CN107532199B - 与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与间质上皮转化因子(MET)抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途，更详细地提供如下：与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用生物标志物，包含免疫球蛋白超家族成员1(Immunoglobulin Superfamily member 1，NM_001555.2)基因；与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用组合物，包含用于测定上述生物标志物基因表达水平或其的蛋白质的表达水平的制剂；与间质上皮转化因子信号传递途径的调节异常相关的疾病的预防或治疗用药学组合物，包含抑制剂作为有效成分，上述抑制剂用于抑制上述生物标志物基因表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性；与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用试剂盒，包含上述与间质上皮转化因子信号传递途径的调节异常相关的疾病的预防或治疗用药学组合物；以及与间质上皮转化因子抑制剂相关的感受性预测方法。根据本发明，本发明与胃癌或肺癌中的间质上皮转化因子抑制制剂相关的感受性预测效果优秀，因此本发明能够有用地利用于胃癌或肺癌治疗。

Description

与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用新型生物标 志物及其用途
技术领域
本发明通过韩国保健福祉部的支援下的课题编号1420030实现，上述课题的研究管理专门机关为癌症征服推进研究开发事业团，研究事业名称为“癌症征服推进研究开发事业”，研究课题名称为“在大肠癌患者中克服西妥昔单抗(cetuximab)抵抗性的新型治疗法开发及生物标志物发掘”，主管机关为首尔峨山医院，研究期间为2014.05.01～2017.04.30。
本发明通过韩国保健福祉部的支援下的课题编号HI06C0868实现，上述课题的研究管理专门机关为韩国保健产业振兴源，韩国保健产业振兴源，研究事业名称为“先导型特性化研究事业”，研究课题名称为”将受体酪氨酸激酶(RTK，Receptor Tyrosine Kinase)作为靶的革新抗癌剂开发”，主管机关为首尔峨山医院先导型癌症研究事业团，研究期间为2011.12.01～2016.11.30。
本发明涉及与间质上皮转化因子(MET)抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途。
背景技术
通常，当在抗癌疗法中给药抗癌剂时的生物体的反应性大大地依赖于成为药剂的靶的癌细胞的与该药剂有关的感受性。这种癌细胞的与药剂有关的感受性根据癌细胞大不同。这种感受性的差异源于该药剂的靶分子或与此相关的因子的量或质的差异或药剂耐性的获得等。将这种背景作为根据，在成为靶的癌细胞对药剂呈现感受性的情况下，若可确认特异性地呈现的癌细胞的遗传性变化，则在早期可实现药剂的效果判定、治疗法的确立、新的治疗法的选择等，从而非常有利。并且，若治疗之前，在通过生物体组织片等取得的癌组织中，通过通常的方法分离癌细胞后，进行药剂处理，来根据上述变化测定该癌细胞是否具有药剂感受性，则可预先预测基于该药剂的治疗是否有效，因此在临床上非常有效。
即，这种抗癌剂与耐性和毒性相关个体差异大，在相同的患者中，还在约半数以上中存在呈现耐性的问题，因此利用适合的治疗反应性标志物的筛选可导致抗癌剂治疗的划时代进步。
对此，近来，持续地活跃展开与基于特定基因的个别抗癌剂的治疗反应性相关的研究。
但是，当前，由于与特定药剂有关的生物体反应有关要素的复合作用、治疗剂及给药方式的多样性及难以确保广泛的试样，从而还非凡的成果微弱。
另一方面，进行细胞调节的主要机制中之一为在细胞内依次调节生物化学途径，来传递细胞外的信号。蛋白质磷酸化是指从分子到分子通过传递细胞内信号，来最终谋求细胞反应的一个过程。这些信号传递连续步骤如不仅在多个蛋白激酶下明确地呈现，而且在磷酸分解酶的存在下明确呈现，得到高度调节把那个往往重复。磷酸化是在细胞内相当遍及的过程，并且细胞的表现型根据这种途径的活性度大大地受到影响，因此，当前认为大多数疾病的状态和/或疾病源于在激酶连续步骤的分子成分中的非正常激活或功能性突变(Weinstein-Oppenheimer et al.Pharma.&.Therap.,2000,88,229-279).
其中，间质上皮转化因子(间质表皮转化因子(c-MET))作为存在于细胞表面的大靶的受体受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase；RTK)，在种类多的癌症中进行过表达，尤其，存在间质上皮转化因子的过表达的患者而言，大部分情况下癌症的治疗预后不好。
癌症中的这种间质上皮转化因子信号传递能够以两种方法得到激活：(i)间质上皮转化因子激活而言，与作为其配体的肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)相结合，来促进细胞内信号传递的肝细胞生长因子-依赖性机制或者(ii)如间质上皮转化因子基因的扩增或间质上皮转化因子基因的突变等通过肝细胞生长因子-非依赖性机制进行介导。
但是，通常将间质上皮转化因子作为靶进行开发的大部分的抑制剂将焦点对准于基于肝细胞生长因子-依赖性机制的间质上皮转化因子激活来进行，当前，未众所周知利用与疾病有关的生物标志物的治疗法，如利用肝细胞生长因子-非依赖性机制介导的间质上皮转化因子激活导致的癌症等。
发明内容
技术问题
在这种状况下，本发明人为了开发在由肝细胞生长因子-非依赖性机制介导的间质上皮转化因子激活导致的癌症中，可预测与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性的生物标志物，锐意努力。其结果，作为预测在胃癌及肺癌中的与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性的生物标志物，对免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子基因和/或蛋白质的表达形态进行分析，确认当在胃癌及肺癌细胞株中，抑制免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子基因时，显著地减少癌细胞的生存率、转移性及移动性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用生物标志物。
并且，本发明的再一目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用组合物。
并且，本发明的另一目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用试剂盒。
并且，本发明的还一目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂。
并且，本发明的又一目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测方法。
并且，本发明的又一目的在于，提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进方法。
并且，本发明的又一目的在于，提供与间质上皮转化因子信号传递途径的调节异常相关的疾病的预防或治疗用药学组合物。
解决问题的方案
以下，对本发明进行详细说明。
根据本发明的一实施方式，本发明提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用生物标志物，包含免疫球蛋白超家族成员1(IGSF1，Immunoglobulin Superfamilymember 1，NM_001555.2)。
本发明的最大的特征在于，将作为免疫球蛋白超家族成员1基因及其的产物的蛋白质利用为生物标志物，来预测与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性。
本发明的生物标志物可成为与作为间质上皮转化因子抑制剂的抗癌剂有关的感受性的指标，作为与抗癌剂有关的感受性标志物的准确性及可靠度也卓越，因此可利用于癌症的发生、发展和/或转移的治疗。
在本说明书中所使用的术语“感受性”是指对各个的患者的癌症特定药物是否呈现效果。
例如，上述特定药物主要是抗癌剂，在这些抗癌剂中，存在根据癌症的种类呈现效果和不呈现效果的情况。并且，众所周知，即使是认定为有效的癌症，也根据各个患者存在呈现效果的情况和不呈现效果的情况。将如上所述的对各个患者的癌症是否呈现抗癌剂效果称为抗癌剂感受性。因此，根据本发明，若可预测在治疗开始之前可期待效果的患者(反应者)和无法期待效果的患者(无反应者)，则可实现有效性和稳定性高的化学疗法。
