средством, эффективным для лечения рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению.
Процесс подготовки соединения А, соединения В, соединения С, соединения Ό и соединения Е показан ниже. В следующих предложениях, ''Е81+'' представляет значение т/ζ в масс-спектрометрии (Е81 способа ионизации, (М+Н)+), ''АРС1/Е81+'' представляет значение т/ζ в масс-спектрометрии (одновременное измерение АРС1 и Е81 способа ионизации, (М+Н)+), ''ИМКГ' представляет δ (ррт) в 'Н-ЯМР в диметилсульфоксиде-б6, и ''ИМК2'' представляет δ (ррт) в 1Н-ЯМР в СИС13.
Подготовительный пример 1. Подготовка соединения А (1) Смесь метил-3,5-диметоксибензоата (1 г) и ацетонитрила (20 мл) охлаждали во льду, и к этому добавляли ^фтор-И'-(хлорметил) триэтилендиамин бис-(тетрафторборат) (4,09 г) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным соляным раствором, и к нему добавляли безводный сульфат натрия и основный силикагель, с последующим перемешиванием в течение 30 мин и затем фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат/гексан), для получения метил-2,6-дифтор-3,5-диметоксибензоата (292 мг). Е81+: 233.
(2) Смесь метил-2,6-дифтор-3,5-диметоксибензоата (10 г) и тетрагидрофурана (50 мл) охлаждали во льду, и к нему добавляли боргидрид лития (3,0 М раствор тетрагидрофурана, 43 мл), с последующим взбалтыванием при комнатной температуре в течение 65 ч. Реакционную смесь снова охлаждали во льду, и к нему дополнительно добавляли боргидрид лития (3,0 М раствор тетрагидрофурана, 14 мл), с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 22 ч. Реакционную смесь охлаждали во льду и медленно прибавляли в ледяную воду (300 мл). Далее, к этому медленно добавляли концентрированную соляную кислоту (25 мл), с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1 ч и экстрагированием толуол/этилацетатом (1:1). Органический слой промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить (2,6-дифтор-3,5-диметоксифенил)метанол (8,67 г). Е81+: 205.
(3) Смесь (2,6-дифтор-3,5-диметоксифенил)метанола (1,71 г), триэтиламина (2,57 мл) и тетрагидрофурана (34 мл) охлаждали во льду, и к ней добавляли метансульфохлорид (716 мкл), с последующим перемешиванием в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли воду, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения 2,6-дифтор-3,5-диметоксибензилметансульфоната (2,32 г).
ЯМР2: 3,04 (3Н, с), 3,88 (6Н, с), 5,34 (2Н, с), 6,72 (1Н, т, 1=8,2 Гц).
(4) К смеси 2-хлор-5-гидроксипиримидина (4,38 г), карбоната калия (9,27 г) и ^И-диметилформамида (79 мл) добавляли 2,6-дифтор-3,5-диметоксибензилметансульфонат (7,89 г), с последующим перемешиванием при 60°С в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли воду. Образованное твердое вещество собирали путем фильтрования, промывали водой и затем высушивали под пониженным давлением для получения 2-хлор-5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина (8,53 г).
АРС1/Е81+: 317.
(5) В атмосфере аргона к смеси 2-хлор-5-{2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина (1,03 г), 3-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]анилина (1,29 г), 1,1'-динафтил-2,2'-диил бис(дифенилфосфина) (609 мг), карбоната цезия (3,19 г) и диоксана (20,6 мл) добавляли ацетат палладия (146 мг) при комнатной температуре, с последующим перемешиванием при 100°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли воду, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом магния, а затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток промывали при помощи силика- 20 029140 гельной колоночной хроматографии (хлороформ/метанол/концентрированный водный аммиак), очищали при помощи основной силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат) и затем перекристаллизовывали с этилацетатом, а затем этанолом для получения 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-Ы-{3метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил) пиперидин-1-ил]фенил}пиримидин-2-амина (соединение А: 830 мг).
ЕБ1+: 585.
ЯМР1: 1,45-1,60 (2Н, м), 1,73-1,84 (2Н, м), 2,14 (3Н, с), 2,17-2,58 (11Н, м), 3,24-3,36 (2Н, м), 3,75 (3Н, с), 3,87 (6Н, с), 5,16 (2Н, с), 6,79 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 7,07 (1Н, т, 1=8,4 Гц), 7,24 (1Н, дд, 1=8,8, 2,4 Гц), 7,32 (1Н, д, 1=2,4 Гц), 8,29 (2Н, с), 9,21 (1Н, с).
Подготовительный пример 2. Подготовка соединения В (1) В атмосфере аргона к смеси 2-хлор-5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина (800 мг), подготовленного тем же способом, что в Примере подготовки 1(4), 2-(4-амино-1Н-пиразол-1ил)этанола (642 мг), 1,1'-динафтил-2,2'-диил бис-(дифенилфосфина) (472 мг), карбоната цезия (2,47 г) и диоксана (16 мл) добавляли ацетат палладия (113 мг) при комнатной температуре, с последующим перемешиванием при 100°С в течение 6 ч. К реакционной смеси добавляли воду и хлороформ, нерастворимые вещества отделяли фильтрованием с целитом, и фильтрат затем экстрагировали хлороформом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (хлороформ/метанол) для получения 2-[4-({5-[(2,6дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1Н-пиразол-1-ил]этанола (соединение В: 139 мг).
ЕБ1+: 408.
ЯМР1: 3,69 (2Н, дд, 1=11,0, 5,6 Гц), 3,87 (6Н, с), 4,07 (2Н, т, 1=5,6 Гц), 4,83 (1Н, т, 1=5,4 Гц), 5,14 (2Н, с), 7,07 (1Н, т, 1=8,4 Гц), 7,45 (1Н, д, 1=0,6 Гц), 7,88 (1Н, д, 1=0,6 Гц), 8,26 (2Н, с), 9,20 (1Н, с).
Подготовительный пример 3. Подготовка соединения С (1) В атмосфере аргона, к смеси 2-хлоро-5-[(2,6-дихлор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина (1,33 г), подготовленного тем же способом, что и в примере подготовки 1(4), 1-(тетрагидро-2Н-пиран-2ил)-1Н-пиразол-4-амин (913 мг), 1,1'-динафтил-2,2'-диил бис-(дифенилфосфина) (785 мг), карбоната цезия (4,11 г) и диоксана (26,6 мл) добавляли ацетат палладия (189 мг) при комнатной температуре, с последующим перемешиванием при 100°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли воду, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат/гексан) для получения 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-П-[1-(тетрагидро-2Н-пиран-2ил)-1Н-пиразол-4-ил]пиримидин-2-амина (1,73 г).
АРС1/ЕБ1+: 448.
(2) К смеси 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-Л-[1-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-пиразол-4-ил]пиримидин-2-амина (3,59 г) и метанола (20 мл) добавляли раствор 4 М хлористого водорода/диоксана (40 мл), с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 6 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и затем к остатку прибавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Образованные твердые вещества собирали путем фильтрации, промывали диэтиловым эфиром и высушивали при пониженном давлении для получения 5-[(2,6-дифтор-3,5диметоксибензил)окси]-Л-(1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-амина (2,9 г).
АРС1/ЕБ1+: 364.
(3) К смеси 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-П-(1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-амина (50 мг), карбоната калия (57 мг) и Х^диметилформамида (1 мл) добавляли [(4Б)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил]метил-4-метилбензолсульфоната (118 мг), с последующим перемешиванием при 60°С в течение 1 ч и при температуре 110°С в течение 4 дней. К реакционной смеси добавляли воду, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом магния и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток затем очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат/гексан), чтобы получить 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-П-(1-{ [(4К)-2,2-диметил1,3-диоксолан-4-ил]метил} -1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-амина (3 9 мг).
АРС1/ЕБ1+: 478.
(4) К смеси 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-Л-(1-{[(4К)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4ил]метил}-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-амина (45 мг) и тетрагидрофурана (2 мл) добавляли 1 М соляную кислоту (1 мл) с последующим перемешиванием при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия с последующей экстракцией хлороформом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (хлороформ/метанол) и затем загущали этилацетатом для получения (2К)-3-[4-({5-[2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1Н- 21 029140 пиразол-1-ил]пропан-1,2-диола (соединение С: 25 мг).
Е81+: 438.
ЯМР1: 3,23-3,38 (2Н, м), 3,72-3,80 (1Н, м), 3,84-3,9б (7Н, м), 4,15 (1Н, дд, 1=13,8, 4,1 Гц), 4,б7 (1Н, т, Л=5,б Гц), 4,91 (1Н, д, 1=5,3 Гц), 5,14 (2Н, с), 7,0б (1Н, т, 1=8,4 Гц), 7,45 (1Н, д, 1=0,б Гц), 7,87 (1Н, д, 1=0,б Гц), 8,2б (2Н, с), 9,21 (1Н, с).
Подготовительный пример 4. Подготовка соединения Ό (1) Таким же способом, что и в подготовке примера 1(5), с использованием 4-(4-метилпиперазин-1ил)анилина и 2-хлор-5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина, подготовленного тем же способом, что и в подготовке примера 1(4) в качестве исходного материала, был получен 5-[(2,б-дифтор3,5-диметоксибензил)окси]-^[4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]пиримидин-2-амин (соединение Ό).
Ε8Ι+: 472
ЯМР1: 2,21 (3Н, с), 2,41-2,48 (4Н, м), 2,98-3,08 (4Н, м), 3,87 (бН, с), 5,15 (2Н, с), б,81-б,90 (2Н, м), 7,07 (1Н, т, 1=8,4 Гц), 7,47-7,55 (2Н, м), 8,2б (2Н, с), 9,15 (1Н, с).
Подготовительный пример 5. Подготовка соединения Е (1) К смеси (1-метил-3-нитро-1Н-пиразол-5-ил)метанола (398 мг), 3,4-дигидро-2Н-пирана (459 мкл) и этилацетата (8 мл) добавляли р-толуолсульфокислоты моногидрат (9б мг) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Далее, к ней добавляли 3,4-дигидро-2Н-пиран (459 мкл) и р-толуолсульфокислоты моногидрат (9б мг), с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1,5 ч. К реакционной смеси добавляли воду, с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток затем очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (гексан/этилацетат), чтобы получить 1-метил-3-нитро-5-[(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил]-1Н-пиразол (487 мг).
АРС1/Е81+: 242.
(2) в атмосфере аргона, к смеси 1-метил-3-нитро-5-[ (тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил]-1Нпиразола (487 мг), тетрагидрофурана (4,9 мл) и этанола (4,9 мл) добавляли 10% палладий-углерода (50 мг). В атмосфере водорода смесь перемешивали в течение 12 ч, и нерастворимые материалы затем удаляли с помощью целитной фильтрации. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить 1-метил-5-[(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил]-1Н-пиразол-3-амин (42б мг).
АРС1/Е81+: 212.
(3) таким же образом, как в подготовительном примере 3(1), с использованием 1-метил-5[(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил]-1Н-пиразол-3-амина и 2-хлор-5-[(2,б-дихлор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидина, подготовленного тем же способом, как в подготовительном примере 1(4) в качестве исходных материалов, был получен 5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-^{1-метил-5-[(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил] -1Н-пиразол-3 -ил}пиримидин-2-амин.
АРС1/Е81+: 492.
(4) К смеси 5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-^{1-метил-5-[(тетрагидро-2Н-пиран-2-илокси)метил]-1Н-пиразол-3-ил}пиримидин-2-амина (70б мг) и метанола (8 мл) добавляли раствор 4 М хлористый водород/диоксан (8 мл ) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и затем к остатку прибавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, с последующей экстракцией хлороформом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Остаток очищали с помощью силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат/гексан), чтобы получить [3-({5-[ (2,б-дифтор-3,5диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1-метил-1Н-пиразол-5-ил]метанол (444 мг). Е81+: 408.
(5) Смесь [3-({5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1-метил-1Н-пиразол-5-ил]метанола (350 мг), триэтиламина (359 мкл), дихлорметана (7 мл) и тетрагидрофурана (7 мл) охлаждали во льду, и к ней добавляли метансульфонилхлорид (120 мкл), с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли воду и этилацетат, и образованное твердое вещество фильтровали и затем сушили при пониженном давлении, чтобы получить [3({5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1-метил-1Н-пиразол-5-ил]метилметансульфонат (218 мг).
ЯМР2: 2,9б (3Н, с), 3,85 (3Н, с), 3,89 (бН, с), 5,1б (2Н, с), 5,25 (2Н, с), б,б8 (1Н, т, 1=8,0 Гц), б,91 (1Н, с), 7,б3 (1Н, шир.с), 8,24 (2Н, с).
(6) К смеси [3-({5-[(2,б-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]пиримидин-2-ил}амино)-1-метил-1Н-пиразол-5-ил]метилметансульфоната (795 мг) и Ν-метилпирролидона (15,9 мл) добавляли 1-метилпиперазин (901 мкл), с последующим перемешивании при 80°С в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляли воду и насыщенный водный бикарбонат натрия, образованные твердые вещества собирали фильтрованием, и затем фильтрат экстрагировали хлороформом. Органический слой промывали насыщенным рассолом, сушили над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Затем, осадок и твердое вещество, собранное ранее путем фильтрования, очищали при помощи силикагельной колоночной хроматографии (хлороформ/метанол), а затем основной силикагельной колоночной хроматографии (этилацетат/метанол), а затем делали твердым при помо- 22 029140 щи этанола/диизопропилового эфира для получения 5-[(2,6-дифтор-3,5-диметоксибензил)окси]-Ы-{1метил-5-[(4-метилпиперазин-1-ил)метил]-1Н-пиразол-3-ил} пиримидин-2-амина (соединение Е: 168 мг).
Е81+: 490.
ЯМР1: 2,14 (3Н, с), 2,18-2,53 (8Н, м), 3,45 (2Н, с), 3,67 (3Н, с), 3,87 (6Н, с), 5,15 (2Н, с), 6,46 (1Н, с), 7,06 (1Н, т, 1=8,4 Гц), 8,26 (2Н, с), 9,42 (1Н, с).
Способ скрининга активного ингредиента фармацевтической композиции
Способ скрининга активного ингредиента фармацевтической композиции включает в себя [1] способ скрининга вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению и [2] способ скрининга средства для лечения рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению.
1. Способ скрининга вещества, ингибирующиго полипептид по настоящему изобретению (ингибирующиго активность и/или экспрессию полипептида по настоящему изобретению)
Способ скрининга вещества, ингибирующиго полипептид по настоящему изобретению, не является особенно ограниченным, при условии, что способ включает следующие этапы (ί)-(ίίί):
(ί) приведение тестируемого вещества в контакт с любым полипептидом по настоящему изобретению или клетками, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению; (ίί) анализ того, ингибируется ли полипептид; и (ίίί) отбор вещества, ингибирующего полипептид Способ скрининга включает следующие способы:
a. Способ скрининга типа ίη νίίΓο;
Способ скрининга вещества, ингибирующего активность полипептида по настоящему изобретению, включающий (1) приведение тестируемого вещества в контакт с полипептидом по настоящему изобретению, (2) анализ того, ингибируется ли активность полипептида и (3) отбор вещества, ингибирующего активность полипептида.
b. Способ скрининга клеточного типа
Способ скрининга вещества, ингибирующего активность полипептида по настоящему изобретению, включающий (1) приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению, (2) анализ того, ингибируется ли активность полипептида и (3) отбор вещества, ингибирующего активность полипептида.
c. Способ скрининга типа ингибирования экспрессии
Способ скрининга вещества, ингибирующего экспрессию полипептида по настоящему изобретению, включающий (1) приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению, (2) анализ того, ингибируется ли экспрессия полипептида и (3) отбор вещества, ингибирующего активность полипептида.
Каждый из способов скрининга будет описан ниже. Клетки, экспрессирующие полипептид по настоящему изобретению, включают клетки, которые природно экспрессируют полипептид по настоящему изобретению, и клетки, которые экспрессируют полипептид по настоящему изобретению в результате переноса генов в клетки при помощи вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему изобретению. Для клеток, экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению, предпочтительным является использование клеток, которые экспрессируют полипептид по настоящему изобретению в результате переноса генов в клетки при помощи вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему изобретению.
а. Способом скрининга типа ίη νίίτο
Способ скрининга типа ίη νίίτο включает стадии, в которых тестируемое вещество добавляют к и приводят в контакт с очищенным полипептидом по настоящему изобретению (стадия контакта); ингибирование активности полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом анализируется путем сравнения активности с активностью полипептида по настоящему изобретению, который не был приведен в контакт с тестируемым веществом (стадия анализа); и отбирают вещество, ингибирующее активность полипептида по настоящему изобретению (то есть, средство для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению).
В способе скрининга активной композиции фармацевтической композиции, в частности, например, каждую стадию выполняют, как показано ниже. После того, как тестируемое вещество добавляют к и приводят в контакт с очищенным полипептидом по настоящему изобретению, к этому добавляют АТФ и измеряют активность полипептида. В качестве контроля, очищенный полипептид смешивают с и приводят в контакт с носителем (например, ДМСО) тестируемого вещества, затем к нему добавляют АТФ и измеряют активность полипептида. В качестве фонового контроля может быть принято состояние, при котором добавление АТФ не осуществляется. После этого анализируют, ингибируется ли активность полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом. Ингибируется ли активность (то есть автофосфорилирующая активность) полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом, может быть определено путем анализа изменения уровня фосфорилирования тирозина полипептида по настоящему изобретению, которое вызвано тестируемым веществом. То есть если активность (то есть автофосфорилирующая активность) полипептида по настоящему изобретению дополнительно ингибиру- 23 029140 ется, когда тестируемое вещество добавляют к (приводят в контакт с) полипептиду, по сравнению со случаем, при котором к полипептиду добавляют контроль с носителем (приводят в контакт с), тестируемое вещество отбирают как вещество, ингибирующее активность полипептида по настоящему изобретению (то есть средство для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению). Способ скрининга типа ίη νίΐΓΟ по настоящему изобретению также включает способ скрининга, который выполняется таким же образом, как и выше, за исключением того, что в предыдущей стадии пептидный субстрат добавляется и смешивается с тестируемым веществом перед добавлением АТФ, а фосфорилирующая активность в отношении пептидного субстрата анализируется как активность полипептида по настоящему изобретению (то есть, ингибируется ли активность полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом, определяется путем анализа изменения уровня фосфорилирования пептидного субстрата, вызванного полипептидом по настоящему изобретению). С помощью вышеописанного способа вещество, которое ингибирует активность на 50% или в более высокой степени при концентрации до 10 мкМ, предпочтительно до 1 мкМ и более предпочтительно до 0,1 мкМ, выбирают в качестве вещества, ингибирующего активность полипептида по настоящему изобретению. Например, способ из примера 21 может использоваться в качестве способа скрининга типа ίη νίΐΓΟ по настоящему изобретению.
b. Способ скрининга клеточного типа
Способ скрининга клеточного типа включает способ, при котором клетки, экспрессирующие полипептид по настоящему изобретению, смешивают с (добавляют к) и приводят в контакт с тестируемым веществом (стадия контактирования); ингибируется ли активность полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом, анализируется путем сравнения активности с активностью полипептида по настоящему изобретению, который не был приведен в контакт с тестируемым веществом (стадия анализа); и отбирают вещество, ингибирующее активность полипептида по настоящему изобретению (то есть, средство для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению). В частности, например, способ можно выполнять, как показано ниже.
Сначала клетки, экспрессирующие полипептид по настоящему изобретению, приводят в контакт с каждым тестируемым веществом и контролем с носителем (например, ДМСО). Затем клетки культивируют в течение определенного периода времени, иммуноблотинг осуществляют с помощью широко известного способа 808-электрофореза с использованием лизата клеток, подготовленного путем лизирования культивируемых клеток, и антитела против фосфорилированного РОРК3 (например, Се11 8ί§ηα1ίη§ ТесЬпо1оду, 1пс.), с тем, чтобы определить активность (то есть автофосфорилирующую активность) полипептида по настоящему изобретению. Таким путем анализируют, ингибируется ли активность (то есть, автофосфорилирующая активность) полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом. Ингибируется ли активность полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом, можно определить путем анализа изменения уровня фосфорилирования тирозина полипептида по настоящему изобретению, вызванного тестируемым веществом. То есть, если активность полипептида по настоящему изобретению дополнительно ингибируется, когда тестируемое вещество добавляют к (приводят в контакт с) полипептиду по сравнению со случаем, при котором контроль с носителем добавляют к (приводят в контакт с) полипептиду, тестируемое вещество отбирают как вещество, ингибирующее активность полипептида по настоящему изобретению (то есть средство для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению).
c. Способ скрининга типа ингибирования экспрессии Способ скрининга типа ингибирования экспрессии включает в себя способ, при котором клетки, экспрессирующие полипептид по настоящему изобретению, смешивают с (добавляют к) и приводят в контакт с тестируемым веществом (стадия контактирования); ингибирование экспрессии полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом анализируют путем сравнения уровня экспрессии с тем, что наблюдалось, когда клетки не приводили в контакт с тестируемым веществом (стадия анализа); и выбирают вещество, ингибирующее экспрессию полипептида по настоящему изобретению (то есть, средство для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению). В частности, например, способ можно выполнять, как показано ниже.
Определенные клетки, экспрессирующие полипептид по настоящему изобретению, приводят в контакт с каждым из тестируемых веществ и контролем с носителем (например, ДМСО). После культивирования, готовят экстракт клеток, а затем с помощью экстракта анализируют, ингибируется ли экспрессия полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом. Ингибирование экспрессии полипептида по настоящему изобретению можно проанализировать подтверждением того, ингибируется ли экспрессия мРНК или белка полипептида по настоящему изобретению. Конкретнее, количество мРНК или белка полипептида по настоящему изобретению, присутствующего в клеточном экстракте, количественно определяют при помощи широко известного способа анализа уровня экспрессии, такого как нозерн- 24 029140 блоттинг, количественный ПЦР, иммуноблоттинг или ЕЫ8А. Об ингибировании экспрессии полипептида по настоящему изобретению тестируемым веществом можно судить, проанализировав изменение уровня экспрессии полипептида по настоящему изобретению, вызванное тестируемым веществом. То есть если уровень экспрессии (количество мРНК или белка) полипептида по настоящему изобретению дополнительно снижается в случае, когда полипептид приводится в контакт с тестируемым веществом, по сравнению со случаем, при котором полипептид приводится в контакт с контролем с носителем, тестируемое вещество отбирают в качестве вещества, ингибирующего экспрессию полипептида по настоящему изобретению (то есть, средства для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению).
2. Способ скрининга средства для лечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению
Способ скрининга вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению (ингибирование активности и/или экспрессии полипептида по настоящему изобретению) может быть использован в качестве способа скрининга средства для лечения рака (предпочтительно рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению. То есть способ скрининга средства для лечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, включает в себя стадии: ί), ίί) и ίίί) из вышеупомянутого 1 способа скрининга вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению.
Способ скрининга средства для лечения рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, предпочтительно дополнительно содержит стадию подтверждения, что выбранное тестируемое вещество проявляет терапевтическую активность в отношении рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, после стадии выбора вещества, ингибирующего полипептид по настоящему изобретению, путем анализа того, ингибирует ли тестируемое вещество полипептид по настоящему изобретению.
Стадия подтверждения факта, что выбранное тестируемое вещество проявляет терапевтическую активность против рака, который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению.
В качестве стадии подтверждения факта, что выбранное тестируемое вещество проявляет терапевтическую активность против рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, примером является стадия выполнения общеизвестного способа оценки или способа, созданного путем модификации способа оценки, например, стадия выполнения способа анализа, реализуемого путем обработки культивируемых клеток или животной опухолевой модели, экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению, выбранным веществом (''СНтса1 Опсо1оду, 211' е'Шоп, .Тарапеке 1оигпа1 о£ Сапсег ап' СЬетоШегару).
В качестве подходящих стадий подтверждения факта, что выбранное вещество проявляет терапевтическую активностью в отношении рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным либо по полинуклеотиду по настоящему изобретению, либо по полипептиду по настоящему изобретению, (1) стадия подтверждения факта, что выбранное тестируемое вещество проявляет активность по ингибированию пролиферации клеток и/или индуцированию гибели клеток с помощью полученных из рака человека (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря) раковых клеток, природно экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению, (2) стадия подтверждения факта, что выбранное тестируемое вещество проявляет ингибирующую активность в отношении анкориджнезависимого роста трансформированных клеток, вынужденных экспрессировать полипептид по настоящему изобретению, и/или (3) стадия подтверждения факта, что выбранное тестируемое вещество проявляет ингибирующую активность в отношении пролиферации опухоли, образованной путем прививания клеток, экспрессирующих полинуклеотид по настоящему изобретению, голой мыши.
В способе с использованием голой мыши можно использовать модель на опухоль-несущих животных, которая получается путем прививания раковых клеток, природно экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению, или клеток, трансформированных для вынужденной экспрессии полипептида по настоящему изобретению, на кожу или внутрь кожи животного, в брюшную полость животного или в каждом органе животного (например, голая мышь, перенесшая трансплантацию клеток МН3Т3, обуславливающих экспрессию полипептида по настоящему изобретению).
Тестируемое вещество, используемое в способе скрининга активного ингредиента фармацевтической композиции, не является особенно ограниченным. Примеры тестируемого вещества включают коммерчески доступные соединения (включая пептиды), различные широко известные соединения (включая пептиды), зарегистрированные в химическом реестре, группу соединений, полученных с помощью способов комбинаторной химии (Ν. ТеггеИ е1 а1., Эгид Όίκ^ν. То'ау, 4 (1) : 41, 1999), условную среду мик- 25 029140 роорганизмов, природные компоненты, полученные из растений или морепродуктов, экстракты тканей животных, двухцепочечные нуклеиновые кислоты, антитела, фрагменты антител и соединения (включая пептиды), полученные путем химически или биологически модифицированных соединений (включая пептиды), выбранных способом скрининга активного ингредиента фармацевтической композиции.
Примеры
Далее в настоящем документе настоящее изобретение подробно описывается с помощью примеров, однако настоящее изобретение не ограничивается примерами. В настоящем документе, если не указано иное, настоящее изобретение может осуществляться широко известным способом. Более того, когда используется коммерчески доступный реагент, набор и подобное, настоящее изобретение может осуществляться с помощью инструкции, прилагаемой к коммерчески доступным продуктам.
Пример 1. Выделение РСРК3-ТАСС3_у1
Двести клинических образцов рака легкого (А81егапй, США) были обратно транскрибированы в кДНК с обратной транскриптазы (Зирег5СГ1р1 III, ЬКе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп) и случайных праймеров (Капйот Рг1тег8, ЬИе ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп) в соответствии с протоколом из набора. Затем выполняли 30 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 10 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 1 мин и 30 с) с использованием праймеров РОРК3-ТАСС3_КТ_Р, представленного ЗЕО ГО N0: 7, и РОРК3-ТАСС3_КТ_К, представленного ЗЕО ГО N0: 8, кДНК, полученной как указано выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы (ТаКаКа Ех Тад: ТАКАКА В10 ГОС.). Далее, проводили 30 циклов ПЦРреакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 1 мин) с использованием продукта ПЦР-реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеров РОРК3ТАСС3_пе§1ей_Р, представленного ЗЕО ГО N0: 9, и РОРК3-ТАСС3_пе81ей_К представленной ЗЕО ГО N0: 10, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР, проводили электрофорез, и в результате был получен ПЦР продукт, состоящий из около 500 пар оснований (п.н.), только от образца Ь§344.
Затем, секвенирование ПЦР-продукта проводили дизезоксиспособом секвенирования (В1§Оуе Тегт1па!ог ν3.1 Сус1е Зесщепстд Κίΐ; ЬИе ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп). В результате было ясно показало, что ПЦР-продукт около 500 Ьр имеет последовательность, в которой 3'-конец экзона 18 кодирующей последовательности (далее, сокращенно СОЗ) гена РОРК3 (ЧМ_001163213.1). зарегистрированного в NСВI, был слит с 5'-концом экзона 11 СОЗ гена ТАСС3 (ЧМ_006342.1).
РНК-образец Ь§334, полученный от тканей рака легких пациента с плоскоклеточной карциномой легкого (А§1егапй, США) был обратно транскрибирован в кДНК при помощи обратной транскриптазы (Зирегкспр! III, Ы1е ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп) и олиго (ЙТ) праймера (0йдо (ЙТ) 20 рптег, Ы1е Тесйпо1ощех Согрогайоп) в соответствии с протоколом набора.
Затем выполняли 25 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с использованием праймеров РОРК3-ТАСС3_с1ошп§_Р, представленного ЗЕО ГО N0: 11, и РОРК3-ТАСС3_с1ошп§_К, представленного ЗЕО ГО N0: 12, кДНК, полученной как описано выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы (К0Э-р1и5 Уег. 2; Т0У0В0 С0., ЬТО.). Затем 25 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) проводили с использованием продукта ПЦР-реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймера РСРР3_ТАСС3_с1оп1п8_ВатН!_Р, представленного ЗЕО ГО N0: 13, и
РОРК3_ТАСС3_с1ошп§_ЕсоШ_К, представленного ЗЕО ГО N0: 14, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР, проводили электрофорез, получая тем самым ПЦР-продукта около 2,9 т.п.н. ПЦР-продукт был клонирован в вектор клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1ошп§ Κίΐ; Ьйе ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп), и секвенирование вставки выполняли дидезоксиспособом секвенирования (ВщОуе Тегт1па!ог ν3.1 Сус1е 20 Зесщепсйщ Κίΐ; ЫГе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп). В результате было ясно показало, что ПЦР-продукт около 2,9 т.п.н представляет собой продукт транскрипции (РСРР3-ТАСС3_у1) (ЗЕО ГО N0: 1), в котором последовательность от 5'-конца СОЗ до 3'-конца экзона 18 гена Р0РК3, зарегистрированного в NСВI (ЯМ_001163213.1) была слита с последовательностью от 5'-конца экзона 11 СОЗ до 3'-конца СОЗ гена ТАСС3 (ЯМ_006342.1). Полипептид, кодируемый ЗЕО ГО N0: 1, показан в ЗЕО ГО N0: 2.
Кроме того, чтобы экспрессировать полноразмерную 0КР РСРВ3-ТАС.’С.’3_у1 в качестве белка, вектор для клонирования подвергали ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью рестрикционного фермента ВатНЙ, и фрагмент ДНК, обработанный рестрикционным ферментом, был очищен. Кроме того, ферментативную реакцию проводили в течение 3 ч при 37°С с помощью ЕсоШ, при этом очищая фрагмент ДНК, обработанный с помощью рестрикционного фермента. Фрагменты ДНК, содержащие 0КР, были клонированы в положение между сайтом ВатНЙ и сайтом ЕсоШ, присутствующих в сайте для множественного клонирования вектора экспрессии (рМХк-риго; СохтоЫо Со., ЫЙ.), с образованием тем самым экспрессионной плазмиды (РОРК3-ТАСС3_у1/рМХ8-риго).
Пример 2. Выделение ΡΟΡΚ3-ΊΆ003_ν2
Пятьдесят девять клинических образцов рака мочевого пузыря (А§1егапй, США) были обратно транскрибированы в кДНК при помощи обратной транскриптазы (Зирег8сйр1 III, Ьйе ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп) и случайных праймеров (Капйот Рйте, Ьйе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп) в соответствии с протоколом из набора.
Затем выполняли 30 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 10 с, 55°С в течение 15
- 26 029140 с и 68°С в течение 1 мин и 30 с) с использованием праймеров из РОРК3_ТАСС3_КТ_Р, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 7, и РОРК3_ТАСС3_КТ_К, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 8, кДНК, полученной как указано выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы (ТаКаКа Ех Тад: ТАКАКА ΒΙ0 ГИС.). Далее, проводили 30 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 1 мин) с использованием продукта ПЦР реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеров РОРК3-ТАСС3_пе8(ей_Р, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 9, и РОРК3-ТАСС3_пе8(ей_К, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 10, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР проводили электрофорез, и в результате было подтверждено, что ПЦР-продукт около 600 п.н. был получен из образца Вй 106.
Затем, секвенирование ПЦР-продукта проводили дидезоксиспособом секвенирования (В|дЭуе ТегпипаЮг ν3.1 Сус1е δе^иеηс^ηд КН; ЫГе ТесНпо1од1С8 Согрогайоп). В результате было ясно показало, что ПЦР-продукт около 600 п.н. имеет последовательность, в которой 3'-конец экзона 18 ΡΌδ гена Р0РК3, зарегистрированного в NСΒI (ХМ_001163213.1), был слит с 5'-концом экзона 10 ί,Όδ гена ТАСС3 (ХМ_006342.1).
РНК-образец Вй106, полученный из ткани рака мочевого пузыря пациента с раком мочевого пузыря (Л81егапй. США), обратно транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы Мирег8спр1 ΙΙΙ, ЫГе ТесНпо1од1С8 Согрогайоп) и олиго (йТ) праймера (0йдо (йТ) 20 Рйтег, ЫГе ТесНпо1од1С8 Согрогайоп) в соответствии с протоколом из набора.
Затем были выполнены 25 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с использованием праймеров РОРК3-ТАСС3_с1отпд_Р, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 11, и РОРК3-ТАСС3_с1отпд_К, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 12, кДНК, полученной как указано выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы (К0О-р1и8 -Усг. 2; Т0У0В0 С0., ЙТЭ.). Затем, проводились 25 циклов реакции ПЦР (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с использованием продукта ПЦР-реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеров ΡΟΡΚ3-ТАСС3_с1оη^η§_ΒатΗI_Ρ, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 13, и ΡΟΡΚ3-ТАСС3_с1оη^η§_ΕсоΚI_Κ, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 14, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР проводили электрофорез, и в результате было подтверждено, что был получен ПЦРпродукта размером около 3,0 т.п.н. ПЦР-продукт был клонирован в вектор клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1отп§ Кй; ЫГе ТссНпо1од1С8 Согрогайоп), и секвенирование вставки было выполнено дидезоксиспособом секвенирования (ВфБуе ТегтйиЛог ν3.1 Сус1е δе^иеηс^η§ Кй; ЫГе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп). В результате было ясно показано, что ПЦР-продукт около 3,0 (т.п.н.) представляет собой продукт транскрипции (РОРК3-ТАСС3 ν2) (δΕΟ ΙΌ N0: 3), в котором последовательность от 5'-конца ίΌδ до 3'-конца экзона 18 в гене Р0РК3, зарегистрированном в NСΒI (ХМ_001163213.1), была слита с последовательностью от 5'-конца экзона 10 ίΌδ до 3'-конца ίΌδ гена ТАСС3 (ХМ_006342.1). Полипептид, кодируемый δΕΟ ΙΌ N0: 3, показан в δΕΟ ΙΌ N0: 4.
Кроме того, чтобы экспрессировать полноразмерную 0КР БСБК3-ТАС’С’3_у2 в качестве белка, вектор для клонирования подвергали ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью рестрикционного фермента ВатШ, и фрагмент ДНК, обработанной с помощью рестрикционного фермента, был очищен. Кроме того, ферментативную реакцию проводили в течение 3 ч при 37°С с помощью Ε^ΚΙ, затем очищали фрагмент ДНК, обработанной с помощью рестрикционного фермента. Фрагменты ДНК, содержащие 0КР, были клонированы в положение между сайтом ВатШ и сайтом Ε^ΚΙ, присутствующих в участке для множественного клонирования вектора экспрессии (рМХ8-риго; Со8тоЫо Со., Ый.), образуя тем самым экспрессионную плазмиду (БСБК3-ТАС’С’3_у2/рМХ8-риго).
Пример 3. Выделение РОРК3-ТАСС3^3
Пятьдесят девять клинических образцов рака мочевого пузыря (А8(егапй, США) обратно транскрибировали в кДНК при помощи обратной транскриптазы (δире^8С^^рι ΙΙΙ, ЫГе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп) и случайных праймеров (Капйот Рйтег8, ЫГе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп) в соответствии с протоколом из набора.
Затем были выполнены 30 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 10 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 1 мин и 30 с) с использованием праймеров РОРК3-ТАСС3_КТ_Р, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 7, и РОРК3-ТАСС3_КТ_К, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 8, кДНК, полученной как указано выше, в качестве матрицы и ДНК-полимеразы (ТаКаКа Εχ Тад: ТАКАКА ВЮ ЕЫС.). Далее проводили 30 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 1 мин) с использованием продукта ПЦР-реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеров РОРК3-ТАСС3_пе8(ей_Р, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 9, и РОРК3-ТАСС3_пе8(ей_К, представленного δΕΟ ΙΌ N0: 10, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР проводили электрофорез, и в результате было подтверждено, что ПЦР-продукт размером около 650 п.н. был получен из образца Вй021.
Затем, секвенирование ПЦР-продукта проводили дидезоксиспособом секвенирования (ВфБуе Тегт1па(ог ν3.1 Сус1с δе^иеηс^ηд Кй; ЫГе Тесйпо1од1е8 Согрогайоп). В результате, было ясно показано, что ПЦР-продукт около 650 п.н. имеет последовательность, в которой средняя последовательность экзона 19 ΕΌδ гена Р0РК3, зарегистрированного в NСΒI (ХМ_001163213.1), была слита с частью интрона 10-11 гена ТАСС3 и с 5'-концом экзона 11 ΕΌδ гена ТАСС3 (ХМ_006342.1).
- 27 029140
РНК-образец ВЙ021, полученный из ткани рака мочевого пузыря пациента с раком мочевого пузыря (ЛХегапй, США), был обратно транскрибирован с помощью обратной транскриптазы (§ирег5СГ1р1 III, П£е ТссНпо1од1С5 Согрогайоп) и олиго (ЙТ) праймера (0йдо (йТ) 20 ргнпег, П£е ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп) в соответствии с протоколом из набора.