在本发明中所使用的术语“预测”使用于指称在本发明中的对象患者针对于药物或药物套件可有利地或不利地进行反应的可能性。在一实时方案中，预测与这种反应的程度相关。例如，预测涉及患者处置后，例如，在特定的治疗剂的处置和/或原发性肿瘤的手术去除和/或特定期间的化学疗法后无癌症的复发是否生存和/或那种概率。作为本发明的预测，选择与大肠癌患者相关的最适当的治疗方式，从而在确定治疗中，临床上可使用。本发明的预测是在患者的治疗处置，例如，指定的治疗性处置中有用的工具，上述指定的治疗性处置为例如，对指定的治疗剂或组合物的给药、手术性介入、化学疗法等是否有利地反应或治疗性处置后，是否患者的脏器生存。
并且，本发明的优选实例，上述间质上皮转化因子以肝细胞生长因子(HepatocyteGrowth Factor)-非依赖性(independent)得到激活。
间质上皮转化因子激活而言，与作为其配体的肝细胞生长因子相结合，来促进细胞内信号传递的肝细胞生长因子-依赖性机制或者如间质上皮转化因子基因的扩增或间质上皮转化因子基因的突变等通过肝细胞生长因子-非依赖性机制进行介导。本发明的间质上皮转化因子通过肝细胞生长因子-非依赖性机来制得到激活，从而作为肝细胞生长因子基因和/或其的产物的蛋白质得不到表达或低表达。
并且，本发明的优选实例，上述激活借助免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子(NM_001127500.1)的共同表达诱导间质上皮转化因子磷酸化。
因此，根据本发明，在本发明的标志物通过肝细胞生长因子-非依赖性机制激活的情况下，用于预测与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性，在肝细胞生长因子高表达的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。
即，本发明的生物标志物将作为肝细胞生长因子基因和/或其的产物的蛋白质未表达或低表达的癌细胞或具有癌症的客体作为对象，来确认细胞内上述基因的表达水平。
根据本发明的再一实施方案，本发明提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用组合物，上述与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用组合物包含用于测定免疫球蛋白超家族成员1(NM_001555.2)基因的表达水平或其的蛋白质的表达水平的制剂。
根据本发明的优选实例，本发明的间质上皮转化因子通过肝细胞生长因子-非依赖性机来制得到激活，从而作为肝细胞生长因子基因和/或其的产物的蛋白质未得到表达或低表达。
并且，根据本发明的优选实例，上述激活借助免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子(NM_001127500.1)的共同表达诱导间质上皮转化因子磷酸化。
因此，根据本发明，本发明的组合物在间质上皮转化因子通过肝细胞生长因子-非依赖性机制激活的情况下，用于预测与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性，在肝细胞生长因子高表达的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。
并且，根据本发明的优选实例，上述间质上皮转化因子抑制剂为与选自由促肾上腺皮质激素(ACTH，adrenocorticotropic hormone)生成肿瘤、急性淋巴细胞白血病或成淋巴细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、子宫内膜症、食道癌、膀胱癌、尤因肉瘤(Ewing’ssarcoma)、舌癌、霍普金斯淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、睾丸癌、肾母细胞瘤及绒膜上皮癌组成的组中的一种以上的癌症有关的治疗剂。更优选地，是促肾上腺皮质激素生成肿瘤、急性淋巴细胞白血病或成淋巴细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓细胞性白血病、肠癌、T区淋巴瘤、子宫内膜症、食道癌、胆汁膀胱癌、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、舌癌、霍普金斯淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、睾丸癌、肾母细胞瘤或绒膜上皮癌，最优选地，是肺癌或胃癌。
在本发明中，上述间质上皮转化因子抑制剂是指抗癌剂，还可使用呈现抗癌效果的任意间质上皮转化因子抑制剂，优选地，是选自由抗-间质上皮转化因子抗体、诱导间质上皮转化因子受体、间质上皮转化因子肽拮抗剂、显性阴性间质上皮转化因子突变、间质上皮转化因子特异性反义寡核苷酸、核酶及选择性小分子间质上皮转化因子激酶抑制剂组成的组中的一种以上。
在本说明书中没有特别的提及的情况下，在本发明中所使用的表述“基因的表达水平；或其的蛋白质的表达水平测定”是指在相当试样内所要检测的对象。在本发明中，所要检测的对象为试样内相当基因的信使核糖核酸和/或蛋白质。即，检测作为基因的转录产物的核糖核酸(RNA)或作为基因产物的蛋白质，从而可确认上述基因是否表达。
作为核糖核酸或蛋白质的检测，通常从试样提取核糖核酸或蛋白质，来检测提取物中的核糖核酸或蛋白质而进行。这种核糖核酸或蛋白质的检测可通过免疫分析方法、杂交化反应及扩增反应，来测定，但是并不限定于此，可利用在本发明所述技术领域中公知的多种技术来容易进行。
并且，根据本发明的优选实例，测定上述基因表达水平的制剂包含与上述基因的信使核糖核酸进行特异性结合的反义寡核苷酸、一对引物或探针。
上述用于测定信使核糖核酸是否表达的制剂选自对上述基因具有特异性的反义寡核苷酸、一对引物、探针及它们的组合组成的组中。即，核酸的检测是可通过使用对基因进行编码的核酸分子或与上述核酸分子的互补物进行杂交的一个以上的寡核苷酸引物的扩增反应来进行。
例如，利用引物的信使核糖核酸的检测可使用如聚合酶链式反应(PCR)等扩增方法，来扩增基因序列后，通过本发明所属领域中公知的方法确认基因是否扩增来进行。
并且，根据本发明的优选实例，用于测定上述蛋白质的表达水平的制剂包含与上述蛋白质进行特异性结合的抗体、肽或核苷酸。
用于测定上述蛋白质的表达水平的制剂是指对上述蛋白质进行特异性结合的抗体，均包含多克隆抗体单克隆抗体、重组抗体及它们的组合。
上述抗体不仅包含多克隆抗体单克隆抗体、重组抗体及具有两个总长度的轻链及两个总长度的重链的完全的形态，而且均包含抗体分子的功能性片段，例如，Fab、F(ab’)、F(ab’)2及Fv。抗体生产而言，可利用在本发明所属领域中公知的技术来容易制备，可利用制备而在商业上销售的抗体。
本发明的组合物不仅包含用于测定上述的基因是否表达的制剂，而且还可包含能够以定量或定性的方式测定抗原-抗体复合体的形成的标签、适用于免疫学分析的通常的工具、试剂等。
能够以定量或定性的方式测定抗原-抗体复合体的形成的标签包含酶活性、荧光物、配体、发光物、微粒(microparticle)、氧化还原分子及放射性同位素等，但并不限定于此。可用作检测标签的酶包含β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、β半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、焦磷酸化酶(GDPase)、核糖核酸酶(RNase)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、谷草转氨酶、磷酸苯酚丙酮酸脱羧酶及β-内酰胺酶等，且并不限定于此。荧光物包含荧光素，异硫氰酸酯，罗丹明，藻红蛋白，藻青蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛及荧光胺等，但并不限定于此。作为配体包含生物素诱导体等，但并不限定于此。发光物包含吖啶酯、虫荧光素、荧光素酶等，但并不限定于此。微粒包含胶体金，着色的乳胶等，但并不限定于此。作为氧化还原分子有二茂铁、钌络合物，紫罗碱，醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、[MO(CN)8]4-等，但并不限定于此。放射性同位素包含3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131Ⅱ、186Re等，但并不限定于此。
作为上述工具或试剂的一例，包含适合的载体、溶解剂、清洗剂、缓冲剂、稳定化剂等，但并不限定于此。在标志物物质为酶的情况下，可包含可测定酶活性的基质及反应停止剤。作为载体有可溶性载体、不溶性载体，作为可溶性载体的一例，有在本发明所属技术领域中公知的生理学上接受的缓冲液，例如，有磷酸盐缓冲液(PBS)，作为不溶性载体的一例可以为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、其它纸、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合。