Затем проводили 25 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с помощью праймеров ЕСЕК3-ТЛСС3_с1отп§_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 11, и ЕСЕК3-ТЛСС3_с1отп§_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 12, кДНК, полученной как указано выше, в качестве матрицы и ДНК-полимеразы (1<00-р1и5-Уег. 2; Т0У0В0 С0., ЬТО.). Затем, проводили 25 циклов ПЦР реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с использованием продукта ПЦР-реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеры ЕСЕК3-ТЛСС3_с1отп§_ВатН1_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 13, и ЕСЕК3ТАСС3_с1отп§_ЕсоК1_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 14, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР проводили электрофорез, и в результате было подтверждено, что был получен ПЦР-продукт около 3,0 т.п.н. ПЦР-продукт был клонирован в вектор клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1отп§ Κίΐ; Ы£е ТесНпо1од1е8 Согрогайоп), и секвенирование вставки было выполнено дидезоксиспособом секвенирования (ВЦОуе ТегпипаЮг ν3.1 Сус1е 8едиепстд Κίΐ; Ы1с ТесЬпо1од1е8 Согрогайоп). В результате было ясно показано, что в ПЦР-продукте около 3,0 (т.п.н.) существует продукт транскрипции (ЕСЕК3-ТЛСС3_\'3) (8ЕЦ ГО N0: 5), в котором последовательность 5'-конец СГО8 к середине экзона 19 гена РСРК3, зарегистрированного в NСВI (ХМ_001163213.1), была слита с частью интрона 10-11 гена ТАСС3 и с последовательностью протяженностью от 5'-конца экзона 11 СГО8 до 3'-конца СГО8 гена ТАСС3 (ХМ_006342.1). Полипептид, кодируемый 8ЕЦ ГО N0: 5, показан в 8ЕЦ ГО N0: 6.
Далее, чтобы экспрессировать полноразмерную 0КР ЕСЕК3-ТАСС3_\'3 как белок, вектор для клонирования подвергали ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью рестрикционного фермента ВатН1, и фрагмент ДНК, обработанный с помощью рестрикционного фермента, был очищен. Кроме того, ферментативную реакцию проводили в течение 3 ч при 37°С с помощью ЕсоК1, затем очищали фрагмент ДНК, обработанный с помощью рестрикционного фермента. Фрагменты ДНК, содержащие 0КЕ, были клонированы в положение между сайтом ВатН1 и сайтом ЕсоК1, присутствующих в участке для множественного клонирования вектора экспрессии (рМХк-риго; СохтоЫо Со., Ый.), образуя тем самым экспрессионную плазмиду (ЕСЕК3-ТЛСС3_\'3/рМХ5-риго).
Пример 4. Детектирование ЕСЕК3-ТЛСС3^1
Образцы кДНК были подготовлены из 200 РНК-образцов, полученных из клинических образцов рака легкого (ЛХегапй, США), а уровень экспрессии гена определяли путем проведения количественной ПЦР-реакции (условия реакции: 95°С в течение 10 мин, а затем 45 циклов реакции, состоящей из 95°С в течение 15 с и 59°С в течение 60 с) с использованием ЛррПей ВюдуХепъ 7900НТ 8у51ет, с помощью кДНК-образцов в качестве субстратов, ЕСЕК3-ТЛСС3(Е18Т11)_цРСК_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 15, и ЕСЕК3-ТЛСС3(Е18Т11)_цРСК_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 16 в качестве набора праймеров, и набора для количественного ПЦР (Р0^ЕК 8УВК Сгееп РСК МаХег Μίχ; БаГе ТесЬпо1од1е8 10 Согрогайоп). В результате, было подтверждено, что среди образцов рака легких амплификация произошла только в образце Ь§344. Кроме того, образцы кДНК были подготовлены из 59 РНК-образцов, полученных из клинических образцов рака мочевого пузыря (ЛХегапй, США), и количественный ПЦР проводили таким же образом, как и описано выше, используя кДНК в качестве субстрата. В результате, было подтверждено, что амплификация произошла в нескольких образцах.
Пример 5. Детектирование ЕСЕК3-ТЛСС3^2
Образцы кДНК были подготовлены из 59 РНК-образцов, полученных из клинических образцов рака легкого (ЛХегапй, США), а уровень экспрессии гена определяли путем проведения количественной ПЦРреакции (условия реакции: 95°С в течение 10 мин, затем 45 циклов реакции, состоящей из 95°С в течение 15 с и 59°С в течение 60 с) с использованием ЛррПей ВюдуХепъ 7900НТ 8у51ет, с помощью кДНК-проб в качестве субстратов, ЕСЕК3-ТЛСС3(Е18Т10)_цРСК_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 17, и ЕСЕК3ТЛСС3(Е18Т10)_цРСК_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 18, в виде набора праймеров и набора для количественного ПЦР (Р0\УЕК 8УВК Сгееп РСК МаХег Μίχ; ЬКе ТесПпо1од1е8 Согрогайоп). В результате, было подтверждено, что амплификация произошла в нескольких образцах рака мочевого пузыря.
Пример 6. Детектирование ЕСЕК3-ТЛСС3^3
Образцы кДНК были подготовлены из 59 РНК-образцов, полученных из клинических образцов рака легкого (ЛХегапй, США), а уровень экспрессии гена определяли путем проведения количественной ПЦРреакции (условия реакции: 95°С в течение 10 мин, а затем 45 циклов реакции, состоящей из 95°С в течение 15 с и 59°С в течение 60 с) с ЛррПей ВюдуХепъ 7900НТ 8у51ет, с помощью кДНК-образцов в качестве субстратов, ЕСЕК3-ТЛСС3(Е19Т11)_цРСК_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 19, и ЕСЕК3ТЛСС3(Е19Т11)_цРСК_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 20) в качестве набора праймеров, и набора для количественного ПЦР (Р0^ЕК 8УВК Сгееп РСК МаХег Μίχ; ЬКе ТесЬпо1од1е8 СогрогаПоп). В результате, было подтверждено, что амплификация произошла в нескольких образцах рака мочевого пузыря.
- 28 029140
Пример 7. Подготовка ретровирусного раствора РОРК3-ТАСС3_у1
С использованием реагента для трансфекции (ΡυΟЕNЕ (зарегистрированный товарный знак) ΗΌ, КосНе, ЬЙ.), клетки Р1айпит Е были трансфицированы 9 мкг РОРК3-ТАСС3_у1/рМХк-риго (пример 1). Через двадцать четыре часа после трансфекции, среда Ό-МЕМ (Он1Ьессо'к МойПей Еад1е Мейит; !ηνίйодеп), содержащая 10% бычьей сыворотки (N^сН^^е^ Вюкйепсек, йс.), была заменена, а обусловленную среду, образованную в течение 24 ч, собирали, подготавливая тем самым раствор ретровируса.
Пример 8. Проверка анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию клеток активности РОРК3ТАСС3_у1
Ро1уЬгепе (Ыдта-АйпсН Со, ЬЬС.) в концентрации 4 мкг/мл добавляли к раствору вируса, подготовленного в примере 7, используя РОРК3-ТАСС3_у1/рМХк-риго, и затем смесь добавляли к клеткам ΝΓΗ3Τ3 для инфицирования клеток. Через шесть ч после добавления раствора вируса среду заменяли на Ό-МЕМ, содержащую 10% бычьей сыворотки (№с1йге1 Вюкаепсек, йс.), и через день после заражения, среда была заменен на Ό-МЕМ ОпуПгодеп), содержащую 10% бычьей сыворотки (N^сН^^е^ Вюкйепсек, йс.) и 1 мкг/мл пуромицина (Ыдта-АйпсН Со, ЬЬС.). Клетки непрерывно культивируют в течение 4 недель при 37°С в присутствии 5% СО2, получая тем самым клетки №Н3Т3, стабильно экспрессирующие РОРК3-ТАСС3_у1 (обозначенные как клетки РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3).
В целях изучения анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию клеток активности клеток РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3, клетки РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3 и клетки №Н3Т3, инфицированные рМХк-риго как пустым вектором (клетки Моск/МН3Т3), соответственно засевают в 96луночный сфероидный планшет (Бнтйоп Се11-Т1дЫ БрЬегой 96И; БυМIΤΟМΟ ВАКЕЫТЕ ί.Ό., ЬТО.) с Ό-МЕМ (!пу11го8еп), содержащей 10% бычьей сыворотки (N^сН^^е^ Вюкйепсек, йс.), так, что число клеток в каждой лунке составляло 1х103. Клетки культивировали при 37°С в присутствии 5% СО2, число клеток в первый день (день 1) и четвертый день (день 4) после культивирования определяли с помощью реагента для измерения числа клеток (Се11Тйег-О1о™ Ьиттексей Се11 У1аЬНйу Аккау; Рготеда Согрогайоп) в соответствии со способом, описанным в руководстве. Для детекции был использован люминометр. Было подтверждено, что в то время как число клеток в клетках Моск/МН3Т3 не увеличилось со дня 1 по день 4, число клеток у клеток РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3 увеличилось примерно в 3,1 раза со дня 1 по день 4. Этот результат ясно показывает, что клетки РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/МН3Т3 приобрели активность анкоридж-независимой клеточной пролиферации.
Пример 9. Ингибирующее действие ингибитора слитого полипептида в отношении анкориджнезависимой клеточной пролиферативной активности клеток РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3
Определение анкоридж-независимой клеточной пролиферации (способ колоний или подобный), как известно, представляет собой систему изучения противоопухолевой активности (фармакологический эффект) соединения (СИп1са1 Οηсо1оду, 2'1 ейПоп, йрапеке 1оигпа1 о£ Сапсег апб СЬетойегару). В качестве способа определения пролиферации неприкрепленных клеток, который является альтернативой способа колоний, существует способ использования сфероидного планшета, описанного выше.
Клетки РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеккюп/№Н3Т3 засевали в 96-луночный сфероидный планшет (Битйоп Се11-Т1дЫ БрЬегой 96И; БυМIΤΟМΟ ВАКЕЫТЕ ί.Ό., ЬТЭ.) с Ό-МЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, так, что число клеток в каждой лунке составляло 1х 103. Кроме того, в качестве положительного контроля была подготовлена лунка, содержащая только среду. После того, как клетки культивировали в течение ночи при 37°С в присутствии 5% СО2, к ним добавляли довитиниб, ΑΖ^4547, и ВО1398 в конечной концентрации 100 нМ. В качестве отрицательного контроля, ДМСО в качестве носителя соединения был добавлен к этому в той же концентрации (0,1%), как было установлено во время добавления соединения. Затем клетки культивировали в течение 4 дней при 37°С в присутствии 5% СО2, и к ним добавляли реагент для определения количества клеток (Се11ТЬег-О1о™ Ьитшексей Се11 У1аЬй1у Аккау; Рготеда СогрогаЬоп). Результат перемешивали в течение 20 мин, и количество клеток измеряли с помощью люминометра. Степень ингибирования положительного контроля и отрицательного контроля рассматривалась как 100% и 0% соответственно для расчета степени ингибирования роста (%) каждого соединения. Как результат, степень ингибирования (%) довитиниба, ΑΖ^4547 и ВО1398 составляла 40%, 74% и 92% соответственно.
Вышеприведенные результаты показывают, что ингибитор слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 может ингибировать пролиферацию раковых клеток или опухолей, экспрессирующих РОРК3-ТАСС3_у1.
Кроме того, было установлено, что путем скринирования индивидуума, который, как предполагается, получит пользу от эффективности терапии с использованием полипептидного ингибитора по настоящему изобретению способом детектирования по настоящему изобретению, может предоставляться индивидуализированная медицинская практика.
Пример 10. Подготовка ретровирусного раствора РОРК3-ТАСС3_у2 и РОРК3-ТАСС3_у3
С помощью РОРК3-ТАСС3_у2/рМХк-риго и РОРК3-ТАСС3_у3/рМХк-риго, подготовленных в примерах 2 и 3, каждый ретровирусный раствор подготавливали в соответствии со способом примера 7.
Пример 11. Проверка анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию активности РОРК3ТАСС3_у2 и РОРК3-ТАСС3_у3
- 29 029140
С помощью вирусного раствора, подготовленного с использованием РСРК3-ТАСС3_у2/рМХ8-риго и РСРК3-ТАСС3_у3/рМХ8-риго в примере 10, клетки №Н3Т3, стабильно экспрессирующие РСРК3ТАСС3_у2 и РСРК3-ТАСС3_у3, были получены в соответствии со способом примера 8 (клетки были спроектированы как клетки РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/№Н3Т3 и клетки РСРК3-ТАСС3_у3 ехргек8юп/№Н3Т3 соответственно).
Для изучения анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию способности клеток РСРК3ТАСС3_у2 е\рге55юп/ШН3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 был использован тот же способ, что и в примере 8. Было подтверждено, что в то время как количество клеток у клеток Моск/№Н3Т3 не увеличилось со дня 1 по день 4, количество клеток у клеток РСРК3-ТАСС3_у2 ехргек8юп/№Н3Т3 увеличилось примерно в 2,8 раза со дня 1 по день 4. Кроме того, было подтверждено, что количество клеток у клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 клетки увеличилось примерно в 2,3 раза со дня 1 по день 4. Приведенные выше результаты ясно показывают, что клетки РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/№Н3Т3 и клетки РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 приобрели активность анкориджнезависимой клеточной пролиферации.
Пример 12. Ингибирующая активность полипептидного ингибитора по настоящему изобретению в отношении анкоридж-независимой клеточной пролиферативной активности клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/№Н3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3
Ингибирующая активность в отношении клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/ШН3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 оценивалась таким же образом, как и в Примере 9. Как результат, степень ингибирования (%) довитиниба, ΆΖΌ4547 и ВСГ398 в отношении клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге88юп/№Н3Т3 составила 21%, 60% и 90% соответственно. Более того, степень ингибирования (%) довитиниба, ΆΖ^4547 и ВСГ398 в отношении клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/ШН3Т3 составила 32%, 51% и 87% соответственно.
Вышеуказанные результаты показывают, что ингибитор слитого полипептида РСРК3-ТАСС3 может ингибировать пролиферацию раковых клеток или опухолей, экспрессирующих РСРК3-ТАСС3_у2 и РСРК3-ТАСС3_у3.
Кроме того, было установлено, что при помощи скринирования индивидуума, который, как предполагается, получит пользу от эффективности терапии с использованием ингибитора слитого полипептида РСРК3-ТАСС3 при помощи способа детектирования по настоящему изобретению, может предоставляться индивидуализированная медицинская практика.
Пример 13. Проверка анти-канцерогенной активности ингибитора слитого полипептида РСРК3ТАСС3 в отношении клеток РСРК3-ТАСС3_у1 е\рге55юп/№Н3Т3. клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге58юп/№Н3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3
Клетки РСРК3-ТАСС3_у1 еxр^е88^оп/NIН3Т3, суспендированные в фосфатном солевом буфере (ΡВδ), прививали в количестве 3х106 4-недельным самцам голых мышей сапп.С8-Ео\п1№.1/Сг1сг1] (№.1/№.1) (СЬаг1е8 Юуег ЬаЪогаЮпев, Япония) при помощи подкожных инъекций, проведенных в заднюю часть мышей. Через три дня после прививки начали введение ΆΖ^4547 и ВСР398, которые представляют собой ингибиторы слитого полипептида РСРК3-ТАСС3. Для теста, 4-5 мышей были отнесены к каждой из группы носителя и группы соединения, ΆΖ^4547 и ВСР398 суспендировали в носителе, составленном из 0,5% метилцеллюлозы (δΙιίπ-Εΐδΐι Скешюа1 Со., Ык.)/99,5% дистиллированной воды, и каждое из соединений перорально вводили в дозе 30 мг/кг. Введение проводили раз в день в течение 11 дней, и массу тела мышей и диаметр опухолей измеряли каждые 2 или 3 дня. Объем опухоли был рассчитан с использованием следующей формулы.
Объем опухоли (мм3) = [большая ось опухоли (мм)] х [малая ось опухоли (мм)]2 х 0,5.
Объем опухоли у группы носителя на дату первого введения соединения и на дату окончательного введения соединения считали как указание на 100%-ное ингибирование и 0%-ое ингибирование, чтобы рассчитать степень ингибирования ΆΖ^4547 и ВСГ398. В результате было подтверждено, что ΆΖ^4547 и ВС1398 ингибировали пролиферацию клеток РСРК3-ТАСС3_у1 е\рге55юп/ШН3Т3 (опухоли) на 51% и 90% соответственно. Анти-канцерогенную активность в отношении клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге58юп/№Н3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 проверяли таким же образом. В результате было подтверждено, что ΆΖ^4547 и ВСГ398 ингибировали пролиферацию клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/№Н3Т3 (опухоли) на 61% и 90% соответственно и ингибировали пролиферацию клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге55юп/№Н3Т3 (опухоли) на 73% и 88% соответственно.
Пример 14. Киназная ингибирующая активность, возникающая в результате введения ингибитора слитого полипептида РСРК3-ТАСС3 в отношении опухолей клеток РСРК3-ТАСС3_у1 е\рге55юп/№Н3Т3, клеток РСРК3-ТАСС3_у2 е\рге55юп/№Н3Т3 и клеток РСРК3-ТАСС3_у3 е\рге58юп/№Н3Т3
Как описано ниже, киназную ингибирующую активность ΆΖ^4 54 7 и ВСГ398 проверяли таким же образом, как в примере 13. Клетки РСРК3-ТАСС3_у1 е\рге55юп/№Н3Т3 прививали в количестве 3х106, и через три дня после прививки начинали введение ΆΖ^4547 и ВСГ398. Для теста, 5 мышей были отнесены к каждой из группы носителя и группы соединения, и через 4 ч после последнего введения опухоли
- 30 029140 были извлечены путем диссекции. После этого, с помощью раствора для лизиса (Се11 Ьук1к ВиГГег; Се11 δίβηαΐίη^ ТесБпо1оду, 1пс., РБокрБа1а/е шЫЬБог соскГаБ; ТБегто ЫкБег 8с1епБйс 1пс., Сотр1е1е; КосБе, Ы'.), были быстро подготовлены белковые экстракты из опухолей, и уровень общего РСРК3 и уровень фосфорилированного РСРК3 измеряли с помощью набора ЕЫ8А (Κ&Ό 8ук!етк). ЕЫ8А выполняли в соответствии с прилагаемым методическим руководством, но детектирование проводили другим способом, в котором проводится детектирование хемилюминесценции с использованием хемилюминесцентного реагента (ВМ СБетБиттексепсе ЕЫ8А 8иЬк1га1е; КосБе, Ы'.) и люминометра (АРУ0; Регк1пЕ1тег 1пс.).
Уровень, полученный путем корректировки уровня фосфорилированного РСРК3 с использованием уровня общего РСРК3 (уровень фосфорилированного РСРК3/уровень общего РСРК3), был принят за уровень фосфорилирования. Уровень фосфорилирования в группе носителя считался соответствующим 0% ингибирования, и абсолютное значение 0 рассматривался как 100%-ное ингибирование, тем самым вычисляя степень ингибирования авто-фосфорилирования тирозина в каждый группе соединений. В результате, было подтверждено, что в группе ΆΖΌ4547 и группе ВС1398 авто-фосфорилирование тирозина слитого полипептида РСРК3-ТЛСС3 ν1 в опухоли была снижена на 58% и 77% соответственно по сравнению с группой носителя.
Для клеток ЕСЕР3-ТАСС3_у2 е\ргеккюп/№Н3Т3 и клеток ЕСЕР3-ТАСС3_у3 е.\ргеккюп/№Н3Т3 исследование было выполнено таким же образом, что и описано выше. В результате было подтверждено, что в группе ΆΖΌ4547 и группе ВШ398 автофосфорилирование тирозина РСРК3-ТЛСС3^2 в опухоли было снижено на 54% и 66% соответственно и автофосфорилирование тирозина РСРК3-ТЛСС3^3 в опухоли было снижено на 78% и 85% соответственно по сравнению с группой носителя.
Исходя из этих результатов, было подтверждено, что антиканцерогенная активность ΆΖΌ4547 и ВС1398 в вышеописанной животной модели основывается на активности, ингибирующей киназную активность слитого полипептида РСРК3-ТЛСС3 в опухоли.
Пример 15. Выделение РСРК3-ТЛСС3_у1 из клеточной линии КТ-112, полученной от пациента с раком мочевого пузыря
Образцы РНК, очищенные из клеточной линии КТ-112, полученной от пациента с раком мочевого пузыря (приобретенные от ЕЫЬш/чпкБип ^8МΖ-^еиΐксБе 8атт1ип§ νоη М1кгоог§атктеп ип' Ζе11ки11игеп СтЬН), обратно транскрибировали в кДНК с использованием обратной транскриптазы (8ирегксг1р1 III, иГе ТесБпо1од1ек СогрогаБоп) и олиго ('Т) праймера (0Бдо ('Т) 20 Рптег, ЫГе ТесБпо1од1ек Согрогайоп), в соответствии с протоколом из набора.
Далее, 25 циклов ПЦР реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 60°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) были выполнены с использованием праймеров РСРК3-ТАСС3_с1ошпд_Р, представленного 8ЕЦ ГО N0: 11, и РСРК3-ТАСС3_с1ошпд_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 12, кДНК, полученной, как описано выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы (К0Э-р1ик-Уег. 2; Т0У0В0 С0., ЬТО.).
Затем, выполняли 25 циклов ПЦР реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) с использованием продукта ПЦР реакции, разбавленного в 10 раз, в качестве матрицы, праймеров ΡСΡК3_ТАСС3_с1ошη§_ВатНI_Ρ, представленного 8ЕЦ ГО N0: 13 и РСРК3 _ТАСС3_с1отпд_ЕсоК[_К, представленного 8ЕЦ ГО N0: 14, и той же ДНК-полимеразы. После реакции ПЦР проводили электрофорез, получая тем самым ПЦР-продукт около 2,9 т.п.н. ПЦР-продукт был клонирован в вектор для клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1ошп§ КБ; ЫГе ТесБпо1од1ек СогрогаБоп), и секвенирование вставки выполняли дидезоксиспособом секвенирования (В1§Пуе ТегпБпаЮг ν3.1 Сус1е 8есщепсищ КБ; ЫГе ТесБпо1од1ек СогрогаБоп). В результате было ясно показано, что ПЦР-продукт является таким же, как продукт транскрипции (РСРК3-ТАСС3_у1) (8ЕЦ ГО N0: 1), в котором последовательность от 5'-конца СГО8 до 3'-конца экзона 18 гена РСРК3, зарегистрированного в NСВI (ИМ_001163213.1), была слита с последовательностью от 5'-конца экзона 11 до 3'-конца СГО8 гена ТАСС3 (ИМ_006342.1).
Пример 16. Ингибирующее действие ингибитора слитого полипептида РСРК3-ТАСС3 в отношении анкоридж-независимой пролиферативной активности клеточной линии КТ-112, полученной от пациента с раком мочевого пузыря
Клетки КТ-112 засевали в 96-луночный сфероидный планшет (8итБоп Се11-ТщБ1 8рБего1' 96И; δυΜΓΓΘΜΘ ВАКЕЫТЕ С0., БТО.) в среду КРМI 1640, содержащую 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, так, что количество клеток в каждой лунке составлял 2х103. Кроме того, в качестве положительного контроля, была подготовлена лунка, в которую добавляли только среду. После того, как клетки культивировали на ночь при 37°С в присутствии 5% СО2, к ним добавляли довитиниб, ΑΖΌ4547 и ВС1398 в конечной концентрации 100 нМ. В качестве отрицательного контроля, ДМСО в качестве носителя соединения добавляли к этому в той же концентрации (0,1%) во время добавления соединения. Затем клетки культивировали в течение 5 дней при 37°С в присутствии 5% СО2, и к ним добавляли реагент для определения количества клеток (Се11ТБег-С1о™ ЫшипексеШ Се11 У1аЬББу Аккау; Рготеда СогрогаБоп). Полученное перемешивали в течение 20 мин, и количество клеток измеряли с помощью люминометра. Степень ингибирования для положительного контроля и отрицательного контроля рас- 31 029140 сматривалась как 100% и 0% соответственно для расчета степени ингибирования роста (%) для каждого соединения. В результате степень ингибирования (%) для довитиниба, ΑΖΌ4547 и ВОЙ398 составила 80%, 90% и 90% соответственно.
Пример 17. Детектирование слитого полипептида РОРВ3-ТАСС3
Способ детектирования слитого полипептида РОРВ3-ТАСС3 в клетках устанавливали, как следует ниже. Культивировали клетки РОРК3-ТАСС3_у1 с\ргс551оп/№Н3Т3 и клетки МН3Т3 в качестве отрицательного контроля. После промывки один раз в РВ8 клетки лизировали в течение 10 мин в растворе для лизиса (Сс11 Ьу515 ВиГГсг; Сс11 8фпаПпд ТссНпо1оду. 1пс., рНо5рНа1а/с иййЬког сосккай; ТНсгто Иккег 8οίспЬПс. 1пс., сотр1с1с; Воск Ый.) на льду. После центрифугирования к полученному лизату добавляли антитела против РОРВ3 (81дта-А1ййсЬ Со, РЬС.), и смесь инкубировали ночь при 4°С. После этого к нему добавляли бусы с белком О (Рто1сш О 8сркато5с 4 Ра51 Иоте; ''ОЕ НсакЬсагс), и иммунопреципитации проводили в течение 4 ч. После центрифугирования осадок промывали 4 раза раствором для промывки (имеющим тот же состав, что и вышеупомянутый раствор для лизиса), к нему добавляли раствор 8Ό8, и смесь кипятили в течение 5 мин и суспендировали осадки. После центрифугирования надосадочную жидкость подвергали иммуноблотингу с использованием антител против ТАСС3 (В&И 8у51ст5). Как результат, слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3 ν1 детектировали в иммунопреципитатах из клеток РОРВ3-ТАСС3_у1 с\ргс55юп/№Н3Т3, но слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3 ν1 не был обнаружен в клетках МН3Т3. Клетки РСРВ3-ТАСС3_у2 с\ртс551оп/М1Н3Т3 и клетки РСРВ3-ТАСС3_у3 с\ргс551оп/Ы1Н3Т3 проверяли таким же образом. Как результат, в иммунопреципитатах из клеток РОРВ3ТАСС3^2 с\ргс551оп/ШН3Т3 и клеток РСРВ3-ТАСС3_у3 с\ргс551оп/ШН3Т3 были обнаружены соответственно слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3 ν2 и слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3 ν3. Кроме того, клетки ВТ-112 были проверены таким же образом, и, как результат, был обнаружен слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3 ν1.
Приведенные выше результаты ясно показали, что с помощью антитела против РОРВ3 и антитела против ТАСС3 в комбинации, присутствие полипептида по настоящему изобретению в раковых клетках или раковой ткани, экспрессирующей слитый полипептид РОРВ3-ТАСС3, может быть обнаружен, и можно скринировать пациента, положительного по полипептиду по настоящему изобретению.
Пример 18. Детектирование слитого полинуклеотида РОРВ3-ТАСС3 (мРНК) в фиксированных в формалине залитых парафином (РРРЕ) срезах клеток РСРВ3-ТАСС3_у1 с\ргс551оп/№Н3Т3, клеток РСРВ3-ТАСС3_у2 с\ргс551оп/№Н3Т3 и клеток РСРВ3-ТАСС3_у3 с\ргс551оп/№Н3Т3 с помощью способа гибридизации ш 5Йи (18Н)
Клетки РСРВ3-ТАСС3_у1 с\ргс551оп/№Н3Т3, клетки РСРВ3-ТАСС3_у2 с\ргс55юп/№Н3Т3 и клетки РСРВ3-ТАСС3_у3 с\ргс551оп/№Н3Т3 подкожно прививали в количестве 3х106 4-недельным самцам голых мышей (САиЫ Сд-Ро\ п1ии/Ст1Сг1) (пи/пи), СЬат1с5 Вкст Ы1Ьога1опс5 йарап). Через 15 дней была подтверждена пролиферация клеточных кластеров, подготавливая тем самым опухоли-несущих мышей.
Из подготовленных опухоли-несущих мышей вырезали ткани, содержащие пролиферирующие раковые клетки. Ткани промывали физиологическим раствором, фиксировали при помощи 10% нейтрального забуференного раствора формалина (81дта-А1ййсЬ Со, ЬЬС.) в течение от 48 до 144 ч при комнатной температуре, обезвоживали в соответствии с традиционным способом с помощью прибора для автоматического погружения (Т155ис Тск νΐΡ, 8акига Ршйск йарап Со., Ый.) и затем заливали в парафин (Т155ис Ргср, РАЬМА Со., Ый.). Образцы ткани, залитые в парафин, нарезали с толщиной 5 мкм, подготавливая тем самым РРРЕ-срезы.
Подготовленные РРРЕ-срезы нагревали в течение 15 мин при 60°С в нагревательном блоке (МО2200; Токио ΒΙΚΑΚΙΚΑΙ С0., ЬТИ.) и фиксировали при помощи 10% формалина (\Уако Ригс 5 СЬсттса1 Ыйшй^, Ый.) в течение 30 мин при комнатной температуре. РРРЕ-срезы промывали 3 раза РВ8 (Ιτινί1годсп), высушивали и обрабатывали ксилолом (\Уако Ригс СЬсттса1 Ыйшй^, Ый.) в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого, РРРЕ-срезы промывали 3 раза РВ8 и кипятили в течение 10 мин при 100°С в растворе для предварительной обработки (АГГутс1г1\, 1пс). Затем, срезы промывали два раза очищенной водой и затем один раз РВ8, а затем обрабатывали раствором протеазы (АГГутс1г1\, 1пс.) в течение 20 мин при 40°С в инкубаторе (НуЬЕΖ НуЬпШ/айоп 8у51ст; Айуапссй Сс11 ^^адио5ί^С5). Затем срезы промывали 3 раза РВ8, фиксировали в 4% формалине (\Уако Ригс СЬсттса1 Ыйшй^, Ый.) в течение 5 мин при комнатной температуре и промывали 3 раза РВ8. Разветвленный ДНК-зонд (ОиапйСспс ^стеВИА РгоЬс 8с1 Турс 4; АГГутс1г1\, 1пс.), специфичный к нуклеотидным положениям от 2851 до 4281 в нуклеотидной последовательности гена РОРВ3 (Входящий номер ОспВапк: NМ_000142.3), который является общим для всех вариантов РОРВ3, и разветвленный ДНК-зонд (ОиапйСспс νίαχΒΗΑ РгоЬс 8с1 Турс 1; ΑГГутсι^^\. 1пс.), специфичный к нуклеотидным положениям от 2220 до 2838 в нуклеотидной последовательности гена ТАСС3 (Входящий номер ОспВапк: ИМ_006342.1), разводили разбавителем для набора зондов ЦТ (АГГутс1г1\, 1пс.) в 40 раз, тем самым подготавливая раствор для набора зондов. Раствор добавляли к РРРЕ-срезам, и гибридизовали с полинуклеотидом (мРНК) в течение 2 ч при 40°С в инкубаторе. Затем, РРРЕ-срезы промывали 3 раза промывочным буфером 1пс.) и подвергали реагированию с РтсАтрНйст Μί\ ЦТ (АГГутс1г1\, 1пс.) в течение 25 мин при 40°С в инкубаторе. Кроме того, РРРЕ-срезы промывали 3 раза промывочным буфером и подвергали реагированию с Атркйст Μί\
- 32 029140
ЦТ (АГГуте1г1\, 1пс.) в течение 15 мин при 40°С в инкубаторе. Срезы затем промывали 3 раза промывочным буфером и подвергали реагированию с ЬаЬе1 РгоЬе ЭйнеШ ЦТ (АйутеРтх, 1пс.), который содержал ЬаЬе1 РгоЬе Μίχ (Айутейтх, 1пс.) в количестве 1/25 по объему, в течение 30 мин при 40°С в инкубаторе. После этого срезы промывали два раза промывочным буфером и затем один раз РВЗ, и подвергали реагированию с РВЗ, содержащим флуоресцентный краситель ЭАР1 (АГГутейтх, 1пс.) в течение 15 мин при комнатной температуре. После промывки два раза с РВЗ, срезы инкапсулированы с помощью средства для инкапсуляции ЕсоМонШ (Вюсате Мебюа1, ЬЬС), и флуоресценцию этого наблюдали в конфокальный лазерный микроскоп (ЬЗМ700; Саг1 2е188). Во всех РРРЕ-срезах клеток ЕСЕК3-ТАСС3_у1 ехрге88Юп/№Н3Т3, клеток ЕСЕК3-ТАСС3_у2 ехрге88Юп/№Н3Т3 и клеток ЕСЕК3-ТАСС3_у3 ехртез8Юп/№Н3Т3 детектировали сигналы ЕСЕК3 и сигналы ТАСС3, и большинство сигналов ЕСЕК3 и сигналов ТАСС3 были колокализованы. Этот результат показал, что в ЕЕРЕ-срезе, содержащем клетки, принудительно экспрессирующие слитые гены ЕСЕК3-ТАСС3, сигналы ЕСЕК3 и сигналы ТАСС3 колокализованы.
Пример 19. Детектирование слитого полинуклеотида ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК) в клетках КТ-112 при помощи способа 1ЗН В соответствии с той же процедурой, что и в примере 18, были подготовлены ЕЕРЕобразцы клеток КТ-112 как клеточной линии, полученной от пациентов с раком мочевого пузыря, и клеток Н8С-39 как клеточной линии, полученной от пациентов с раком желудка, и выполняли детектирование слитого полинуклеотида ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК) при помощи способа 18Н. Образцы были обработаны способом, выполняемым после обработки с использованием нагревательного блока в Примере 18, и наблюдали флуоресценцию в инкапсулированных образцах. Полученные изображения анализировали с использованием ГО Се11 Апа1у/ег 2000 (СЕ НеаНйсаге). Как результат, в ЕЕРЕ-срезах клеток КТ-112 (пример 15), экспрессирующих ЕСЕК3-ТАСС3_у1, детектировали большое количество колокализованных сигналов ЕСЕК3 и ТАСС3, но в ЕЕРЕ-срезах клеток Н8С-39, в которых, как было подтверждено, не экспрессировался слитый полинуклеотид ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК) способом КТ-РСК, описанным в примере 23, колокализации сигналов ЕСЕК3 и ТАСС3 практически не детектировали. Эти результаты ясно показали, что в ЕЕРЕ-срезах, содержащих клетки, природно экспрессирующих слитый ген ЕСЕК3ТАСС3, сигналы ЕСЕК3 и сигналы ТАСС3 колокализованы, а в клетках, не экспрессирующих слитый ген ЕСЕК3-ТАСС3, сигналы не колокализованы. Это ясно показывает, что путем измерения таких колокализованных сигналов, можно определить наличие или отсутствие слитого гена ЕСЕК3-ТАСС3.
Пример 20. Детектирование слитого полинуклеотида (мРНК) ЕСЕК3-ТАСС3 в ЕЕРЕ-срезе, полученном от пациента с раком мочевого пузыря, путем 18Н-способа ЕЕРЕ-срезы тканей, полученных от пациентов с раком мочевого пузыря, которые были приобретены у А81егапб ИЗА, были обработаны способом, выполняемым после обработки с использованием нагревательного блока в примере 18, и наблюдали флуоресценцию инкапсулированных срезов. Полученные изображения анализировали с использованием ГО Се11 Апа1у/ег 2000 (СЕ НеаНйсаге). В результате было ясно показало, что количество колокализованных сигналов ЕСЕК3 и ТАСС3 является заметно большим в ЕЕРЕ-срезах, полученных от тканей пациентов с раком мочевого пузыря, который, как было подтверждено, экспрессирует ЕСЕК3ТАСС3_у2, с помощью способа КТ-РСК, описанного в примере 23, чем в ЕЕРЕ-срезах, полученных от тканей пациентов с раком мочевого пузыря, для которого не была подтверждена экспрессия слитого полинуклеотида ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК) с помощью способа КТ-РСК, описанного в примере 23.
Для ЕЕРЕ-срезов, полученных из тканей нескольких пациентов с раком мочевого пузыря, которые были приобретены из Т188ие Зо1ийоп8 ИК, колокализацию сигналов ЕСЕК3 и ТАСС3 проверяли тем же способом. В результате было ясно показало, что число колокализованных сигналов ЕСЕК3 и ТАСС3 заметно больше в ЕЕРЕ-срезах, полученных из тканей пациентов с раком мочевого пузыря, для которого экспрессия слитого полинуклеотида ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК) подтверждена с помощью способа КТ-РСК, описанного в примере 23, чем в ЕЕРЕ срезов, полученных из тканей пациентов с раком мочевого пузыря, для которого с помощью способа КТ-РСК, описанного в примере 23, подтверждено отсутствие экспрессии слитого полинуклеотида ЕСЕК3-ТАСС3 (мРНК).
Эти результаты ясно показали, что даже по ЕЕРЕ-срезам, полученным из тканей пациентов с раком мочевого пузыря, при помощи наблюдения колокализованных сигналов можно принять решение о наличии или отсутствии слитого гена ЕСЕК3-ТАСС3.
Пример 21. Ингибирующее действие соединений в отношении киназной активности слитого полипептида ЕСЕК3-ТАСС3 ίη уйго 1) Создание экспрессионных плазмид со слитым ЕЬАС-тегом (ЕСЕК3ТАСС3_у1 (N-Е^АС)/рс^NА3.1/Ζеο(+), ЕСЕК3-ТАСС3_\2(\-ЕЕАС.)/рс1)\АА1//ео(·) и ЕСЕК3ТАСС3_у3 (\-ЕЕАС.)/рс1)\АА1//ео ( + ))
Чтобы получить слитый полинуклеотид ЕСЕК3-ТАСС3, в котором ЕЬАС-тег был слит с 5'-концом, ПЦР-реакции для добавления ЕЬАС-тега к 5'-концу выполняли с помощью векторов, клонированных в примерах 1, 2 и 3, в качестве матрицы. 12 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) выполняли с использованием праймеров ЕСЕК3_N_Е^АС_ΒатНI, представленного ЗЕЦ ГО N0: 21, и ЕСЕК3_ТАСС3_с1отп§_ЕсоК1_К, представленного ЗЕО ГО N0: 14 и ДНК-полимеразы (К0Э-р1н8-Уег. 2; Т0У0В0 С0., БТЭ.). ПЦР-продукты были клонированы в вектор для клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1отп§ набор; Ьйе ТесЬпо1од1е8 Согрога- 33 029140
Поп), и секвенирование вставки было выполнено дидезоксиспособом секвенирования (ЫдЭуе ТегтшаЫг ν3.1 Сус1е Бесщепстд Κίΐ; ЫГе Тескпо1од1е8 Согрогайоп). В результате, было подтверждено, что ПЦРпродукты имеют последовательности нуклеиновых кислот, в которых 3 основания (АТО), кодирующие первый метионин, были удалены из последовательности, описанной в §ЕЦ ГО N0: 1, 8ЕЦ ГО N0: 3 и §ЕЦ ГО N0: 5, и последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕЦ ГО N0: 22), кодирующая инициирующий кодон и РЬАО, была добавлена к 5'-концу. Полипептиды, кодируемые ПЦР-продуктами, обозначены как слитый полипептид РОРК3-ТАСС3^1 Щ-РкАО), слитый полипептид РОРК3-ТАСС3^2 ЩРЬАО) и слитый полипептид РОРК3-ТАСС3_у3 Щ-РЬАО) соответственно, и они все вместе обозначены как слитые полипептиды РОРК3-ТАСС3 Щ-РЬАО). Для получения векторов экспрессии, которые экспрессируют, в качестве белка, полную длину 0КР из РОРК3-ТАСС3_у1 Щ-РкАО), РОРК3-ТАСС3^2 Щ-РЬАО) и РОРК3-ТАСС3^3 Щ-РкАО), к которым вышеупомянутая последовательность РЬАО была добавлена, ДНК-фрагмент, обработанный рестриктазой, который был получен путем воздействия на вышеописанный вектор для клонирования ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью рестрикционного фермента ВатН1, очищали, и очищали фрагмент ДНК, обработанный рестриктазой, который был получен путем воздействия на вышеописанный вектор для клонирования ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью ЕсоК1. Эти фрагменты ДНК, содержащие 0КР, были клонированы в положение между сайтом ВатН1 и сайтом ЕсоК1, присутствующих в участке для множественного клонирования вектора экспрессии (рс^NА3.1/Ζеο(+), ЫГе Тескпо1од1е8 Согрогайоп), образуя тем самым экспрессионные плазмиды (РОРК3-ТАСС3^1 (N-Р^АО)/рс^NА3.1/Ζеο(+), РОРК.3-ТАСС3_у2 (N-Р^А0)/рс^NА3.1 ^ео (+) и РСРК3-ТАСС3._у3 (N-Р^АО)/рс^NА3.1/Ζеο(+)).
2) Получение слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 Щ-РВАО) За день до выполнения трансфекции клетки НЕК293 культивировали в среде Ό-ΜΗΜ, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота на десяти покрытых коллагеном чашках диаметром 15 см, в количестве 0,5х107 на чашку. В день трансфекции, клетки НЕК293 трансфецировали РОРК3-ТАСС3^1 (N-Р^АО)/рс^NА3.1/Ζеο( + ), РОРК3-ТАСС3^2 (N-Р^АО)/рс^NА3.1/Ζеο ( + ) и РСРК3-ТАСС3_у3 (N-Р^АО)/рс^NА3.1/Ζеο (+), используя каждую плазмиду в количестве 27 мкг и 81 мкл реагента для трансфекции (РИОЕМЕ (зарегистрированный товарный знак) ΗΌ; Коске, Ый.) для каждой чашки. Через двадцать четыре часа после трансфекции среду удаляли, и клетки промывали 3 раза РВ§. Затем к этому добавляли 1 мл РВ§, клетки соскребали клеточным скребком (Согшпд 1псогрога!ей) и собирали в полипропиленовую пробирку. После удаления супернатанта центрифугированием в течение 5 мин при 1200 об/мин, клетки лизировали при инкубации на льду в течение 30 мин с 150 мкл раствора для клеточного лизиса (50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 150 мМ №С1, 1% №-40, 1 мМ ЭДТА, коктейль ингибиторов протеаз сотр1е1е (Коске-О1адпо8Йс8)). Каждый из слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у1 Щ-РкАО), слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у2 ЩРЬАО) и слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у3 Щ-РкАО) в надосадочной жидкости, полученной путем центрифугирования лизата клеток, очищали с использованием аффинного геля с М2-антителами (АОТ1-РЬАО Μ2 АГйпку Ое1; §1дта-А1ййск Со, ЬЬС.) в соответствии со способом, описанным в информации, прилагаемой к продукту. Для промывки и элюирования, промывочный раствор (50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 150 мМ №С1, 1% №-40, 1 мМ ЭДТА, коктейль ингибиторов протеаз сотр1е1е (КоскеЭ1адпо8Йс8) ) и элюент (20 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 10 мМ ΜдС12, 10 мМ ΜηС12, 0,5 мг/мл пептида РЬАО) использовались соответственно, получая таким образом 100 мкл элюата. Элюат подвергали иммуноблотингу и окрашиванию серебром с использованием антител против РОРК3 (Се11 81дпа1шд Тескпо1оду, 1пс.) и М2-антител против РЬАО (81дша-А1йг1ск Со, ЬЬС.), подтверждая тем самым, что был получен слитый полипептид РОРК3-ТАСС3^1 Щ-РкАО), слитый полипептид РОРК3-ТАСС3^2 Щ-РЬАО) и слитый полипептид РОРК3-ТАСС3^3 Щ-РЬАО).
3) Детектирование ш укго киназной активности слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 Щ-РкАО)
Активность фосфорилирования слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у1 Щ-РкАО), слитого полипептида РОРК.3-ТАСС3_у2 Щ-РЬАО) и слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у3 Щ-РкАО), которые очищали, как и описаны выше, в отношении пептидного субстрата исследовали с помощью набора для детектирования киназной активности (НТКР К1пЕА§Е-Т3; САЬю Вюаккаук). Использовали 384луночный черный планшет с малым объемом (Согшпд 1псогрога!ей), и использовали 1-кратно разбавленный раствор, 3-кратно разбавленный раствор или 10-кратно разбавленный раствор вышеописанного элюента соответственно в количестве 1 мкл в качестве источника фермента. Кроме того, реакционный раствор подготавливали путем добавления БЭТ и Μд2+ к 5х киназному буферу, входящему в набор, так, что его конечная концентрация стала 1 и 5 мМ соответственно. В качестве субстрата, субстрат ТК, входящий в набор, добавляли к планшету, так, что его конечная концентрация составляла 2,0 мкМ. Кроме того, в некоторые лунки не добавляли АТФ, в то время как в некоторые лунки добавляли АТФ, так что его конечная концентрация составляла 100 мкМ, и реакцию проводили в течение 1 ч при комнатной температуре, контролируя конечный объем, составляющий 5,0 мкл. После реакции, раствор 8а-ХЬ 665 и раствор ТК АпйЬойу-Еи (К) готовили способом, который предлагался в описании к набору, и каждый из этих растворов добавляли к лункам в количестве 2,5 мкл каждого, с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре, и детектировали счет НТКР (то есть фосфорилирование пептидного суб- 34 029140 страта). В результате было ясно показано, что при добавлении 1 мкл 1-кратно разбавленного раствора каждого элюата, содержащего слитый полипептид РОРК3-ТАСС3_у1 (Ν-РЬАО), слитый полипептид РОРК3-ТАСС3_у2 (Ν-РЬАО) или слитый полипептид РОРК3-ТАСС3_у3 (Ν-РЬАО,) в лунки с добавлением АТФ, счет НТКР был увеличен приблизительно в 38 раз, 40 раз и 38 раз соответственно, по сравнению с лунками без добавления АТФ; при добавлении 1 мкл 3-кратно разбавленного раствора элюата в лунки с добавлением АТФ, счет НТКР был увеличен примерно в 27 раз, в 34 раза и 31 раз соответственно; и при добавлении 1 мкл 10-кратно разбавленного раствора элюата в лунки с добавлением АТФ, счет НТКР был увеличен в 5 раз, в 18 раз и в 11 раз соответственно.
Как описано выше, использование набора для детектирования киназной активности позволило детектировать киназную активность ίη νίίτο слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 (Ν-РЬАО).
(4) Ингибирующая активность соединения в отношении киназной активности ίη νίίτο слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 (Ν-РЬАО)
Ингибирующее действие соединений довитиниба, ΛΖΌ4547, ВОР398 и ЬУ2874455 в отношении киназной активности ίη νίίτο слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у1 (Ν-РЬАО), слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у2 (Ν-РЬАО) и слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^3 (Ν-РЬАО) исследовали с помощью вышеописанного набора для детектирования киназной активности и такого же 384-луночного планшета, как описано выше. 1,0 мкл растворов соответствующих соединений добавляли в лунки, так что конечная концентрация ДМСО (в качестве растворителя) составляла на 0,1%, и конечная концентрация соединения довитиниб составляла 1 мкМ, 100 нМ и 10 нМ; конечная концентрация ΆΖΌ4547 и ВО1398 составляла 100 нМ, 10 нМ и 1 нМ соответственно; и конечная концентрация ЬУ2874455 составляла 10 нМ, 1 нМ и 0,1 нМ. Кроме того, в качестве контроля, в лунки добавляли только ДМСО, так что его концентрация составляла 0,1%. Кроме того, для слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^1 (Ν-РЬАО) использовали 1 мкл 2-кратно разбавленного раствора элюата; для слитого полипептида РОРК3ТАСС3_у2 (Ν-РЬАО) использовали 1 мкл 3-кратно разбавленного раствора элюата; и для слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^3 (Ν-РЬАО) использовали 1 мкл 3-кратно разбавленного раствора элюата. Затем, в качестве субстрата, субстрат ТК, входящий в набор, был добавлен в лунки, так что конечная концентрация его составляла 2,0 мкМ, и реакцию проводили в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого, в некоторые лунки не добавляли АТФ, в то время как в некоторые лунки добавляли АТФ, так что конечная концентрация этого составляла 100 мкМ, и реакцию проводили в течение 1 ч при комнатной температуре, контролируя конечный объем, составляющий 5,0 мкл. Кроме того, каждый из раствора 8а-ХЬ665 и раствора ТК АпЬЬобу-ЕИ (К), подготовленного таким же образом, что и в приведенном выше разделе (3), добавляли в лунки в количестве 2,5 мкл каждого, с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре, и детектировали счет НТКР. Счета фосфорилирования в лунках без добавления АТФ и в лунках с добавлением АТФ в отсутствии соединения (в данном случае ДМСО добавляли в концентрации 0,1%, в той же, что и в случае добавления соединения) считались как имеющие 100%-ное ингибирование и 0%-ное ингибирование соответственно, и степень ингибирования (%) соединений в отношении киназной активности слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у1 (Ν-РЬАО), слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^2 (Ν-РЬАО) и слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^3 (Ν-РЬАО) рассчитывали по следующей формуле.
Степень ингибирования киназной активности соединения (%) = (1-[счет фосфорилирования во время, когда соединение и АТФ добавляются - счет фосфорилирования во время, когда ни соединение, ни АТФ не добавлено]/[счет фосфорилирования в момент времени, когда АТФ добавляется, но соединение не добавляется - счет фосфорилирования в момент времени, когда ни соединение, ни АТФ не добавлено])х100
В результате, было обнаружено, что активность фосфорилирования очищенного слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^1 (Ν-РЬАО), слитого полипептида РОРК3-ТАСС3^2 (Ν-РЬАО) и слитого полипептида РОРК3-ТАСС3_у3 (Ν-РЬАО) в отношении пептидного субстрата ингибировалось соединениями довитиниба, ΆΖ^4547, ВОР398 и ЬУ2874455. Степень ингибирования (%) соответствующих соединений в соответствующих конечных концентрациях в отношении пептидного субстрата приведены в табл. 1.
- 35 029140
Таблица 1
| Соединение | Конечная концентрация | Ингибирование в отношении пептидного субстрата | ||
| ВСВЕЗ-ТАСС3 | ||||
| νΐ | ν2 | ν3 | ||
| Довитиниб | 1 мкМ | 94% | 94% | 93% |
| 100 нМ | 36% | 37% | 43% | |
| 10 нМ | 15% | 9% | 7% | |
| ΑΖΏ4547 | 100 нМ | 69% | 77% | 74% |
| 10 нМ | 46% | 50% | 52% | |
| 1 нМ | 13% | 16% | 9% | |
| ВСД398 | 100 нМ | 58% | 79% | 75% |
| 10 нМ | 47% | 44% | 38% | |
| 1 нМ | 26% | 8% | 13% | |
| ΣΥ2874455 | 10 нМ | 77% | 87% | 83% |
| 1 нМ | 46% | 64% | 57% | |
| 0, 1 нМ | 12% | 15% | 3% |
Пример 22. Активность БУ2874455, ингибирующая анкоридж-независимую клеточную пролиферацию в отношении клеток РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток РОРК3-ТАСС3_у2 ехргеззюпЖ1Н3Т3 и клеток РОРК3-ТАСС3_у3 ехргеззюп/№Н3Т3
Активность, ингибирующую анкоридж-независимую клеточную пролиферацию в отношении клеток РОРК3-ТАСС3_у1 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток РОРК3-ТАСС3_у2 ехргеззюп/№Н3Т3 и клеток ЕОЕК3ТАСС3_у3 ехргеззюпЖ1Н3Т3, оценивали таким же образом, как в примере 9, за исключением того, что конечная концентрация БУ2874455 контролировалась на уровне 10 нМ. Как результат, степень ингибирования (%) БУ2874455, как было подтверждено, составляла 88%, 90% и 89% соответственно.
Приведенные выше результаты показывают, что БУ2874455, которое представляет собой ингибитор слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3, может ингибировать пролиферацию раковых клеток или опухолей, экспрессирующих РОРК3-ТАСС3_у1, РОРК3-ТАСС3_у2 и РОРК3-ТАСС3_у3.
Пример 23. Выделение РОРК3-ТАСС3_у5а и РОРК3-ТАСС3_у5Ь из образца инвазивного рака мочевого пузыря человека
Образец инвазивного рака мочевого пузыря человека (Тхззие 8о1ийопз ϋΚ) обратно транскрибировали в кДНК с помощью набора обратной траскриптазы (8ирег 8сг1р( III Ейз! 8(гапб 8уп1йез13 8ирег М1х; ЫГе Тесйпо1од1ез Согрогайоп) с использованием праймера олиго-бТ.
Далее, осуществляли ПЦР-реакцию (условия реакции: 94°С в течение 2 мин, а затем 40 циклов реакции, состоящий из 98°С в течение 10 с и 68°С в течение 3,5 мин) с помощью праймера ЕОЕК3_Е002 (8ЕЦ ГО N0: 23), праймера ТАСС3_К002 (8ЕЦ ГО N0: 24), кДНК, полученной, как указано выше, в качестве матрицы и ДНК-полимеразы (Рпте8ТАК; ТАКАКА ΒΙ0 ШС.).
Эти праймеры соответствуют 5'-ϋΤΚ гена ЕОЕК3 и 3'-ϋΤΚ гена ТАСС3 соответственно. Соответственно, если слитый ген, составленный из ЕОЕК3 и ТАСС3, присутствует в образеце, можно было бы детектировать все слитые гены, независимо от варианта.
Полученный ПЦР-продукт был клонирован в вектор для клонирования (2его Ыипе! Т0Р0 РСК Кй; БИе ТесЕпо1од1ез Согрогабоп), и секвенирование вставки было выполнено дидезоксиспособом секвенирования (В1§Пуе ТегттаЮг ν3.Ι Сус1е 8едиепст§ Кй; БИе Тесйпо1од1ез Согрогабоп). В результате было ясно показало, что ПЦР-продукт был идентичен продукту транскрипции (ЕОЕК3-ТАСС3^5а), в котором последовательность от 5' СО8 до середины экзона 18 (от 257-го основания до 2498-го основания) гена ЕОЕК3, зарегистрированного в NСΒI (NМ_001163213.1), был слит с серединой экзона 7 СО8 гена ТАСС3 (от 1771-го основания до 2672-го основания в NМ_006342.1), за исключением одного основания (8ЕЦ ГО N0: 25). Положение одного основания представляло собой 1980-е основание гена ЕОЕК3, зарегистрированного в NСΒI (NМ_001163213.1). Несмотря на то, что основание было зарегистрировано как С, путем секвенирования было обнаружено, что это О. Кроме того, было ясно показано, что существует также продукт транскрипции (ЕОЕК3-ТАСС3^5Ь) (8ЕЦ ГО N0: 27), имеющий последовательность, из которой была удалена последовательность (от 690-го основания до 701-го основания) 3'-стороны экзона 4 гена ЕОЕК3 (№М_001163213.1), и в которую последовательность САО была встроена между экзоном 10 и экзоном 11. Полипептид, кодируемый 8ЕЦ ГО N0: 25, показан в 8ЕЦ ГО N0: 2 6, и полипептид, кодируемый 8ЕЦ ГО N0: 27, показан в 8ЕЦ ГО N0: 28.
Пример 24. Подготовка ретровирусного раствора ЕОЕК3-ТАСС3^5а и ЕОЕК3-ТАСС3^5Ь
Для экспрессии полноразмерных 0КЕ ЕОЕК3-ТАСС3^5а и ЕОЕК3-ТАСС3^5Ь в качестве белка, экспрессионные плазмиды для подготовки ретровирусного раствора были получены, как показано ниже. 15 циклов ПЦР-реакции (условия реакции: 98°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с и 68°С в течение 3 мин и 30 с) выполняли с помощью клонированных векторов, подготовленных в примере 23, в качестве матрицы соответственно, праймеров ЕОЕК3_ТАСС3_с1ошп§_ВатН1_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 7 и ЕОЕК3-ТАСС3_с1опт§_ЕсоК1_Е, представленного 8ЕЦ ГО N0: 8, и ДНК-полимеразы (К0П-р1из-Уег. 2;
- 36 029140
Τ0Υ0Β0 С0., БТЭ.). После реакции ПЦР проводили электрофорез, получая тем самым ПЦР-продукты, имеющие заданные размеры соответственно. ПЦР-продукты были клонированы в вектор для клонирования (ТОРО ХЬ РСК С1ошп§ набор; ЬИе ТесНпо1од1е5 СогрогаНоп), и секвенирование вставки было выполнено дидезокси способом секвенирования (В1§Эуе ТепшпаЮг ν3.1 Сус1е Зедиепсшд Κίΐ; Ы1е ТесНпо1оЦе5 Согрогайоп). В результате, было подтверждено, что каждый из продуктов ПЦР содержит 8ЕЦ ГО N0: 25 или 8ЕЦ ГО N0: 27. Для экспрессии полноразмерных 0КР РСРР3-ТЛСС3_\'5а и Р0РК3ТАСС3^5Ъ в качестве белка, очищали ДНК-фрагмент, обработанный рестрикционным ферментом, который был получен воздействием на вышеупомянутый вектор для клонирования ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью рестрикционного фермента ВатН1, и очищали фрагмент ДНК, обработанный рестрикционным ферментом, который был получен воздействием на вышеупомянутый вектор для клонирования ферментативной реакции в течение 3 ч при 37°С с помощью ЕсоК1. Фрагменты ДНК, содержащие 0КР, были клонированы в положение между сайтом ВатН1 и сайтом ЕсоК1, присутствующих в участке для множественного клонирования вектора экспрессии (рМХ5-риго; Со5шоЪю Со., ЬШ.), с получением таким образом экспрессионных плазмид (РОРК3-ТАСС3^5а/рМХ5-риго и Р0РК3Т ЛСС3_\'5Ъ/рМХ5-риго).
С помощью векторов, полученных как описано выше, ретровирусные растворы были подготовлены по методике Примера 7.
Пример 25. Проверка анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию активности Р0РК3ТЛСС3^5а и РОРК3-ТЛСС3^5Ъ
С помощью вирусных растворов, подготовленных в примере 24, с РСРР3-ТЛСС3_\'5а/рМХ5-риго и РСРР3-ТЛСС3_\'5Ъ/рМХ5-риго. клетки МН3Т3, стабильно экспрессирующие РОРК3-ТЛСС3^5а и РСРР3-ТАС.'С.'3_\'5Ъ. были получены в соответствии со способом Примера 8 (клетки были обозначены как клетки РСРР3-ТЛСС3_\'5а е\рге55юп/№Н3Т3 и клетки РСРР3-ТЛСС3_\'5Ъ е\рге55юп/№Н3Т3 соответственно).
Для проверки анкоридж-независимой ускоряющей пролиферацию активности клеток Р0РК3ТЛСС3_\'5а е\рге551оп/Ы1Н3Т3 и клеток РСРР3-ТЛСС3_\'5Ъ е\рге551оп/Х1Н3Т3, был использован тот же способ, что и в Примере 8. Было подтверждено, что несмотря на то, что количество клеток у клеток Моск/№Н3Т3 не возрасло с Дня 1 по День 4, количество клеток у клеток РСРР3-ТЛСС3_\'5а е\рге55юп/№Н3Т3 увеличилось примерно в 2,6 раза с дня 1 по день 4. Было также подтверждено, что количество клеток у клеток РСРР3-ТЛСС3_\'5Ъ е\рге55юп/№Н3Т3 увеличилось примерно в 2,7 раза с дня 1 по день 4. Эти результаты ясно показывают, что клетки РСРР3-ТЛСС3_\'5а ехрге55Юп/Ы1Н3Т3 и клетки РСРР3-ТЛСС3_\'5Ъ е\рге55Юп/№Н3Т3 демонстрируют анкоридж-независимую ускоряющую клеточную пролиферацию активность.
Пример 26. Детектирование слитого полипептида РОРК3-ТЛСС3 в фиксированном в формалине образце клеток РСРР3-ТЛСС3_\'1 е\рге55юп/№Н3Т3 при помощи способа иммуноокрашивания (1) Подготовка образца
Клетки РСРР3-ТЛСС3_\'1 е\рге55юп/№Н3Т3 и клетки МН3Т3, подготовленные в Примере 8, культивировали ночь на покровном стекле. На следующий день культуральную среду удаляли, а затем клетки фиксировали в 3,7% формальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре. После промывки РВ8, клетки обрабатывали 0,2% ТгПоп Х-100 (ШкаНц Те5дие) в течение 10 мин при комнатной температуре и затем обрабатывали 0,5% 8Ό8 в течение 25 мин при комнатной температуре. После промывки РВ8 клетки блокировали при помощи блокирующего раствора (01шк Вю5шепсе).
(2) Детектирование слитого полипептида-мишени
Образец, подготовленный в разделе (1), инкубировали при 4°С в течение ночи с антителами против Р0РК3 (хозяин: мышь, 5>ап1асги/ Вю!есЬпо1оду, 1пс.) и антителами против ТАСС3 (хозяин: коза, Κ&Ό 5>у51ет5), разбавленными Сап Се1 §1дпа1 1ттипо51аш 8о1ийоп А (Τ0Υ0Β0 С0., ЬТЭ.).
На следующий день, образец промывали промывочным буфером (0йпк Вю5аепсе). После этого, покровное стекло погружали в ЭноПпк шЗйи РЬА РгоЪе апй-Мои5е МГОИЗ и ЭиоПпк 1п8йи РЬА РгоЪе апП-Соа1 РЬИЗ (все производства 01тк Вю5аепсе), разбавленные в Сап Се1 §1дпа1 1шшцпо51ат 8о1ийоп А, в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки промывочным буфером А, образец погружали в Ыдайоп-Ы^е 8о1ийоп (01шк Вю5аепсе), включенный в набор реагентов ЭиоПпк II, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. На этой стадии образуется циклический олигонуклеотид между двумя видами антител 1п811и РЬА ргоЪе, находящихся в положениях достаточно близко друг к другу. После того, как образцы промывали промывочным буфером А, к нему добавляли АтрШгса1юп-Ро1утега5е 5о1и1юп (0Ппк Вю5аепсе), включенный в тот же набор, и образец инкубировали в течение 100 мин при 37°С. На этой стадии нуклеиновая кислота удлиняется с помощью циклических олигонуклеотидов в качестве матрицы, и флюоресцентно-меченый олигонуклеотид гибридизуется с удлиненной нуклеиновой кислотой. После промывки дважды промывочным буфером В (0йпк Вю5шепсе) и промывки один раз с помощью раствора, полученного путем разбавления промывочного буфера В водой в 100 раз, образец помещали в ЭиоПпк МоипИпд Мебшш с ЭАР1 (0Нпк Вю5аепсе), и его флуоресценцию наблюдали при помощи конфокального лазерного микроскопа (Б8М700; Саг1 2е155). В клетках РОРК3-ТАСС3^1 е\рге55юп/№Н3Т3, наблюдались клетки, имеющие большое количество флуоресцентных точек. Наоборот, в
- 37 029140 клетках №Н3Т3 флуоресцентная точка практически не наблюдалась. Флуоресцентная точка является результатом флуоресцентно меченых олигонуклеотидов, гибридизовавшихся с нуклеиновой кислотой, которая была элонгирована с помощью циклического олигонуклеотида в качестве матрицы, и наблюдается тогда, когда два вида антигенов, то есть, РОРК3 и ТАСС3 находятся в состоянии достаточно близкого расположения друг к другу, то есть в состоянии нахождения в одной и той же молекуле. Соответственно было подтверждено, что путем наблюдения за присутствием флуоресцентной точки при помощи способа из настоящего примера, можно определить (обнаружить) наличие или отсутствие слитого полипептида Р ОРК3 -Т ЛСО3.
Пример 27. Детектирование слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 в фиксированных в формалине погруженных в парафин (РРРЕ) образце клеток КТ-112 при помощи способа иммуноокрашивания (1) Подготовка образца
РРРЕ-образцы клеток КТ-112, экспрессирующих РОРК3-ТАСС3^1, и клеток Н8С-39, не экспрессирующих РОРК3-ТАСС3_у1, которые были подготовлены в примере 19, погружали по 3 раза в каждый из ксилола и этанола соответственно, в течение 8 мин, чтобы удалить парафин, а затем образцы смачивали в Нпшипохауег (N18801 ЕМ Сотротайоп) и кипятили. После промывки РВ8, срезы обрабатывали 0,2% Тгйоп Х-100 в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого срезы промывали РВ8, и выполняли блокирование с использованием Рто1еш В1оск 8егит-Ргее (Эако).
(2) Детектирование слитого полипептида-мишени
В соответствии с той же процедурой, что и в разделе (2) примера 26, детектирование проводили с помощью способа иммуноокрашивания, и наблюдалась флуоресценция образца. В клетках КТ-112, экспрессирующих РСРК3-ТАСС3_у1, наблюдалось большое количество флуоресцентных точек. Наоборот, в клетках Н8О-39, не экспрессирующих РСРК3-ТАСС3_у1, такие флуоресцентные точки практически не наблюдались. Соответственно было подтверждено, что путем наблюдения флуоресцентных точек в РРРЕ-срезе, содержащем клетки, природно экспрессирующие слитый ген РОРК3-ТАСС3, можно определить (обнаружить) наличие или отсутствие слитого полипептида РОРК3-ТАСС3.
Пример 28. Детектирование слитого полипептида РОРК3-ТАСС3 в РРРЕ-срезах, полученных от пациентов с раком мочевого пузыря, при помощи иммуноокрашивания (1) Подготовка образца
РРРЕ-срезы клинических образцов рака мочевого пузыря, которые были приобретены от Т188ие 8о1иРоп8 ИК, погружались по 3 раза в каждый из ксилола и этанола соответственно в течение 8 мин, чтобы удалить парафин, а затем срез обмакивали в 1тпшпо8ауег (N18801 ЕМ Сотротайоп) и кипятили. РРРЕсрезы промывали раствором МНН-0 и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин с 3% водным раствором перекиси водорода. После промывки РВ8, срезы обрабатывали 0,2% Тгйоп X100 в течение 10 мин при комнатной температуре, и затем обрабатывали раствором 0,5% 8Ό8 в течение 20 мин. После этого срезы промывали РВ8, и блокировка была выполнена с использованием Рто1еш В1оск 8еглт-Ргее (Эако).
(2) Детектирование слитого полипептида-мишени РРРЕ-срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с антителами РОРК3 (хозяин: мышь, 8ап1асгп/ В1о1есЬпо1оду, 1пс.) и антителами ТАСС3 (хозяин: коза, Ρ&Ό 8у81ет8), разбавленными Сап Ое1 8щпа1 1ттипо81аш 8о1ийоп А (Т0У0В0 С0., ЬТО.).
На следующий день, срезы промывали промывочным буфером (01шк Вю8с1епсе). После этого, РРРЕ-срезы погружали в ЭпоРпк ш8Ьи РЬА РгоЬе апИ-Моше МГЫи8 и ЭпоРпк 1п8Ьи РЬА РгоЬе апНСоа1 РЬИ8 (все производства 0Ппк Вю8с1епсе), разбавленного Сап Ое! 81дпа1 1ттипо81атп 8о1ийоп А, в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки промывочным буфером, срезы смачивали в Пдайоп-Е1§а8е 8о1ийоп (00пк Вю8с1епсе), включенные в набор реагентов ЭпоРпк II ВйдЫ йе1', и выдерживали в течение 30 мин при 37°С. На этой стадии формируется циклический олигонуклеотид, как описано в примерах 26 и 27. После промывки промывочным буфером А, срезы инкубировали в течение 120 мин при 37°С в Атрййсайоп Ро1утега8е 8о1ийоп (0Нпк Вю8с1епсе), включенном в тот же набор. На этой стадии, нуклеиновую кислоту удлиняют с помощью циклического олигонуклеотида в качестве матрицы. После промывки промывочным буфером А срезы смачивали в Ое1есйоп ВйдЫ Р1е1' 8о1ийоп, включенном в тот же набор, в течение 1 ч при комнатной температуре. На этой стадии олигонуклеотид, меченный пероксидазой хрена (НКР), гибридизуется с нуклеиновой кислотой, удлиненной в предыдущей стадии. После промывки промывочным буфером А, к срезам добавляли раствор субстрата, включенного в тот же набор, и подвергали реагированию в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Затем, после промывки раствором МПП-О, к срезам добавляли Бпс1еаг 81атп 8о1ийоп, включенный в тот же набор, и подвергали реагированию в течение 2 мин при комнатной температуре и промывали водопроводной водой. Затем, после обезвоживания и прояснения с помощью этанола и ксилола, срезы были инкапсулированы.
В результате проведения наблюдения с высокой освещенностью при помощи микроскопа (ΈΖ-9000; КЕУЕБСЕ Со., Ы'.), в РРРЕ-срезе, полученном из тканей пациентов с раком мочевого пузыря, который, как было подтверждено, экспрессирует РОРК3-ТАСС3_у1 по способу примера 23, наблюдали части, окрашенные в красный цвет. Наоборот, в срезе, полученном из тканей пациентов, которые, как было подтверждено, не экспрессируют слитый ген, составленный из РОРК3 и ТАСС3, по способу примера 23,
- 38 029140 частей, окрашенных в красный цвет, не наблюдали. Части, окрашенные в красный цвет, возникали в результате НКР-меченого олигонуклеотида, гибридизующегося с нуклеиновой кислотой, которая была удлинена с помощью циклических олигонуклеотидов в качестве матрицы, и наблюдались, когда ЕОЕК3 и ТАСС3 присутствуют в одной и той же молекуле, как описано в примерах 26 и 27. Соответственно было подтверждено, что в срезе, в котором наблюдались части, окрашенные в красный цвет, ЕОЕК3 и ТАСС3 присутствуют в состоянии слияния друг с другом. Следовательно, было подтверждено, что даже в ЕЕРЕсрезе, полученном из тканей пациентов с раком мочевого пузыря, путем наблюдения частей, окрашенных в красный цвет, можно определить (детектировать) наличие или отсутствие слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3.
Пример 29. Ингибирующая активность соединений А, В, С, И и Е в отношении киназной активности ίη νίίΓΟ слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3 (Ν-ЕБАО)
В соответствии с способом раздела (4) примера 21, проверяли ингибирующую активность соединений А, В, С, И и Е в отношении киназной активности ίη νίίΓΟ слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3_у1 (ΝЕБАО), слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3^2 (Ν-ЕБАО) и слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3^3 (Ν-ЕБАО). В настоящем документе каждое из соединений добавляли таким образом, чтобы их конечная концентрация составляла 100 нМ, 10 нМ и 1 нМ.
В результате, было обнаружено, что фосфорилирующая активность очищенного слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3^1 (Ν-ЕБАО), слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3^2 (Ν-ЕБАО) и слитого полипептида ЕОЕК3-ТАСС3^3 (Ν-ЕБАО) в отношении пептидного субстрата ингибировалась соединениями А, В, С, И и Е. Степень ингибирования (%) соответствующих соединений в соответствующих конечных концентрациях в отношении пептидного субстрата приведены в табл. 2.
_ Таблица 2
| Соединение | Конечная концентрация | Ингибирование в отношении пептидного субстрата | ||
| ЕСЕНЗ-ТАССЗ | ||||
| νΐ | ν2 | ν3 | ||
| А | 100 нМ | 92% | 94% | 93% |
| 10 нМ | 77% | 86% | 85% | |
| 1 нМ | 49% | 33% | 47% | |
| В | 100 нМ | 92% | 94% | 96% |
| 10 нМ | 79% | 74% | 81% | |
| 1 нМ | 28% | 24% | 35% | |
| С | 100 нМ | 95% | 95% | 96% |
| 10 нМ | 79% | 73% | 86% | |
| 1 нМ | 31% | 22% | 41% | |
| ϋ | 100 нМ | 94% | 95% | 97% |
| 10 нМ | 80% | 80% | 85% | |
| 1 нМ | 34% | 27% | 45% | |
| Е | 100 нМ | 86% | 78% | 91% |
| 10 нМ | 40% | 25% | 55% | |
| 1 нМ | 7% | 6% | 30% |
Пример 30. Анкоридж-независимая ингибирующая клеточную пролиферацию активность соединений А, В, С, И и Е в отношении клеток 1;О1;Н3-ТАСС3_\4 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^2 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^3 ехргеззюп/№Н3Т3 и клеточных линий КТ-112, полученных от пациента с раком мочевого пузыря
Клетки 1;О1;К3-ТАСС3_\4 ехргеззюп/№Н3Т3, клетки ЕОЕК3-ТАСС3^2 ехргеззюаЖ1Н3Т3 и клетки ЕОЕК3-ТАСС3^3 ехргеззюп/№Н3Т3 засевали с использованием той же среды, что и в Примере 9. Клеточную линию КТ-112, полученную от пациентов с раком мочевого пузыря, засевали с использованием среды КРМ11640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ Б-глутамина, так что количество клеток на лунку составляло 1 х 103. Кроме того, соответствующие соединения добавляли таким образом, что их конечная концентрация составляло 100 нМ, 10 нМ и 1 нМ. Были созданы условия, отличные от этих, такие же, как в способе Примера 9, и оценивали ингибирующую активность соединений А, В, С, И и Е в отношении пролиферации клеток 1;О1;К3-ТАСС3_\4 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^2 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^3 ехргеззюп/№Н3Т3 и клеточной линии КТ-112, полученной от пациента с раком мочевого пузыря. В результате, было обнаружено, что анкоридж-независимая ускоряющая пролиферацию активность клеток ЕОЕК3-ТАСС3_у1 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^2 ехргеззюп/№Н3Т3, клеток ЕОЕК3-ТАСС3^3 ехргеззюп/№Н3Т3 и клеточной линии КТ-112, полученной от пациента с раком мочевого пузыря, ингибировалась соединениями А, В, С, И и Е. Степень ингибирования (%) соответствующих соединений в соответствующих конечных концентрациях в отношении роста клеток показана в табл. 3.
- 39 029140
Приведенные выше результаты ясно показывают, что пролиферация раковых клеток или опухолей, экспрессирующих 1;ОГК3-ТЛСС3 ν1. ΡΟΡΚ3-ΤΑ^3_ν2 и ΡΟΡΚ3-ΤΑ^3_ν3, может ингибироваться соединениями А, В, С, Ό, Е и Р.
Таблица 3
| Пример | νί | ν2 | ν3 | НТ-112 | |
| А | 100 нМ | 92% | 91% | 91% | 90% |
| 10 нМ | 84% | 79% | 78% | 83% | |
| 1 нМ | 22% | 21% | 20% | 29% | |
| В | 100 нМ | 91% | 91% | 87% | 89% |
| 10 нМ | 53% | 42% | 32% | 77% | |
| 1 нМ | 4% | 2% | 3% | 23% | |
| С | 100 нМ | 91% | 90% | 86% | 89% |
| 10 нМ | 44% | 31% | 24% | 72% | |
| 1 нМ | 5% | 0% | 3% | 21% | |
| ϋ | 100 нМ | 90% | 88% | 89% | 89% |
| 10 нМ | 84% | 79% | 79% | 80% | |
| 1 нМ | 26% | 23% | 25% | 23% | |
| Е | 100 нМ | 84% | 79% | 81% | 81% |
| 10 нМ | 28% | 29% | 20% | 33% | |
| 1 нМ | 7% | 11% | 6% | 5% |
Промышленная применимость
Способ детектирования по настоящему изобретению может применяться для определения пациента, положительного либо по слитому гену по настоящей спецификации, либо по полипептиду по настоящему изобретению. Кроме того, в способе детектирования можно использовать набор для детектирования, набор праймеров и набор зондов по настоящему изобретению. Более того, вещество, ингибирующее полипептид по настоящему изобретению, может применяться в качестве фармацевтической композиции для лечения рака (в частности, рака легких или рака мочевого пузыря), который является положительным по слитому гену, составленному из гена РОРК3 и гена ТАСС3, или по полипептиду по настоящему изобретению.