本发明的组合物包含上述的生物标志物作为有效成分，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含上述组合物的与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用试剂盒。
上述试剂盒不仅包含用于测定上述的基因的表达；或上述其的蛋白质的表达水平的制剂，而且可包含使用于免疫学分析的在本领域中通常所使用的工具、试剂等。
作为上述工具或试剂的一例包含载体、可生成能够检测的信号的标志物物质、发色团(chromophores)、溶解剂、清洗剂、缓冲剂、稳定化剂等，但并不限定于此。在标志物物质为酶活性的情况下，可包含可测定酶活性的基质及反应停止剂。载体有包含溶性载体及不溶性载体，作为可溶性载体的一例包含在该领域中公知的在生理学上接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)，作为不溶性载体的一例，可以为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、如在乳胶镀金属的磁性微粒等高分子、其它纸、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合。
本发明的试剂盒作为构成包含上述的生物标志物及组合物，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供与对象的间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂或感受性增进用组合物，包含如下的抑制剂作为有效成分：上述抑制剂是指用于抑制免疫球蛋白超家族成员1(NM_001555.2)基因的表达或者上述基因的蛋白质的表达或活性的抑制剂。
根据本发明的优选实例，上述与对象的间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂或增进用组合物还包含如下的抑制剂，上述抑制剂是指抑制间质上皮转化因子(NM_001127500.1)基因的表达或者上述基因的蛋白质的表达或活性的抑制剂。
在本发明中，在上述对象以肝细胞生长因子-非依赖性机制间质上皮转化因子激活(磷酸化)的情况下，使间质上皮转化因子抑制剂相关的感受性增进，用于预测与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性，在以肝细胞生长因子-依赖性间质上皮转化因子激活(磷酸化)的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。
即，用于抑制本发明的免疫球蛋白超家族成员1和/或间质上皮转化因子基因的表达；或上述基因的蛋白质的表达或活性的抑制剂可通过减少间质上皮转化因子的磷酸化，减少癌细胞的移动性及转移性，来呈现卓越的抗癌效果。
并且，本发明的优选实例，上述抑制剂为选自由小干扰核糖核酸(smallinterference RNA)、短发夹核糖核酸(short hairpin RNA)、微小核糖核酸(micro RNA)、核酶(ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme)、肽核酸(PNA，peptide nucleic acids)、反义寡核苷酸、抗体、适体、天然提取物及化学物质组成的组中的一种以上。更优选地，是与上述基因的信使核糖核酸进行特异性结合的反义寡核苷酸、适体、小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸或微小核糖核酸，最优选地，是小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸或微小核糖核酸。
在本发明中所使用的术语“微小核糖核酸(microRNA)”是指通过与信使核糖核酸的3’非翻译区(UTR)部位的碱基键，来转录后起到抑制剂作用的大致22nt的非翻译核糖核酸。作为微小核糖核酸的制备方法并不特别限定，可使用在本领域中公知的方法。
根据本发明的优选实例，上述微小核糖核酸为包含序列1的碱基序列的MiR34a；或序列2的碱基序列的miR34c。
在本发明中所使用的术语“小干扰核糖核酸”是指作为双链的核糖核酸借助Dicer切割来生成的21～25核苷酸大小的小的核糖核酸片段，与具有互补的序列的信使核糖核酸进行特异性结合来抑制表达。指与本发明的目的信使核糖核酸进行特异性结合，来抑制上述基因的表达。能够以化学或酶活性学的方式合成小干扰核糖核酸。并不特别限定小干扰核糖核酸的制备方法，可使用在本领域中公知的方法。
在本发明中所使用的术语“短发夹核糖核酸”是指作为具有45至70核苷酸的长度的单链核糖核酸，与靶基因小干扰核糖核酸碱基序列的正义链(sense)具有互补性的无义(nonsense)之间连接3～10个的碱基链的寡聚脱氧核糖核酸(DNA)后，若在质粒载体中进行克隆或通过将短发夹核糖核酸插入语作为逆转录病毒的慢病毒(lentivirus)及腺病毒(adenovirus)来进行表达，则制备具有发夹(hairpin)结构的短发夹核糖核酸(shorthairpin RNA),通过细胞内的帽子(Dicer)转换为小干扰核糖核酸，来呈现RNAi效果。包含短发夹核糖核酸的表达构建/载体可利用本领域中公知的方法制备。
本发明的优选实例，上述小干扰核糖核酸(small interference RNA)为包含序列3的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸、包含序列4的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸或包含序列5的碱基序列的间质上皮转化因子小干扰核糖核酸；上述短发夹核糖核酸(short hairpin RNA)为包含序列6的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1短发夹核糖核酸或包含序列7的碱基序列的间质上皮转化因子短发夹核糖核酸。
根据本发明，利用RNAi方法(小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸、微小核糖核酸)抑制癌细胞的免疫球蛋白超家族成员1基因或作为其的产物地蛋白质的表达的情况下，以小干扰核糖核酸浓度-依赖性的方式减少间质上皮转化因子的磷酸化。
并且，在本发明中作为免疫球蛋白超家族成员1和/或间质上皮转化因子基因或其的产物的蛋白质的表达得到抑制的癌细胞，与蛋白质的表达未得到抑制的癌细胞相比，呈现生存率、移动性及转移性(浸润)显著降低的结果。
因此，这是提示免疫球蛋白超家族成员1和/或间质上皮转化因子基因的表达；或上述基因的蛋白质的表达或活性抑制使与间质上皮转化因子抑制剂有关的癌细胞的感受性增加，基于上述本发明提供对象的与间质上皮转化因子抑制剂有关的卓越的感受性增进效果。
本发明的感受性增进剂或增进用组合物还可包含药学上可接受的载体。在本发明中可使用的在药学上可接受的载体可选择通常的赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、其他添加剂，例如，可选择稳定剂、润肤剂、乳化剂等而使用。例如，作为赋形剂可使用微晶纤维素、乳糖、低取代羟丙基纤维素等，作为崩解剂可使用羧甲基淀粉钠、无水磷酸氢钙等。作为结合剂可使用乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素等，作为润滑剂可从硬脂酸镁、二氧化硅、滑石选择而使用。
本发明的组合物利用上述的生物标志物的表达水平，增进与表皮生长因子受体(EGFR)-靶制剂有关的感受性，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
根据本发明另一实施方式，本发明提供与间质上皮转化因子信号传递途径的调节异常相关的疾病的预防或治疗用药学组合物，包含上述的与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂以及间质上皮转化因子抑制剂作为有效成分。
在本发明中，与上述间质上皮转化因子信号传递途径的调节异常相关的疾病为癌症、动脉粥样硬化症、肺纤维化、肾纤维化及再生、肝脏疾病、变应性疾病、炎症性疾病、自身免疫疾病、脑血管疾病、心血管疾病或与器官移植相关的症状，优选地，是癌症。
即，用于抑制本发明的与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂的免疫球蛋白超家族成员1和/或间质上皮转化因子基因的表达；或上述基因的蛋白质的表达或活性的抑制剂通过与抗癌剂相关的感受性，来与它们抗癌剂一同给药的情况下，增减抗癌剂的抗癌作用，从而可使癌症的治疗变得更容易。
作为基于本发明的组合物的改善、预防或治疗对象疾病的“癌症(cancer)”是指细胞无视正常的生长局限，具有进行分裂及生长的攻击性(aggressive)特性、向周围组织侵入的侵入性特性及向体内的其他部位扩散的转移性(metastatic)特性的基于细胞的疾病的总称。在本说明书中上述癌症还与恶性肿瘤(malignant tumor)相同的意义来使用。