Свободный текст перечня последовательностей
Раздел с номером <223> в следующем перечне последовательностей включает описание ''Искусственной последовательности''. В частности, каждая из нуклеотидных последовательностей, представленных БЕр ГО N0:13, БЕр ГО N0: 14 и БЕр ГО N0: 21 перечня последовательностей, представляет собой искусственно синтезированную последовательность праймера. Нуклеотидная последовательность, представленная БЕр ГО N0: 22 перечня последовательностей, представляет собой искусственно синтезированную последовательность Ρ^ΑО тега.
- 40 029140
Список последовательностей
| <110> | Азсе!!аз РЬагта 1пс. |
| <120> | НОВЫЙ СЛИТЫЙ РСРКЗ |
| <130> | А13008А00 |
| <150> <151> | ЗР2012-052147 2012-03-08 |
| <150> <151> | ЗР2012-195451 2012-09-05 |
| <150> <151> | ЗР2О12-28О325 2012-12-21 |
| <160> | 28 |
| <170> | Расепст уегзтоп 3.5 |
| <210> <211> <212> <213> | 1 2856 Днк ното зартепз |
| <220> <221> <222> | С05 (1)..(2856) |
<400> 1
| асд мес 1 | ддс дсс ссС С1у А1а Рго | дсс сде дсс сСс А1а Су5 а! а Деи 5 | дед А! а | |||||
| дгд Уа! | дсс | ддс С1у | дсс | ссс | сед | дад | ССС | «д |
| А1а | А1а | Вег | Вег | с!и | вег | Деи | ||
| 20 | 25 | |||||||
| 999 | еда | дед | дса | даа | дсс | ссд | ддс С1у | сса |
| с!у | Агд | а! а | А1а | с!и | Уа1 | РГО | Рго | |
| 35 | 40 | |||||||
| ггд | дсс | ссс | ддс | аде | ддд СТу | дас | дсс | д!д Уа! |
| ьеи | Уа1 | РКе | С1у | Вег | Азр | а! а | ||
| 50 | 55 | |||||||
| 999 С1у | дд! С1у | дд! С1у | ссс Рго | асд мес | ддд С1у | ссс РГО | асе тКг | дсс Уа1 |
| 65 | 70 | |||||||
| сед | д!д Уа! | ссс | !сд | дад | сде | дсс | сед | д!д |
| Деи | Рго | 5ег | с!и | Агд | Уа! | |_еи | Уа1 | |
| 85 | ||||||||
| сед | аас | дсс | ссс | сас | дад | дас | Ссс | ддд |
| Ьеи | Азп | А1а | 5ег | Н1 5 | с! и | Азр | Вег | С1 у |
| 100 | 105 | |||||||
| ссс | асд | сад | сде | дса | сед | сде | сас | ССС |
| Деи | Тпг | С1п | Агд | Уа1 | ьеи | Суз | Нтз | Рпе |
| 115 | 120 | |||||||
| сса | Ссс | сед | дда | дас | дас | даа | дас | ддд С1у |
| РГО | 5ег | 5ег | сТу | А5р | А5Р | е!и | Азр | |
| 130 | 135 |
| ссс сде Деи Суз 10 ддд асд | дед дсс дед дсс Уа! а!а Уа! а!а | асе 1!е д!д Уа! | 48 96 | ||||
| дад сад еде | 15 д!с Уа! | ||||||
| С! у | тпг | С! и | С!п | Агд 30 | |||
| дад | ссс | ддс | сад | сад | дад | сад | 144 |
| С1и | РГО | С1у | С1п | С!п | с!и | с!п | |
| 45 | |||||||
| дад | сед | аде | !д! | ссс | сед | ссс | 192 |
| с! и | |_еи | 5ег | Суз | РГО | РГО | РГО | |
| 60 | |||||||
| !дд | дсс | аад | дас | ддс | аса | ддд С1у | 240 |
| тгр | Уа1 | ьуз | Азр | С1у | тпг | ||
| 75 | 80 | ||||||
| ддд С1у | ссс Рго | сад С1п | едд Агд | сед Деи | сад с!п | д!д Уа! | 288 |
| 90 | 95 | ||||||
| дсс | сас | аде | Сде | едд | сад | едд | 336 |
| а! а | туг | Вег | суз | Агд | с!п | Агд | |
| 110 | |||||||
| аде Вег | д!д Уа1 | едд Агд | д!д уа! | аса ТКг | дас Азр | дсс А! а | 384 |
| 125 | |||||||
| дад | дас | дад | дсс | дад | дас | аса | 432 |
| с! и | Азр | с! и | а! а | С! и | Азр | тЬг |
140
- 41 029140
| 99ΐ 9ΐ9 | дас аса | ддд дсс б1у А1а 150 | ест Тас | тдд аса | едд ссс дад | едд Агд | атд мет | дас Азр 160 | 480 | |||||||
| С1у 145 | Уа1 | Азр | ТЬг | Рго | Туг | тгр | ТЬг | Агд 155 | РГО | 61 и | ||||||
| аад | аад | стд | стд | дсс | дтд Уа1 | сед | дсс | дсс | аас | асе | дтс | еде | ТТС | сдс | где | 528 |
| БУ5 | Буз | Беи | Беи | А1а | Рго | А1а | А1а | АЗП | ТЬг | Уа! | Агд | РЬе | Агд | Суз | ||
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| сса | дсс | дет | дас б1у | аас | ссс | асе | ссс | тсс | атс | ТСС | гдд | стд | аад | аас | ддс | 576 |
| РГО | А1а | А1а | АЗП | РГО | тЬг | РГО | 5ег | 11е | 5ег | Тгр | Беи | Буз | АЗП | 61 у | ||
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| адд | дад | ТТС | еде | ддс 61 у | дад | сас | сдс | атт | дда | ддс 61 у | атс | аад | стд | едд | сат | 624 |
| Агд | 61 и | рЬе | Агд | б1и | нт 5 | Агд | 11е | б!у | 11 е | Буз | Беи | Агд | нтз | |||
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| сад | сад | гдд | аде | стд | дтс | атд | даа | аде | дгд дгд Уа! Уа1 | ссс | Тед | дас | сдс | ддс 61у | 672 | |
| С1п | 61 η | тгр | 5ег | Беи | Уа1 | мет | б!и | 5ег | Рго | 5ег | Азр | Агд | ||||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| аас | Тас | асе | где | дтс | дгд Уа! | дад | аас | аад | ттт | ддс б1у | аде | атс | едд | сад | асд | 720 |
| АЗП | Туг | тЬг | Су5 | Уа1 | б1и | АЗП | туз | РЬе | 5ег | 11 е | Агд | 61 η | ТЬг | |||
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| гас | асд | стд | дас | дгд Уа1 | стд | дад | еде | ТСС | сед | сас | едд | ссс | атс | стд | сад | 768 |
| туг | ТЬг | Беи | Азр | Беи | б1и | Агд | 5ег | Рго | нтз | Агд | Рго | 11е | Беи | б!п | ||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| дед | ддд 61у | стд | сед | дсс | аас | сад | асд | дед | дгд Уа1 | стд | ддс б1у | аде | дас | дтд Уа! | дад | 816 |
| а1 а | Беи | Рго | А1а | АЗП | 61 η | тЬг | А1а | Беи | 5ег | Азр | б!и | |||||
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| ттс | сас | тде | аад | дгд Уа1 | тас | адт | дас | дса | сад | ссс | сас | атс | сад | гдд | стс | 864 |
| рЬе | Н1 5 | Суз | Буз | туг | 5ег | Азр | А1а | 61 η | РГО | НТ 5 | 11е | б1п | Тгр | Беи | ||
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| аад Буз | сас НТ 5 | дтд Уа1 | дад 61 и | дгд Уа1 | аат АЗП | ддс 61у | аде 5ег | аад Буз | дтд Уа! | ддс б1у | сед Рго | дас Азр | ддс б1у | аса тЬг | ссс Рго | 912 |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| тас | дтт | асе | дгд Уа1 | стс | аад | Тсс | гдд | атс | адт | дад | адт | дгд Уа1 | дад | дсс | дас | 960 |
| Туг | Уа1 | тЬг | Беи | Буз | 5ег | тгр | ίί е | 5ег | б1и | 5ег | б1и | А1а | Азр | |||
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| дгд Уа1 | сдс | стс | сдс | стд | дсс | аат | дгд Уа1 | тсд | дад | едд | дас | ддд 61у | ддс | дад | тас | 1008 |
| Агд | Беи | Агд | Беи | А1а | АЗП | 5ег | 61 и | Агд | Азр | 61 у | 61 и | туг | ||||
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| СТС | тдт | еда | дсс | асе | аат | ТТС | ата | ддс | дгд Уа! | дсс | дад | аад | дсс | ттт | гдд | 1056 |
| Беи | Суз | Агд | А1а | ТЬг | А5П | РЬе | Не | 61у | А1а | б!и | Бу5 | А1а | РЬе | тгр | ||
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| стд | аде | дтт | сас | ддд б!у | ссс | еда | дса | дсс | дад | дад | дад | стд | дгд уа! | дад | дет | 1104 |
| Беи | 5ег | Уа1 | нтз | Рго | Агд | А1а | А1а | б!и | б1и | б!и | Беи | 61 и | А1а | |||
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| дас | дад | дед | ддс 61у | адт | дгд Уа1 | тат | дса | ддс | атс | стс | аде | тас | ддд б1у | дтд Уа! | ддс | 1152 |
| А5р | 61 и | А1а | 5ег | Туг | А1а | 61у | 11е | Беи | 5ег | туг | б!у | |||||
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| ТТС | ТТС | стд | ТТС | атс | стд | дгд Уа1 | дед Уа1 | дед | дет | дгд уа! | асд | стс | тде | сдс | стд | 1200 |
| РЬе | рЬе | Беи | РЬе | 11е | Беи | А1а | А1а | ТЬг | Беи | Суз | Агд | Беи | ||||
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| сдс | аде | ссс | ссс | аад | ааа | ддс б!у | стд | ддс | ТСС | ссс | асе | дтд Уа! | сас | аад | атс | 1248 |
| Агд | 5ег | Рго | Рго | Буз | Буз | Беи | 61у | 5ег | РГО | тЬг | НТ 5 | Буз | 11е | |||
| 405 | 410 | 415 |
- 42 029140
| есс Бег | сдс еее | ссд сес | аад еда сад ьуз Агд с!п | дгд Уа! 425 | есс сед дад есс аас Бег 1_еи с!и Бег Азп 430 | дед А! а | есс Бег | 1296 | ||||||||
| Агд | РКе | РГО 420 | 1еи | |||||||||||||
| аед | аде | есс | аас | аса | сса | егд | дгд Уа1 | сдс | аес | дса | адд | сед | есс | еса | ддд С! у | 1344 |
| мее | Бег | Бег | Азп | ТКг | РГО | |_еи | Агд | 1!е | А! а | Агд | |_еи | Бег | Бег | |||
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| дад | ддс С 1 у | ССС | асд | сед | дсс | аас | дсс | есс | дад | сес | дад | сед | ссе | дсс | дас | 1392 |
| С1и | Рго | тКг | ьеи | а! а | АЗП | Уа! | Бег | с! и | ьеи | с! и | ьеи | рго | а! а | Азр | ||
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| ССС | ааа | едд | дад | сед | еее | едд | дсс | едд | сед | асе | сед | ддс | аад | ССС | еее | 1440 |
| РГО | 1_уз | тгр | с!и | |_еи | Бег | Агд | а! а | Агд | 1_еи | тКг | |_еи | С1у | ьуз | Рго | 1_еи | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| ддд | дад | ддс | где | еее | ддс | сад | дгд уа! | дгс | аед | дед | дад | дсс | аес | ддс | асе | 1488 |
| С1у | с!и | С1у | суз | РКе | С1у | с!п | Уа! | мее | а! а | с! и | А! а | 1!е | С1у | 1!е | ||
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| дас | аад | дас | едд | дсс | дсс | аад | ссе | дес | асе | деа | дсс | дгд уа! | аад | аед | егд | 1536 |
| Азр | ьуз | Азр | Агд | а! а | а! а | 1_уз | РГО | Уа! | тКг | уа! | а! а | гуз | мее | ьеи | ||
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| ааа | дас | дае | дсс | асе | дас | аад | дас | егд | есд | дас | егд | дгд Уа! | еее | дад | аед | 1584 |
| ЬУ5 | Азр | Азр | а! а | тКг | Азр | ьуз | Азр | |_еи | Бег | Азр | |_еи | Бег | с! и | мее | ||
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| дад | аед | аед | аад | аед | аес | ддд | ааа | сас | ааа | аас | аес | аес | аас | егд | егд | 1632 |
| С1и | мее | мее | |_уз | мее | 11е | С1у | ьуз | Нт 5 | 1_уз | АЗП | 1!е | 1!е | АЗП | |_еи | |_еи | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| ддс | дсс | еде | асд | сад | ддс С1у | ддд | ССС | егд | еас | дгд Уа1 | сед | дгд Уа1 | дад | еас | дед | 1680 |
| С1у | А! а | Суз | тКг | С1п | С1у | рго | |_еи | Туг | 1_еи | с1и | туг | а! а | ||||
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| дсс | аад | дде С1у | аас | сед | едд | дад | еее | сед | едд | дед | едд | едд | ССС | ссд | ддс С1у | 1728 |
| А1а | |_уз | Азп | ьеи | Агд | с!и | РКе | |_еи | Агд | А! а | Агд | Агд | РГО | Рго | |||
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| сед | дас | еас | есс | еее | дас | асе | где | аад | ссд | ССС | дад | дад | сад | сес | асе | 1776 |
| ьеи | Азр | туг | Бег | РКе | Азр | тКг | Су 5 | ьуз | Рго | Рго | С! и | с! и | С1п | |_еи | тКг | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| еее | аад | дас | сед | дгд Уа! | есс | гдг | дсс | еас | сад | дгд | дсс | едд | ддс | аед | дад | 1824 |
| РКе | ьуз | А5р | Беи | Бег | суз | а! а | ту г | с!п | Уа1 | а! а | Агд | С1у | мее | с! и | ||
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| гас | еед | дсс | есс | сад | аад | еде | аес | сас | адд | дас | сед | дсе | дсс | сдс | аас | 1872 |
| Туг | |_еи | а! а | Бег | с!п | ьуз | суз | ΐΐ е | нт 5 | Агд | А5р | 1_еи | а! а | А! а | Агд | АЗП | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| дед Уа1 | сед | дед Уа! | асе | дад | дас | аас | дгд Уа1 | аед | аад | аес | дса | дас | еее | ддд | сед | 1920 |
| 1_еи | тКг | с!и | Азр | АЗП | мее | ьуз | 11е | а! а | А5р | РКе | С1у | |_еи | ||||
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| дсс | едд | дас | дгд Уа! | сас | аас | сес | дас | еас | еас | аад | аад | аса | асе | аас | ддс | 1968 |
| А1а | Агд | А5р | НТ 5 | АЗП | Беи | Азр | туг | туг | гуз | Буз | тКг | тКг | А5П | С1у | ||
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| едд | сед | ССС | дгд уа’ | аад | гдд | аед | дед | ссе | дад | дсс | егд | еее | дас | еда | дес | 2016 |
| Агд | 1_еи | РГО | Буз | Тгр | мее | А! а | рго | С! и | а! а | |_еи | РКе | Азр | Агд | Уа! | ||
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| еас | асе | сас | сад | аде | дас | дгс | гдд | есс | еее | ддд | дес | егд | сес | гдд | дад | 2064 |
| туг | ТКг | Нт 5 | С!п | Бег | Азр | Уа! | тгр | Бег | РКе | С1у | уа! | |_еи | |_еи | тгр | с! и | |
| 675 | 680 | 685 |
- 43 029140
| асе ССс асд 11е РКе тКг | сед ддд | ддс б1у | Ссс ссд сас ссс ддс асе ссс дед дад дад | 2112 | ||||||||||||
| ьеи | С1у | 5ег 695 | Рго | туг | Рго | 61 у | Пе 700 | Рго | Уа1 | 61 и | 61 и | |||||
| 690 | ||||||||||||||||
| ССС | ссс | аад | сед | сед | аад | дад | ддс | сас | сдс | асд | дас | аад | ссс | дсс | аас | 2160 |
| ьеи | РКе | ьуз | Ьеи | ьеи | ьуз | б1и | 61у | НТ 5 | Агд | мес | Азр | Ьуз | РГО | А1а | АЗП | |
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| где | аса | сас | дас | сед | еас | асд | асе | асд | едд | дад | еде | едд | сас | дсс | дед | 2208 |
| Су5 | тКг | нтз | Азр | ьеи | туг | мес | Пе | мес | Агд | 61 и | суз | Тгр | НТ 5 | А1а | А1а | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| ССС | ссс | сад | адд | ссс | асе | ссс | аад | сад | сед | дед Уа! | дад | дас | сед | дас | еде | 2256 |
| РГО | 5ег | С1п | Агд | Рго | тКг | рКе | Ьуз | б1п | ьеи | б1и | Азр | ьеи | А5р | Агд | ||
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| дгс | ссс | асе | дед Уа1 | асд | ссс | асе | дас | дса | аад | дед | аса | сад | дад | дад | аас | 2304 |
| Уа1 | Ьеи | тКг | ТКг | 5ег | тКг | А5р | уа! | ьуз | А1а | тКг | 61 п | 61 и | 61 и | АЗП | ||
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| едд | дад | сед | адд | аде | адд | еде | дад | дад | ССС | сас | ддд | аад | аас | сед | даа | 2352 |
| Агд | б!и | ьеи | Агд | 5ег | Агд | Суз | б1и | б1и | ьеи | НТЗ | б!у | ьуз | А5П | ьеи | б!и | |
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| сед | ддд | аад | асе | асд | дас | адд | ССС | даа | дад | дее | дед уа! | сас | сад | дсс | асд | 2400 |
| ьеи | 61у | ьуз | 11 е | мес | Азр | Агд | РКе | 61 и | б!и | Уа! | туг | б1п | А1а | мес | ||
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
| дад | даа | дее | сад | аад | сад | аад | даа | ссс | Ссс | ааа | дсс | даа | асе | сад | ааа | 2448 |
| б!и | с!и | Уа1 | С1п | ьуз | С1п | Ьуз | б1и | ьеи | 5ег | Ьуз | А1а | б!и | 11 е | б!п | ьуз | |
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| дсс | сса | ааа | даа | ааа | дас | саа | ссе | асе | аса | дас | сед | аас | Ссс | асд | дад | 2496 |
| Уа! | ьеи | Ьуз | б!и | ьуз | Азр | 6ΐη | ьеи | тКг | тКг | Азр | ьеи | АЗП | 5ег | Мес | б1и | |
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| аад | есс | ссс | ссс | дас | ссс | ссс | аад | еде | ссс | дад | ааа | сад | ааа | дад | дед уа! | 2544 |
| ьуз | 5ег | РКе | 5ег | Азр | ьеи | РКе | ьуз | Агд | рКе | б!и | ьуз | б1п | ьуз | 61 и | ||
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| асе | дад | ддс | сас | сдс | аад | аас | даа | дад | сса | сед | аад | аад | сдс | дед Уа1 | дад | 2592 |
| 11 е | б1и | 61у | туг | Агд | ьуз | АЗП | 61 и | б!и | 5ег | ьеи | ьуз | ьуз | Суз | б!и | ||
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| дас | еас | сед | дса | адд | асе | асе | сад | дад | ддс | сад | адд | сас | саа | дсс | сед | 2640 |
| Азр | туг | Ьеи | А1а | Агд | Пе | тКг | б!п | б1и | 61 у | б1п | Агд | туг | б!п | А1а | Ьеи | |
| 865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| аад | дсс | сас | дед | дад | дад | аад | сед | сад | сед | дса | аас | дад | дад | асе | дсс | 2688 |
| ьуз | А1а | нтз | А1а | б1и | 61 и | ьуз | Ьеи | 6ΐη | ьеи | А1а | АЗП | б1и | б1и | Пе | а! а | |
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| сад | дсс | едд | аде | аад | дсс | сад | дед | даа | дед | еед | дсс | ссс | сад | дсс | аде | 2736 |
| 61η | Уа1 | Агд | 5ег | ьуз | А1а | 61 η | А1а | 61 и | А1а | ьеи | А1а | ьеи | б1п | А1а | 5ег | |
| 900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
| сед | адд | аад | дад | сад | асд | сдс | асе | сад | сед | сед | дад | аад | аса | дед Уа1 | дад | 2784 |
| ьеи | Агд | Ьуз | б1и | 6ΐη | Мес | Агд | Пе | 6ΐη | 5ег | ьеи | 61 и | ьуз | тКг | 61 и | ||
| 915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
| сад | аад | асе | ааа | дад | аас | дад | дад | сед | асе | адд | асе | Сдс | дас | дас | ссс | 2832 |
| 6ΐη | ьуз | ТКг | ьуз | б!и | АЗП | 61 и | б!и | ьеи | тКг | Агд | Пе | Суз | Азр | Азр | Ьеи | |
| 930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
| асе | есс | аад | асд | дад | аад | асе | еда | 2856 | ||||||||
| Пе | 5ег | ьуз | мес | б!и | ьуз | Пе | ||||||||||
| 945 | 950 |
- 44 029140 <210> 2 <211> 951 <212> РКТ <213> Ното 5артепз <400> 2
| мет с!у 1 | А1а | Рго | А1а 5 | Суз А1а ьеи А1а | ьеи 10 | Суз Уа1 | А1а | Уа1 | А1а 15 | 11е | |||||
| Уа1 | А1а | с!у | А1а | зег | Зег | С1и | Зег | Ьеи | С1у | ТНг | С1и | С1п | Агд | Уа1 | Уа1 |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| С1у | Агд | А1а | А1а | С1и | Уа1 | РГО | С1у | рго | С1и | Рго | С1у | С1п | С1п | С1и | С1п |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| ьеи | УаТ | РНе | С1у | Зег | С1у | Азр | А1а | Уа1 | С1и | ьеи | Зег | Суз | Рго | Рго | РГО |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С1у | С1у | С1у | Рго | Мег | С1у | Рго | тНг | Уа1 | Тгр | Уа1 | Ьуз | АЗр | С1у | тНг | С1у |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| ьеи | Уа1 | РГО | зег | с!и | Агд | Уа1 | ьеи | Уа1 | С1у | РГО | С1п | Агд | ьеи | с!п | Уа1 |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ьеи | АЗП | А1а | Зег | ΗΪ 5 | С1и | Азр | зег | е1у | А1а | туг | Зег | суз | Агд | С1п | Агд |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| 1_еи | ТНг | с1п | Агд | Уа1 | ьеи | суз | НТ 5 | РНе | зег | Уа1 | Агд | Уа1 | тНг | Азр | А1а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| РГО | Зег | Зег | С1у | Азр | Азр | с1и | Азр | С1у | С1и | Азр | С1и | А1а | С1и | Азр | ТНг |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| с!у | Уа1 | Азр | тНг | С1у | А1а | РГО | туг | тгр | тНг | Агд | РГО | е!и | Агд | мет | Азр |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ЬУ5 | ЬуЗ | ьеи | Ьеи | А1а | Уа1 | рго | А1а | А1а | Азп | ТНг | Уа1 | Агд | РНе | Агд | суз |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| рго | А1а | А1а | с!у | АЗП | Рго | тНг | Рго | Зег | 11е | Зег | тгр | ьеи | ьуз | АЗП | С1у |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | С1и | РНе | Агд | С1у | С1и | нт 5 | Агд | 11 е | С1у | С1у | 11е | Ьуз | ьеи | Агд | Нт 5 |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| С1п | с!п | Тгр | зег | 1_еи | Уа1 | мет | С1и | Зег | Уа1 | Уа1 | РГО | Зег | Азр | Агд | С1у |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| АЗП | туг | тНг | Суз | Уа1 | Уа1 | е!и | Азп | ьуз | РНе | С1у | Зег | Пе | Агд | С1п | тНг |
| 225 | 230 | 235 | 240 |
- 45 029140
| туг ТКг ьеи | Азр Уа! 245 | Ьеи с!и Агд 5ег Рго 250 | нтз | Агд | РГО | Пе | Ьеи 255 | 6ΐη | |||||||
| а! а | б1у | ьеи | Рго | А! а | АЗП | с! η | ТКг | а! а | Уа! | ьеи | с! у | 5ег | Азр | Уа! | б1и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| РКе | НТ 5 | Суз | ЬУЗ | Уа! | Туг | 5ег | Азр | а! а | 6ΐη | РГО | НТ 5 | 11 е | 61 η | Тгр | ьеи |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ьуз | НТ 5 | Уа! | б!и | уа! | АЗП | с!у | 5ег | ьуз | Уа! | б!у | Рго | Азр | б!у | ТКг | Рго |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Туг | Уа! | тКг | Уа! | ьеи | ЬУЗ | 5ег | Тгр | 11 е | 5ег | с! и | 5ег | Уа! | б1и | а! а | Азр |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Ьеи | Агд | ьеи | а! а | азп | Уа! | 5ег | С! и | Агд | Азр | с! у | 61 у | б1и | туг |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| ьеи | Суз | Агд | а! а | тКг | АЗП | РКе | 11 е | с! у | Уа! | А! а | с! и | Ьу5 | А! а | РКе | Тгр |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| кеи | 5ег | Уа! | НТ 5 | с! у | РГО | Агд | а! а | А1а | с! и | с! и | 61 и | ьеи | Уа! | б1и | а! а |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Азр | с! и | а! а | б!у | 5ег | Уа! | туг | А1а | с!у | 11е | Ьеи | 5ег | туг | б!у | Уа! | 61 у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| РНе | РКе | Ьеи | РКе | Пе | ьеи | Уа! | Уа! | А1а | а! а | Уа! | ТКг | ьеи | суз | Агд | ьеи |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Агд | 5ег | Рго | РГО | ьуз | ьуз | с! у | ьеи | с! у | 5ег | Рго | ТКг | Уа1 | Нтз | ЬУЗ | Пе |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| 5ег | Агд | РКе | РГО | Ьеи | ьуз | Агд | с! η | Уа! | 5ег | ьеи | с! и | 5ег | Азп | а! а | 5ег |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Μθΐ | 5ег | 5ег | АЗП | ТКг | РГО | ьеи | Уа! | Агд | 11 е | А1а | Агд | ьеи | 5ег | 5ег | 61 у |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| б!и | б1у | Рго | тКг | Ьеи | а! а | Азп | Уа! | 5ег | с!и | ьеи | б1и | ьеи | РГО | а! а | Азр |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Рго | ЬУЗ | тгр | с! и | Ьеи | 5ег | Агд | А1а | Агд | ьеи | ТКг | ьеи | б!у | ьуз | Рго | Ьеи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| б1у | б!и | с! у | Суз | РКе | С! у | с! η | Уа! | Уа! | меь | а! а | б1и | а! а | 11е | б1у | Пе |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Αδρ | ЬУЗ | Азр | Агд | а! а | а! а | ьуз | Рго | Уа! | тКг | Уа! | а! а | Уа! | ьуз | мет | Ьеи |
| 500 | 505 | 510 |
- 46 029140
| Ьуз Азр Азр | А1а тКг Азр | ьуз | Азр ьеи 5ег Азр ьеи 520 | УаТ 525 | 5ег | сТи | мег | ||||||||
| 515 | |||||||||||||||
| сТи | мет | мет | Ьуз | мет | 1Те | сТу | Ьуз | НТ 5 | Ьуз | Азп | 1Те | 1Те | Азп | ьеи | Ьеи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| СТу | АТа | суз | ТКг | с1п | С1у | СТу | Рго | ьеи | Туг | УаТ | Ьеи | УаТ | СТи | Туг | АТа |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| А1а | ьуз | С1у | АЗП | ьеи | Агд | сТи | РКе | ьеи | Агд | АТа | Агд | Агд | Рго | Рго | СТу |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| ьеи | Азр | Туг | 5ег | РКе | Азр | тКг | Суз | ьуз | РГО | Рго | сТи | сТи | сТп | Ьеи | тКг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| РКе | ьуз | Азр | ьеи | УаТ | 5ег | суз | АТа | Туг | СТп | УаТ | АТа | Агд | СТу | ме! | сТи |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| туг | Ьеи | АТа | 5ег | С1п | ьуз | суз | 11е | НТ 5 | Агд | Азр | ьеи | АТа | АТа | Агд | АЗП |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| УаТ | Ьеи | УаТ | тКг | сТи | Азр | АЗП | УаТ | мет | ьуз | 1Те | АТа | Азр | РКе | СТу | ьеи |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Азр | УаТ | НТ 5 | Азп | ьеи | Азр | туг | туг | ьуз | ЬУ5 | ТКг | ТКг | А5П | СТу |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Агд | ьеи | Рго | Уа1 | ьуз | тгр | мет | АТа | Рго | сТи | АТа | Ьеи | РКе | Азр | Агд | УаТ |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| Туг | тКг | Нт 5 | СТп | 5ег | А5Р | Уа1 | Тгр | 5ег | РКе | СТу | УаТ | Ьеи | Ьеи | Тгр | сТи |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Не | РКе | ТКг | ьеи | с1у | СТ у | 5ег | рго | Туг | РГО | СТу | Не | РГО | УаТ | СТ и | сТи |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| Ьеи | РКе | ьуз | ьеи | ьеи | ьуз | сТи | СТу | НТ 5 | Агд | мет | Азр | ьуз | Рго | АТа | Азп |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Суз | тКг | Нт 5 | Азр | ьеи | туг | мет | 11е | мет | Агд | сТи | Суз | Тгр | ΗΪ 5 | АТа | АТа |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| Рго | 5ег | СТп | Агд | Рго | тКг | РКе | ьуз | сТп | ьеи | УаТ | СТ и | А5р | ьеи | Азр | Агд |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| УаТ | ьеи | ТКг | Уа1 | тКг | 5ег | тКг | Азр | УаТ | ьуз | АТа | ТКг | сТп | сТи | сТи | Азп |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| Агд | сТи | ьеи | Агд | 5ег | Агд | Суз | сТи | СТ и | ьеи | НТ 5 | СТу | ьуз | Азп | Ьеи | сТи |
| 770 | 775 | 780 |
- 47 029140
| ьеи 785 | с!у ьу5 | Не | Мег | А5р Агд 790 | РЬе | С1и | с!и | Уа1 795 | Уа1 | туг | С1п | А1а | Мег 800 | ||
| С1и | С1и | Уа1 | С1п | Ьуз | С1п | ьуз | С1и | Ьеи | 5ег | ьуз | А1а | С1и | Не | с1п | Ьуз |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| Уа1 | Ьеи | ьуз | С1и | ьуз | Азр | С1п | ьеи | ТЬг | ТЬг | АЗр | Ьеи | Азп | 5ег | мет | С1и |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| ьуз | 5ег | РЬе | 5ег | Азр | Ьеи | РЬе | ьуз | Агд | РЬе | С1и | Ьуз | С1п | ьуз | с!и | Уа1 |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| 11е | с1и | С1у | туг | Агд | ьуз | Азп | с!и | С1и | 5ег | ьеи | ьуз | Ьуз | Суз | Уа1 | С1и |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| Азр | Туг | ьеи | А1а | Агд | Не | ТЬг | С1п | С1и | С1у | С1п | Агд | Туг | с1п | А1а | Ьеи |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| ЬУ5 | А1а | Нт 5 | А1а | С1и | С1и | ьуз | ьеи | С1п | ьеи | А1а | АЗП | С1и | с1и | 11е | А1а |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| с1п | Уа1 | Агд | 5ег | ьуз | А1а | с1п | А1а | С1и | А1а | ьеи | А1а | Ьеи | е!п | А1а | 5ег |
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| ьеи | Агд | Ьуз | С1и | е1п | Мег | Агд | 11е | С1п | 5ег | Ьеи | С1и | Ьуз | ТЬг | Уа1 | С1и |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| С1п | ЬУ5 | ТЬг | ьуз | С1и | АЗП | С1и | С1и | ьеи | ТЬг | Агд | 11е | Суз | Азр | Азр | ьеи |
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| 11е | 5ег | Ьуз | Мег | С1и | ьуз | Х1е |
945 950 <210> 3 <211> 2961 <212> ДНК
| <213> ното | зартеп5 | |||||||||||||
| <220> | ||||||||||||||
| <221> СЭ5 | ||||||||||||||
| <222> (1).. | . (2961) | |||||||||||||
| <400> 3 | ||||||||||||||
| агд ддс дсс | ссг | дсс | где | дсс | сгс | дед | сгс | где | дгд | дсс | дгд | дсс | агс | 48 |
| мег с1у А1а | РГО | А1а | су 5 | А1а | Ьеи | А1а | ьеи | суз | Уа1 | А1а | Уа1 | А1а | 11е | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| дгд дсс ддс | дсс | гсс | гсд | дад | гсс | ггд | ддд | асд | дад | сад | сдс | дгс | дгд | 96 |
| Уа1 А1а С1у | А1а | 5ег | 5ег | с!и | 5ег | ьеи | С1у | ТЬг | С1и | С1п | Агд | Уа1 | Уа1 | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| ддд еда дед | дса | даа | дгс | ссд | ддс | сса | дад | ССС | ддс | сад | сад | дад | сад | 144 |
| С1у Агд А1а | А1а | с!и | Уа1 | РГО | С1у | Рго | с!и | РГО | С1у | С1п | С1п | С1и | С1п | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| ггд дгс ггс | ддс | аде | ддд | даг | дег | дгд | дад | егд | аде | гдг | ССС | ссд | ССС | 192 |
- 48 029140
| Ьеи \/а1 | РКе с!у 5ег с!у Азр 55 | а! а | Уа! | с! и | ьеи | 5ег суз 60 | Рго | РГО | Рго | |||||||
| 50 | ||||||||||||||||
| ддд | дде | дде 01 у | ссс | асд | ддд сТу | ссс | асе | дсс | едд | дсс | аад | дас | ддс с!у | аса | ддд | 240 |
| С1у | СТу | РГО | мес | Рго | тКг | уа! | тгр | Уа! | ьуз | Азр | ТКг | сТу | ||||
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| сед Ьеи | дед Уа! | ссс Рго | сед 5ег | дад с! и | сдс Агд | дсс уа! | сед ьеи | дед ддд Уа! С1у | ссс РГО | сад с! η | едд Агд | сед ьеи | сад с1п | дед Уа1 | 288 | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| сед | аас | дсс | ссс | сас | дад | дас | ссс | ддд | дсс | сас | аде | сдс | едд | сад | едд | 336 |
| ьеи | АЗП | а! а | 5ег | Нт 5 | с! и | Азр | 5ег | С1у | а! а | туг | 5ег | суз | Агд | С! η | Агд | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| ссс | асд | сад | сдс | деа | ссд | еде | сас | ссс | аде | дед Уа! | едд | дед уа! | аса | дас | дсс | 384 |
| ьеи | ТКг | с! η | Агд | Уа! | Ьеи | суз | НТ 5 | рКе | 5ег | Агд | тКг | Азр | а! а | |||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| сса | Ссс | ссд | дда | дас | дас | даа | дас | ддд | дад | дас | дад | дсс | дад | дас | аса | 432 |
| РГО | 5ег | 5ег | С1у | Азр | Азр | с!и | Азр | С1у | с! и | АЗр | С1и | А! а | с! и | Азр | ТКг | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| дде с!у | дед Уа1 | дас | аса | ддд | дсс | ссс | сас | едд | аса | едд | ссс | дад | едд | асд | дас | 480 |
| Азр | тКг | с!у | а! а | Рго | туг | Тгр | тКг | Агд | Рго | с! и | Агд | мес | Азр | |||
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| аад | аад | ссд | сед | дсс | дед Уа! | ссд | дсс | дсс | аас | асе | дсс | сдс | ССс | сдс | сдс | 528 |
| ЬУ5 | ЬуЗ | ьеи | Ьеи | а! а | Рго | а! а | а! а | Азп | тКг | Уа! | Агд | РКе | Агд | суз | ||
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| сса | дсс | дсс | ддс С1 у | аас | ссс | асе | ссс | ссс | асе | Ссс | едд | сед | аад | аас | ддс | 576 |
| РГО | а! а | А! а | АЗП | Рго | тКг | Рго | 5ег | Не | 5ег | тгр | Ьеи | ьуз | АЗП | с! у | ||
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| адд | дад | ссс | сдс | ддс С1у | дад | сас | сдс | асе | дда | ддс С1у | асе | аад | ссд | едд | сас | 624 |
| Агд | с!и | РКе | Агд | С! и | НТ 5 | Агд | Пе | С1у | Не | ьуз | ьеи | Агд | НТ 5 | |||
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| сад | сад | едд | аде | сед | дсс | асд | даа | аде | дед дед УаТ Уа! | ссс | есд | дас | сдс | ддс С1у | 672 | |
| С1п | с! η | тгр | 5ег | Ьеи | Уа! | МеС | С1и | 5ег | РГО | 5ег | Азр | Агд | ||||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| аас | сас | асе | еде | дес | дед уа! | дад | аас | аад | ссс | ддс б! у | аде | асе | едд | сад | асд | 720 |
| АЗП | туг | тКг | Суз | Уа! | е!и | АЗП | ьуз | РКе | 5ег | Не | Агд | с! η | ТКг | |||
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| Сас | асд | сед | дас | дед уа! | сед | дад | сдс | ссс | ссд | сас | едд | ссс | асе | ссд | сад | 768 |
| туг | тКг | ьеи | Азр | ьеи | с! и | Агд | 5ег | Рго | НТ 5 | Агд | Рго | Пе | ьеи | С! η | ||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| дед | ддд | сед | сед | дсс | аас | сад | асд | дед | дед уа1 | ссд | ддс С! у | аде | дас | дед Уа! | дад | 816 |
| а! а | С1у | ьеи | рго | а! а | АЗП | С! η | тКг | а! а | Ьеи | 5ег | Азр | с! и | ||||
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| ССС | сас | еде | аад | дед Уа! | Сас | аде | дас | дса | сад | ссс | сас | асе | сад | едд | ССС | 864 |
| РКе | Н1 5 | суз | ьуз | туг | 5ег | Азр | а! а | с! η | РГО | НТ 5 | Пе | С! η | тгр | Ьеи | ||
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| аад 1_У5 | сас НТ 5 | дед Уа! | дад с! и | дед уа! | аас АЗП | ддс с!у | аде 5ег | аад ьуз | дед уа! | ддс с!у | ссд Рго | дас Азр | ддс сТу | аса ТКг | ссс Рго | 912 |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| Сас | дее | асе | дед Уа! | ссс | аад | ссс | едд | асе | аде | дад | аде | дед Уа! | дад | дсс | дас | 960 |
| Туг | Уа! | тКг | ьеи | ьуз | 5ег | тгр | Пе | 5ег | с! и | 5ег | с! и | а! а | Азр | |||
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| дгд | сдс | ссс | сдс | сед | дсс | аас | дед | ссд | дад | едд | дас | ддд | ддс | дад | сас | 1008 |
- 49 029140
| Уа1 | Агд | геи | Агд | геи 325 | А1а Азп | Уа1 | 5ег С1и 330 | Агд | Азр С1у С1у | б!и 335 | ту Г | |||||
| сгс | хдх | еда | дсс | асе | ааг | ггс | ага | ддс | дед | дсс | дад | аад | дсс | ггг | !дд | 1056 |
| геи | СУ5 | Агд | А1а | тКг | Азп | рКе | 11 е | С1у | Уа1 | А1а | б1и | гуз | А1а | рКе | тгр | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| сйд | аде | дгг | сас | ддд | ссс | еда | дса | дсс | дад | дад | дад | егд | дгд | дад | дег | 1104 |
| геи | 5ег | Уа1 | Нт 5 | сТу | рго | Агд | А1а | А1а | с1и | б!и | б1и | геи | Уа1 | б1и | А1а | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| дас | дад | дед | ддс | адг | дгд | гаг | дса | ддс | агс | сгс | аде | гас | ддд | дгд | ддс | 1152 |
| Азр | С1и | А1а | С1у | 5ег | Уа1 | туг | А1а | б1у | Пе | геи | 5ег | ту Г | 61у | Уа1 | 61 у | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| «с | сгс | егд | ггс | агс | егд | дед дед | дед | дег | дед | асд | сгс | где | сдс | егд | 1200 | |
| РКе | геи | геи | рКе | Пе | геи | Уа! Уа! | А1а | А1а | Уа! | ТКг | геи | Суз | Агд | геи | ||
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| сдс | аде | ссс | ссс | аад | ааа | ддс | егд | ддс | гсс | ссс | асе | дгд | сас | аад | агс | 1248 |
| Агд | 5ег | рго | РГО | гуз | гуз | 61у | геи | б1у | 5ег | Рго | ТКг | Уа1 | Нт 5 | гуз | Пе | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| 1СС | сдс | ггс | сед | сгс | аад | еда | сад | дгд | гсс | егд | дад | гсс | аас | дед | гсс | 1296 |
| 5ег | Агд | рКе | рго | геи | гуз | Агд | С1п | Уа1 | 5ег | геи | б1и | 5ег | А5П | А1а | 5ег | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| агд | аде | гсс | аас | аса | сса | егд | дед | сдс | агс | дса | адд | егд | гсс | гса | ддд | 1344 |
| мег | 5ег | 5ег | А5П | тКг | РГО | геи | Уа! | Агд | Пе | А1а | Агд | геи | 5ег | 5ег | 61у | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| дад | ддс | ссс | асд | егд | дсс | ааг | дгс | гсс | дад | сгс | дад | С!д | ссг | дсс | дас | 1392 |
| С1и | 61 у | Рго | тКг | геи | А1а | АЗП | Уа1 | 5ег | б1и | геи | б!и | геи | РГО | А1а | Азр | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| ссс | ааа | хдд | дад | егд | гсг | едд | дсс | едд | егд | асе | егд | ддс | аад | ссс | егг | 1440 |
| рго | СуЗ | тгр | б1и | геи | 5ег | Агд | А1а | Агд | геи | тКг | геи | С1у | гуз | Рго | геи | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| ддд | дад | ддс | !дс | ггс | ддс | сад | дед | дгс | агд | дед | дад | дсс | агс | ддс | агг | 1488 |
| сТу | б1и | 61у | суз | рКе | б1у | б1п | Уа1 | Уа1 | мег | А1а | б1и | А1а | Пе | С1у | Пе | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| дас | аад | дас | едд | дсс | дсс | аад | ссг | дгс | асе | дга | дсс | дгд | аад | агд | егд | 1536 |
| Азр | гуз | Азр | Агд | а1 а | а! а | гуз | рго | Уа! | тКг | Уа! | А1а | Уа1 | гуз | мег | геи | |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| ааа | дас | даг | дсс | асг | дас | аад | дас | егд | гсд | дас | егд | дгд | гсг | дад | агд | 1584 |
| ьу5 | Азр | Азр | А1а | ТКг | Азр | гуз | Азр | геи | 5ег | Азр | геи | уа! | 5ег | б!и | мег | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| дад | агд | агд | аад | агд | агс | ддд | ааа | сас | ааа | аас | агс | агс | аас | егд | егд | 1632 |
| б!и | мег | мег | гуз | мег | 11 е | б!у | гуз | Нт 5 | гуз | Азп | Пе | Пе | АЗП | геи | геи | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| ддс | дсс | где | асд | сад | ддс | ддд | ссс | с!д | гас | дгд | егд | дгд | дад | гас | дед | 1680 |
| б!у | А1а | Суз | тКг | б!п | сТу | б1у | рго | геи | ту Г | Уа1 | геи | уа! | б!и | туг | А1а | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| дсс | аад | дд! | аас | егд | едд | дад | ггг | егд | едд | дед | едд | едд | ссс | сед | ддс | 1728 |
| А1а | гуз | б1у | Азп | геи | Агд | б!и | рКе | геи | Агд | А1а | Агд | Агд | Рго | рго | 61 у | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| егд | дас | гас | гсс | ггс | дас | асе | хде | аад | сед | ссс | дад | дад | сад | сгс | асе | 1776 |
| геи | Азр | ту Г | 5ег | рКе | Азр | ТКг | суз | гуз | РГО | РГО | б1и | б!и | с1п | геи | ТКг | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| ггс | аад | дас | егд | дгд | гсс | !д! | дсс | гас | сад | дед | дсс | едд | ддс | агд | дад | 1824 |
- 50 029140
| РКе ьуз Азр ьеи \/а1 595 | Зег | Суз А1а туг 600 | с!п | Уа! | А!а Агд с!у 605 | мес | с! и | |||||||||
| гас | ссд | дсс | есс | сад | аад | сде | асе | сас | адд | дас | ссд | дсс | дсс | сдс | аас | 1872 |
| туг | ьеи | а! а | Зег | С1п | ьуз | суз | Не | НТ 5 | Агд | Азр | ьеи | а! а | А! а | Агд | АЗП | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| 9*9 Уа1 | ссд | д*д Уа! | асе | дад | дас | аас | д*д Уа1 | асд | аад | асе | дса | дас | ССС | ддд | с*д | 1920 |
| ьеи | тКг | С1и | А5р | АЗП | мес | ьуз | 1!е | А! а | А5р | РКе | с! у | ьеи | ||||
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| дсс | сдд | дас | дед Уа! | сас | аас | ссс | дас | сас | сас | аад | аад | аса | асе | аас | ддс С1у | 1968 |
| А1а | Агд | Азр | Нт 5 | Азп | ьеи | Азр | туг | туг | ьуз | ьуз | ТКг | ТКг | АЗП | |||
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| сдд | ссд | ссс | д*д Уа! | аад | *дд | асд | дед | ссс | дад | дсс | ссд | ссс | дас | еда | дсс | 2016 |
| Агд | ьеи | РГО | ьуз | тгр | мес | А1а | РГО | с1и | а! а | ьеи | рКе | Азр | Агд | Уа! | ||
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| сас | асе | сас | сад | аде | дас | дсс | *дд | ссс | ссс | ддд | дсс | ссд | ссс | *дд | дад | 2064 |
| Туг | ТКг | НТ 5 | с!п | Зег | А5Р | Уа! | тгр | 5ег | РКе | С!у | Уа! | ьеи | Ьеи | Тгр | С! и | |
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
| асе | ССС | асд | с*д | ддд | ддс | ссс | ссд | сас | ссс | ддс С1у | асе | ссс | д*д Уа! | дад | дад | 2112 |
| 11 е | рКе | ТКг | Ьеи | 61у | С1у | зег | рго | туг | Рго | 11е | РГО | С! и | с! и | |||
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| ссс | ссс | аад | сСд | ссд | аад | дад | ддс С1у | сас | сдс | асд | дас | аад | ссс | дсс | аас | 2160 |
| ьеи | РКе | ьуз | ьеи | Ьеи | ьуз | С1и | НТ 5 | Агд | мес | Азр | ьуз | РГО | а! а | Азп | ||
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| Сдс | аса | сас | дас | ссд | Сас | асд | асе | асд | сдд | дад | *дс | *дд | сас | дсс | дед | 2208 |
| Суз | тКг | НТ 5 | Азр | Ьеи | Туг | мес | 11е | Мес | Агд | С1и | суз | тгр | НТ 5 | а! а | А1а | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| ссс | ссс | сад | адд | ссс | асе | ссс | аад | сад | ссд | дед Уа! | дад | дас | ссд | дас | сдс | 2256 |
| Рго | Зег | с1п | Агд | Рго | тКг | РКе | ьуз | С1п | ьеи | с! и | Азр | ьеи | Азр | Агд | ||
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| дсс Уа! | ССС Ьеи | асе тКг | дед Уа! | асд ТКг | Ссс Зег | асе ТКг | дас Азр | дед Уа1 | сса РГО | ддс с!у | сса Рго | ссс Рго | сса РГО | дд* С1у | дсс Уа! | 2304 |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| ссс | дед | ссс | ддд | ддс | сса | ссс | ссд | ссс | асе | дда С1у | ссс | аса | дед Уа! | дас | ссд | 2352 |
| РГО | А! а | РГО | сТу | с1у | РГО | РГО | ьеи | Зег | тКг | Рго | т!е | Азр | Ьеи | |||
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| ссс | сад | сас | аде | сад | аад | дас | ссд | дас | дса | д*д Уа1 | дса | аад | дед | аса | сад | 2400 |
| ьеи | С1п | туг | 5ег | С1п | Ьуз | Азр | ьеи | Азр | а! а | Уа! | ьуз | а! а | тКг | С1п | ||
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
| дад | дад | аас | сдд | дад | с*д | адд | аде | адд | сдс | дад | дад | ссс | сас | ддд С1у | аад | 2448 |
| с! и | С1и | АЗП | Агд | с! и | ьеи | Агд | Зег | Агд | Суз | с! и | С1и | ьеи | НТ 5 | ьуз | ||
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| аас | ссд | даа | ссд | ддд С1у | аад | асе | асд | дас | адд | ссс | даа | дад | дсс | д*д уа! | сас | 2496 |
| АЗП | Ьеи | С1и | ьеи | ЬУ5 | 11е | мес | Азр | Агд | РКе | с! и | с! и | Уа! | туг | |||
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| сад | дсс | асд | дад | даа | дсс | сад | аад | сад | аад | даа | ссс | Ссс | ааа | дсс | даа | 2544 |
| С1п | А1а | мес | с!и | С1и | Уа! | С1п | ьуз | С1п | ьуз | с! и | Ьеи | Зег | ьуз | а! а | е!и | |
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| асе | сад | ааа | дсс | сСа | ааа | даа | ааа | дас | саа | сСС | асе | аса | дас | с*д | аас | 2592 |
| 11е | с!п | Ьуз | Уа! | Ьеи | ьуз | с!и | ьуз | Азр | с!п | ьеи | тКг | тКг | Азр | ьеи | Азп | |
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| ссс | асд | дад | аад | ссс | ссс | ссс | дас | ссс | ссс | аад | сдс | ссс | дад | ааа | сад | 2640 |
- 51 029140
| 5ег | Ме! | сТи | |_уз | 5ег | рКе | 5ег | Азр | ьеи | рЬе | ьуз | Агд | РКе | СТ и | ьуз | СТп | |
| 865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| ааа | дад | дгд | а! с | дад | ддс | !ас | сдс | аад | аас | даа | дад | !са | с!д | аад | .аад | 2688 |
| ьуз | сТи | УаТ | Пе | сТи | СТу | туг | Агд | ьуз | АЗП | сТи | сТи | 5ег | Ьеи | ьуз | ьуз | |
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| где | дгд | дад | да! | !ас | С!д | дса | адд | а!с | асе | сад | дад | ддс | сад | адд | !ас | 2736 |
| Суз | Уа1 | СТи | Азр | туг | ьеи | АТа | Агд | Пе | ТЬг | СТп | сТи | С 1 у | СТп | Агд | Туг | |
| 900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
| саа | дсс | сед | аад | дсс | сас | дед | дад | дад | аад | с!д | сад | с!д | дса | аас | дад | 2784 |
| сТп | А1а | ьеи | ьуз | А1а | нтз | АТа | сТи | СТи | ьуз | ьеи | сТп | ьеи | АТа | А5П | еТи | |
| 915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
| дад | а! с | дсс | сад | д!с | едд | аде | аад | дсс | сад | дед | даа | дед | !!д | дсс | С!С | 2832 |
| еТи | Пе | АТа | СТп | УаТ | Агд | 5ег | Ьуз | АТа | СТ η | АТа | СТ и | АТа | Ьеи | АТа | ьеи | |
| 930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
| сад | дсс | аде | с!д | адд | аад | дад | сад | а!д | сдс | асе | сад | !сд | с!д | дад | аад | 2880 |
| СТп | АТа | 5ег | ьеи | Агд | ьуз | сТи | СТп | Ме! | Агд | Пе | СТп | 5ег | Ьеи | сТи | ьуз | |
| 945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
| аса | дед | дад | сад | аад | ас! | ааа | дад | аас | дад | дад | с!д | асе | адд | а! с | где | 2928 |
| ТНг | УаТ | сТи | СТп | 1_у5 | тЬг | ьуз | сТи | АЗП | сТи | сТи | ьеи | тКг | Агд | Пе | суз | |
| 965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
| дас | дас | с!с | а! с | !СС | аад | а!д | дад | аад | а! с | !да | 2961 | |||||
| Αδρ | Азр | ьеи | Пе | 5ег | ьуз | ме! | сТи | ьуз | Пе | |||||||
| 980 | 985 | |||||||||||||||
| <210> - | 4 | |||||||||||||||
| <211> ! | Э86 | |||||||||||||||
| <212> 1 | ||||||||||||||||
| <213> 1 | чото | зарт епз | ||||||||||||||
| <400> - | 4 | |||||||||||||||
| Ме! | СТу | А1а | Рго | АТа | Суз | АТа | ьеи | АТа | ьеи | Суз | УаТ | АТа | УаТ | аТ а | Пе | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| Уа1 | А1а | сТу | Αί а | 5ег | 5ег | сТи | 5ег | ьеи | СТу | тНг | сТи | сТп | Агд | УаТ | УаТ | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| СТу | Агд | а1 а | А1а | сТи | УаТ | Рго | СТу | рго | СТ и | Рго | СТу | СТп | СТп | сТи | сТп | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| Ьеи | Уа1 | РЬе | С1у | 5ег | СТу | Азр | АТа | УаТ | еТи | ьеи | 5ег | Суз | Рго | РГО | РГО | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| сТу | С1у | СТу | Рго | ме! | СТу | Рго | тЬг | УаТ | тгр | УаТ | ьуз | Азр | СТу | тКг | СТу | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| ьеи | УаТ | Рго | 5ег | сТи | Агд | УаТ | ьеи | УаТ | СТу | РГО | СТп | Агд | ьеи | СТп | УаТ | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| ьеи | АЗП | АТа | 5ег | НТ 5 | еТи | Азр | 5ег | сТу | АТ а | туг | 5ег | Суз | Агд | СТп | Агд | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| ьеи | тКг | СТп | Агд | УаТ | ьеи | Су5 | НТ 5 | рКе | 5ег | УаТ | Агд | УаТ | ТЬг | Азр | АТа |
- 52 029140
115 120 125
| РГО | Бег Бег б!у Азр 130 | А5р С1и Азр С1у С1и Азр 135 | С! и 140 | А1а | б1и | А5р | тЬг | ||||||||
| б!у | Уа! | Азр | ТЬг | с1у | А1а | Рго | туг | тгр | тЬг | Агд | Рго | с! и | Агд | Мех | Азр |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ьуз | 1_уз | Ьеи | Ьеи | А1а | Уа1 | Рго | А1а | А1а | АЗП | ТЬг | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | Суз |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| рго | а! а | А1а | б1у | АЗП | РГО | ТЬг | Рго | Бег | 11 е | Бег | тгр | Ьеи | ьуз | АЗП | С1у |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | б1и | РЬе | Агд | б!у | б1и | нтз | Агд | Пе | С1у | С1у | Не | ЬУ5 | Ьеи | Агд | Нт 5 |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| С1п | С1п | Тгр | Бег | ьеи | Уа1 | мет | С1и | Бег | Уа! | Уа! | Рго | Бег | Азр | Агд | 61 у |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| АЗП | туг | ТЬг | Суз | Уа! | Уа1 | б1и | АЗП | ьуз | РЬе | с1у | Бег | Пе | Агд | С! η | тЬг |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Туг | тКг | ьеи | Азр | Уа! | ьеи | С1и | Агд | Бег | Рго | НТ 5 | Агд | Рго | Пе | ьеи | С1п |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| а! а | б!у | ьеи | Рго | А1 а | АЗП | б1п | ТЬг | а! а | Уа! | ьеи | с! у | Бег | АЗр | Уа! | б1и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| РЬе | Нтз | суз | ьуз | Уа! | Туг | Бег | Азр | А1а | С1п | Рго | НТ 5 | Пе | С1п | тгр | Ьеи |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ьуз | НТ 5 | Уа! | с! и | Уа1 | АЗП | С1у | Бег | ьуз | Уа! | б1у | рго | Азр | с! у | тЬг | РГО |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| туг | Уа! | ТЬг | Уа! | Ьеи | ЬУ5 | Бег | Тгр | 11е | Бег | с! и | Бег | Уа1 | с1и | а! а | Азр |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | ьеи | Агд | Ьеи | А1а | АЗП | Уа1 | Бег | С1и | Агд | Азр | е!у | с1у | е1и | Туг |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Ьеи | Суз | Агд | А1а | ТЬг | Азп | РЬе | Пе | С1у | Уа1 | А1а | с! и | ьуз | А! а | РЬе | тгр |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| ьеи | 5ег | Уа! | НТ 5 | б1у | Рго | Агд | А1а | А1а | б!и | б!и | С1и | ьеи | Уа! | С! и | А1а |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| А5р | С1и | а! а | б!у | Бег | Уа! | Туг | А1а | с!у | Не | Ьеи | Бег | туг | С! у | Уа1 | б1у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| РЬе | Ьеи | ьеи | РЬе | 11 е | Ьеи | Уа1 | уа! | А1а | А1а | Уа! | тЬг | ьеи | Суз | Агд | ьеи |
- 53 029140
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Агд | 5ег | Рго | Рго | ьуз | ьуз | с! у | ьеи | с! у | 5ег | РГО | тНг | Уа! | НТ 5 | Ьуз | 1!е |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| 5ег | Агд | РНе | РГО | ьеи | ьуз | Агд | с!п | Уа! | 5ег | ьеи | е!и | 5ег | АЗП | а! а | 5ег |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Мег | 5ег | 5ег | АЗП | тНг | Рго | ьеи | Уа! | Агд | 11е | а! а | Агд | ьеи | 5ег | 5ег | С! у |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| с!и | с! у | Рго | тНг | ьеи | а! а | Азп | Уа! | 5ег | с! и | ьеи | с!и | ьеи | Рго | а! а | Азр |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| РГО | Ьуз | тгр | С! и | ьеи | 5ег | Агд | а! а | Агд | ьеи | тНг | ьеи | с! у | ьуз | Рго | ьеи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| С1у | С! и | с! у | суз | РНе | С! у | с!п | Уа! | Уа! | мет | а! а | С! и | а! а | 1!е | с! у | 1!е |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Азр | Ьуз | Азр | Агд | а! а | а! а | Ьуз | Рго | Уа! | ТНг | Уа! | а! а | Уа! | ьуз | мет | Ьеи |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| ьуз | Азр | А5Р | А! а | тНг | Азр | ЬУ5 | А5р | ьеи | 5ег | А5р | ьеи | Уа! | 5ег | с!и | мет |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| с1и | мет | мет | Ьуз | мет | 1!е | С1у | Ьуз | НТ 5 | Ьуз | А5П | 11е | 11е | АЗП | ьеи | ьеи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| б!у | а! а | суз | ТНг | с!п | с! у | С! у | Рго | Ьеи | туг | Уа! | Ьеи | Уа! | с! и | туг | а! а |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| А1а | ьуз | с1у | АЗП | Ьеи | Агд | с! и | РНе | Ьеи | Агд | А1а | Агд | Агд | Рго | Рго | С! у |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| ьеи | АЗр | туг | 5ег | рНе | Азр | ТНг | суз | ьуз | Рго | Рго | с! и | с! и | с!п | ьеи | тНг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| РНе | ьуз | Азр | ьеи | Уа! | 5ег | суз | а! а | Туг | с!п | Уа! | А1а | Агд | С!у | мет | с!и |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| туг | ьеи | а! а | 5ег | с!п | ьуз | суз | 11е | НТ 5 | Агд | Азр | Ьеи | А! а | А! а | Агд | А5П |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Уа! | ьеи | Уа! | тНг | с! и | Азр | АЗП | Уа! | мет | ьуз | 1!е | А! а | Азр | РНе | С! у | ьеи |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| а! а | Агд | Азр | Уа! | ΗΊ 5 | АЗП | ьеи | АЗр | туг | туг | ьуз | ьуз | ТНг | тНг | Азп | С! у |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Агд | Ьеи | Рго | Уа! | ЬУ5 | тгр | мет | а! а | рго | С! и | а! а | ьеи | РНе | Азр | Агд | Уа! |
- 54 029140
660 665 670
| Туг | тКг | НТ 5 675 | С1п | зег | А5р | Уа1 | тгр зег РКе С1у Уа1 680 | ьеи 685 | ьеи Тгр с!и | ||||||
| Пе | РКе | ТКг | ьеи | С1у С1у | Зег | Рго | Туг | Рго | С1у | Пе | РГО | Уа1 | С1и | С1и | |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| ьеи | РКе | ьуз | ьеи | ьеи | ьуз | С1и | С1у | Нт 5 | Агд | мет | Азр | ьуз | Рго | А1а | Азп |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| СУ5 | тКг | НТ 5 | Азр | ьеи | туг | мет | 11 е | мет | Агд | С1и | суз | Тгр | НТ 5 | А1а | А1а |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| Рго | Зег | С1п | Агд | РГО | тКг | РКе | ьуз | с!п | Ьеи | Уа1 | С1и | А5р | ьеи | АЗр | Агд |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| Уа1 | ьеи | тКг | Уа1 | тКг | 5ег | тКг | АЗр | Уа1 | Рго | С1у | Рго | рго | Рго | С1у | Уа1 |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| Рго | А1а | РГО | С1у | С1у | РГО | РГО | ьеи | 5ег | ТКг | С1у | Рго | Пе | Уа1 | Азр | ьеи |
| 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
| Ьеи | С1п | туг | Зег | С1п | ьуз | АЗр | ьеи | Азр | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьуз | А1а | тКг | с1п |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| С1и | СТ и | Азп | Агд | С1и | Ьеи | Агд | 5ег | Агд | Суз | С1и | С1и | Ьеи | НТ 5 | С1у | ьуз |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| АЗП | Ьеи | С1и | ьеи | С1у | ьуз | Пе | мет | Азр | Агд | РКе | С1и | С1и | Уа1 | Уа1 | туг |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| 6ΐη | а1 а | мет | С1и | С1и | Уа1 | С1п | ьуз | с1п | ьуз | с!и | ьеи | Зег | ьуз | А1а | С1и |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| Пе | С1п | Ьуз | Уа1 | Ьеи | Ьуз | С1и | ьуз | Азр | 61 η | ьеи | ТКг | ТКг | Азр | Ьеи | Азп |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| 5ег | мет | с!и | Ьуз | Зег | РКе | Зег | А5р | Ьеи | РКе | ьуз | Агд | РКе | С1и | ЬУ5 | С1п |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| 1_У5 | с1и | Уа1 | Пе | С1и | С1у | туг | Агд | ьуз | Азп | С1и | С1и | 5ег | ьеи | Ьуз | ьуз |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| Суз | УаТ | С1и | Азр | Туг | ьеи | А1а | Агд | Пе | тКг | С1п | С1и | С1у | с!п | Агд | туг |
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| С1п | А1а | ьеи | ьуз | А1а | НТ 5 | А1а | С1и | С1и | ьуз | Ьеи | С1п | Ьеи | А1а | Азп | С1и |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| С1и | 11 е | А1а | С1п | Уа1 | Агд | зег | Ьуз | А1а | С1п | А1а | С1и | А1а | ьеи | А1а | ьеи |
- 55 029140
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| С1п | А1а | 5ег | ьеи | Агд | Ьуз | С1и | С1п | Мег | Агд | 11е | С1п | 5ег | Ьеи | С1и | Ьуз |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
| ТКг | Уа1 | е1и | е!п | ьу5 | ТКг | ьуз | е!и | АЗП | С1и | С1и | Ьеи | тКг | Агд | 11 е | Суз |
| 965 | 970 | 975 | |||||||||||||
| Азр | Азр | ьеи | 11е | 5ег | ьуз | мег | С1и | ьуз | 11е |
980 985 <210> 5 <211> 3003 <212> ДНК
| <213> Ното зартепз | |||||||||||||||
| <220> | |||||||||||||||
| <221> СР5 | |||||||||||||||
| <222> 1 | :ΐ).. | ,(3003) | |||||||||||||
| <400> : | |||||||||||||||
| агд | ддс | дсс | ссг | дсс | где | дсс | сгс | дед сгс | где | дгд уа! | дсс | дгд Уа1 | дсс | агс | 48 |
| Мег | 61 у | А1а | рго | А1а | Су5 | А1а | ьеи | А1а ьеи | Суз | а! а | А1а | 11е | |||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| 9*9 Уа1 | дсс А1а | ддс С1у | дсс А1а | гсс 5ег | гсд 5ег | дад С1и | гсс 5ег | ггд ддд Ьеи С1у | асд ТКг | дад С1и | сад С1п | сдс Агд | дгс Уа1 | дгд УаТ | 96 |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| ддд | еда | дед | дса | даа | дгс | ссд | ддс С1у | сса дад | ссс | ддс С1у | сад | сад | дад | сад | 144 |
| С1у | Агд | А1а | А1а | с!и | Уа1 | Рго | Рго с!и | РГО | с1п | с1п | С1и | С1п | |||
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| **д | дгс | ггс | ддс с!у | аде | ддд | даг | дег | д*д дад Уа1 е1и | егд | аде | *д* | ссс | ссд | ссс | 192 |
| ьеи | Уа1 | РКе | 5ег | 61 у | Азр | А1а | ьеи | 5ег | суз | рго | рго | рго | |||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| ддд | 99* С1у | дд* | ссс | агд | ддд С1у | ссс | асг | д*с гдд | дгс | аад | даг | ддс | аса | ддд С1у | 240 |
| С1у | е1у | РГО | мег | Рго | тКг | Уа1 тгр | Уа1 | ьуз | Азр | С1у | ТКг | ||||
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| егд ьеи | дгд Уа1 | ссс Рго | гсд 5ег | дад е!и | едг Агд | дгс Уа1 | егд ьеи | д*д ддд Уа1 С1у | ссс РГО | сад С1п | едд Агд | егд Ьеи | сад С1п | д*д Уа1 | 288 |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| егд | ааг | дсс | гсс | сас | дад | дас | гсс | ддд дсс | гас | аде | где | едд | сад | едд | 336 |
| ьеи | АЗП | А1а | 5ег | ΗΪ 5 | с!и | Азр | 5ег | С1у А1а | туг | Зег | суз | Агд | е!п | Агд | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| сгс | асд | сад | сдс | дга | егд | где | сас | ггс адг | дгд Уа1 | едд | д*д Уа1 | аса | дас | дег | 384 |
| ьеи | ТКг | С1п | Агд | Уа! | ьеи | суз | НТ 5 | РКе 5ег | Агд | ТКг | Азр | А1а | |||
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| сса | гсс | гсд | дда С1у | даг | дас | даа | дас | ддд дад С1у с!и | дас | дад | дег | дад | дас | аса | 432 |
| Рго | 5ег | 5ег | Азр | Азр | е!и | Азр | Азр | С1и | А1а | с1и | Азр | тКг | |||
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| дд* | 9*9 Уа1 | дас | аса | ддд | дсс | ссг | гас | гдд аса | едд | ссс | дад | едд | агд | дас | 480 |
| 61 у | Азр | тКг | С1у | А1а | рго | туг | тгр тКг | Агд | Рго | с1и | Агд | мег | А5р | ||
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| аад | аад | егд | егд | дсс | д*д Уа1 | ссд | дсс | дсс аас | асе | дгс | сдс | ггс | сдс | где | 528 |
| ьуз | ьуз | ьеи | ьеи | А1а | рго | А1а | А1а Азп | тКг | Уа1 | Агд | РКе | Агд | суз |
- 56 029140
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| сса | дсс | дее | ддс | аас | ссс | асе | ссс | есс | асе | есс | едд | сед | аад | аас | ддс | 576 |
| РГО | А1а | А1а | С1у | АЗП | РГО | ТЬг | рго | 5ег | Пе | Зег | тгр | ьеи | ьуз | Азп | с!у | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| адд | дад | ССС | еде | ддс | дад | сас | еде | асе | дда | ддс | аес | аад | сед | едд | сас | 624 |
| Агд | б!и | РЬе | Агд | С1у | б1и | НТ 5 | Агд | Пе | С!у | С!у | Пе | ьуз | ьеи | Агд | нт 5 | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| сад | сад | едд | аде | сед | дее | асд | даа | аде | дед | дед | ссс | есд | дас | сдс | ддс | 672 |
| б!п | С1п | тгр | 5ег | ьеи | Уа! | мес | С! и | 5ег | Уа! | Уа! | Рго | зег | Азр | Агд | С1у | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| аас | Тае | асе | еде | дее | дед | дад | аас | аад | еее | ддс | аде | аес | едд | сад | асд | 720 |
| АЗП | туг | тКг | суз | уа! | Уа1 | с! и | АЗП | ьуз | рЬе | С1у | Зег | Пе | Агд | с! η | тЬг | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| гас | асд | сед | дас | дед | сед | дад | еде | есс | ссд | сас | едд | ссс | аес | сед | сад | 768 |
| туг | тЬг | Ьеи | Азр | Уа 1 | 1_еи | с! и | Агд | 5ег | Рго | НТ 5 | Агд | РГО | Пе | Ьеи | с! η | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| дед А1а | ддд б!у | сед ьеи | сед РГО | дсс а! а | аас Азп | сад С! η | асд ТЬг | дед а! а | дед Уа! | сед ьеи | ддс С1у | аде Зег | дас А5Р | дед Уа! | дад С! и | 816 |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| «с | сас | еде | аад | дед | сас | аде | дас | дса | сад | ссс | сас | аес | сад | едд | сес | 864 |
| РЬе | Нт 5 | Суз | ьуз | уа! | Туг | 5ег | Азр | а! а | С1п | РГО | НТ 5 | Пе | С1п | тгр | ьеи | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| аад ьуз | сас НТ 5 | дед Уа1 | дад С1и | дед Уа! | аас Азп | ддс С1у | аде 5ег | аад ьуз | дед Уа! | ддс С!у | сед РГО | дас Азр | ддс е!у | аса тЬг | ссс Рго | 912 |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| еас | дее | асе | дед | сес | аад | есс | едд | асе | аде | дад | аде | дед | дад | дсс | дас | 960 |
| туг | Уа! | тКг | Уа! | ьеи | ьуз | 5ег | тгр | Пе | Зег | б1и | зег | Уа! | С! и | а! а | Азр | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| дед | еде | сес | еде | сед | дсс | аас | дед | есд | дад | едд | дас | ддд | ддс | дад | еас | 1008 |
| Уа1 | Агд | ьеи | Агд | ьеи | А! а | АЗП | Уа! | 5ег | С! и | Агд | Азр | С!у | С1у | с! и | туг | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| сес | еде | еда | дсс | асе | аас | сес | аса | ддс | дед | дсс | дад | аад | дсс | еее | едд | 1056 |
| ьеи | су 5 | Агд | А1а | ТЬг | Азп | рЬе | Пе | С1у | Уа! | а! а | с! и | ЬУЗ | А! а | рЬе | тгр | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| сед | аде | дее | сас | ддд | ссс | еда | дса | дсс | дад | дад | дад | сед | дед | дад | дее | 1104 |
| ьеи | 5ег | Уа1 | НТ 5 | С1у | Рго | Агд | а! а | А! а | е!и | с! и | с! и | Ьеи | Уа1 | С! и | а! а | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| дас | дад | дед | ддс | аде | дед | еае | дса | ддс | аес | сес | аде | еас | ддд | дед | ддс | 1152 |
| Азр | с! и | а! а | С1у | 5ег | Уа! | Туг | А1а | с! у | Пе | ьеи | зег | туг | С1у | Уа! | С1у | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| ССС | еее | сед | есс | асе | сед | дед | дед | дед | дее | дед | асд | сес | еде | сдс | сед | 1200 |
| РЬе | РКе | ьеи | РЬе | Пе | Ьеи | уа1 | уа! | а! а | А1а | Уа1 | ТЬг | ьеи | суз | Агд | ьеи | |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| еде | аде | ссс | ссс | аад | ааа | ддс | сед | ддс | есс | ссс | асе | дед | сас | аад | аес | 1248 |
| Агд | 5ег | РГО | РГО | ьуз | ьуз | С!у | ьеи | с!у | зег | рго | тЬг | Уа! | Нт 5 | ьуз | Пе | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| есс | еде | ссс | сед | сес | аад | еда | сад | дед | есс | сед | дад | есс | аас | дед | есс | 1296 |
| 5ег | Агд | рЬе | РГО | Ьеи | ьуз | Агд | с! η | Уа! | зег | ьеи | с! и | Зег | АЗП | а! а | зег | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| асд | аде | есс | аас | аса | сса | сед | дед | сдс | аес | дса | адд | сед | есс | сса | ддд | 1344 |
| МеС | 5ег | 5ег | АЗП | тКг | РГО | ьеи | Уа! | Агд | Пе | а! а | Агд | Ьеи | 5ег | 5ег | 61 у |
- 57 029140
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| дад | ддс | ссс | асд | сгд | дсс | ааг | дгс | гсс | дад | сгс | дад | сед | ссг | дсс | дас | 1392 |
| С1и | б1у | РГО | тКг | ьеи | А1а | АЗП | уа! | 5ег | б1и | ьеи | б1и | ьеи | рго | а! а | А5Р | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| ссс | ааа | сдд | дад | сгд | гсг | сдд | дсс | сдд | сгд | асе | сгд | ддс | аад | ссс | егг | 1440 |
| РГО | ьуз | Тгр | б!и | ьеи | 5ег | Агд | а! а | Агд | Ьеи | тКг | ьеи | б!у | ьуз | рго | ьеи | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| ддд | дад | ддс | сде | ггс | ддс | сад | дед | дгс | агд | дед | дад | дсс | агс | ддс | агг | 1488 |
| б1у | б1и | б1у | суз | рКе | 61у | б1п | Уа! | уа! | Мег | А1а | б1и | а! а | Пе | 61у | Пе | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| дас | аад | дас | сдд | дсс | дсс | аад | ссг | дгс | асе | дга | дсс | дед | аад | агд | сгд | 1536 |
| Азр | Ьуз | Азр | Агд | А1а | а! а | ьуз | рго | уа! | ТКг | Уа! | А1а | Уа1 | ьуз | мег | ьеи | |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| ааа | дас | даг | дсс | асг | дас | аад | дас | сгд | гсд | дас | сгд | дед | гсг | дад | агд | 1584 |
| ьуз | Азр | А5р | а! а | тКг | А5р | ьуз | Агр | ьеи | 5ег | А5Р | ьеи | Уа! | 5ег | 61 и | мег | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| дад | агд | агд | ааа | агд | агс | ддд | ааа | сас | ааа | аас | агс | агс | аас | сгд | сгд | 1632 |
| б1и | мег | мег | ьуз | мег | Пе | 61 у | Ьуз | нтз | ьуз | АЗП | Пе | Пе | АЗП | Ьеи | ьеи | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| ддс | дсс | где | асд | сад | ддс | ддд | ссс | сгд | гас | дед | сгд | дед | дад | гас | дед | 1680 |
| 61 у | А! а | суз | ТКг | б1п | с’у | С1у | Рго | ьеи | туг | Уа! | ьеи | уа! | б!и | ту Г | а! а | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| дсс | аад | ддс | аас | сгд | сдд | дад | ггг | сгд | сдд | дед | сдд | сдд | ссс | ссд | ддс | 1728 |
| а! а | ьуз | с'у | АЗП | ьеи | Агд | 61 и | РКе | ьеи | Агд | А! а | Агд | Агд | РГО | рго | 61у | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| сгд | дас | гас | гсс | ггс | дас | асе | где | аад | ссд | ссс | дад | дад | сад | сгс | асе | 1776 |
| ьеи | Азр | ту Г | 5ег | рКе | Азр | ТКг | суз | ьуз | рго | рго | б1и | б1и | б!п | ьеи | тКг | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| ггс | аад | дас | сгд | дгд | гсс | гдг | дсс | гас | сад | дед | дсс | сдд | ддс | агд | дад | 1824 |
| РКе | ьуз | АЗр | ьеи | Уа! | 5ег | Су 5 | А! а | Туг | б!п | уа! | а! а | Агд | б1у | мег | б1и | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| гас | ггд | дсс | гсс | сад | аад | где | агс | сас | адд | дас | сгд | дег | дсс | сдс | ааг | 1872 |
| Туг | ьеи | а! а | 5ег | б!п | ьуз | суз | Пе | НТ 5 | Агд | АЗр | ьеи | а! а | а! а | Агд | АЗП | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| дед | сгд | дед | асе | дад | дас | аас | дед | агд | аад | агс | дса | дас | ггс | ддд | сгд | 1920 |
| Уа! | ьеи | Уа! | ТКг | б!и | Азр | АЗП | Уа! | мег | ьуз | Пе | а! а | Азр | рКе | б1у | ьеи | |
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| дсс | сдд | дас | дед | сас | аас | сгс | дас | гас | гас | аад | аад | аса | асе | аас | ддс | 1968 |
| А1а | Агд | Азр | Уа! | нтз | АЗП | ьеи | Азр | ту Г | туг | ьуз | ьуз | тКг | тКг | А5П | 61у | |
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| сдд | сгд | ссс | дед | аад | едд | агд | дед | ссг | дад | дсс | ггд | ггг | дас | еда | дгс | 2016 |
| Агд | ьеи | РГО | Уа! | ьуз | тгр | мег | А1а | рго | 61 и | а! а | ьеи | РКе | Аэр | Агд | уа! | |
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| гас | асг | сас | сад | адг | дас | дгс | сдд | гсс | ггг | ддд | дес | сгд | сгс | едд | дад | 2064 |
| Туг | тКг | Нтз | б!п | 5ег | Азр | Уа1 | тгр | 5ег | РКе | 61 у | Уа! | Ьеи | ьеи | Тгр | б1и | |
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
| агс 11е | ггс РКе | асд тКг | сгд ьеи | ддд 61 у | ддс 61 у | гсс 5ег | ссд Рго | гас ту Г | ссс Рго | ддс б1у | агс 11 е | ссг РГО | дед Уа! | дад б!и | дад б!и | 2112 |
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| сгс | ггс | аад | сгд | сгд | аад | дад | ддс | сас | сдс | агд | дас | аад | ссс | дсс | аас | 2160 |
| ьеи | РКе | ьуз | ьеи | ьеи | ьуз | б!и | б’у | НТ 5 | Агд | мег | Азр | ьуз | Рго | а! а | А5П |
- 58 029140
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| еде | аса | сас | дас | сед | сас | асд | асе | асд | едд | дад | еде | тдд | сас | дсс | дед | 2208 |
| СУ5 | тЬг | Нт 5 | Азр | ьеи | туг | мее | Не | мее | Агд | б1и | суз | тгр | НТ 5 | А1а | А1а | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| ССС | ГСС | сад | адд | ССС | асе | еес | аад | сад | сед | д*д | дад | дас | сед | дас | сде | 2256 |