可使用本发明的组合物的癌症为乳腺癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、胃癌(stomach cancer)、肝癌(liver cancer)、血液癌(blood cancer)、骨癌(bonecancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、皮肤癌(skin cancer)、头或颈癌(head or neckcancer)、皮肤或眼球黑色素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)、子宫肉瘤(uterine sarcoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、直肠癌(rectal cancer)、肛门癌(analcancer)、大肠癌(colon cancer)、输卵管癌(fallopian tube carcinoma)、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、子宫颈癌(cervical cancer)、小肠癌(small intestinecancer)、内分泌癌(endocrine cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、肾癌(adrenal cancer)、软组织肿瘤(soft tissue tumor)、尿道癌(urethral cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、支气管癌(bronchogenic cancer)、骨髓癌(bone marrow tumor)等，但并不限定于此。
优选地，本发明的组合物可适用于胃癌或肺癌的预防或治疗。
在本说明书中术语“预防”是指无诊断为疾病或保留疾病的情况，但是在具有易得这种疾患或疾病的倾向的动物中抑制疾患或疾病的发生。在本说明书中术语“治疗”是指(i)疾患或疾病的发展的抑制；(ii)疾患或疾病的减轻；以及(iii)疾患或疾病的去除。
本发明的药学组合物还可包含药学上接受的载体。
在本发明的药剂学组合物中包含的药学上接受的载体是在制剂时通常利用的，其包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。本发明的药学组合物除了上述成分之外，还能追加包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保存剂等。适合的药学上接受的载体及制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细记载。
本发明的药学组合物的适合的给药剂量会根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等因素，能够下多种处方。
另一方面，优选地，本发明的药学组合物的给药量为每天0.0001～100mg/kg(体重)。
本发明的药学组合物能够进行口服给药或非口服给药，而在进行非口服给药的情况下，能够通过静脉内注入、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药、等方式给药。优选地，本发明的药剂学组合物而言，根据所适用的疾病的种类确定给药途径。
作为在本发明的组合物中包含的有效成分的增进剂内的相当基因或其的蛋白质的表达抑制剂的浓度考虑治疗目的、患者的状态、必要期间、疾病的严重度等来确定，并不限定于特定范围的浓度。
本发明的药剂学组合物根据本所属领域普通技术人员能够容易实施的方法，利用药学上接受的载体和/或赋形剂进行制剂化，从而以单位容量形态制备或装在大容量容器内进行制备。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳化液形态，或是浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，且还能包含分散剂或稳定剂。
本发明的组合物利用上述的作为感受性增进剂及抗癌剂的间质上皮转化因子抑制剂，来提高细胞死亡，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测方法，上述与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测方法包括：步骤(a)，从对象准备生物学试样；以及步骤(b)，对上述生物学试样内免疫球蛋白超家族成员1的基因的表达水平(NM_001555.2)；或其的蛋白质的表达水平进行测定，在上述步骤(b)中，与对照组相比，免疫球蛋白超家族成员1基因的表达水平或其的蛋白质表达水平为高表达的情况下，判定为具有与对象的间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性。
在本说明书中无特别的提及的情况下，在本发明中所使用的术语“对照组”是指正常的健康的人的相当基因或其的蛋白质表达水平；或作为比较对象的患者的相当基因或其的蛋白质表达水平。
在本发明的预测方法中，包括如下工序来进行，即从对象患者获得生物学试样，从上述试样内测定免疫球蛋白超家族成员1是否表达后，与对照组试样进行比较，来在所记载的基因或蛋白质的表达增加的情况下，判定为针对于间质上皮转化因子抑制剂具有感受性。
并且，根据本发明的优选实例，与对照组相比，上述对象的肝细胞生长因子基因或其的蛋白质表达水平为低表达或非表达。
并且，根据本发明的优选实例，与对照组相比，上述对象的间质上皮转化因子基因或其的蛋白质表达水平为高表达。
更详细地，确认到在肝细胞生长因子基因或其的蛋白质表达水平与对照组相比，低表达或非表达；免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子基因或它们的蛋白质表达水平与对照组的值相比，增加的情况下，判定为从对象患者获得的该肿瘤细胞对于作为抗癌剂的间质上皮转化因子抑制剂具有感受性。
即，在从肝细胞生长因子-非表达或低表达患者中免疫球蛋白超家族成员1基因或其的蛋白质水平高表达的情况下，免疫球蛋白超家族成员1基因诱导间质上皮转化因子的激活，因此判定为呈现与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性。
在本说明书中，提及上述基因的表达水平所使用的术语“低表达”指称在生物标志物呈现非正常过程、疾患或个体内其他病态或其的症候的情况下，生物学试样内的生物标志物的值或水平低于从健康或正常的个体或作为比较对象的个体获得的生物学试样中检测的生物标志物的值或水平范围。
在本说明书中，提及上述基因的表达水平所使用的术语“高表达”指称在生物标志物呈现非正常过程、疾患或个体内其他病态或其的症候的情况下，生物学试样内的生物标志物的值或水平高于从健康或正常的个体或作为比较对象的个体获得的生物学试样中检测的生物标志物的值或水平范围。
并且，提及上述基因的表达水平所使用的术语可指称为与生物标志物的“正常”表达水平或值进行比较，来具有微分(differential)水平”或“微分值”或“得到不同的表达”，在表达中均包含两者即，定量性差异及定性差异。
在本发明中所使用的术语“生物学试样”是指从可检测本发明的生物标志物的表达的个体取得的全部试样。
根据本发明的优选实例，上述生物学试样是选自由唾液(saliva)、活检(biopsy)、血液、皮肤组织、液体培养物、粪便及小便组成的组中的一种，且并不局限于此，可利用在本发明的技术领域中通常所使用的方法进行处理而准备。
在本发明的方法中利用上述的生物标志物，来判定为具有感受性，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进方法，包括将与上述的间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性增进剂以及间质上皮转化因子抑制剂共同给药到对象中的步骤。
在本发明的方法中利用作为上述的感受性增进剂及抗癌剂的间质上皮转化因子抑制剂，来增进感受性，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。
发明的效果
若利用本发明的与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用生物标志物，则可针对于各个患者的上述感受性在治疗开始之前确实地进行判定，从而可实现选择治疗效果高的抗癌剂。并且，可回避未取得效果的抗癌剂的使用，因此可回避不必要的副作用。
附图说明
图1a呈现针对于肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物的鉴定过程。
图1b示出利用肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物鉴定免疫球蛋白超家族成员1的MALDI-TOF分析结果。
图2a示出在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性(independent)间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的表达分析结果。
图2b示出在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的表达分析结果。