| РГО | 5ег | С1п | Агд | РГО | тЬг | рЬе | ьуз | б!п | ьеи | Уа1 | б!и | Азр | ьеи | Азр | Агд | |
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| дес | сее | асе | дтд | асд | есс | асе | дас | дад | сас | сед | дас | сед | есд | дед | ссе | 2304 |
| Уа1 | ьеи | ТЬг | Уа1 | ТЬг | 5ег | тЬг | Азр | б1и | туг | Ьеи | Азр | ьеи | 5ег | А1а | РГО | |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| еес | дад | сад | Сас | есс | ссд | ддс | ддс | сад | дас | асе | ССС | аде | есс | аде | есс | 2352 |
| РЬе | б!и | С1п | туг | 5ег | РГО | 61 у | 61 у | 61 η | Азр | тЬг | РГО | 5ег | 5ег | 5ег | 5ег | |
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| еса | ддд | дас | дас | есс | дад | дсс | стд | дда | ддд | еса | дее | едд | ССС | дсс | еде | 2400 |
| 5ег | 61 у | Азр | Азр | 5ег | б1и | Уа1 | ьеи | 61 у | 61 у | 5ег | Уа1 | тгр | РГО | а1 а | суз | |
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
| сед | сед | асе | едд | д^д | *дд | ССС | дад | сад | дса | аад | дед | аса | сад | дад | дад | 2448 |
| ьеи | Ьеи | тЬг | тгр | уа 1 | тгр | РГО | б!и | 6ΐη | Уа1 | ьуз | А1а | тЬг | б1п | 61 и | 61 и | |
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| аас | едд | дад | сед | адд | аде | адд | еде | дад | дад | сес | сас | ддд | аад | аас | стд | 2496 |
| АЗП | Агд | б1и | ьеи | Агд | 5ег | Агд | суз | б1и | 61 и | ьеи | НТ 5 | б!у | ьуз | АЗП | ьеи | |
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| даа | сед | ддд | аад | асе | асд | дас | адд | еес | даа | дад | дее | дтд | еас | сад | дсс | 2544 |
| б1и | Ьеи | 61у | Ьуз | 11е | мее | Азр | Агд | рЬе | б!и | б1и | Уа! | Уа | туг | б1п | А1а | |
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| агд | дад | даа | дее | сад | аад | сад | аад | даа | сее | есс | ааа | дее | даа | аес | сад | 2592 |
| Мее | б1и | б1и | Уа! | 6ΐη | ьуз | 6ΐη | ьуз | б1и | ьеи | 5ег | ьуз | А1а | б1и | 11е | б1п | |
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| ааа | дее | сеа | ааа | даа | ааа | дас | саа | сее | асе | аса | дае | сед | аас | есс | аед | 2640 |
| Ьуз | Уа! | ьеи | ьуз | б1и | ьуз | Азр | б!п | ьеи | тЬг | тЬг | Азр | ьеи | АЗП | 5ег | мее | |
| 865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| дад | аад | есс | еес | есс | дас | ССС | еес | аад | сде | еее | дад | ааа | сад | ааа | дад | 2688 |
| 61 и | ьуз | 5ег | РЬе | 5ег | Азр | ьеи | рЬе | ьуз | Агд | рЬе | б1и | Ьу5 | б!п | ьуз | б!и | |
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| д*д | аес | дад | ддс | сас | сде | аад | аас | даа | дад | еса | сед | аад | аад | еде | дед | 2736 |
| Уа1 | Не | б1и | 61 у | туг | Агд | ьуз | АЗП | 61 и | 61 и | 5ег | ьеи | ьуз | ьуз | Суз | уа! | |
| 900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
| дад | дае | Сас | сед | дса | адд | асе | асе | сад | дад | ддс | сад | адд | еас | саа | дсс | 2784 |
| 61 и | Азр | туг | ьеи | А1а | Агд | 11е | тЬг | 6ΐη | 61 и | б1у | 6ΐη | Агд | туг | 6ΐη | А1а | |
| 915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
| сед | аад | дсс | сас | дед | дад | дад | аад | сед | сад | сед | дса | аас | дад | дад | аес | 2832 |
| Ьеи | ьуз | А1а | Нт 5 | А1а | б1и | б1и | ьуз | Ьеи | б!п | ьеи | А1а | АЗП | б1и | б!и | 11е | |
| 930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
| дсс | сад | дсс | едд | аде | аад | дсс | сад | дед | даа | дед | еед | дсс | сес | сад | дсс | 2880 |
| А1а | С1п | Уа1 | Агд | 5ег | ьуз | А1а | 61 η | А1а | б!и | А1а | ьеи | А1а | ьеи | 6ΐη | А1а | |
| 945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
| аде | сед | адд | аад | дад | сад | асд | сдс | асе | сад | *сд | сед | дад | аад | аса | дед | 2928 |
| 5ег | ьеи | Агд | ьуз | 61 и | с1п | мее | Агд | 11е | б!п | 5ег | Ьеи | б1и | ьуз | ТЬг | Уа! | |
| 965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
| дад | сад | аад | асе | ааа | дад | аас | дад | дад | сед | асе | адд | аес | еде | дас | дас | 2976 |
| б!и | С1п | ьуз | ТЬг | ьуз | б!и | Азп | б!и | б!и | ьеи | тЬг | Агд | 11 е | суз | Азр | Азр |
- 59 029140
| 980 | 985 | 990 | |||||||
| СТС | атс | ТСС | аад | агд | дад | аад | атс тда | 3003 | |
| Ьеи | Пе | 5ег | Ьуз | МеТ | с!и | ьуз | Пе | ||
| 995 | 1000 |
<210> б <211> 1000 <212> РРТ <213> ното зартепз <400> б
| Мет С1у 1 | А1а Рго а!а Су5 а!а 5 | ьеи А!а ьеи Суз 10 | Уа! | а! а | Уа! | а! а 15 | Пе | ||||||||
| Уа! | А1а | с! у | а! а | 5ег | 5ег | С! и | 5ег | Ьеи | С! у | ТНг | с! и | С! η | Агд | Уа! | Уа! |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| е!у | Агд | а! а | а! а | с! и | Уа! | Рго | с! у | Рго | с! и | РГО | с! у | с! η | с! η | с! и | С! п |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| ьеи | Уа! | рКе | С1у | 5ег | С! у | Азр | А! а | Уа! | С1и | ьеи | 5ег | Суз | Рго | РГО | Рго |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С1у | С! у | С! у | Рго | мет | с!у | Рго | ТКг | Уа! | Тгр | Уа! | ьуз | Азр | с!у | тКг | С1у |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Уа! | Рго | 5ег | С! и | Агд | Уа! | ьеи | Уа! | С! у | рго | с! η | Агд | Ьеи | с! η | Уа! |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ьеи | АЗП | А! а | 5ег | Н1 5 | С1и | Азр | 5ег | с! у | А1а | Туг | 5ег | Суз | Агд | С! η | Агд |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| ьеи | тКг | с! η | Агд | Уа! | ьеи | Суз | нт 5 | рКе | 5ег | Уа! | Агд | Уа! | ТКг | Азр | а! а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Рго | 5ег | 5ег | е!у | Азр | Азр | С! и | Азр | с! у | е!и | Азр | с! и | а! а | с! и | Азр | тКг |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| с!у | Уа! | Азр | тКг | с!у | А! а | Рго | Туг | тгр | ТКг | Агд | Рго | с! и | Агд | Мет | Азр |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ьу5 | 1_У5 | ьеи | ьеи | а! а | Уа! | Рго | а! а | а! а | АЗП | ТКг | Уа! | Агд | р|те | Агд | Суз |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Рго | А! а | А! а | С! у | А5П | РГО | ТКг | Рго | 5ег | Пе | 5ег | Тгр | Ьеи | Ьуз | АЗП | С! у |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | с! и | р(те | Агд | С! у | с! и | НТ 5 | Агд | Пе | с! у | С! у | Пе | ьуз | Ьеи | Агд | нтз |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| С1п | с! η | тгр | 5ег | Ьеи | Уа! | мет | С! и | 5ег | Уа! | Уа! | Рго | 5ег | Азр | Агд | С! у |
| 210 | 215 | 220 |
- 60 029140
| АЗП 225 | туг | тКг суз | Уа! | Уа! 230 | с! и | Азп | Ьуз РКе | е!у Вег Пе Агд с!п тКг | |||||||
| 235 | 240 | ||||||||||||||
| туг | ТКг | ьеи | Азр | Уа! | Деи | с1и | Агд | Вег | Рго | НТ 5 | Агд | РГО | Пе | Деи | С1п |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| а! а | С1у | ьеи | Рго | А! а | Азп | с!п | тКг | а! а | Уа! | Деи | С! у | Вег | А5р | Уа! | С! и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| РКе | Нт 5 | Суз | ьуз | Уа! | туг | вег | Азр | А! а | с!п | РГО | Нт 5 | Пе | С1п | Тгр | Деи |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ьуз | НТ 5 | Уа! | с!и | Уа! | АЗП | с! у | Вег | |_уз | Уа1 | с! у | РГО | Азр | С1у | тКг | РГО |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| туг | Уа! | тКг | Уа! | ьеи | 1_уз | Вег | Тгр | Пе | Вег | с! и | Вег | уа! | С1и | А1а | Азр |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | ьеи | Агд | ьеи | а! а | АЗП | Уа! | Вег | С! и | Агд | Азр | С! у | е!у | с! и | туг |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| деи | Суз | Агд | а! а | тКг | А5П | РКе | 1!е | С!у | Уа! | а! а | С1и | дуз | а! а | РКе | тгр |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| ьеи | вег | Уа1 | НТ 5 | с1у | Рго | Агд | а! а | А! а | С! и | С! и | С! и | деи | Уа1 | С! и | А! а |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Азр | с! и | А1а | С! у | Вег | уа! | туг | а! а | С! у | Не | Деи | Вег | Туг | с! у | Уа! | с! у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| РКе | РКе | |_еи | РКе | Пе | ьеи | Уа1 | Уа! | А! а | А1а | Уа! | ТКг | Деи | Суз | Агд | деи |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Агд | вег | рго | рго | ьуз | 1_уз | с! у | Деи | с! у | Вег | Рго | тКг | Уа! | Нт 5 | Ду5 | Пе |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Вег | Агд | РКе | Рго | Деи | ьуз | Агд | с!п | Уа! | Вег | Деи | с! и | Вег | Азп | а! а | вег |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| мес | вег | вег | АЗП | тКг | Рго | ьеи | Уа! | Агд | Не | А! а | Агд | деи | Вег | вег | с! у |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| с! и | С1у | РГО | ТКг | Ьеи | а! а | А5П | Уа1 | Вег | С! и | Деи | С! и | деи | РГО | а! а | Азр |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| рго | ьуз | тгр | С! и | Деи | вег | Агд | а! а | Агд | Деи | ТКг | Деи | с! у | дуз | РГО | деи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| с!у | с! и | с!у | Суз | РКе | с! у | б!п | Уа! | уа! | Мес | А! а | с! и | а! а | Пе | с! у | Пе |
| 485 | 490 | 495 |
- 61 029140
| А5Р | Ьуз Азр | Агд 500 | АТа АТа | ьуз Рго УаТ тКг УаТ 505 | АТа | УаТ | ьуз 510 | ме! | ьеи | ||||||
| ьуз | Азр | Азр | АТа | тКг | А5р | Ьуз | Азр | ьеи | Зег | Азр | ьеи | УаТ | Зег | сТи | Ме! |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| сТи | Ме! | мег | ьуз | ме! | Пе | СТу | Ьуз | ΗΊ 5 | Ьуз | Азп | 1Те | 1Те | АЗП | ьеи | Ьеи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| сТу | АТа | СУ5 | тКг | СТп | сТу | СТу | РГО | ьеи | Туг | УаТ | Ьеи | УаТ | сТи | туг | АТа |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| А1а | ьуз | СТу | Азп | ьеи | Агд | сТи | РКе | ьеи | Агд | АТа | Агд | Агд | Рго | Рго | СТу |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| ьеи | А5Р | Туг | Зег | РКе | Азр | тКг | суз | ьуз | рго | Рго | СТ и | сТи | СТп | ьеи | тКг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| РКе | ьуз | А5р | Ьеи | УаТ | Зег | Суз | аТ а | туг | СТп | УаТ | АТа | Агд | сТу | ме! | СТ и |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Туг | ьеи | АТа | Зег | СТп | Ьуз | суз | 1Те | НТ 5 | Агд | Азр | Ьеи | АТа | АТа | Агд | Азп |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Уа1 | ьеи | УаТ | ТКг | СТи | Азр | А5П | УаТ | ме! | Ьу5 | 1Те | АТа | А5Р | РКе | СТу | ьеи |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| АТа | Агд | Азр | УаТ | НТ 5 | АЗП | ьеи | Азр | Туг | Туг | Ьуз | ьуз | тКг | тКг | АЗП | СТу |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Агд | ьеи | рго | УаТ | Ьуз | тгр | ме! | аТ а | РГО | СТ и | АТа | ьеи | РКе | Азр | Агд | УаТ |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| туг | тКг | нт 5 | СТп | зег | Азр | УаТ | тгр | зег | РКе | СТу | УаТ | ьеи | ьеи | Тгр | сТи |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Не | РКе | ТКг | Ьеи | сТу | СТу | Зег | РГО | туг | Рго | СТу | 1Те | РГО | УаТ | сТи | сТи |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| ьеи | РКе | Ьуз | ьеи | ьеи | ьуз | сТи | сТу | ΗΪ 5 | Агд | ме! | Азр | ьуз | РГО | АТ а | Азп |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Суз | тКг | НТ 5 | Азр | ьеи | Туг | Ме! | 1Те | ме! | Агд | сТи | суз | тгр | НТ 5 | АТа | АТа |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| РГО | 5ег | СТп | Агд | Рго | ТКг | РКе | ьуз | СТ п | Ьеи | УаТ | сТи | Азр | ьеи | Азр | Агд |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| УаТ | ьеи | ТКг | УаТ | тКг | Зег | тКг | Азр | СТ и | Туг | ьеи | Азр | ьеи | Зег | АТа | Рго |
| 755 | 760 | 765 |
- 62 029140
| РНе | С1и 770 | С1п | Туг Зег Рго С1у 775 | С1у | С1п | Азр ТНГ | Рго 780 | зег Зег | Зег | зег | |||||
| 5ег | С1у | Азр | Азр | 5ег | С1и | Уа1 | ьеи | С1у | С1у | Зег | Уа1 | Тгр | Рго | А1а | суз |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| ьеи | Ьеи | тНг | Тгр | Уа1 | Тгр | Рго | С1и | С1п | Уа1 | Ьуз | А1а | тНг | С1п | С1и | С1и |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| АЗП | Агд | С1и | ьеи | Агд | зег | Агд | суз | С1и | С1и | ьеи | НТ 5 | с!у | ьуз | АЗП | Ьеи |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| С1и | ьеи | С1у | ьуз | Пе | мет | А5р | Агд | РНе | С1и | С1и | Уа1 | Уа1 | Туг | С1п | А1а |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| мет | с!и | С1и | Уа1 | С1п | ьуз | С1п | Ьуз | С1и | Ьеи | Зег | ьуз | А1а | С1и | Пе | С1п |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| ЬУ5 | Уа1 | Ьеи | ьуз | С1и | 1_У5 | Азр | С1п | ьеи | тНг | ТНг | Азр | Ьеи | АЗП | зег | Мет |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| С1и | ЬУ5 | зег | РНе | зег | АЗр | ьеи | РНе | ьуз | Агд | РНе | С1и | ьуз | С1п | ьуз | С1и |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| Уа1 | Пе | С1и | С1у | туг | Агд | ьуз | Азп | С1и | С1и | Зег | ьеи | ьуз | ьуз | Суз | Уа1 |
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| С1и | А5р | Туг | ьеи | А1а | Агд | ιί е | ТНг | С1п | С1и | С1у | с1п | Агд | Туг | С1п | А1а |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| ьеи | ьуз | А1а | Нт 5 | А1а | С1и | б1и | ьуз | Ьеи | С1п | ьеи | А1а | АЗП | С1и | б1и | Пе |
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| А1 а | С1п | Уа1 | Агд | Зег | ьуз | А1а | С1п | Αΐ а | С1и | А1а | ьеи | А1а | Ьеи | С1п | А1а |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
| Зег | Ьеи | Агд | ьуз | С1и | С1п | мет | Агд | Пе | С1п | зег | ьеи | С1и | ьуз | тНг | Уа1 |
| 965 | 970 | 975 | |||||||||||||
| с!и | С1п | ьуз | тНг | Ьуз | С1и | АЗП | С1и | С1и | ьеи | тНг | Агд | 11 е | Су 5 | Азр | Азр |
| 980 | 985 | 990 | |||||||||||||
| ьеи | Пе | Зег | 1_уз | мет | С1и | ьуз | Пе | ||||||||
| 995 | 1000 | ||||||||||||||
| <210> | 7 | ||||||||||||||
| <211> | 20 | ||||||||||||||
| <212> | ДНК | ||||||||||||||
| <213> | ното | зартепз | |||||||||||||
| <400> | 7 |
- 63 029140
| ссгддасгас | тссысдаса | |
| <210> | 8 | |
| <211> | 23 | |
| <212> | ДНК | |
| <213> | ното | зарт епз |
<400> 8 гсггстссаг сггддадатд адд 23 <210> 9 <211> 23 <212> ДНК <213> ногтю Бартелз <400> 9 тдтттдассд адтстасаст сас 23 <210> 10 <211> 24 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 10
11с1ссатдд адгтсадатс гдгд 24 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> И
1сс1дс1с1д ссддгсдсас 20
| <210> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 12 садсддсгсс дгддаддтса | 20 |
| <210> | 13 |
| <211> | 27 |
| <212> | ДНК |
| <213> | Искусственная |
| <220> | |
| <223> | Описание искусственной последовательности: искусственно синтезированная последовательность праймера |
| <400> | 13 |
| ддагссдсса ссагдддсдс сссгдсс |
<210> 14 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Описание искусственной последовательности: искусственно
- 64 029140 <400> 14 дааттстсад атсттстсса тсттдд 26 <210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 15 ддасстддас сдтдтсстта 20 <210> 16 <211> 20 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 16 тстсстсстд тдтсдсстгт 20 <210> 17 <211> 17 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 17 стддассдтд тссттас 17 <210> 18 <211> 17 <212> ДНК <213> ното 5артепз <400> 18 ссттстддст дтастдд 17 <210> 19 <211> 17 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 19 сттгсдадса дгасТсс 17 <210> 20 <211> 20 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 20 аддссасасс саадТсадса 20 <210> 21 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Описание искусственной последовательности: искусственно синтезированная последовательность праймера
- б5 029140 <400> 21 ддатссдсса ссатддаста сааддасдас датдасаадд дсдсссстдс стдсдссстс 60 <210> 22 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная <220>
<223> Описание искусственной последовательности: искусственно синтезированная последовательность рьас тега
| <400> | 22 |
| атддастаса аддасдасда тдасаад | |
| <2Ю> | 23 |
| <211> | 27 |
| <212> | ДНК |
| <213> | ното зартепз |
<400> 23 сстдаддасд ссдсддсссс сдссссс 27 <210> 24 <211> 27 <212> ДНК <213> Ното зартеп5 <400> 24 дсддддасад сддстссдтд даддтса 27
| <210> <211> <212> <213> | 25 3144 ДНК Ното | зарт епз |
| <220> | ||
| <221> | СЭ5 | |
| <222> | (1).. | , (3144) |
<400> 25 атд ддс дсс сст дсс Тдс дсс стс дед стс где дтд дсс дтд дсс атс 48
Мет сТу а! а Рго а!а Суз А1а ьеи а!а ьеи Суз Уа! а!а Уа1 а! а 11е
10 15 дтд дсс ддс дсс тсс тсд дад тсс ттд ддд асд дад сад сдс дтс дтд 96
УаТ А1а с!у А1а 5ег 5ег с!и 5ег Ьеи С1у тНг С1и с!п Агд Уа! Уа1
25 30 ддд еда дед дса даа дтс ссд ддс сса дад ссс ддс сад сад дад сад 144 б!у Агд а!а а!а с!и Уа! Рго С1у Рго с!и Рго сТу с!п с!п с!и с!п
40 45 ттд дтс ттс ддс аде ддд дат дет дтд дад стд аде ТдТ ссс сед ссс 192 ьеи Уа! РЬе С1у 5ег С1у Азр А!а Уа! с!и ьеи 5ег Су5 Рго Рго Рго
55 60 ддд ддт ддт ссс атд ддд ссс асТ дтс тдд дтс аад дат ддс аса ддд 240
С1у С1у С1у Рго Мет С!у Рго ТНг Уа! тгр Уа! Ьуз Азр С1у тЬг с!у
70 75 80 стд дтд ссс тсд дад едт дтс стд дтд ддд ссс сад едд стд сад дтд 288
- 66 029140
| ьеи УаТ | РГО | 5ег СТи Агд 85 | УаТ | ьеи УаТ | сТу 90 | Рго СТп | Агд | ьеи | СТп 95 | УаТ | ||||||
| егд | ааг | дсс | гсс | сас | дад | дас | гсс | ддд сТу 105 | дсс | гас | аде | где | едд | сад | едд | 336 |
| Ьеи | А5П | А1а | 5ег 100 | нт 5 | бТи | Азр | 5ег | АТа | туг | 5ег | Суз | Агд 110 | СТп | Агд | ||
| сгс | асд | сад | сдс | дга | егд | где | сас | ггс | адг | дгд УаТ | едд | дгд УаТ | аса | дас | дег | 384 |
| ьеи | тЬг | СТп | Агд | УаТ | ьеи | Суз | НТ 5 | РЬе | 5ег | Агд | тЬг | Азр | АТа | |||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| сса | гсс | гсд | дда | даг | дас | даа | дас | ддд СТу | дад | дас | дад | дег | дад | дас | аса | 432 |
| Рго | 5ег | 5ег | СТу | Азр | Азр | бТи | Азр | СТи | Азр | сТи | АТа | бТи | А5р | тЬг | ||
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ддг СТу | дгд УаТ | дас | аса | ддд СТу | дсс | ссг | гас | гдд | аса | едд | ссс | дад | едд | агд | дас | 480 |
| Азр | ТЬг | АТа | рго | туг | Тгр | тЬг | Агд | РГО | бТи | Агд | мег | А5р | ||||
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| аад | аад | егд | егд | дсс | дгд УаТ | ссд | дсс | дсс | аас | асе | дгс | сдс | ггс | сдс | где | 528 |
| ьуз | ЬУ5 | ьеи | ьеи | АТа | РГО | АТа | АТа | АЗП | ТЬг | УаТ | Агд | РЬе | Агд | суз | ||
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| сса | дсс | дег | ддс | аас | ССС | асг | ссс | гсс | агс | гсс | гдд | егд | аад | аас | ддс | 576 |
| РГО | АТа | АТа | сТу | АЗП | Рго | тЬг | Рго | 5ег | Ле | 5ег | тгр | ьеи | ьуз | Азп | СТу | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| адд | дад | ггс | сдс | ддс 61 у | дад | сас | сдс | агг | дда | ддс 61 у | агс | аад | егд | едд | саг | 624 |
| Агд | бТи | рЬе | Агд | сТи | НТ 5 | Агд | 1Те | СТу | Не | ьуз | ьеи | Агд | нт 5 | |||
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| сад | сад | гдд | аде | егд | дгс | агд | даа | аде | дгд УаТ | дгд УаТ | ссс | гсд | дас | сдс | ддс | 672 |
| СТп | СТп | тгр | 5ег | ьеи | УаТ | мег | бТи | 5ег | рго | 5ег | Аэр | Агд | сТу | |||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| аас | гас | асе | где | дгс | дгд | дад | аас | аад | ггг | ддс С1у | аде | агс | едд | сад | асд | 720 |
| АЗП | туг | тЬг | суз | Уа1 | УаТ | СТ и | АЗП | ьуз | РЬе | 5ег | 1Те | Агд | СТп | тЬг | ||
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| гас | асд | егд | дас | дгд УаТ | егд | дад | еде | гсс | ссд | сас | едд | ссс | агс | егд | сад | 768 |
| туг | ТЬг | ьеи | А5р | ьеи | сТи | Агд | 5ег | РГО | Нт 5 | Агд | РГО | Не | ьеи | СТп | ||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| дед | ддд | егд | ссд | дсс | аас | сад | асд | дед | дгд УаТ | егд | ддс С1у | аде | дас | дгд уа1 | дад | 816 |
| А1а | СТу | ьеи | Рго | А1а | Азп | сТп | ТЬг | АТа | ьеи | 5ег | Азр | сТи | ||||
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| ггс | сас | где | аад | дгд уа1 | гас | адг | дас | дса | сад | ссс | сас | агс | сад | гдд | сгс | 864 |
| РЬе | Нт 5 | Суз | ьуз | Ту Г | 5ег | Азр | АТа | СТ η | РГО | Нт 5 | Не | СТп | Тгр | ьеи | ||
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| аад | сас | дгд Уа1 | дад | дгд УаТ | ааг | ддс сТу | аде | аад | дгд УаТ | ддс | сед | дас | ддс | аса | ссс | 912 |
| ьуз | Нт 5 | СТ и | АЗП | 5ег | ьуз | СТу | Рго | Азр | СТу | тЬг | Рго | |||||
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| гас | дгг | асе | дгд УаТ | сгс | аад | гсс | гдд | агс | адг | дад | адг | дгд УаТ | дад | дсс | дас | 960 |
| туг | УаТ | тЬг | ьеи | ьуз | 5ег | тгр | 1Те | 5ег | СТ и | 5ег | СТ и | аТ а | Азр | |||
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| дгд УаТ | сдс | сгс | еде | егд | дсс | ааг | дгд УаТ | гсд | дад | едд | дас | ддд | ддс 61у | дад | гас | 1008 |
| Агд | ьеи | Агд | ьеи | АТ а | АЗП | 5ег | сТи | Агд | Азр | С1у | сТи | Туг | ||||
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| сгс | гдг | еда | дсс | асе | ааг | ггс | ага | ддс СТу | дгд УаТ | дсс | дад | аад | дсс | ггг | гдд | 1056 |
| ьеи | суз | Агд | А1а | тЬг | АЗП | рЬе | 1Те | АТа | сТи | ьуз | аТ а | рЬе | Тгр | |||
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| егд | аде | дгг | сас | ддд | ссс | еда | дса | дсс | дад | дад | дад | егд | дгд | дад | дег | 1104 |
- 67 029140
| Ьеи | Зег | Уа1 355 | нтз | б1у | Рго | Агд А1а А1а б!и б!и б!и ьеи Уа! | б1и | А1а | ||||||||
| 360 | 365 | |||||||||||||||
| дас | дад | дед | ддс | аде | дед | сас | дса | ддс 61у | асе | ССС | аде | сас | ддд б1у | дед | ддс | 1152 |
| Азр | б1и | А1а | С1у | Зег | уа1 | туг | А1а | Пе | ьеи | Зег | Туг | Уа1 | б!у | |||
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| ССС | есс | сед | есс | асе | сед | дед дед Уа1 Уа! | дед | дсс | дед Уа1 | асд | сес | еде | сдс | сед | 1200 | |
| РКе | рКе | Ьеи | рКе | 11 е | ьеи | А1а | А1а | ТКг | ьеи | суз | Агд | ьеи | ||||
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| сдс | аде | ссс | ссс | аад | ааа | ддс | ссд | ддс б1у | Ссс | ссс | асе | дед Уа1 | сас | аад | асе | 1248 |
| Агд | 5ег | РГО | Рго | ьуз | ьуз | б1у | ьеи | Зег | Рго | ТКг | Нт 5 | Ьу5 | Пе | |||
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| ссс | сдс | еес | ссд | ссс | аад | еда | сад | дед уа! | ссс | сед | дад | есс | аас | дед | есс | 1296 |
| зег | Агд | рКе | рго | ьеи | ьуз | Агд | б!п | зег | ьеи | б!и | Зег | АЗП | а! а | зег | ||
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| асд | аде | ссс | аас | аса | сса | сед | дед Уа1 | сдс | асе | дса | адд | сед | есс | Сса | ддд | 1344 |
| мес | Зег | зег | АЗП | тКг | Рго | ьеи | Агд | Пе | А1а | Агд | Ьеи | зег | Зег | 61у | ||
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| дад | ддс | ссс | асд | сед | дсс | аас | дсс | ссс | дад | ссс | дад | сед | ссс | дсс | дас | 1392 |
| б1и | б1у | Рго | тКг | ьеи | Αΐ а | АЗП | Уа! | Зег | б1и | ьеи | б1и | ьеи | рго | А1а | Азр | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| ссс | ааа | едд | дад | сед | Ссе | едд | дсс | едд | сед | асе | ссд | ддс | аад | ссс | ссе | 1440 |
| РГО | ьуз | тгр | б1и | ьеи | Зег | Агд | А1а | Агд | ьеи | тКг | Ьеи | 61у | ьуз | Рго | ьеи | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| ддд | дад | ддс | еде | есс | ддс б1у | сад | дед Уа! | дсс | асд | дед | дад | дсс | ас с | ддс 61у | асе | 1488 |
| с!у | б1и | б!у | Суз | рКе | б!п | Уа! | мес | А1а | б!и | А1а | Пе | Пе | ||||
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| дас | аад | дас | едд | дсс | дсс | аад | ссе | дсс | асе | дса | дсс | дед Уа1 | аад | асд | сед | 1536 |
| Азр | ьуз | Азр | Агд | а! а | А1а | ьуз | РГО | Уа1 | ТКг | Уа! | А1а | ьуз | мес | ьеи | ||
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| ааа | дас | дас | дсс | асе | дас | аад | дас | сед | еед | дас | сед | дед Уа! | ссс | дад | асд | 1584 |
| ьуз | Азр | Азр | А1а | тКг | Азр | ьуз | Азр | Ьеи | Зег | Азр | ьеи | зег | б1и | мес | ||
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| дад | асд | асд | аад | асд | асе | ддд | ааа | сас | ааа | аас | асе | асе | аас | сед | сед | 1632 |
| б!и | мес | мес | ьуз | мес | 11е | 61у | ьуз | Нт 5 | ьуз | Азп | Пе | Пе | АЗП | ьеи | ьеи | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| ддс С1у | дсс | еде | асд | сад | ддс б1у | ддд | ссс | ссд | еас | дед Уа1 | ссд | дед Уа1 | дад | еас | дед | 1680 |
| А1а | суз | ТКг | 6ΐη | б!у | Рго | Ьеи | Туг | ьеи | б!и | туг | А1а | |||||
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| дсс | аад | ддс | аас | сед | едд | дад | ссс | ссд | едд | дед | едд | едд | ссс | едд | ддс | 1728 |
| А1а | ьуз | б1у | АЗП | ьеи | Агд | б!и | рКе | ьеи | Агд | А1а | Агд | Агд | Рго | Агд | б1у | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| сед | дас | Сас | ссс | ССС | дас | асе | еде | аад | ссд | ссс | дад | дад | сад | сес | асе | 1776 |
| ьеи | Азр | туг | зег | РКе | Азр | тКг | суз | ьуз | Рго | РГО | б1и | 61 и | б1п | ьеи | ТКг | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| ссс | аад | дас | ссд | дед Уа1 | есс | еде | дсс | сас | сад | дед Уа1 | дсс | едд | ддс | асд | дад | 1824 |
| РКе | ьуз | Азр | ьеи | зег | Су5 | А1а | Туг | б1п | Αΐ а | Агд | 61у | мес | 61 и | |||
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| Сас | еед | дсс | ссс | сад | аад | сдс | асе | сас | адд | дас | сед | дсс | дсс | сдс | аас | 1872 |
| туг | ьеи | А1а | Зег | 61 η | ьуз | суз | 11 е | Нт 5 | Агд | А5р | Ьеи | А1а | А1а | Агд | Азп | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| дед | сед | дед | асе | дад | дас | аас | дед | асд | аад | асе | дса | дас | ссс | ддд | ссд | 1920 |
- 68 029140
| Уа1 625 | ьеи Уа1 | тКг б!и | Азр Азп Уа1 630 | мет | Ьуз Пе А1а 635 | Азр | РКе | 61 у | Ьеи 640 | |||||||
| дсс | едд | дас | дтд Уа1 | сас | аас | СТС | дас | тас | тас | аад | аад | аса | асе | аас | ддс | 1968 |
| А1а | Агд | Азр | нт 5 | АЗП | ьеи | Азр | туг | туг | ьуз | ьуз | тКг | тКг | АЗП | б!у | ||
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| едд | стд | ссс | д^д | аад | тдд | атд | дед | сст | дад | дсс | ттд | ΐΐΐ | дас | еда | дтс | 2016 |
| Агд | ьеи | Рго | Уа1 | ьуз | Тгр | мет | А1а | Рго | б1и | А1а | ьеи | РКе | Азр | Агд | Уа1 | |
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| тас | аст | сас | сад | адт | дас | дтс | тдд | тсс | ΐΐΐ | ддд б1у | дтс | стд | СТС | тдд | дад | 2064 |
| туг | тКг | Н1 5 | 6ΐη | Зег | Азр | Уа1 | тгр | Зег | РКе | Уа1 | ьеи | ьеи | тгр | 61 и | ||
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
| атс Пе | ттс РКе | асд ТКг | стд теи | ддд 61 у | ддс 61 у | тсс зег | сед Рго | тас туг | ссс Рго | ддс б1у | атс 11 е | сст Рго | дтд Уа1 | дад б1и | дад б1и | 2112 |
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| СТС | ттс | аад | стд | стд | аад | дад | ддс | сас | сдс | атд | дас | аад | ссс | дсс | аас | 2160 |
| ьеи | РКе | ьуз | ьеи | Ьеи | ьуз | б1и | б1у | Нтз | Агд | мет | Азр | |_уз | Рго | А1а | Азп | |
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| тдс | аса | сас | дас | стд | тас | атд | атс | атд | едд | дад | Тдс | тдд | сат | дсс | дед | 2208 |
| суз | тКг | нт 5 | Азр | ьеи | Туг | мет | 11 е | мет | Агд | б!и | суз | тгр | нтз | А1а | А1а | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| ссс | тсс | сад | адд | ссс | асе | ттс | аад | сад | стд | дтд Уа1 | дат | тас | стд | дад | сад | 2256 |
| Рго | Зег | 61 η | Агд | РГО | тКг | рКе | ьуз | б1п | ьеи | Азр | туг | ьеи | б1и | б1п | ||
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| ΐΐΐ | дда | аст | Тсс | тсд | ΐΐΐ | аад | дад | тсд | дсс | ттд | адд | аад | сад | Тсс | тта | 2304 |
| РНе | б1у | тКг | Зег | Зег | РКе | ьуз | б1и | Зег | А1а | Ьеи | Агд | ьуз | 6ΐη | Зег | ьеи | |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| тас | стс | аад | ΐΐΐ | дас | ссс | стс | стд | адд | дас | адт | сст | ддт б1у | ада | сса | дтд Уа1 | 2352 |
| туг | ьеи | ьуз | РКе | Азр | Рго | ьеи | ьеи | Агд | Азр | Зег | РГО | Агд | РГО | |||
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| ссс | дтд Уа1 | дсс | асе | дад | асе | аде | аде | атд | сас | ддт | дса | аат | дад | аст | ссс | 2400 |
| Рго | а1 а | ТКг | б1и | тКг | Зег | Зег | мет | НТ 5 | б1у | А1а | АЗП | б1и | ТКг | Рго | ||
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
| тса | дда | едт | ссд | едд | даа | дсс | аад | СТТ | дтд Уа1 | дад | ттс | дат | ттс | ттд | дда | 2448 |
| Зег | 61у | Агд | РГО | Агд | б1и | а1 а | ьуз | ьеи | б1и | РКе | Азр | РКе | ьеи | б1у | ||
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| дса | стд | дас | атт | сст | дтд Уа1 | сса | ддс | сса | ссс | сса | ддт | дтт | ссс | дед | сст | 2496 |
| А1а | ьеи | Азр | Пе | Рго | Рго | б!у | Рго | Рго | Рго | б!у | Уа1 | РГО | А1а | РГО | ||
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| ддд | ддс | сса | ссс | стд | тсс | асе | дда | сст | ата | дтд Уа1 | дас | стд | стс | сад | тас | 2544 |
| С1у | б!у | Рго | Рго | ьеи | Зег | тКг | б1у | РГО | Пе | Азр | ьеи | ьеи | б1п | туг | ||
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| аде | сад | аад | дас | стд | дат | дса | дтд Уа1 | дта | аад | дед | аса | сад | дад | дад | аас | 2592 |
| Зег | 61 η | ьуз | Азр | Ьеи | Азр | А1а | Уа1 | ьуз | А1а | тКг | б1п | С1и | б1и | АЗП | ||
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| едд | дад | стд | адд | аде | адд | тдт | дад | дад | стс | сас | ддд | аад | аас | стд | даа | 2640 |
| Агд | 61 и | ьеи | Агд | Зег | Агд | Суз | 61 и | 61 и | ьеи | НТ 5 | б1у | |_уз | АЗП | ьеи | 61 и | |
| 865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| стд | ддд | аад | атс | атд | дас | адд | ТТС | даа | дад | дтт | дтд Уа1 | тас | сад | дсс | атд | 2688 |
| Ьеи | С1у | ьуз | Пе | мет | Азр | Агд | РКе | б!и | б!и | Уа1 | туг | б!п | а1 а | мет | ||
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| дад | даа | дтт | сад | аад | сад | аад | даа | стт | тсс | ааа | дет | даа | атс | сад | ааа | 2736 |
- 69 029140
| с! и с!и | Уа! | с! η 1_уз С! η 900 | Буз | б! и | |_еи Бег 1_уз а!а с!и 905 | 11е 910 | С! п | ьуз | ||||||||
| дес | сса | ааа | даа | ааа | дас | саа | сес | асе | аса | дае | сед | аас | есс | аед | дад | 2784 |
| Уа1 | |.еи | еуз | С1и | ьуз | Азр | с!п | |_еи | тКг | ТКг | Азр | ьеи | А5П | Бег | мее | с! и | |
| 915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
| аад | есс | еее | есс | дас | сес | еее | аад | еде | еее | дад | ааа | сад | ааа | дад | дед Уа! | 2832 |
| ьуз | Бег | РКе | Бег | Азр | |_еи | РКе | Буз | Агд | РКе | с! и | |_уз | с!п | ьуз | с! и | ||
| 930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
| аес | дад | ддс | еас | сдс | аад | аас | даа | дад | еса | сед | аад | аад | еде | дед Уа! | дад | 2880 |
| 1!е | с! и | с! у | туг | Агд | ьуз | Азп | с! и | с! и | Бег | Ьеи | ьуз | |_уз | Суз | С! и | ||
| 945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
| дае | еас | сед | дса | адд | аес | асе | сад | дад | ддс С! у | сад | адд | еас | саа | дсс | сед | 2928 |
| А5р | туг | ьеи | а! а | Агд | 1!е | тКг | с!п | с! и | С!п | Агд | туг | с!п | А! а | |_еи | ||
| 965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
| аад | дсс | сас | дед | дад | дад | аад | сед | сад | сед | дса | аас | дад | дад | аес | дсе | 2976 |
| ьуз | а! а | Нт 5 | а! а | е!и | с! и | |_уз | |_еи | с!п | |_еи | а! а | Азп | с! и | с! и | 1!е | а! а | |
| 980 | 985 | 990 |
сад дес едд аде аад дсс сад дед даа дед сед дсс сес сад дсс аде 3024 с1п \/а1 Агд Бег 1_уз а! а с!п а! а с! и а! а 1_еи а! а 1_еи с! η а! а Бег
995 1000 1005
| сед адд аад | дад | сад | аед | сдс | аес | сад | гсд | сед | дад | аад | аса | дгд Уа1 | 3069 |
| 1_еи Агд Буз | С! и | С!п | мее | Агд | 1!е | с!п | Бег | 1_еи | с! и | Буз | тКг | ||
| 1010 | 1015 | 1020 | |||||||||||
| дад сад аад | асе | ааа | дад | аас | дад | дад | сед | асе | адд | аес | где | дас | 3114 |
| с! и С1п 1_уз | тКг | 1_уз | с! и | Азп | С1и | с! и | |_еи | ТКг | Агд | 11е | суз | Азр | |
| 1025 | 1030 | 1035 | |||||||||||
| дас сес аес | есс | аад | аед | дад | аад | аес | еда | 3144 | |||||
| Азр 1_еи 11е | Бег | |_уз | мее | С1и | ьуз | г!е | |||||||
| 1040 | 1045 | ||||||||||||
| <210> 26 <211> 1047 <212> РРТ | |||||||||||||
| <213> Ното : | 5арт епз | ||||||||||||
| <400> 26 |
| Мее 1 | с!у | а!а Рго | А! а Суз а! а 1_еи а! а 5 | |_еи 10 | Суз | Уа1 | А! а | Уа! | а! а 15 | 11е | |||||
| Уа! | а! а | с! у | а! а | Бег | Бег | с! и | Бег | |_еи | с! у | тКг | с! и | с!п | Агд | Уа! | Уа! |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| С! у | Агд | А! а | А! а | С! и | Уа! | РГО | с! у | Рго | С! и | РГО | с! у | С1п | с!п | с! и | С1п |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| 1_еи | Уа! | РКе | С1у | Бег | С! у | Азр | а! а | Уа1 | С! и | |_еи | Бег | суз | Рго | Рго | РГО |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С! у | С! у | С1у | РГО | мее | С! у | Рго | тКг | Уа! | Тгр | Уа! | ьуз | Азр | С! у | тКг | с! у |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| |_еи | Уа! | РГО | Бег | с! и | Агд | Уа! | 1_еи | Уа! | С! у | Рго | с!п | Агд | 1_еи | с!п | Уа! |
- 70 029140
90 95
| Ьеи | Азп | А1а | 5ег | НТ 5 | С1и | Азр | 5ег | с!у | а! а | Туг | 5ег | суз | Агд | с!п | Агд |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| ьеи | тКг | С! η | Агд | Уа! | Ьеи | суз | Нтз | рКе | 5ег | Уа! | Агд | Уа! | тКг | Азр | а! а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Рго | 5ег | 5ег | С! у | Азр | Азр | С! и | Азр | с! у | с! и | Азр | С! и | а! а | с! и | Азр | тКг |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| С1у | Уа! | Азр | ТКг | С! у | а! а | рго | туг | тгр | тКг | Агд | Рго | С! и | Агд | мет | Азр |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ьуз | ьуз | ьеи | ьеи | а! а | Уа! | РГО | а! а | А1а | А5П | ТКг | Уа! | Агд | РКе | Агд | Суз |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Рго | А! а | А! а | с1у | АЗП | Рго | тКг | Рго | 5ег | Пе | 5ег | Тгр | ьеи | Ьуз | А5П | С1у |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | с!и | РКе | Агд | С! у | С! и | НТ 5 | Агд | Пе | С! у | С! у | Пе | ьуз | ьеи | Агд | Нт 5 |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| с!п | с! η | Тгр | 5ег | ьеи | Уа! | мет | С! и | 5ег | Уа! | Уа! | Рго | 5ег | Азр | Агд | с! у |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| АЗП | Туг | тКг | Суз | Уа! | Уа! | С! и | АЗП | ьуз | РКе | с! у | 5ег | Пе | Агд | с! η | тКг |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| туг | тКг | Ьеи | Азр | Уа! | Ьеи | С! и | Агд | 5ег | Рго | НТ 5 | Агд | Рго | Пе | ьеи | с! η |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| а! а | е!у | ьеи | Рго | А! а | АЗП | С1п | ТКг | а! а | Уа! | ьеи | С1у | 5ег | Азр | Уа! | С! и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| РКе | НТ 5 | Суз | ьуз | Уа! | Туг | 5ег | Азр | а! а | с! η | Рго | нтз | Пе | с! η | Тгр | ьеи |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ьуз | НТ 5 | Уа! | С! и | Уа! | АЗП | С! у | 5ег | ьуз | Уа! | С! у | Рго | АЗр | С! у | тКг | Рго |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| туг | Уа! | тКг | Уа! | ьеи | ьуз | 5ег | тгр | Пе | 5ег | С! и | 5ег | Уа! | С! и | а! а | АЗр |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа! | Агд | Ьеи | Агд | ьеи | А! а | АЗП | Уа! | 5ег | С! и | Агд | Азр | с! у | С! у | С! и | Туг |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Ьеи | Суз | Агд | а! а | ТКг | АЗП | рКе | Пе | с!у | Уа! | А1а | с! и | ьуз | А! а | РКе | Тгр |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ьеи | 5ег | Уа! | Нт 5 | с!у | Рго | Агд | А! а | а! а | С! и | С! и | с! и | ьеи | Уа! | С! и | А! а |
- 71 029140
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Αδρ | с! и | а! а | с! у | 5ег | Уа! | Туг | А! а | С1у | 11е | Беи | 5ег | туг | С1у | Уа1 | с1у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| РЬе | рЬе | Беи | РЬе | 11е | Беи | Уа! | Уа1 | А1а | А1а | Уа1 | ТЬг | Беи | су 5 | Агд | Беи |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Агд | 5ег | РГО | Рго | Буз | Буз | С! у | Беи | С1у | 5ег | РГО | ТЬг | Уа! | нтз | Буз | 11е |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| 5ег | Агд | РЬе | рго | Беи | Буз | Агд | С! η | Уа1 | 5ег | Беи | б!и | 5ег | АЗП | А1а | 5ег |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| мет | 5ег | 5ег | АЗП | тЬг | РГО | Беи | Уа! | Агд | Не | А1а | Агд | Беи | 5ег | 5ег | С1у |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| с1и | с1у | рго | ТЬг | Беи | А! а | АЗП | Уа1 | 5ег | с!и | Беи | С1и | Беи | РГО | Αΐ а | Азр |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| РГО | Буз | тгр | с! и | Беи | 5ег | Агд | а! а | Агд | Беи | тЬг | Беи | С1у | Буз | РГО | Беи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| С1у | С! и | с! у | Суз | рЬе | С1у | С1п | Уа1 | Уа! | Мет | А1а | С1и | А1а | 11е | С1у | 11 е |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| А5р | Буз | Азр | Агд | А1а | А! а | Буз | РГО | Уа1 | ТЬг | Уа! | А1а | Уа! | Буз | мет | Беи |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Буз | АЗр | Азр | А1а | тЬг | Азр | Буз | Азр | Беи | 5ег | Азр | Беи | Уа1 | 5ег | С1и | мет |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| С1и | мет | мет | Буз | мет | 11е | С! У | Буз | НТ 5 | Буз | А5П | 11е | Не | АЗП | Беи | Беи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| С1у | а! а | Суз | ТЬг | С1п | С1у | С! у | РГО | Беи | туг | Уа1 | Беи | Уа1 | С1и | Туг | а! а |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| А1а | Буз | С1у | АЗП | Беи | Агд | с1и | РЬе | Беи | Агд | А1а | Агд | Агд | РГО | Агд | е1у |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Беи | Азр | туг | 5ег | РЬе | Азр | ТЬг | суз | Буз | Рго | РГО | С1и | С1и | с!п | Беи | тЬг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| РКе | Бу5 | Азр | Беи | Уа1 | 5ег | Суз | Αΐ а | Туг | С1п | Уа1 | А1а | Агд | б1у | мет | е!и |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Туг | Беи | а! а | 5ег | с! η | Буз | Суз | 11 е | НТ 5 | Агд | Азр | Беи | А1а | а1 а | Агд | АЗП |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Уа! | Беи | Уа! | тЬг | С! и | Азр | АЗП | Уа! | мет | Бу5 | Не | А1а | Азр | РЬе | с!у | Беи |
- 72 029140
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Азр | Уа! | НТ 5 | АЗП | ьеи | Азр | туг | туг | ьуз | ьуз | тКг | тКг | А5П | б1у |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Агд | Ьеи | Рго | Уа! | ьуз | Тгр | ме! | а! а | Рго | б!и | а1 а | ьеи | РКе | Азр | Агд | Уа1 |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| туг | ТКг | Нт 5 | б!п | Бег | А5р | Уа! | тгр | Бег | РКе | б!у | Уа! | ьеи | ьеи | Тгр | б!и |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Пе | РКе | ТКг | ьеи | б1у | б!у | Бег | Рго | туг | РГО | б1у | Пе | РГО | Уа! | б!и | б!и |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| ьеи | РКе | ьуз | ьеи | ьеи | ьуз | б1и | б1у | НТ 5 | Агд | мет | Азр | ьуз | Рго | а! а | Азп |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Суз | тКг | НТ 5 | Азр | ьеи | Туг | ме! | Пе | мет | Агд | 61 и | суз | тгр | НТЗ | а! а | А1а |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| РГО | Бег | б!п | Агд | Рго | ТКг | РКе | Ьуз | б!п | ьеи | Уа! | АЗр | туг | ьеи | б!и | 61 п |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| РКе | б1у | тКг | Бег | Бег | РКе | ьуз | б1и | Бег | А1а | ьеи | Агд | ьуз | 61 η | Бег | Ьеи |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| туг | ьеи | ьуз | РКе | Азр | РГО | ьеи | ьеи | Агд | Азр | Бег | Рго | 61 у | Агд | Рго | Уа! |
| 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
| РГО | Уа! | А! а | тКг | б1и | тКг | Бег | Бег | мет | НТЗ | 61 у | А1а | Азп | б1и | ТКг | Рго |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| Бег | 61 у | Агд | Рго | Агд | б!и | А1а | ьуз | ьеи | Уа! | 61 и | РКе | Азр | РКе | Ьеи | б!у |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| А1а | ьеи | Азр | Пе | РГО | Уа1 | РГО | 61 у | Рго | РГО | Рго | б!у | Уа! | Рго | А1а | Рго |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| С1у | б1у | РГО | РГО | ьеи | Бег | тКг | б1у | РГО | Пе | Уа! | Азр | ьеи | ьеи | 61 п | туг |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| Бег | б1п | ьуз | Азр | ьеи | Азр | А1а | Уа! | Уа! | ьуз | а! а | тКг | 61 η | 61 и | 61 и | АЗП |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| Агд | б1и | ьеи | Агд | Бег | Агд | Суз | б!и | б1и | ьеи | НТ 5 | 61 у | Ьуз | Азп | Ьеи | б1и |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| ьеи | б!у | ьуз | Ие | мет | Азр | Агд | РКе | б!и | 61 и | Уа! | Уа1 | Туг | 61 п | А! а | мет |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| б!и | 61 и | Уа! | б!п | ЬУ5 | 61 п | ьуз | 61 и | ьеи | Бег | ьуз | а! а | 61 и | Пе | 61 п | ьуз |
- 73 029140
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| Уа! | Деи | Дуз | б!и | Ду5 | Азр | С1п | Деи | тКг | ТКг | Азр | Деи | Азп | Вег | мес | 61 и |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| Дуз | Вег | РКе | вег | Азр | Деи | РКе | Дуз | Агд | РКе | 61 и | Дуз | б!п | Дуз | 61 и | Уа! |
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| Пе | б1и | б1у | туг | Агд | Ду5 | АЗП | б!и | 61 и | Вег | Деи | Дуз | Дуз | Суз | Уа! | 61 и |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Деи | А1а | Агд | Пе | ТКг | С1п | б1и | 61 у | 61 п | Агд | Туг | 61 п | А1а | Деи |
| 965 | 970 | 975 | |||||||||||||
| дуз | А1а | Нт 5 | А1а | б!и | б!и | дуз | Деи | С1п | Деи | А1а | Азп | б!и | 61 и | Пе | А! а |
| 980 | 985 | 990 |
С1п Уа1 Агд Вег Дуз А1а С1п А1а б1и А1а деи А1а деи с1п а!а Вег 995 1000 1005
| Деи Агд 1010 | Дуз с!и | б!п | мес | Агд 1015 | 11е с!п вег деи | б1и 1020 | дуз | ТКг | Уа! | |||||
| б!и | С1п | дуз | тКг | дуз | б1и | АЗП | б1и | б!и | деи | тКг | Агд | Пе | суз | Азр |
| 1025 | 1030 | 1035 | ||||||||||||
| А5р | Деи | ί! е | Вег | дуз | мес | С1и | дуз | 11 е | ||||||
| 1040 | 1045 |
| <210> <211> <212> <213> | 27 3135 ДНК Ното | зартепз |
| <220> | ||
| <221> | сов | |
| <222> | (1).. | .(3135) |
<400> 27
| асд мес 1 | ддс б1у | дсс а! а | ссс РГО | дсс а! а 5 | сде суз | дсс а! а | ссс деи | дед а! а | ссс Деи 10 | где суз | д!д Уа! | дсс а! а | д!д Уа1 | дсс а! а 15 | асе Пе | 48 |
| дед | дсс | ддс | дсс | ССС | ссд | дад | ССС | ссд | ддд | асд | дад | сад | сдс | дсс | д!д | 96 |
| Уа1 | а! а | С1у | а! а | вег | вег | 61 и | вег | Деи | 61 у | тКг | с! и | б!п | Агд | Уа! | Уа! | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| ддд | еда | дед | дса | даа | дсс | ссд | ддс | сса | дад | ссс | ддс | сад | сад | дад | сад | 144 |
| б1у | Агд | А! а | а! а | 61 и | Уа! | рго | 61 у | Рго | б!и | Рго | С1у | С1п | С1п | б!и | б1п | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| ссд | дсс | ссс | ддс | аде | ддд | дас | дсс | дед | дад | ссд | аде | сдс | ссс | ссд | ссс | 192 |
| Деи | Уа1 | РКе | б!у | Вег | С1у | Азр | А! а | Уа1 | 61 и | Деи | вег | су 5 | РГО | РГО | рго | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| ддд | ддс | ддс | ссс | асд | ддд | ссс | асе | дсс | !дд | дсс | аад | дас | ддс | аса | ддд | 240 |
| б!у | б!у | б!у | РГО | мес | 61 у | РГО | ТКг | Уа! | Тгр | Уа! | дуз | Азр | 61 у | тКг | 61у |
- 74 029140
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| егд | дгд | ссс | !сд | дад | едг | д!с | егд | дгд | ддд | ссс | сад | едд | егд | сад | дгд | 288 |
| Ьеи | уат | РГО | 5ег | сТи | Агд | УаТ | ьеи | Уа1 | С1у | Рго | СТп | Агд | ьеи | СТп | Уа1 | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| ссд | аа! | дсс | !СС | сас | дад | дас | !СС | ддд | дсс | !ас | аде | где | едд | сад | едд | 336 |
| Ьеи | АЗП | АТа | 5ег | НТ 5 | сТи | Азр | 5ег | СТу | АТа | туг | 5ег | Су5 | Агд | СТп | Агд | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| С!С | асд | сад | сдс | д!а | с!д | где | сас | !!С | ад! | дгд | едд | дгд | аса | дас | дс! | 384 |
| Ьеи | тЬг | СТп | Агд | УаТ | ьеи | суз | НТ 5 | РЬе | 5ег | УаТ | Агд | уа! | тЬг | Азр | АТа | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| сса | ССС | гсд | дда | да! | дас | даа | дас | ддд | дад | дас | дад | дс! | дад | дас | аса | 432 |
| Рго | 5ег | 5ег | СТу | Азр | Азр | СТ и | АЗр | СТу | сТи | Азр | СТ и | АТа | СТи | Азр | тЬг | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ддд | дсс | СС! | !ас | гдд | аса | едд | ССС | дад | едд | а!д | дас | аад | аад | егд | егд | 480 |
| С1у | АТа | РГО | туг | Тгр | тЬг | Агд | РГО | СТи | Агд | ме! | Азр | ьуз | Ьуз | ьеи | ьеи | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| дсс | дед | ссд | дсс | дсс | аас | асе | дгс | сдс | !!с | сдс | где | сса | дсс | дс! | ддс | 528 |
| А1а | УаТ | РГО | АТа | АТа | АЗП | тЬг | УаТ | Агд | РЬе | Агд | суз | РГО | АТа | аТ а | СТу | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| аас | ссс | ас! | ссс | !СС | а!с | !СС | гдд | с!д | аад | аас | ддс | адд | дад | !!С | сдс | 576 |
| АЗП | Рго | тЬг | Рго | 5ег | Пе | 5ег | тгр | ьеи | ьуз | АЗП | С1у | Агд | СТи | РЬе | Агд | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| ддс | дад | сас | сдс | а!! | дда | ддс | а!с | аад | с!д | едд | са! | сад | сад | гдд | аде | 624 |
| СТу | СТи | НТ 5 | Агд | Пе | С1у | СТу | Пе | ьуз | ьеи | Агд | НТ 5 | СТп | СТп | тгр | 5ег | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| с!д | дсс | а!д | даа | аде | д!д | дгд | ссс | гсд | дас | сдс | ддс | аас | !ас | асе | где | 672 |
| ьеи | УаТ | ме! | сТи | 5ег | УаТ | УаТ | Рго | 5ег | А5р | Агд | С1у | АЗП | туг | тЬг | Су5 | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| д!с | дгд | дад | аас | аад | !!! | ддс | аде | а! с | едд | сад | асд | !ас | асд | с!д | дас | 720 |
| уаТ | Уа1 | сТи | АЗП | ьуз | РЬе | сТу | 5ег | Пе | Агд | СТп | ТЬг | ту г | тЬг | ьеи | Азр | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| дгд | сед | дад | сдс | !СС | ссд | сас | едд | ссс | а!с | с!д | сад | дед | ддд | с!д | ссд | 768 |
| Уа1 | ьеи | сТи | Агд | 5ег | рго | нтз | Агд | Рго | Пе | ьеи | СТп | АТа | сТу | Ьеи | Рго | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| дсс | аас | сад | асд | дед | д!д | с!д | ддс | аде | дас | дгд | дад | !!с | сас | !дс | аад | 816 |
| АТа | АЗП | сТп | тЬг | АТа | УаТ | ьеи | С1у | 5ег | Азр | УаТ | сТи | РЬе | НТ 5 | Суз | ьуз | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| дгд | !ас | ад! | дас | дса | сад | ссс | сас | а!с | сад | гдд | с!с | аад | сас | дгд | дад | 864 |
| УаТ | туг | 5ег | АЗр | АТа | СТп | Рго | НТ 5 | Пе | СТп | Тгр | ьеи | ьуз | Нтз | УаТ | сТи | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| дгд УаТ | аа! АЗП | ддс СТу | аде 5ег | аад Ьуз | д!д УаТ | ддс С1у | ссд Рго | дас Азр | ддс С1у | аса тЬг | ссс РГО | !ас Туг | дгг УаТ | асе ТЬг | дгд УаТ | 912 |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| С!С | аад | Ссс | гдд | а!с | ад! | дад | ад! | дгд | дад | дсс | дас | дгд | сдс | С!С | сдс | 960 |
| ьеи | ьуз | 5ег | тгр | Пе | 5ег | сТи | 5ег | УаТ | сТи | АТа | Азр | УаТ | Агд | ьеи | Агд | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| с!д | дсс | аа! | д!д | !сд | дад | едд | дас | ддд | ддс | дад | !ас | С!С | гдг | еда | дсс | 1008 |
| Ьеи | АТа | А5П | УаТ | 5ег | СТ и | Агд | Азр | сТу | СТу | СТ и | туг | ьеи | суз | Агд | АТа | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| асе | аа! | !!С | а!а | ддс | дгд | дсс | дад | аад | дсс | !!! | гдд | с!д | аде | д!! | сас | 1056 |
| ТЬг | АЗП | РЬе | Пе | СТу | Уа1 | АТа | сТи | ьуз | АТа | РЬе | тгр | ьеи | 5ег | УаТ | НТ 5 |
- 75 029140
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| ддд | ссс | еда | дса | дсс | дад | дад | дад | с!д | дед | дад | дсс | дас | дад | дед | ддс | 1104 |
| С1 у | Рго | Агд | АТа | АТа | сТи | СТ и | сТи | Ьеи | УаТ | СТи | аТ а | Азр | сТи | АТа | СТу | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| ад! | д!д | !а! | дса | ддс | а!с | С!С | аде | !ас | ддд | дед | ддс | !!С | !!С | сед | !!С | 1152 |
| 5ег | УаТ | туг | АТа | С1у | 1Те | ьеи | зег | туг | СТу | УаТ | сТу | РКе | РКе | Ьеи | РКе | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| а!с | сед | дед | дед | дед | дс! | дед | асд | С!С | еде | сде | сед | сде | аде | ссс | ССС | 1200 |
| 11е | ьеи | Уа1 | Уа1 | АТа | АТа | УаТ | тКг | ьеи | суз | Агд | ьеи | Агд | 5ег | рго | Рго | |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| аад | ааа | ддс | сед | ддс | !СС | ссс | асе | дед | сас | аад | а!с | !СС | сде | !!С | ссд | 1248 |
| ьуз | ьуз | СТу | ьеи | С1у | Зег | РГО | тКг | УаТ | ΗΪ 5 | ьуз | 1Те | 5ег | Агд | РКе | Рго | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| ССС | аад | еда | сад | сад | дед | !СС | с!д | дад | ссс | аас | дед | !СС | а!д | аде | !СС | 1296 |
| Ьеи | ьуз | Агд | СТп | сТп | УаТ | 5ег | ьеи | сТи | Зег | АЗП | АТа | Зег | ме! | Зег | Зег | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| аас | аса | сса | с!д | дед | еде | а! с | дса | адд | сед | !СС | сса | ддд | дад | ддс | ССС | 1344 |
| АЗП | тКг | Рго | ьеи | УаТ | Агд | 1Те | АТа | Агд | ьеи | зег | зег | СТу | СТ и | СТу | РГО | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| асд | сед | дсс | аа! | д!с | !СС | дад | ссс | дад | сед | сс! | дсс | дас | ссс | ааа | едд | 1392 |
| ТКг | Ьеи | АТа | А5П | УаТ | 5ег | СТ и | ьеи | СТ и | Ьеи | РГО | АТа | Азр | Рго | Ьуз | тгр | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| дад | сед | !С! | сдд | дсс | сдд | с!д | асе | сед | ддс | аад | ссс | с!! | ддд | дад | ддс | 1440 |
| сТи | ьеи | Зег | Агд | АТа | Агд | Ьеи | тКг | ьеи | СТу | ьуз | Рго | Ьеи | СТу | сТи | С1у | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| !дс | !!С | ддс | сад | дед | д!с | а!д | дед | дад | дсс | а! с | ддс | а!! | дас | аад | дас | 1488 |
| суз | РКе | СТу | сТп | УаТ | УаТ | ме! | АТа | СТи | АТа | 1Те | СТу | 1Те | Азр | ьуз | Азр | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| сдд | дсс | дсс | аад | сс! | дес | асе | дса | дсс | дед | аад | а!д | с!д | ааа | дас | да! | 1536 |
| Агд | А1а | А! а | ЬУ5 | Рго | УаТ | тКг | УаТ | АТа | УаТ | ьуз | ме! | ьеи | ьуз | Азр | Азр | |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| дсс | ас! | дас | аад | дас | сед | есд | дас | с!д | дед | !С! | дад | асд | дад | асд | асд | 1584 |
| АТа | тКг | Азр | ьуз | Азр | Ьеи | зег | Азр | Ьеи | УаТ | Зег | сТи | Ме! | сТи | Ме! | Ме! | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| аад | а!д | асе | ддд | ааа | сас | ааа | аас | а!с | асе | аас | сед | сед | ддс | дсс | еде | 1632 |
| ьуз | ме! | 11е | С1у | ьуз | Н1 5 | ьуз | АЗП | 1Те | хТе | АЗП | ьеи | ьеи | СТу | АТа | Суз | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| асд | сад | ддс | ддд | ссс | сед | !ас | дед | сед | дед | дад | !ас | дед | дсс | аад | дде | 1680 |
| тКг | СТп | СТу | СТу | Рго | ьеи | Туг | УаТ | Ьеи | УаТ | сТи | туг | АТа | АТа | ьуз | сТу | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| аас | сед | сдд | дад | !!! | сед | сдд | дед | сдд | сдд | ссс | сед | ддс | с!д | дас | !ас | 1728 |
| АЗП | ьеи | Агд | сТи | РКе | ьеи | Агд | АТа | Агд | Агд | РГО | Рго | СТу | Ьеи | Азр | Туг | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| !СС | !!С | дас | асе | еде | аад | ссд | ссс | дад | дад | сад | С!С | асе | !!С | аад | дас | 1776 |
| зег | РКе | Азр | тКг | суз | ьуз | рго | РГО | сТи | сТи | сТп | Ьеи | ТКг | РКе | ьуз | Азр | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| с!д | дед | !сс | еде | дсс | !ас | сад | дед | дсс | сдд | ддс | а!д | дад | !ас | еед | дсс | 1824 |
| ьеи | УаТ | Зег | Суз | АТа | туг | СТп | УаТ | АТа | Агд | С1у | Мес | сТи | туг | ьеи | АТа | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| !СС | сад | аад | еде | а! с | сас | адд | дас | сед | дс! | дсс | сде | аа! | дед | с!д | дед | 1872 |
| Зег | с!п | ьуз | суз | 1Те | ΗΪ 5 | Агд | Азр | ьеи | АТа | АТа | Агд | А5П | УаТ | ьеи | УаТ |
- 76 029140
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| асе | дад | дас | аас | дед | асд | аад | асе | дса | дас | ССС | ддд | ссд | дсс | едд | дас | 1920 |
| ТКг | с1и | АЗр | А5П | УаТ | мес | ьуз | Пе | а! а | Азр | РКе | сТу | ьеи | а! а | Агд | Азр | |
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| дед | сас | аас | ссс | дас | Сас | Сас | аад | аад | аса | асе | аас | ддс | едд | ссд | ссс | 1968 |
| Уа! | НТ 5 | АЗП | ьеи | Азр | Туг | туг | ьуз | ьуз | тКг | тКг | АЗП | сТу | Агд | ьеи | РГО | |
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| дед | аад | едд | асд | дед | ССС | дад | дсс | еед | ССС | дас | еда | дсс | Сас | асе | сас | 2016 |
| УаТ | ьуз | тгр | мес | А! а | РГО | с! и | А1а | Ьеи | РКе | Азр | Агд | Уа! | Туг | ТКг | НТ 5 | |
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| сад | аде | дас | дсс | едд | есс | ссс | ддд | дсс | ссд | ссс | едд | дад | асе | ссс | асд | 2064 |
| С1п | 5ег | А5Р | Уа! | Тгр | 5ег | рКе | сТу | Уа! | Ьеи | ьеи | тгр | с1и | Пе | РКе | тКг | |
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
| сед | ддд | ддс | Ссс | ссд | Сас | ссс | ддс | асе | ссс | дед | дад | дад | ссс | ссс | аад | 2112 |
| ьеи | СТу | сТу | 5ег | рго | Туг | рго | с! у | ί! е | РГО | УаТ | с! и | с! и | ьеи | РКе | ьуз | |
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| сед | ссд | аад | дад | ддс | сас | сдс | асд | дас | аад | ссс | дсс | аас | еде | аса | сас | 2160 |
| ьеи | ьеи | ьуз | С! и | сТу | НТ 5 | Агд | мес | Азр | ьуз | Рго | а! а | Азп | суз | ТКг | НТ 5 | |
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| дас | ссд | сас | асд | асе | асд | едд | дад | еде | едд | сас | дсс | дед | ссс | Ссс | сад | 2208 |
| Азр | ьеи | Туг | мес | Пе | мес | Агд | с! и | Суз | тгр | НТ 5 | а! а | А1а | РГО | 5ег | с!п | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| адд | ссс | асе | ссс | аад | сад | сед | дед | дас | сас | ссд | дад | сад | ссс | дда | асе | 2256 |
| Агд | Рго | тКг | РКе | Ьу5 | с! η | ьеи | УаТ | Азр | туг | ьеи | С1и | е!п | рКе | сТу | тКг | |
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| ссс | есд | ссс | аад | дад | ссд | дсс | еед | адд | аад | сад | ссс | сса | Сас | ссс | аад | 2304 |
| 5ег | 5ег | РКе | ьуз | с! и | 5ег | а! а | ьеи | Агд | ьуз | с! η | 5ег | ьеи | туг | Ьеи | ьуз | |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| ССС | дас | ссс | ссс | ссд | адд | дас | аде | ссС | дде | ада | сса | дед | ссс | дед | дсс | 2352 |
| РКе | Азр | РГО | Ьеи | ьеи | Агд | Азр | 5ег | Рго | сТу | Агд | Рго | УаТ | Рго | УаТ | а! а | |
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| асе | дад | асе | аде | аде | асд | сас | дде | дса | аас | дад | асе | ссс | сса | дда | сдс | 2400 |
| тКг | С1 и | тКг | 5ег | 5ег | мес | НТ 5 | сТу | а! а | АЗП | с! и | тКг | Рго | 5ег | сТу | Агд | |
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||||
| ссд | едд | даа | дсс | аад | есс | дед | дад | ССС | дас | ссс | ссд | дда | дса | ссд | дас | 2448 |
| Рго | Агд | С1и | а! а | ьуз | ьеи | УаТ | с! и | РКе | Азр | рКе | ьеи | сТу | а! а | ьеи | Азр | |
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| асе | ссс | дед | сса | ддс | сса | ссс | сса | дде | дее | ссс | дед | ссс | ддд | ддс | сса | 2496 |
| Пе | Рго | Уа1 | РГО | сТу | рго | Рго | РГО | сТу | уа! | Рго | а! а | рго | сТу | сТу | Рго | |
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| ссс | сед | ссс | асе | дда | ссс | аса | дед | дас | ссд | ссс | сад | сас | аде | сад | аад | 2544 |
| Рго | ьеи | 5ег | ТКг | сТу | РГО | 11 е | уа! | Азр | ьеи | Ьеи | с! η | Туг | 5ег | с!п | ьуз | |
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| дас | ссд | дас | дса | дед | дса | аад | дед | аса | сад | дад | дад | аас | едд | дад | ссд | 2592 |
| Азр | ьеи | Азр | а! а | уа! | Уа! | ьуз | А1 а | ТКг | с!п | С1и | С1и | А5П | Агд | с! и | Ьеи | |
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| адд | аде | адд | еде | дад | дад | ссс | сас | ддд | аад | аас | ссд | даа | ссд | ддд | аад | 2640 |
| Агд | 5ег | Агд | суз | с! и | С! и | ьеи | НТ 5 | сТу | ьуз | АЗП | ьеи | С1и | ьеи | сТу | Ьуз | |
| 865 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| асе | асд | дас | адд | ССс | даа | дад | дсс | дед | сас | сад | дсс | асд | дад | даа | дее | 2688 |
| 11 е | МеС | Азр | Агд | РКе | С! и | с! и | Уа! | УаТ | туг | С! η | А! а | мес | с! и | с! и | Уа! |
- 77 029140
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| сад | аад | сад | аад | даа | ССС | Ссс | ааа | дсс | даа | асе | сад | ааа | дсс | сса | ааа | 2736 |
| б!п | ьуз | 6ΐη | 1_У5 | б1и | ьеи | Зег | ЬУ5 | А1а | б1и | Не | б1п | ьуз | Уа! | ьеи | ьуз | |
| 900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
| даа | ааа | дас | саа | ссс | асе | аса | дас | сед | аас | ссс | асд | дад | аад | ссс | ссс | 2784 |
| б1и | ьуз | А5р | С1п | ьеи | тКг | ТКг | Азр | Ьеи | АЗП | Зег | мес | 61 и | ьуз | зег | рКе | |
| 915 | 920 | 925 | ||||||||||||||
| Ссс | дас | ССС | ССС | аад | еде | ссс | дад | ааа | сад | ааа | дад | дед | асе | дад | ддс | 2832 |
| Зег | Азр | ьеи | РКе | ьуз | Агд | РКе | б1и | Ьуз | 6ΐη | Ьуз | б!и | Уа1 | Пе | 61 и | б1у | |
| 930 | 935 | 940 | ||||||||||||||
| Сас | сдс | аад | аас | даа | дад | Сса | сед | аад | аад | Сдс | дед | дад | дас | Сас | сед | 2880 |
| туг | Агд | Ьуз | АЗП | 61 и | б!и | Зег | ьеи | Ьуз | ьуз | Суз | Уа1 | 61 и | Азр | туг | ьеи | |
| 945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
| дса | адд | асе | асе | сад | дад | ддс | сад | адд | сас | саа | дсс | ссд | аад | дсс | сас | 2928 |
| А! а | Агд | Не | ТКг | 61 η | б1и | 61 у | 6ΐη | Агд | Туг | б!п | А1а | Ьеи | ьуз | А! а | Нтз | |
| 965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
| дед | дад | дад | аад | сед | сад | сед | дса | аас | дад | дад | асе | дсс | сад | дсс | сдд | 2976 |
| а! а | б!и | б!и | ьуз | Ьеи | 61 η | Ьеи | А1а | АЗП | 61 и | б!и | 11 е | А1а | 6ΐη | Уа! | Агд | |
| 980 | 985 | 990 |
аде аад дсс сад дед даа дед ссд дсс ссс сад дсс аде сед адд аад 3024
5ег ьуз А1а С1п А1а С1и А1а ьеи А1а ьеи с1п А1а зег ьеи Агд ьуз
995 1000 1005
| дад б!и | сад б1п 1010 | асд Мес | сдс асе Агд Пе | сад сед б!п зег 1015 | сед дад | аад аса дед | дад сад аад б!и б!п Ьуз | 3069 | |||||||
| ьеи | 61 и | ьуз | ТКг | Уа! 1020 | |||||||||||
| асе | ааа | дад | аас | дад | дад | ссд | асе | адд | асе | Сдс | дас | дас | ссс | асе | 3114 |
| ТКг | ьуз | б!и | АЗП | б!и | 61 и | ьеи | тКг | Агд | Пе | Суз | Азр | Азр | ьеи | Пе | |
| 1025 | 1030 | 1035 | |||||||||||||
| ссс | аад | асд | дад | аад | асе | еда | 3135 | ||||||||
| зег | ьуз | мес | б!и | ьуз | Пе |
1040 <210> 28 <211> 1044 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 28
| мес 1 | 61 у | а!а Рго А1а суз 5 | а!а ьеи а!а | ьеи Су5 Уа! 10 | а! а | Уа! | А! а 15 | Пе | |||||||
| Уа! | А1а | 61 у | А! а | зег | Зег | б!и | зег | ьеи | 61 у | ТКг | б1и | б1п | Агд | Уа! | Уа1 |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| б1у | Агд | а! а | А! а | б1и | Уа! | РГО | 61 у | РГО | б1и | РГО | б1у | б!п | б!п | 61 и | 61 п |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| ьеи | Уа! | рКе | б!у | зег | 61 у | Азр | А! а | Уа! | б!и | ьеи | Зег | Суз | Рго | Рго | Рго |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| б1у | б!у | б!у | Рго | мес | 61 у | Рго | тКг | Уа! | Тгр | Уа! | Ьуз | Азр | б!у | тКг | б1у |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
- 78 029140
| ьеи | Уа! | Рго 5ег | с!и Агд Уа! 85 | Ьеи | Уа! | С! у 90 | Рго с!п Агд | ьеи | с!п 95 | Уа! | |||||
| ьеи | АЗП | а! а | 5ег | НТ 5 | с! и | Азр | 5ег | е!у | а! а | Туг | 5ег | СУ5 | Агд | С!п | Агд |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| ьеи | тНг | С! η | Агд | Уа! | ьеи | Су5 | нтз | РНе | 5ег | Уа! | Агд | Уа! | ТНг | Азр | а! а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| РГО | 5ег | 5ег | С1у | Азр | Азр | С! и | Азр | С! у | С! и | Азр | С! и | А! а | С! и | Азр | тНг |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| с!у | а! а | Рго | туг | тгр | тНг | Агд | Рго | С! и | Агд | мет | Азр | ьуз | ьуз | ьеи | ьеи |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| а! а | Уа! | РГО | а! а | а! а | АЗП | ТНг | Уа! | Агд | рНе | Агд | Суз | Рго | а! а | а! а | с! у |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| АЗП | Рго | тНг | РГО | 5ег | 1!е | 5ег | тгр | Ьеи | ьуз | Азп | С! у | Агд | С! и | РНе | Агд |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| С1у | с! и | ΗΊ 5 | Агд | 1!е | С!у | С1у | 1!е | ьуз | ьеи | Агд | НТ 5 | С1п | с!п | тгр | 5ег |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| ьеи | Уа! | мет | с! и | 5ег | Уа! | Уа! | рго | 5ег | Азр | Агд | с! у | АЗП | туг | тНг | суз |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Уа! | Уа! | е!и | АЗП | ьуз | РНе | С!у | 5ег | 1!е | Агд | е!п | ТНг | Туг | ТНг | ьеи | А5р |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Уа1 | Ьеи | с1и | Агд | 5ег | Рго | Нт 5 | Агд | РГО | 11е | Ьеи | С1п | А1а | С! у | ьеи | РГО |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| А1а | АЗП | с! η | тНг | а! а | Уа! | ьеи | С! у | 5ег | Азр | Уа! | с! и | РНе | нтз | СУ5 | ьуз |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Уа! | туг | 5ег | Азр | а! а | с!п | Рго | нтз | 1!е | С1п | тгр | ьеи | Ьуз | НТ 5 | Уа! | С! и |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Уа! | АЗП | с! у | 5ег | ьуз | Уа! | С! у | рго | Азр | с! у | тНг | РГО | туг | Уа! | тНг | Уа! |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| ьеи | ьуз | 5ег | Тгр | 11е | 5ег | С1и | 5ег | Уа! | С1и | А! а | А5Р | Уа! | Агд | Ьеи | Агд |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| ьеи | а! а | АЗП | Уа! | 5ег | с! и | Агд | Азр | С! у | с! у | с! и | туг | Ьеи | суз | Агд | а! а |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| тНг | А5П | РНе | 1!е | с! у | Уа! | а! а | С! и | ьуз | а! а | РНе | тгр | Ьеи | 5ег | Уа! | нт 5 |
| 340 | 345 | 350 |
- 79 029140
| С1у Рго Агд | а!а А!а с!и с!и б!и геи Уа! 360 | С! и | А! а | А5р 365 | С! и | а! а | С1у | ||||||||
| 355 | |||||||||||||||