图2c示出在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子蛋白质之间的结合分析结果。
图2d示出在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子之间的具体地结合位置。并且，还示出间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1蛋白质之间的结合分析结果。
图2e示出当抑制在人类胃癌细胞株及肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族(IGSF)时，间质上皮转化因子磷酸化变化。
图2f示出在胃癌细胞株中基于免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子表达变化的调节机制分析结果。
图3a示出当抑制在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1表达时，癌细胞的生长抑制结果。
图3b示出当抑制在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1表达时，癌细胞的生长抑制结果。
图4a示出当抑制在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1表达时，癌细胞的转移性及移动性抑制分析结果。
图4b示出当抑制在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1表达时，癌细胞的转移性抑制及分析结果。
图5a示出在胃癌细胞株中基于免疫球蛋白超家族成员1是否表达的间质上皮转化因子抑制剂的功效比较分析结果。
图5b示出在肺癌细胞株中基于免疫球蛋白超家族成员1是否表达的间质上皮转化因子抑制剂的功效比较分析结果。
图6a示出利用微小核糖核酸的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的一同抑制确认效果。
图6b示出基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的、miR34a及miR34c的免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的表达变化结果。
图6c示出基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的、miR34a及miR34c的细胞生长分析结果。
图6d示出基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的、miR34a及miR34c的细胞转移性及移动性抑制分析结果。
图6e示出针对于基于mir-34a和mir-34c的免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的抑制利用拮抗剂(antagomir)诱导恢复(recovery)的结果。
图7示出确认在胃癌患者组织中，肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导因子免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子激活表达呈现的比率的结果。并且示出作为大靶的患者样品结果。
具体实施方式
以下，实施例仅仅是为了对本发进行更加具体的说明的，而根据本发明的主旨本发明的范围不会因这些实施例而受到限制是对本发明所属领域的普通技术人员显而易见的。
实验方法及条件
肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导
在肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌细胞株AGS细胞株中使间质上皮转化因子野生型结构物(质粒(plasmid))转染(transfection)48小时后，收取细胞培养液,来执行了肝细胞生长因子联免疫吸附测定法(elisa assay)(R&D Systems,Inc,Minneapolis,MN,USA)。收取细胞溶解物来通过蛋白质印迹法验证了间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1蛋白质的变化。
免疫沉降法及MALDI-TOFF
为了鉴定与作为肝细胞生长因子-非依赖性的间质上皮转化因子激活相关的基因，在人类胃癌AGS细胞株中使间质上皮转化因子野生型质粒过表达48小时后，收取细胞溶解物。500μg的人类胃癌细胞株溶解液与1μg的抗-磷酸化间质上皮转化因子(pMET)抗体混合后，在4℃温度下培养12小时，然后添加20μl的蛋白质-琼脂糖株(Protein-Sepharosebead)(美国加利福尼亚州圣克鲁兹市圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotehcnology,Santa Cruz,CA,USA))，然后进行2小时的追加反应。利用缓冲液(NondietP-40细胞溶解缓冲液(lysis buffer))将免疫沉降物清洗5次后，添加20μl的2×十二烷基磺酸钠(SDS)样品溶液且进行加热，然后执行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，然后使用银染试剂盒(Silver staining kit)(美国新泽西州GE医疗生物科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences Corp,NJ,USA))进行了染色。为了鉴定与肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子激活相关的蛋白质，通过质量分析法(Mass Spectrometry)坚定了通过银染色法(Silver staining)确认的蛋白质。
蛋白质印迹法
为了执行蛋白质印迹法，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离从各个细胞分离的蛋白质后，将其移到膜(PolyScreen膜(membranes)(美国马萨诸塞州波斯顿市New England Nuclear公司(New England Nuclear、Boston、MA、USA))，然后利用多种抗体(抗-磷酸间质上皮转化因子(anti-phospho MET)、E-钙粘素(E-cadherin)、(美国马萨诸塞州比佛利Cell signaling Technology公司(Cell signaling Technology、Beverly、MA、USA))、抗间质上皮转化因子(anti-MET)、抗-r-微管蛋白(anti-r-tubulin)(美国加利福尼亚州圣克鲁兹市圣克鲁斯生物技术公司)、抗-免疫球蛋白超家族成员1(中国台湾Jhouzih亚诺法公司(Abnova,Jhouzih,Taiwan,China))，来在4℃温度下，反应12小时后，利用1×TBS-T缓冲液10分钟清洗了3次。在常温条件下，使适当的抗兔-辣根过氧化物酶(rabbit-HRP)或抗小鼠-辣根过氧化物酶第二(mouse-HRP secondary)抗体反应2小时后，利用1×TBS-T缓冲液10分钟清洗了3次，然后利用ECL溶液(ECL solution)(GE医疗生物科学公司)，来验证了蛋白质的表达。
细胞浸润测定法(invasion chamber assay)及细胞移动测定法(migrationassay)
在肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌细胞株MKN45、SNU638及肺癌HCC827细胞株中，使免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸或间质上皮转化因子小干扰核糖核酸转染48小时。在24孔板(well plate)中放入8mm孔径(pore size)的插入板(insert plate)(BD生物科学公司(BD Biosciences))、以200μg/ml的插入板基质胶(insert plate matrigel)(BD生物科学公司)的浓度以每次100μl的方式接种后，在CO2恒温箱(incubator)中进行了30分钟的反应。针对于胞转染间质上皮转化因子或免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸的2.5×104细，在无血清培养基(serum free media)中将总体积(total volume)对准为100μl，来放入插入板。在底板(Bottom plate)接种400μl的长培养基(growth media)(RPMI1640+10％胎牛血清(FBS))后，在CO2恒温箱中进行了24小时的培养。24小时后，利用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗(washing)插入板，然后用棉棒擦留在插入板上面的细胞，然后利用10％的甲醛(formalin)固定了20分钟。利用二次水清洗后，利用0.01％的结晶紫(crystal violet)溶液染色20分钟，然后利用温水(warm water)清洗，然后干燥后测定了移动的细胞数。在迁移分析(Migration assay)的情况下，不涂敷(coating)插入板，且与上述相同的方法进行。在空白对照(Control)和转染间质上皮转化因子或免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸的胃癌及肺癌细胞株中，通过测定通过插入板进行移动的细胞数来进行了验证。
基因表达抑制方法
小干扰核糖核酸及短发夹核糖核酸的制备方法
在肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌细胞株MKN45、SNU638及肺癌HCC827细胞株中使免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸(序列3免疫球蛋白超家族成员1#1；5’-GCAGGUCUUUACCGGUGCU-3’、序列4免疫球蛋白超家族成员1#2；5’-GGUGCUGCUACUGGAAGGA-3’)、间质上皮转化因子小干扰核糖核酸(序列5；5’-AAAGATAAACCTCTCATAATG-3’)、免疫球蛋白超家族成员1短发夹核糖核酸(序列6；5’-CAAAGAUGGAAGUGAAAUAUCUCUAUUUCACUUCCAUCUUUGUU-3’)和/或间质上皮转化因子短发夹核糖核酸(序列7；5’-GCCAGCCUGAAUGAUGACAUCUCUGUCAUCAUUCAGGCUGGCUU-3’)转染(transfection)48小时后，收取细胞溶解物，来通过蛋白质印迹法验证了间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1蛋白质的变化。
微小核糖核酸(micro RNA)的制备方法
从赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司购买人类微小核糖核酸34a(序列1；UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU)或微小核糖核酸34c(序列2；AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC)而使用。接种4×105细胞(cells)的肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌SNU638细胞后，使300nM的微小核糖核酸34a或微小核糖核酸34c转染后，通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusionmethod)，将细胞数测定了0天、1天、2天及3天。
细胞生长确认
接种(seeding)4×105的肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌SNU638细胞或3×105的MKN45细胞后，使300nM的微小核糖核酸34a(序列1)或微小核糖核酸34c(序列2)转染，然后通过台盼蓝排除法，将细胞数测定了0天、1天、2天及3天。
antagomir制备方法
从赛默飞世尔科技公司购买人类微小核糖核酸34a和微小核糖核酸34c的antagomir而使用。接种4×105的肝细胞生长因子-非依赖性人类胃癌SNU638细胞或3×105的MKN45细胞后，使300nM的微小核糖核酸34a或微小核糖核酸34c转染，然后通过台盼蓝排除法，将细胞数测定了0天、1天、2天及3天。
实施例1.利用肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物的免疫球蛋白超家族成员1的鉴定
本发明人为了鉴定肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物，在肝细胞生长因子-作为阴性的人类胃癌细胞株AGS中，使间质上皮转化因子野生型脱氧核糖核酸过表达，从而诱导了肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化(图1a，左侧图表)。在上述中，在上述中，磷酸化间质上皮转化因子(p-MET)抗体进行免疫沉降法(immunoprecipitation)后，为了测定与间质上皮转化因子相结合的蛋白质进行了银染色法(silver staining)(图1a，右侧凝胶图像)
并且，通过在上述结果物中进行MALDI-TOF分析，来确认了与间质上皮转化因子结合的蛋白质。
其结果，如图1b所示，利用肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物坚定了免疫球蛋白超家族成员1。
实施例2.肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的关联性确认
2-1.在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的表达分析
本发明人为了在人类胃癌细胞株中鉴定肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的关联性，在总8种的胃癌细胞株中，利用免疫球蛋白超家族成员1、磷酸化间质上皮转化因子(pMET)(磷酸化的活性型间质上皮转化因子)抗体，来进行了蛋白质印迹法。
其结果，如图2a(左侧)所示，在作为人类胃癌细胞株的SNU638、MKN45中，间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1得到共同表达的情况下，观察到间质上皮转化因子被磷酸化。
并且，确认上述SNU638、MKN45的肝细胞生长因子表达，其结果，如图2a(右侧)所示，与作为阳性对照组的U87MG细胞株相比，未检测到肝细胞生长因子。
因此，可知如下：仅在肝细胞生长因子-阴性(非依赖性)，且间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1共同表达的情况下，诱导间质上皮转化因子磷酸化。
2-2.在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的表达分析
本发明人为了分析在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子磷酸化之间的表达，在总9种的肺癌细胞株中，利用免疫球蛋白超家族成员1、磷酸化间质上皮转化因子(pMET)(磷酸化的活性型间质上皮转化因子)抗体，来进行了蛋白质印迹法。
其结果，如图2b(左侧)所示，在作为人类肺癌细胞株的H1944、H2228及HCC827中，间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1得到共同表达的情况下，观察到间质上皮转化因子被磷酸化。
并且，确认上述H1944、H2228及HCC827的肝细胞生长因子表达，其结果，如图2b(右侧)所示，与作为阳性对照组的U87MG细胞株相比，未检测到肝细胞生长因子。
因此，可知如下：仅在肝细胞生长因子-阴性(非依赖性)，且间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1共同表达的情况下，诱导间质上皮转化因子磷酸化。
2-3.在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子蛋白质之间的结合确认
本发明人为了分析在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1与间质上皮转化因子蛋白质之间的表达，在人类胃癌细胞株AGS中使间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1过表达，利用磷酸化间质上皮转化因子抗体进行免疫沉降法后，通过蛋白质印迹法确认了与免疫球蛋白超家族成员1的结合。
其结果，如图2c(左侧)所示，确认了在肝细胞生长因子-作为阴性的人类胃癌细胞株AGS中，使间质上皮转化因子过表达情况下，间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1相结合。
并且，如图2c(右侧)所示，对使间质上皮转化因子过表达的肝细胞生长因子-阴性人类胃癌细胞株AGS的细胞质(cytosol)及细胞膜(membrane)进行分馏来确认的情况下，确认了在细胞膜中间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1相结合。
为了得知两个蛋白质在哪个位置相结合，制备了使免疫球蛋白超家族成员1蛋白质按域(domain)缺失(deletion)的构建体(constructs)。制备了缺失胞外域(Extracellular domain)的构建体和缺失螺旋形(Helical)或胞浆区(cytoplasmicdomain)的构建体。将间质上皮转化因子野生型(WT)和免疫球蛋白超家族成员1缺失构建体(deletion constructs)转染于293T细胞后，通过免疫沉降法确认了在哪个位置相结合。
其结果，如图2d所示，在571-1328缺失(extracellular domain)的位点确认不进行整合(binding)，来可确认两种蛋白质在此位点上相结合而起到作用。并且，还可确认野生型间质上皮转化因子(WT MET)和免疫球蛋白超家族成员1相结合。
2-4.当抑制在人类胃癌细胞株及肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族的表达时间质上皮转化因子磷酸化变化
本发明人为了分析当抑制在人类胃癌细胞株(AGS、MKN45及SNU638)及肺癌细胞株(HCC827)中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族的表达时，在人类胃癌及肺癌细胞株中，针对于免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子通过小干扰核糖核酸方法抑制表达后，通过蛋白质印迹法确认了间质上皮转化因子蛋白质的磷酸化的变化。
其结果，如图2e所示，在人类胃癌(AGS、MKN45及SNU638)及肺癌(HCC827)细胞株中以依赖免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸浓度的方式间质上皮转化因子的磷酸化减少。并且，以依赖间质上皮转化因子短发夹核糖核酸浓度的方式免疫球蛋白超家族成员1的表达减少。
2-5.在胃癌细胞株中，基于免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子表达变化的调节机制分析
本发明人利用短发夹核糖核酸在作为人类胃癌细胞株的SNU638和MKN45中抑制免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子后，利用实时聚合酶链反应(real-time PCR)确认了各个基因的表达的表达变化。
其结果，如图2f的上端面所示，在两个细胞株中抑制间质上皮转化因子的情况下，免疫球蛋白超家族成员1的表达减少，在抑制免疫球蛋白超家族成员1的情况下，相反地，间质上皮转化因子的表达减少。通过上述结果可确认在核糖核酸水平中得到调节。
并且，如图2f的下端面所示，确认在胃癌细胞株中，免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的表达调节不在蛋白质水平上得到调节。是处理间质上皮转化因子抑制剂后，针对于免疫球蛋白超家族成员1的表达怎么得到调节，处理各个抑制剂(inhibitor)后，通过蛋白质印迹法分析方法确认的结果。
(PHA665752：c-MET抑制剂、MG132：蛋白酶体(proteasome)抑制剂、亮抑酶肽(Leupeptin)&NH4Cl：溶酶体蛋白质分解酶活性(lysosomal protease)抑制剂)
实施例3.当抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1时，细胞生长抑制能力
3-1.当在人类胃癌细胞株中抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1的表达时，细胞生长抑制能力分析
本发明人通过短发夹核糖核酸技法抑制在SNU638和MKN45中，免疫球蛋白超家族成员1的表达或间质上皮转化因子的表达后，分析了细胞生长抑制能力。
其结果，如图3a的上端面所示，可确认当对细胞数测定3天时，当抑制间质上皮转化因子或免疫球蛋白超家族成员1时，细胞的生长得到抑制。
并且，在人类胃癌细胞株SNU638和MKN45中抑制免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子的表达后，通过集落形成测定法(colony forming assay)确认了细胞生长抑制程度。
其结果，如图3a的下端面所示，可确认在抑制免疫球蛋白超家族成员1或间质上皮转化因子的情况下，菌落数减少。
3-2.当在人类肺癌细胞株中抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1的表达时，细胞生长抑制能力分析
本发明人通过短发夹核糖核酸技法抑制在人类肺癌细胞株HCC827和HCC1944中，免疫球蛋白超家族成员1的表达或间质上皮转化因子的表达后，分析了细胞生长抑制能力。
如图3b所示，在24小时、48小时测定细胞数，其结果，可确认在抑制间质上皮转化因子或免疫球蛋白超家族成员1的组中，细胞生长得到抑制。
实施例4.确认当抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1时，癌细胞的转移性及移动性抑制
4-1.当抑制在人类胃癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1表达时，癌细胞的转移性及移动性抑制分析
本发明人通过短发夹核糖核酸技法抑制在人类胃癌细胞株SNU638和MKN45中免疫球蛋白超家族成员1的表达后，通过细胞浸润测定法(invasion chamber assay)和伤口愈合实验法(wound healing assay)分析了转移性和移动性的抑制程度。
其结果，如图4a所示，观察到如下：抑制免疫球蛋白超家族成员1的表达的细胞和抑制间质上皮转化因子的表达的细胞相同地抑制转移性和移动性。
4-2.当抑制在人类肺癌细胞株中的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1的表达时，癌细胞的转移性及移动性抑制分析
本发明人通过短发夹核糖核酸技法抑制在人类肺癌细胞株HCC827和H1944中免疫球蛋白超家族成员1的表达后，通过细胞浸润测定法(invasion chamber assay)和细胞移动测定法(migration assay)分析了癌细胞的转移性及移动性抑制程度。
其结果，观察到如下：如图4b所示，在HCC827和H1944中，免疫球蛋白超家族成员1的抑制与对照组(sc)相比，转移能力减少80％以下。在抑制间质上皮转化因子的情况下，还呈现相似的形态。
实施例5.当在胃癌及肺癌细胞株中适用间质上皮转化因子抑制剂时，免疫球蛋白超家族成员1的影响分析
5-1.在胃癌细胞株中基于免疫球蛋白超家族成员1是否表达的间质上皮转化因子抑制剂的功效比较分析
本发明人确认了当在作为胃癌细胞株的SNU638和MKN45中，抑制免疫球蛋白超家族成员1时，与间质上皮转化因子抑制剂相关的反应性增加。如图5a所示，当按浓度处理作为、间质上皮转化因子抑制剂的PHA665752时，通过台盼蓝拒染法(trypan blueexclusion)确认诱导细胞凋亡，此时，证明了使活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase3)的表达增减。
5-2.在肺癌细胞株中基于免疫球蛋白超家族成员1是否表达的间质上皮转化因子抑制剂的功效比较分析
本发明人确认了如下：在作为肺癌细胞株的HCC827中抑制免疫球蛋白超家族成员1的表达，其结果细胞凋亡增加，且与间质上皮转化因子抑制剂有关的反应性也增加。
实施例6.利用微小核糖核酸的肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及c-间质上皮转化因子的一同抑制
6-1.基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及c-间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子抑制能力分析
本发明人为了分析基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的抑制程度，在人类293细胞株中利用使各个野生型免疫球蛋白超家族成员1、野生型间质上皮转化因子、它们的3’UTR部位突变(mutation)的荧光素酶(luciferase)质粒，来与miR34a或miR34c一同进行转染(transfection)。
其结果，如图6a所示，miR34a及miR34c在野生型间质上皮转化因子中呈现低的荧光素酶活性。即，基于MiR34a及miR34c的免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的荧光素酶活性仅在野生型中得到抑制。确认了miR34a及miR34c与间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1基因的3’UTR部位相结合，来一同抑制两种基因。
6-2.基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及c-间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的免疫球蛋白超家族成员1和c-间质上皮转化因子的表达变化
本发明人为了分析基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的表达变化程度，在人类胃癌细胞株MKN45及SNU638中转染miR34a或miR34c后，利用实时聚合酶链反应确认了MET表达和免疫球蛋白超家族成员1的表达。
其结果，观察到如下：如图6b所示，在SNU638细胞株中，通过MiR34a或miR34c肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子的表达减少。
并且，如图6b的下端面所示，在人类胃癌MKN45及SNU638细胞株中转染miR34a或miR34c，来对间质上皮转化因子表达和免疫球蛋白超家族成员1的表达进行分析，其结果，观察到如下：通过MiR34a或miR34c肝细胞生长因子-非依赖性c-间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1和c-间质上皮转化因子的表达减少。
6-3.基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及c-间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的细胞生长分析
本发明人为了分析基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的细胞生长，在人类胃癌细胞株SNU638中转染miR34a或miR34c后，确认了癌细胞的生长。
其结果，如图6c的上端面所示，癌细胞的生长通过MiR34a或miR34c，来与对照组相比，显著地得到抑制。
并且，如图6c的下端面所示，确认了如下：当在人类胃癌细胞株中转染miR34a或miR34c时，相关信号机制的表达减少。
6-4.基于一同抑制肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化诱导标志物免疫球蛋白超家族成员1及c-间质上皮转化因子的miR34a及miR34c的细胞转移性及移动性抑制分析
如图6d的上端面所示，本发明人确认了如下：当在作为胃癌细胞株的SNU638和MKN45中转染mir-34a或mir-34c时，细胞移动性得到抑制。
并且，如图6d的中间面所示，可确认当在胃癌细胞株中转染mir-34a或mir-34c时，细胞的转移性被抑制约50％左右的结果。
并且，如图6d的下端面所示，可确认当在作为胃癌细胞株的SNU638中转染mir-34a或mir-34c时，抑制细胞的移动性，此时，MMP9的表达减少。
6-5.针对基于mir-34a及mir-34c的免疫球蛋白超家族成员1及间质上皮转化因子的抑制利用antagomir诱导恢复(recovery)
如图6e的上端面所示，本发明人在核糖核酸水平(左侧)和蛋白质水平(右侧)中确认了如下：当在作为胃癌细胞株的SNU638中转染mir-34a或mir-34c时，恢复由mir-34a或mir-34c抑制的间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1的表达。
并且，如图6e的下端面所示，可确认如下：在作为肺癌细胞株的HCC827和H1944中中转染mir-34a、mir-34c后，磷酸化间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1的表达减少。并重新恢复恢复由mir-34a和mir-34c减少的间质上皮转化因子和免疫球蛋白超家族成员1的表达。
另一方面，如图6f的上端面所示，针对于在作为胃癌细胞株的SNU638和MKN45中由抗-mir34a(anti-mir34a)或抗-mir34c(anti-mir34c)重新会洗细胞的生长的结果与mir34a、mir34c的结果进行比较。
并且，如图6f的下端面所示，确认当在肺癌细胞株中进行与上述相同的实验时，恢复细胞生长。
另一方面，如6g的上端面所示，确认在肺癌细胞株中由抗-mir34a或抗-mir34c恢复细胞的移动性。
并且，如图6g的中间面所示，确认在胃癌细胞株中由抗-mir34a或抗-mir34c恢复细胞的转移性。
并且，如图6g的中间面所示，确认在肺癌细胞株(HCC827)中由抗-mir34a或抗-mir34c恢复细胞的转移性和移动性。
因此，用于诱导肝细胞生长因子-非依赖性间质上皮转化因子磷酸化的诱导免疫球蛋白超家族成员1和间质上皮转化因子呈现作为与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用生物标志物的可能性。
实施例7.确认胃癌患者组织中的间质上皮转化因子活性、免疫球蛋白超家族成员1及肝细胞生长因子的表达水平
本发明人为了确认在实际胃癌患者组织中的间质上皮转化因子活性、免疫球蛋白超家族成员1及肝细胞生长因子的表达水平，从美国生物公司(US Biomax)购买组织微阵列载玻片(TMA slide)后，进行了免疫化学染色法。
其结果，如图7的上端面所示，在胃癌患者组织微阵列(TMA，tissue microarray)组织中呈现间质上皮转化因子活性，并表达免疫球蛋白超家族成员1，未表达肝细胞生长因子的比率占约30％。
<110> 财团法人峨山社会福祉财团
<120> 与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途
<130> Asan1.91p-1
<150> KR 10-2014-0096636
<151> 2014-07-29
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA34a
<400> 1
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA34c
<400> 2
aggcagugua guuagcugau ugc 23
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IGSF1 siRNA
<400> 3
gcaggucuuu accggugcu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IGSF1 siRNA
<400> 4
ggugcugcua cuggaagga 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET siRNA
<400> 5
aaagataaac ctctcataat g 21
<210> 6
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IGSF1 shRNA
<400> 6
caaagaugga agugaaauau cucuauuuca cuuccaucuu uguu 44
<210> 7
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET shRNA
<400> 7
gccagccuga augaugacau cucugucauc auucaggcug gcuu 44

Claims (6)

1.一种用于抑制免疫球蛋白超家族成员1基因的表达或者抑制上述基因的蛋白质的表达的抑制剂在制造感受性增进剂中的用途，其特征在于，所述感受性增进剂用于增强具有肺癌或胃癌的受试者对间质上皮转化因子抑制剂的感受性，并包含所述用于抑制免疫球蛋白超家族成员1基因的表达或者抑制上述基因的蛋白质的表达的抑制剂作为有效成分，其中所述间质上皮转化因子以肝细胞生长因子-非依赖性得到激活。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述感受性增进剂还包含：用于抑制间质上皮转化因子基因的表达或者抑制上述基因的蛋白质的表达的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，上述抑制剂为选自由小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸、微小核糖核酸、核酶、脱氧核酶、肽核酸、反义寡核苷酸、抗体及天然提取物组成的组中的一种以上。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，上述微小核糖核酸为包含序列1的碱基序列的MiR34a或者包含序列2的碱基序列的miR34c。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，上述小干扰核糖核酸为包含序列3的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸、包含序列4的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1小干扰核糖核酸或包含序列5的碱基序列的间质上皮转化因子小干扰核糖核酸；上述短发夹核糖核酸为包含序列6的碱基序列的免疫球蛋白超家族成员1短发夹核糖核酸或包含序列7的碱基序列的间质上皮转化因子短发夹核糖核酸。
6.一种药学组合物在药物制造中的用途，所述药学组合物包含如权利要求1-5中任一项中所述的感受性增进剂和间质上皮转化因子抑制剂作为有效成分，所述药物用于治疗肺癌或胃癌，其中上述癌是以肝细胞生长因子-非依赖性MET激活的癌症。
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