| 5ег | Уа! | туг | А! а | С! у | П е | геи | 5ег | Туг | С! у | Уа! | с! у | РКе | РКе | геи | РКе |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Пе | геи | Уа! | Уа! | а! а | а! а | Уа1 | ТКг | геи | Суз | Агд | геи | Агд | 5ег | РГО | рго |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| гуз | гуз | б! у | геи | С! у | 5ег | рго | ТКг | Уа1 | НТ 5 | гуз | Пе | 5ег | Агд | РКе | РГО |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| геи | гуз | Агд | е!п | С1п | Уа! | 5ег | геи | с1и | 5ег | АЗП | А1а | 5ег | мег | 5ег | 5ег |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Азп | тКг | Рго | геи | Уа! | Агд | Пе | а! а | Агд | геи | 5ег | 5ег | с! у | С1и | с1у | Рго |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| тКг | геи | А1а | Азп | Уа1 | 5ег | с! и | геи | с! и | геи | РГО | а! а | Азр | Рго | гуз | тгр |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| б1и | геи | 5ег | Агд | А! а | Агд | геи | тКг | геи | С1у | гу5 | Рго | геи | С1у | С1и | С1у |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| СУ 5 | РКе | С! у | с!п | Уа! | Уа! | мег | а! а | с! и | а! а | Пе | б!у | Пе | Азр | гуз | Азр |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Агд | а! а | а! а | гуз | Рго | Уа! | тКг | Уа! | а! а | Уа! | гуз | мег | геи | гуз | Азр | Азр |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| А1а | тКг | Азр | гуз | А5р | геи | 5ег | Азр | геи | Уа! | 5ег | С1и | мег | б! и | мег | мег |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| гуз | мег | 11 е | с! у | гуз | НТ 5 | гуз | АЗП | 11 е | 11 е | Азп | геи | геи | с! у | А! а | суз |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| тКг | с1п | С! у | с! у | Рго | геи | Туг | Уа! | геи | Уа! | с! и | Туг | А1а | а! а | гуз | б1у |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| АЗП | геи | Агд | б!и | рКе | геи | Агд | а! а | Агд | Агд | Рго | РГО | С! у | геи | АЗр | Туг |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| 5ег | РКе | Азр | тКг | суз | гуз | Рго | РГО | С1и | с! и | С1п | геи | ТКг | РКе | гуз | А5р |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| геи | Уа! | 5ег | Суз | а! а | ту г | с1п | Уа1 | а! а | Агд | С1у | мег | С1и | ту г | геи | А1а |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| 5ег | С1п | гуз | Суз | ι! е | Нт 5 | Агд | АЗр | геи | а! а | А! а | Агд | АЗП | Уа! | геи | Уа! |
| 610 | 615 | 620 |
- 80 029140
| тКг 625 | б!и Азр | Азп Уа! | мег ьуз 630 | Пе | а! а | Азр рКе с!у ьеи а!а Агд Азр | |||||||||
| 635 | 640 | ||||||||||||||
| Уа! | НТ 5 | АЗП | Ьеи | А5р | Туг | Туг | ьуз | ьуз | тКг | ТКг | Азп | 61 у | Агд | ьеи | Рго |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Уа! | ьуз | тгр | мег | а! а | РГО | с! и | а! а | ьеи | РКе | Азр | Агд | Уа! | туг | ТКг | НТ 5 |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| 6ΐη | 5ег | АЗр | Уа! | тгр | 5ег | РКе | б1у | Уа! | ьеи | ьеи | Тгр | 61 и | Пе | РКе | тКг |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Ьеи | С1у | С! у | 5ег | РГО | туг | РГО | б1у | Пе | Рго | Уа1 | б!и | 61 и | Ьеи | РКе | ьуз |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| ьеи | ьеи | Ьуз | б1и | с! у | НТЗ | Агд | мег | Азр | ьуз | Рго | А1а | А5П | Суз | ТКг | НТЗ |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| А5р | ьеи | туг | мег | Пе | мег | Агд | 61 и | Суз | тгр | НТ 5 | А! а | А! а | Рго | 5ег | б1п |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| Агд | Рго | тКг | РКе | Ьуз | б1п | ьеи | Уа! | Азр | туг | Ьеи | 61 и | 61 η | РКе | б!у | ТКг |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| 5ег | 5ег | РКе | ьуз | с! и | 5ег | а! а | ьеи | Агд | ьуз | 61 п | 5ег | Ьеи | Туг | ьеи | Ьуз |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| РНе | Азр | Рго | ьеи | ьеи | Агд | Азр | 5ег | Рго | с! у | Агд | Рго | Уа! | РГО | Уа! | а! а |
| 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
| тКг | б1и | тКг | 5ег | 5ег | мег | Нтз | б1у | а! а | А5П | б1и | тКг | Рго | 5ег | б!у | Агд |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| Рго | Агд | С! и | а! а | ьуз | Ьеи | Уа! | с! и | РКе | Азр | РКе | ьеи | б!у | А1а | ьеи | Азр |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| 11е | РГО | Уа! | Рго | С! у | РГО | РГО | Рго | с! у | Уа! | РГО | а! а | Рго | 61 у | б!у | РГО |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| Рго | ьеи | 5ег | ТКг | б1у | РГО | Пе | уа! | АЗр | ьеи | ьеи | б1п | Туг | 5ег | б1п | ьуз |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| Азр | Ьеи | Азр | а! а | Уа! | Уа! | ьуз | а! а | тКг | б1п | б!и | б1и | АЗП | Агд | 61 и | ьеи |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| Агд | 5ег | Агд | Суз | с! и | с! и | ьеи | НТ 5 | с! у | ьуз | Азп | Ьеи | б1и | ьеи | 61 у | Ьуз |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| Пе | мег | Азр | Агд | РКе | с! и | С! и | уа! | Уа! | туг | 61 п | а! а | мег | б!и | б!и | Уа! |
| 885 | 890 | 895 |
- 81 029140
| С1п ьуз | С1п Ьуз С1и Ьеи Зег Ьуз А1а | С1и 11е С1п ьуз Уа! 910 | ьеи | ьуз | |
| 900 | 905 | ||||
| С1и ьуз | Азр С1п | Ьеи тКг тКг Азр ьеи | А5п Зег Мег С1и ьуз | Зег | РКе |
| 915 | 920 | 925 | |||
| Зег Азр | ьеи РКе | ьуз Агд РКе с!и Ьуз | с1п ьуз С1и Уа1 11е | с! и | с! у |
| 930 | 935 | 940 | |||
| Туг Агд | Ьуз Азп | С1и С1и 5ег ьеи ьуз | Ьу5 Суз Уа! с!и Азр | туг | ьеи |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||
| Αί а Агд | 11е тКг | С1п е!и е!у с1п Агд | Туг с1п А1а ьеи ьуз | а! а | Н1 5 |
| 965 | 970 | 975 | |||
| а! а с!и | С1и Ьуз | Ьеи С1п ьеи А1а Азп | с!и с!и 11е а!а С1п | Уа! | Агд |
| 980 | 985 | 990 | |||
| зег ьуз | А1а с1п | А1а С1и А1а ьеи А1а ьеи С1п А1а Зег ьеи Агд ьуз | |||
| 995 | 1000 | 1005 | |||
| с!и с!п | мег Агд 11е с!п Зег ьеи С1и ьуз тКг Уа! С1и с!п | ьуз | |||
| 1010 | 1015 | 1020 | |||
| тКг ьуз | С1и Азп с1и С1и Ьеи тКг Агд 11е Суз Азр Азр 1 | Ьеи | 11 е | ||
| 1025 | 1030 | 1035 |
зег ьуз мег с1и ьуз 11е
Claims (43)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ детектирования слитого гена, состоящего из гена рецептора 3 фактора роста фибробластов (РСРК3) и гена трансформирующего кислого биспиральсодержащего белка 3 (ТАСС3), в образце, полученном от тестируемого индивидуума, включающий детектирование в указанном образце полинуклеотида, кодирующего полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28, причем стадия детектирования наличия полинуклеотида включает амплификацию (а) полинуклеотида с использованием праймеров или (б) зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом.
- 2. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕЦ ГО N0: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕЦ ГО N0: 28.
- 3. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 26 или 8ЕО ГО N0: 28.- 82 029140
- 4. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2, 8Е0 ГО ΝΟ: 4, 8Е0 ГО ΝΟ: 6, 8Е0 ГО ΝΟ: 26 или 8Е0 ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8Е0 ГО ΝΟ: 2, 8Е0 ГО ΝΟ: 4, 8Е0 ГО ΝΟ: 6, 81®) ГО ΝΟ: 26 или 81®) ГО ΝΟ: 28.
- 5. Способ по п.1, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной 8Е0 ГО ΝΟ: 2, 8Е0 ГО ΝΟ: 4, 8Е0 ГО ΝΟ: 6, 8Е0 ГО ΝΟ: 26 или 81®) ГО ΝΟ: 28.
- 6. Способ детектирования слитого белка, состоящего из РОРК3 и ТАСС3, в образце, полученном от тестируемого индивидуума, включающий детектирование в указанном образце полипептида, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8Е0 ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8Е0 ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8Е0 ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28, причем стадия детектирования наличия полинуклеотида включает приведение антитела, которое узнает часть, полученную из гена полипептида РОРК3, и антитела, которое узнает часть, полученную из гена полипептида ТАСС3, в контакт с образцом.
- 7. Способ по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕО ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕО ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕО ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕО ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕО ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕО ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28.
- 8. Способ по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 4, 8ЕО ГО ΝΟ: 6, 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или 81®) ГО ΝΟ: 28.
- 9. Способ по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 4, 8ЕО ГО ΝΟ: 6, 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или 8ЕО ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 4, 8ЕО ГО ΝΟ: 6, 81®) ГО ΝΟ: 26 или 81®) ГО ΝΟ: 28.
- 10. Способ по п.6, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 4, 8ЕО ГО ΝΟ: 6, 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или 81®) ГО ΝΟ: 28.
- 11. Набор для детектирования слитого гена, состоящего из гена РОРК3 и гена ТАСС3, который включает смысловой праймер и антисмысловой праймер, спроектированные, чтобы быть способными специфически амплифицировать полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий канцерогенностью и содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕО ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕО ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕО ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28.
- 12. Набор по п.11, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕО ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕО ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕО ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕО ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕО ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕО ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 8ЕО ГО ΝΟ: 28.
- 13. Набор по п.11, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 4, 8ЕО ГО ΝΟ: 6, 8ЕО ГО- 83 029140N0: 26 или 8ЕО ΙΌ N0: 28.
- 14. Набор по п.11, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 26 или 8Е0 ГО N0: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 26 или 8ЕО ГО N0: 28.
- 15. Набор по п.11, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 26 или 8ЕО ГО N0: 28.
- 16. Набор праймеров для детектирования слитого гена, состоящего из гена РОРК3 и гена ТАСС3, выбранный из группы, состоящей из следующих от а) до е):a) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 1, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,b) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 3, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,c) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 5, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,') набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 25, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях,е) набор праймеров, содержащий антисмысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной 8Е0 ГО N0: 27, в жестких условиях, и смысловой праймер, состоящий из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с комплементарной цепью полинуклеотида в жестких условиях.
- 17. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 1 до 2280 8Е0 ГО N0: 1; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 2281 до 2856 8ЕО ГО N0: 1.
- 18. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 1 до 2280 8Е0 ГО N0: 3; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 2281 до 2961 8ЕО ГО N0: 3.
- 19. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 1 до 2368 8Е0 ГО N0: 5; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 2369 до 3003 8ЕО ГО N0: 5.
- 20. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 1 до 2242 8Е0 ГО N0: 25; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 2243 до 3144 8ЕО ГО N0: 25.
- 21. Набор праймеров из смыслового праймера, состоящего из олигонуклеотидных, по меньшей мере, любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 1 до 2233 8Е0 ГО N0: 27; и антисмыслового праймера, состоящего из олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, по меньшей мере, из любых последовательных 16 оснований между нуклеотидами в положениях от 2234 до 3135 8ЕО ГО N0: 27.- 84 029140
- 22. Набор зондов для детектирования слитого гена, состоящего из гена РСРК3 и гена ТАСС3, причем набор зондов включает зонд, спроектированный из части, полученной из гена РСРК3, и зонд, спроектированный из части, полученной из гена ТАСС3, где каждый из зондов состоит из молекул нуклеиновых кислот, гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, где полипептид обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО ΝΟ: 28.
- 23. Набор зондов по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 БЕЦ ГО ΝΟ: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 БЕЦ ГО ΝΟ: 4, номерами аминокислот с 461 по 996 БЕЦ ГО ΝΟ: 6, номерами аминокислот с 461 по 1043 БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или номерами аминокислот с 461 по 1040 БЕЦ ГО ΝΟ: 28.
- 24. Набор зондов по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной БЕЦ ГО ΝΟ: 2, БЕЦ ГО ΝΟ: 4, БЕЦ ГО ΝΟ: 6, БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или БЕЦ ГО ΝΟ: 28.
- 25. Набор зондов по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную БЕЦ ГО ΝΟ: 2, БЕЦ ГО ΝΟ: 4, БЕЦ ГО ΝΟ: 6, БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или БЕЦ ГО ΝΟ: 28; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной БЕЦ ГО ΝΟ: 2, БЕЦ ГО ΝΟ: 4, БЕЦ ГО ΝΟ: 6, БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или БЕЦ ГО ΝΟ: 28.
- 26. Набор зондов по п.22, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной БЕЦ ГО ΝΟ: 2, БЕЦ ГО ΝΟ: 4, БЕЦ ГО ΝΟ: 6, БЕЦ ГО ΝΟ: 26 или БЕЦ ГО ΝΟ: 28.
- 27. Набор зондов для детектирования слитого гена, состоящего из гена РСРК3 и гена ТАСС3, выбранный из группы, состоящей из следующих от а) до е):a) наборы зондов, включающие многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 1 и 2280 БЕЦ ГО ΝΟ: 1, и многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 2281 и 2856 БЕЦ ГО ΝΟ: 1;b) наборы зондов, включающие многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 1 и 2280 БЕЦ ГО ΝΟ: 3, и многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 2281 и 2961 БЕЦ ГО ΝΟ: 3;c) наборы зондов, включающие многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 1 и 2368 БЕЦ ГО ΝΟ: 5, и многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 2369 и 3003 БЕЦ ГО ΝΟ: 5;б) наборы зондов, включающие многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 1 и 2242 БЕЦ ГО ΝΟ: 25, и многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 2243 и 3144 БЕЦ ГО ΝΟ: 25;е) наборы зондов, включающие многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонуклеотиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 1 и 2233 БЕЦ ГО ΝΟ: 27, и многие виды наборов зондов, состоящих из пар зондов, которые граничат друг с другом и содержат олигонукле- 85 029140 отиды, комплементарные, по меньшей мере, любым последовательным 16 основаниям между нуклеотидами в положениях 2234 и 3135 8ЕЦ ГО N0: 27.
- 28. Способ детектирования слитого гена, состоящего из гена РСРК3 и гена ТАСС3, по любому из пп.1-5, где стадия детектирования присутствия полинуклеотида включает постановку гибридизации ш 5ίΙι.ι с использованием образца, полученного от тестируемого индивидуума, и набора зондов по п.17, амплификацию сигналов гибридизации и детектирование наложения сигналов.
- 29. Набор для детектирования слитого гена, состоящего из гена РСРК3 и гена ТАСС3, включающий набор зондов для детектирования слитого гена, состоящего из гена РСРК3 и гена ТАСС3, по п.27; реагент для амплификации сигналов гибридизации.
- 30. Способ детектирования слитого белка, состоящего из РСРК3 и ТАСС3, по любому из пп.6-10, где стадия детектирования присутствия полипептида включает:ί) приведение антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена РСРК3 полипептида, и антитела (первичного антитела), которое узнает часть, полученную от гена ТАСС3 полипептида, в контакт с образцом, полученным от испытуемого индивидуума, ίί) добавление вторичных антител, которые конъюгированы с олигонуклеотидами и соответственно связываются с первичными антителами, ίίί) вызывание реакции лигирования путем добавления лигирующего раствора, содержащего два вида олигонуклеотидов, которые частично комплементарны олигонуклеотидам, конъюгированным со вторичными антителами, и лигазы, которая может образовывать циклическую структуру между вторичными антителами путем вызывания лигирования, когда два вида олигонуклеотидов сближаются друг с другом, ιν) элонгацию последовательности нуклеиновой кислоты вдоль образованной циклической структуры,ν) гибридизацию меченого олигонуклеотидного зонда, который может гибридизоваться с элонгированной последовательностью нуклеиновых кислот, и νί) детектирование сигналов метки.
- 31. Набор для детектирования слитого белка, состоящего из РСРК3 и ТАСС3, который используется для способа детектирования слитого белка, состоящего из РСРК3 и ТАСС3, по любому из пп.1-5, включающий антитело (первичное антитело), которое узнает часть, полученную от гена РСРК3 слитого полипептида;антитело (первичное антитело), которое узнает часть, полученную от гена ТАСС3 слитого полипептида;вторичные антитела, которые конъюгированы с олигонуклеотидами и соответственно связываются с первичными антителами;два вида олигонуклеотидов, которые частично комплементарны олигонуклеотидам, конъюгированным с вторичными антителами;лигазу, которая может формировать циклическую структуру между вторичными антителами путем вызывания лигирования, когда два вида олигонуклеотидов сближаются друг с другом; и меченый олигонуклеотидный зонд.
- 32. Фармацевтическая композиция для лечения рака, которая включает ингибитор полипептида, где рак является положительным либо по слитому гену, состоящему из гена РСРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, состоящему из РСРК3 и ТАСС3, причем полипептид обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6.
- 33. Фармацевтическая композиция по п.32, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, представленную номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6; или полипептид, который обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 до 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6.
- 34. Фармацевтическая композиция по п.32, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 461 по 947 8ЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 461 по 982 8ЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 461 по 996 8ЕЦ ГО N0: 6.
- 35. Фармацевтическая композиция по п.32, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4 или 8ЕЦ ГО N0: 6.- 86 029140
- 36. Фармацевтическая композиция по п.32, где полипептид представляет собой полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, представленную ЗЕЦ ГО N0: 2, ЗЕЦ ГО N0: 4 или ЗЕЦ ГО N0: б; или полипептид, который обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность с делецией, заменой и/или инсерцией от 1 до 10 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной ЗЕЦ ГО N0: 2, ЗЕЦ ГО N0: 4 или ЗЕЦ ГО N0: б.
- 37. Фармацевтическая композиция по п.32, где полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной ЗЕЦ ГО N0: 2, ЗЕЦ ГО N0: 4 или ЗЕЦ ГО N0: б.
- 38. Фармацевтическая композиция для лечения рака по любому из пп.32-37, где ингибитор полипептида представляет собой довитиниб, ΑΖΌ4547, ВО1398 или ЬУ2874455.
- 39. Фармацевтическая композиция для лечения рака по любому из пп.32-37, где рак представляет собой рак легкого или рак мочевого пузыря.
- 40. Применение ингибитора полипептида для изготовления фармацевтической композиции для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, состоящему из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, состоящему из РОРК3 и ТАСС3, причем полипептид обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 4б1 по 947 ЗЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 4б1 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 4б1 по 99б ЗЕЦ ГО N0: б.
- 41. Применение ингибитора полипептида для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, состоящему из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, состоящему из РОРК3 и ТАСС3, причем полипептид обладает канцерогенностью и содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 4б1 по 947 ЗЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 4б1 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 4б1 по 99б ЗЕЦ ГО N0: б.
- 42. Ингибитор полипептида для лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, состоящему из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, состоящему из РОРК3 и ТАСС3, причем полипептид обладает канцерогенностью и включает аминокислотную последовательность, обладающую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 4б1 по 947 ЗЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 4б1 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 4б1 по 99б ЗЕЦ ГО N0: б.
- 43. Способ лечения рака, который является положительным либо по слитому гену, состоящему из гена РОРК3 и гена ТАСС3, либо по слитому белку, состоящему из РОРК3 и ТАСС3, включающий введение индивидууму эффективного количества ингибитора полипептида, обладающего канцерогенностью и содержащего аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности аминокислотной последовательности, представленной номерами аминокислот с 4б1 по 947 ЗЕЦ ГО N0: 2, номерами аминокислот с 4б1 по 982 ЗЕЦ ГО N0: 4 или номерами аминокислот с 4б1 по 99б ЗЕЦ ГО N0: б.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012052147 | 2012-03-08 | ||
| JP2012195451 | 2012-09-05 | ||
| JP2012280325 | 2012-12-21 | ||
| PCT/JP2013/056225 WO2013133351A1 (ja) | 2012-03-08 | 2013-03-07 | 新規ｆｇｆｒ３融合体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201491655A1 EA201491655A1 (ru) | 2015-01-30 |
| EA029140B1 true EA029140B1 (ru) | 2018-02-28 |
Family
ID=49116820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201491655A EA029140B1 (ru) | 2012-03-08 | 2013-03-07 | Новый слитый fgfr3 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9481911B2 (ru) |
| EP (1) | EP2824181B1 (ru) |
| JP (1) | JP6107812B2 (ru) |
| KR (4) | KR20200046135A (ru) |
| CN (1) | CN104379740B (ru) |
| AU (1) | AU2013228389A1 (ru) |
| BR (1) | BR112014021897B1 (ru) |
| CA (1) | CA2865388C (ru) |
| EA (1) | EA029140B1 (ru) |
| ES (1) | ES2702305T3 (ru) |
| HK (1) | HK1205528A1 (ru) |
| MX (1) | MX365214B (ru) |
| PH (1) | PH12014501918A1 (ru) |
| PL (1) | PL2824181T3 (ru) |
| PT (1) | PT2824181T (ru) |
| WO (1) | WO2013133351A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201406570B (ru) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201007286D0 (en) | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Astex Therapeutics Ltd | New compounds |
| GB201118652D0 (en) | 2011-10-28 | 2011-12-07 | Astex Therapeutics Ltd | New compounds |
| GB201118654D0 (en) | 2011-10-28 | 2011-12-07 | Astex Therapeutics Ltd | New compounds |
| GB201118656D0 (en) | 2011-10-28 | 2011-12-07 | Astex Therapeutics Ltd | New compounds |
| GB201209613D0 (en) | 2012-05-30 | 2012-07-11 | Astex Therapeutics Ltd | New compounds |
| US20150203589A1 (en) | 2012-07-24 | 2015-07-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Fusion proteins and methods thereof |
| KR102132149B1 (ko) | 2012-07-24 | 2020-07-09 | 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 | 융합 단백질 및 그의 방법 |
| CN107501413A (zh) | 2012-09-27 | 2017-12-22 | 中外制药株式会社 | Fgfr3融合基因和以其作为标靶的药物 |
| US11230589B2 (en) * | 2012-11-05 | 2022-01-25 | Foundation Medicine, Inc. | Fusion molecules and uses thereof |
| US20160052926A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-25 | Hutchison Medipharma Limited | Novel pyrimidine and pyridine compounds and usage thereof |
| WO2014165710A2 (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-09 | Life Technologies Corporation | Gene fusions |
| TW201605452A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-02-16 | 安斯泰來製藥股份有限公司 | 以嘧啶化合物作爲有效成分之醫藥組成物 |
| CN105980555A (zh) * | 2013-12-19 | 2016-09-28 | 日本国立癌症研究中心 | 作为胃癌的责任因子的新型融合基因 |
| EP3098312B1 (en) * | 2014-01-24 | 2023-07-19 | Japanese Foundation For Cancer Research | Novel fusant and method for detecting same |
| WO2015120094A2 (en) * | 2014-02-04 | 2015-08-13 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method of identifying tyrosine kinase receptor rearrangements in patients |
| AU2015238301B2 (en) | 2014-03-26 | 2020-06-25 | Astex Therapeutics Ltd | Combinations |
| JO3512B1 (ar) | 2014-03-26 | 2020-07-05 | Astex Therapeutics Ltd | مشتقات كينوكسالين مفيدة كمعدلات لإنزيم fgfr كيناز |
| DK3122359T3 (da) | 2014-03-26 | 2021-03-08 | Astex Therapeutics Ltd | Kombinationer af en fgfr-inhibitor og en igf1r-hæmmer |
| JOP20200201A1 (ar) | 2015-02-10 | 2017-06-16 | Astex Therapeutics Ltd | تركيبات صيدلانية تشتمل على n-(3.5- ثنائي ميثوكسي فينيل)-n'-(1-ميثيل إيثيل)-n-[3-(ميثيل-1h-بيرازول-4-يل) كينوكسالين-6-يل]إيثان-1.2-ثنائي الأمين |
| US10478494B2 (en) * | 2015-04-03 | 2019-11-19 | Astex Therapeutics Ltd | FGFR/PD-1 combination therapy for the treatment of cancer |
| JP6524833B2 (ja) * | 2015-07-17 | 2019-06-05 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光体集積ナノ粒子を用いたｆｉｓｈまたは免疫染色スライドの封入方法 |
| AU2016328692B2 (en) | 2015-09-23 | 2021-03-11 | Janssen Pharmaceutica Nv | New compounds |
| MX2018003564A (es) | 2015-09-23 | 2018-06-18 | Janssen Pharmaceutica Nv | 1,4-benzodiazepinas biheteroarilo sustituidas y usos de las mismas para el tratamiento del cancer. |
| CN111424081B (zh) * | 2020-04-13 | 2023-04-25 | 广东省妇幼保健院 | 基于多重荧光定量pcr技术检测软骨发育不全fgfr3基因突变的引物、探针和试剂盒 |
| EP4200019A1 (en) | 2020-08-21 | 2023-06-28 | Genzyme Corporation | Fgfr3 antibodies and methods of use |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1878766B (zh) * | 2003-11-07 | 2011-08-17 | 诺华疫苗和诊断公司 | 合成喹啉酮化合物的方法 |
| ES2486240T3 (es) | 2003-11-07 | 2014-08-18 | Novartis Ag | Sales de lactato de compuestos de quinolinona y su uso farmacéutico |
| US7737149B2 (en) | 2006-12-21 | 2010-06-15 | Astrazeneca Ab | N-[5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-2H-pyrazol-3-yl]-4-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzamide and salts thereof |
| AR078411A1 (es) | 2009-05-07 | 2011-11-09 | Lilly Co Eli | Compuesto de vinil imidazolilo y composicion farmaceutica que lo comprende |
| US20130096021A1 (en) | 2011-09-27 | 2013-04-18 | Arul M. Chinnaiyan | Recurrent gene fusions in breast cancer |
| ES2746288T3 (es) | 2012-02-28 | 2020-03-05 | Astellas Pharma Inc | Compuesto heterocíclico aromático que contiene nitrógeno |
| KR102132149B1 (ko) * | 2012-07-24 | 2020-07-09 | 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 | 융합 단백질 및 그의 방법 |
| CN107501413A (zh) | 2012-09-27 | 2017-12-22 | 中外制药株式会社 | Fgfr3融合基因和以其作为标靶的药物 |
| US11230589B2 (en) * | 2012-11-05 | 2022-01-25 | Foundation Medicine, Inc. | Fusion molecules and uses thereof |
-
2013
- 2013-03-07 PT PT13757006T patent/PT2824181T/pt unknown
- 2013-03-07 KR KR1020207012045A patent/KR20200046135A/ko active Application Filing
- 2013-03-07 EA EA201491655A patent/EA029140B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-03-07 CA CA2865388A patent/CA2865388C/en active Active
- 2013-03-07 US US14/383,199 patent/US9481911B2/en active Active
- 2013-03-07 WO PCT/JP2013/056225 patent/WO2013133351A1/ja active Application Filing
- 2013-03-07 CN CN201380012774.XA patent/CN104379740B/zh active Active
- 2013-03-07 ES ES13757006T patent/ES2702305T3/es active Active
- 2013-03-07 KR KR1020237024475A patent/KR20230111270A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-03-07 KR KR1020147028041A patent/KR102106962B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-07 JP JP2014503528A patent/JP6107812B2/ja active Active
- 2013-03-07 AU AU2013228389A patent/AU2013228389A1/en not_active Abandoned
- 2013-03-07 PL PL13757006T patent/PL2824181T3/pl unknown
- 2013-03-07 EP EP13757006.5A patent/EP2824181B1/en not_active Revoked
- 2013-03-07 BR BR112014021897-8A patent/BR112014021897B1/pt active IP Right Grant
- 2013-03-07 KR KR1020227002486A patent/KR20220017512A/ko active Application Filing
- 2013-03-07 MX MX2014010823A patent/MX365214B/es active IP Right Grant
-
2014
- 2014-08-26 PH PH12014501918A patent/PH12014501918A1/en unknown
- 2014-09-08 ZA ZA2014/06570A patent/ZA201406570B/en unknown
-
2015
- 2015-06-25 HK HK15106042.8A patent/HK1205528A1/xx unknown
-
2016
- 2016-09-14 US US15/264,900 patent/US10004739B2/en active Active
Non-Patent Citations (11)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102106962B1 (ko) | 2020-05-07 |
| PT2824181T (pt) | 2018-12-20 |
| US10004739B2 (en) | 2018-06-26 |
| HK1205528A1 (en) | 2015-12-18 |
| MX2014010823A (es) | 2015-03-19 |
| PH12014501918A1 (en) | 2014-11-24 |
| CA2865388C (en) | 2022-01-04 |
| JPWO2013133351A1 (ja) | 2015-07-30 |
| CN104379740B (zh) | 2019-05-14 |
| KR20230111270A (ko) | 2023-07-25 |
| CN104379740A (zh) | 2015-02-25 |
| MX365214B (es) | 2019-05-27 |
| WO2013133351A1 (ja) | 2013-09-12 |
| US9481911B2 (en) | 2016-11-01 |
| BR112014021897B1 (pt) | 2022-06-14 |
| ZA201406570B (en) | 2015-12-23 |
| CA2865388A1 (en) | 2013-09-12 |
| US20160375023A1 (en) | 2016-12-29 |
| EA201491655A1 (ru) | 2015-01-30 |
| ES2702305T3 (es) | 2019-02-28 |
| PL2824181T3 (pl) | 2019-02-28 |
| KR20140140070A (ko) | 2014-12-08 |
| EP2824181A4 (en) | 2015-07-15 |
| EP2824181A1 (en) | 2015-01-14 |
| JP6107812B2 (ja) | 2017-04-05 |
| KR20220017512A (ko) | 2022-02-11 |
| US20150031703A1 (en) | 2015-01-29 |
| AU2013228389A1 (en) | 2014-09-25 |
| KR20200046135A (ko) | 2020-05-06 |
| EP2824181B1 (en) | 2018-11-14 |
| BR112014021897A2 (pt) | 2017-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA029140B1 (ru) | Новый слитый fgfr3 | |
| AU2015321626B2 (en) | Use of FGFR mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an FGFR inhibitor | |
| US9216172B2 (en) | Method for determining effectiveness of cancer treatment by assessing the presence of a KIF5B-RET chimeric gene | |
| CN101384734B (zh) | 正常和异常基因表达中的dna构象(环结构) | |
| CN105658814A (zh) | 在肺癌中检测出的新型融合基因 | |
| JP2019216725A (ja) | Ｆｇｆｒ融合体 | |
| CN107532199B (zh) | 与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途 | |
| CN105934521A (zh) | 检测和治疗响应于dot1l抑制的白血病的方法 | |
| CN108026588A (zh) | Fgfr表达以及对fgfr抑制剂的敏感性 | |
| Shi et al. | CCAT2 enhances autophagy‐related invasion and metastasis via regulating miR‐4496 and ELAVL1 in hepatocellular carcinoma | |
| CN100348614C (zh) | 一种肝癌－睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽 | |
| Vinhas et al. | A novel BCR-ABL1 mutation in a patient with Philadelphia chromosome-positive B-cell acute lymphoblastic leukemia | |
| JP6467580B2 (ja) | 小細胞肺がんの診断薬及び治療薬 | |
| WO2016104794A1 (ja) | Ｂｒａｆ変異検出によるｅｇｆｒ阻害剤の効果予測 | |
| JP2007082433A (ja) | 悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途 | |
| JPWO2017122816A1 (ja) | 新規融合体及びその検出法 | |
| WO2010013633A1 (ja) | 細胞のｒｂステイタス及びｐｌｋ１阻害剤に対する感受性を予測する方法 | |
| KR20230001587A (ko) | 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
| CN108524937A (zh) | Mrvi1-as1作为靶位点在制备治疗鼻咽癌紫杉醇化疗增敏药物中的应用 | |
| KR20140058630A (ko) | 신규 pan-CDK 저해제로 유방 종양을 치료하는데 있어서 분류 마커로서의 MAD2L2의 용도 | |
| CN107095872A (zh) | 用于确定癌症预后的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |