KR20140071695A

KR20140071695A - 암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 암 진단 방법

Info

Publication number: KR20140071695A
Application number: KR1020120139566A
Authority: KR
Inventors: 송시영; 정다운
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-06-12
Also published as: KR101588018B1

Abstract

본 발명은 (a) 엠비진(embigin)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 (b) 엠비진 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트 및 이를 이용한 췌장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 바이오마커인 엠비진의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 정상 조직보다 암 조직에서 특이적으로 증가한다. 따라서, 본 발명의 마커인 엠비진을 이용하면 정상조직과 암을 확실하게 구별하여 암을 진단할 수 있다.

Description

암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 암 진단 방법{Biomarker Indicative of Cancer and Diagnosis Method Using the Same}

본 발명은 암에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

췌장암은 최근 대장암, 유방암, 갑상선암과 함께 우리나라에서 발생빈도가 급격히 증가하는 암의 하나이며, 발생빈도에서는 9위, 암으로 인한 사망원인으로는 5위를 차지하는 암이다. 이러한 췌장암은 인체에서 가장 치명적인 암으로써 5년 생존율이 5% 이하이며, 평균생존기간이 5개월에 불과하다. 또한 진단 당시 이미 80-90%의 환자는 수술적인 절제가 불가능한 상태에서 발견되므로, 전적으로 항암약물과 방사선치료에 의존하고 있다. 하지만, 항암약물 또는 방사선 치료에도 불구하고 치료에 대한 반응성이 매우 적으며, 대부분의 환자들은 치료 후 2-4개월 내에 항암제 내성을 보이고 있으며, 간 전이와 같은 전이성 질환으로 사망하는 경우가 대부분이하다. 그러므로, 췌장암을 보다 조기에 진단하고 암의 성장과 전이를 조절하는 인자를 찾는다면, 새로운 진단표지자 또는 항암제로써 이용가치가 매우 크다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암을 신속하고 정확하게 분자 진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 엠비진(embigin)이 암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 암 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 엠비진(embigin)을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 엠비진 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 엠비진 단백질 또는 엠비진의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 암 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 암을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상술한 분자 마커가 암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

본 발명의 분자 마커는 암의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 암의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 암은 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비 종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이고, 보다 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 보다 더 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암 또는 대장암이며, 가장 바람직하게는 췌장암이다.

본 발명의 실시예에 따르면, 엠비진이 정상 췌장 조직보다 췌장암 조직에서 특이적으로 고발현되는 것을 알 수 있다(참조: 도 1). 본 발명의 마커인 엠비진을 이용하면 정상 췌장과 췌장암을 확실하게 구별하여 췌장암을 진단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 정상 췌장 시료와 췌장암 시료 중에서 췌장암 시료만을 선택적으로 진단 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 엠비진을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 엠비진 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 췌장암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 췌장암을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 엠비진 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 췌장암을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 췌장암으로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 엠비진 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 췌장암 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 췌장암 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 췌장(pancreas) 조직세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 췌장암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 췌장암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 췌장 조직세포)보다 강하게 나오는 경우에는 췌장암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 췌장암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 췌장 조직, 혈액 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오는 경우에는 췌장암으로 진단된다.

따라서 본 발명의 췌장암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 췌장암에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포와 비교하여 1.5-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 췌장암으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 상기 엠비진 단백질의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 상기 엠비진 단백질의 발현을 억제시키면 암 치료제로 판단된다.

본 발명의 암 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 암은 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비 종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이고, 보다 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 보다 더 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암 또는 대장암이며, 가장 바람직하게는 췌장암이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 엡비긴-인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 단백질 또는 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 엠비진 단백질의 발현을 억제시키는 경우, 암 치료제로 판정될 수 있다.

상술한 뉴클레오타이드 서열의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 상술한 프라이머 세트는 이용되는 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열이다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 뉴클레오타이드 서열의 발현량 변화를 측정한다.

또한, 엠비진 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 엠비진의 양의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 엠비진의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엠비진(embigin)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 엠비진 발현억제제 또는 활성 억제제는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체 또는 앱타머이며, 보다 바람직하게는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 항체이고, 보다 더 바람직하게는 siRNA, shRNA, miRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 siRNA이다.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(p21 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(p21 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 뮤신 유전자(바람직하게는, MUC5AC)의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 뮤신 유전자(바람직하게는, MUC5AC)에 상보적이고 뮤신 유전자 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, p21 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

본 명세서의 용어 “miRNA(microRNA)”는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로써, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ 타입 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 암 세포 또는 암 조직으로부터 분비된 마이크로파티클의 약제학적 유효량 ; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 마이크로파티클은 혈관신생을 유도하며, 허혈성 질환에 적용되어 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로파티클은 암 세포 또는 암 조직으로부터 분비되며, 보다 바람직하게는 저산소 조건하에서 암 세포 또는 암 조직으로부터 분비된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로파티클은 암 세포 또는 암 조직으로부터 분비되며, 상기 암은 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이고, 보다 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 보다 더 바람직하게는 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 간암, 위암 또는 대장암이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “약제학적 유효량”은 혈관신생을 적절히 유도하여 상기 허혈성 질환 치료의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 암에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다

(ⅱ) 본 발명의 바이오마커인 엠비진의 mRNA 또는 단백질의 발현량은 정상 조직보다 암 조직에서 특이적으로 증가한다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 마커인 엠비진을 이용하면 정상조직과 암조직을 확실하게 구별하여 암의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

도 1은 정상 조직(NL) 대비 암조직(CA)에서의 엠비진 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 2는 암 조직(a, b)과 정상 조직(c)에서의 엠비진 발현 변화를 조직면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 3은 엠비진 siRNA 처리 후 세포내의 신호 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 4는 엠비진 siRNA 처리 후 세포의 형태학적 변화를 촬영한 사진이다.
도 5는 엠비진 siRNA 처리 후 세포 증식을 WST-8을 이용하여 측정한 결과이다.
도 6은 엠비진 siRNA 처리에 따른 세포 이동 및 침입 능력 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 엠비진 siRNA 처리에 따른 상처회복능력 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 젤라틴을 이용하여 자아모그라피를 수행하여 MMR-2/9의 발현 및 활성을 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

대장암 조직에서 엠비진 ( embigin ) 발현 변화

췌장암 수술 조직에서 암조직 및 상대적으로 암조직에서 먼 거리에 있는 정상 조직 부분을 절제하여 정상 조직 대비 암에서의 유전적 발현 변화를 살펴보았다. 이를 위해 조직을 떼어낸 후 RNAlater RNA 안정화 시약(Qiagen, 미국)에 담근 후 RNeasy 프로텍트 미니 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 총 RNA를 수득하였다. 총 RNA에서 mRNA를 역전사 하기 위해 SuperscriptII(Invitrogen, 미국), RNaseOut(Invitrogen, 미국), 올리고dT 프라이머(Invitrogen, 미국), dNTP(Invitrogen, 미국)를 이용하였다. 총 RNA에서 수득한 mRNA는 엠비진의 프라이머(정방향-5’-TACAAGTCCACCTCTCAGAGAAG-3’, 역방향-5’-CCCAGATGTTGTGAACTGGCATG-3’) 및 베타-액틴의 프라이머, Ex-Taq 폴리머라아제를 이용하여 PCR을 수행하였다.

한편, 발현의 위치를 확인하기 위해 환자의 조직으로 만들어진 파라핀 블록에서 발현을 확인하였다. 자일렌을 이용하여 파라핀 조직으로부터 파라핀을 제거하고 농도별 에탄올을 이용해 탈수화 과정을 수행하였다. 그 다음, 시트르산을 이용하여 항원부활(antigen retrival) 단계를 거친 후 당나귀 혈청(Hyclone)을 처리하여 블로킹 시키고 항체를 처리한 다음, HRP가 붙어있는 Dako RealEnvision(Dako)을 처리 후 기질-크로모겐(Dako)을 처리하여 발색을 유도하였다.

유전자의 발현 변화를 통한 유전자적 영향 분석

췌장암 세포주 BxPC-3(ATCC, 미국)에 엠비진 siRNA(#1 타겟 서열 5’-GCCGUGCACUAUUCCAAUU-3’ #2 타겟 서열 5’-GCAAACAAAUGGGAAGUUA-3’)과 스크램블 siRNA(5’- CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’)을 각각 리포펙타민 RNAi MAX(Invitrogen, 미국)과 혼합한 후 20 nM농도로 세포에 처리하였다. 72시간 간격으로 siRNA를 3회 형질주입 시킨 후, 유전자의 발현양을 실시간 PCR을 통해 확인하고 단백질의 발현양을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

실시간 PCR은 Applied Biosystems사의 기계를 이용하였고 X2 SyberGreen (Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 발현을 확인하였다. 실험 결과는 베타-액틴의 발현량으로 표준화하였다. 웨스턴 블롯은 siRNA를 처리한 세포주를 세포 스크레퍼를 통해 긁어낸 후 단백질 용해 버퍼와 혼합하여 용해를 유도하고 단백질의 농도를 측정한 후, 10% SDS-PAGE에 전기영동하고 니트로셀룰로오스 페이퍼(Milipore, 미국)에 블롯팅을 하고 5% 스킴 밀크로 블로킹한 후 항-엠비진(Abcam, 미국) 항체, 항-GAPDH(SantaCruz, 미국) 항체를 처리하였다. 2차 항체는 각각 항-토끼(SantaCruz, 미국), 항-마우스(SantaCruz, 미국) 항체를 이용하였다. 항체는 HRP를 이용하여 발색하였다. siRNA를 이용하여 발현을 저하시킨 BxPC-3 세포주에서 발현 변화를 살펴보기 위해 다양한 항체(phosphor-GSKß (Cell Signaling, 미국), PI3K-110α(SantaCruz, 미국), snail/slug(Abcam, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

유전자의 발현 변화를 통한 세포의 모양 변화 관찰

세포에 siRNA를 처리 후 세포의 모양에 변화가 있는지 현미경(IX50, Olympus)을 이용하여 관찰하였다.

유전자의 발현 변화에 따른 세포의 생장속도 변화

세포에 siRNA를 처리한 후 다음날 세포 배양액에 WST-8(EZ-Cytox, 대일랩서비스)을 용량에 맞게 넣고 2시간 동안 37℃에서 배양한 후, ELISA 리더를 이용해 흡광도(450 nm)를 측정하였다. 세포의 배양액 색의 변화와 존재하는 세포의 수가 비례한 것을 감안하여 세포의 생장 속도를 측정하였다.

유전자의 발현 변화에 따른 세포의 이동( migration )/침입( invasion ) 능력 측정

세포의 이동능력(migration)을 알아보기 위해 Transwell(Costar, 미국)에 각각 siRNA를 처리한 세포 2x10⁴를 1% FBS를 포함하는 배지에 부유시킨 후 분주하였다. 세포를 끌어당기는 유인물질로 20% FBS 세포 배양액을 바닥에 깔았다. 세포는 37℃ 세포 배양기에서 12시간동안 배양한 후 세포를 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

세포의 메트리젤 통과 능력을 알아보기 위해 메트리젤(Invitrogen, 미국)을 1:5농도로 무혈청 배지에 희석한 트랜스웰에 코팅을 한 후 각각 siRNA를 처리한 세포 2x10⁴를 1% FBS를 포함하는 배지에 부유시킨 후 분주하였다. 세포를 끌어당기는 유인물질로 20% FBS 세포 배양액을 바닥에 깔았다. 세포는 37℃ 세포 배양기에서 12시간동안 배양한 후 세포를 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

유전자의 발현 변화에 따르는 세포의 상처회복능력 측정

팁을 이용하여 세포가 붙어있는 배양접시 바닥을 긁어 siRNA를 처리한 세포에 인위적인 상처를 내고 이 상처가 치유되는 과정을 살펴보았다.

유전자의 발현 변화에 따르는 세포의 MMP -2/9 발현 변화 측정

MMP-2/9의 발현과 기능을 살펴보기 위해 자아모그라피(Zymography)를 수행하였다. siRNA를 처리한 세포를 2일간 무혈청 배지에서 키운 후 배지를 수거하여 동결건조 시키고 동일 양의 단백질을 10% 젤라틴(Sigma, 미국)이 들어있는 SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 다음, 겔을 37℃에서 배양하여 겔에 포함되어있는 젤라틴의 분해정도를 확인하였다.

실험 결과

췌장암 환자의 정상조직과 암조직에서의 엠비진 발현

mRNA의 발현을 통해 환자의 정상조직 대비 췌장암 조직에서 엠비진의 발현이 대체적으로 증가되어있음을 확인하였고 환자의 파라핀 조직을 이용한 면역 블롯팅을 통해 정상 췌장의 췌도에서 발현되는 엠비진이 췌장암 조직에서는 화생성 관(metaplastic duct) 및 암조직에서 발현하는 것을 확인하였다(도 1-2).

엠비진 siRNA 처리 후 세포내의 신호 변화

웨스턴 블롯을 통해 기존에 보고된 바시긴(Basigin)의 발현에 따르는 변화와 유사하게 엠비진의 발현이 억제되면 인산-GSK-3ß, PIdK-110α, Snail/Slug의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 3).

유전자의 발현 변화를 통한 세포의 모양 변화 관찰

현미경 관찰 결과, 엠비진 siRNA를 처리한 세포는 기존의 BxPC-3에 비해 전체적으로 둥그스름하며 뾰족한 세포의 끝부분이 대부분 보이지 않는다(도 4).

유전자의 발현 변화에 따른 세포의 생장속도, 이동/침입 능력 변화

엠비진 siRNA 처리에 따른 엠비진의 발현 억제는 대조군에 비해 세포의 생장을 약 13% 가량 늦추는 것을 관찰하였다(도 5). 엠비진 siRNA를 처리한 세포는 엠비진의 발현 억제에 의해 세포의 이동 및 침입 능력이 저하되었다(도 6).

유전자의 발현 변화에 따르는 세포의 상처회복능력 측정

세포에 상처를 유도하고 21시간 후 세포 상태를 관찰한 결과, 엠비진 siRNA를 처리한 세포에서 상처 회복 능력이 저하된 것을 확인하였다(도 7).

자아모그라피를 통해 엠비진 siRNA를 처리한 세포에서 상대적으로 적은 양의 MMP-2/9이 발현되고 있는 것을 확인하였다(도 8). MMP는 아연-의존적 엔도펩티다아제로서 세포 외 기질에서 물질을 선택적으로 분해시키는 역할을 하며, 정상적인 세포의 리모델링과 종양 혈관신생 및 전이에 관여한다. MMP 가운데 MMP-9, MMP-2은 종양 침입 및 전이에 관련되어 있다. 상기 실험결과에서 확인된 바와 같이, 엠비진의 발현 억제에 의해 세포의 이동/침입 능력 및 상처 회복 능력 저하는 MMP-2/9의 발현 저하에 의한 것이라고 생각된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Embigin <130> PN120606 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4309 <212> RNA <213> Homo sapiens embigin mRNA <220> <221> gene <222> (1)..(4309) <220> <221> CDS <222> (250)..(1230) <400> 1 acatccggga acgccagcag ccggctgagg gctgcataac tgatggaggg ccgggcgcgg 60 taagagcgtc tcgggggagt ggggcaaggc ggccgggccc ctcccattcc gccttttctt 120 cagcgtccta cccgcggcac tggctgcgag cgccgggcca cctgcgagtg tgcgcaggga 180 ctctggacac ccgcggcggc gagctgaggg agcagtctcc acgaggaccc aggcggaccc 240 tctggcgcc atg cgc gcc ctc ccc ggc ctg ctg gag gcc agg gcg cgt acg 291 Met Arg Ala Leu Pro Gly Leu Leu Glu Ala Arg Ala Arg Thr 1 5 10 ccc cgg ctg ctc ctc ctc cag tgc ctt ctc gct gcc gcg cgc cca agc 339 Pro Arg Leu Leu Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Pro Ser 15 20 25 30 tcg gcg gac ggc agt gcc cca gat tcg cct ttt aca agt cca cct ctc 387 Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Asp Ser Pro Phe Thr Ser Pro Pro Leu 35 40 45 aga gaa gaa ata atg gca aat aac ttt tcc 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Gly Lys Asn Lys Pro Leu Ile Ser Tyr Val Gly Asp Ser Thr 165 170 175 Val Leu Thr Cys Lys Cys Gln Asn Cys Phe Pro Leu Asn Trp Thr Trp 180 185 190 Tyr Ser Ser Asn Gly Ser Val Lys Val Pro Val Gly Val Gln Met Asn 195 200 205 Lys Tyr Val Ile Asn Gly Thr Tyr Ala Asn Glu Thr Lys Leu Lys Ile 210 215 220 Thr Gln Leu Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Tyr Trp Cys Arg Ala Leu 225 230 235 240 Phe Gln Leu Gly Glu Ser Glu Glu His Ile Glu Leu Val Val Leu Ser 245 250 255 Tyr Leu Val Pro Leu Lys Pro Phe Leu Val Ile Val Ala Glu Val Ile 260 265 270 Leu Leu Val Ala Thr Ile Leu Leu Cys Glu Lys Tyr Thr Gln Lys Lys 275 280 285 Lys Lys His Ser Asp Glu Gly Lys Glu Phe Glu Gln Ile Glu Gln Leu 290 295 300 Lys Ser Asp Asp Ser Asn Gly Ile Glu Asn Asn Val Pro Arg His Arg 305 310 315 320 Lys Asn Glu Ser Leu Gly Gln 325

Claims

(a) 엠비진(embigin)을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 (b) 엠비진 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 엠비진 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 결합제는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 엠비진 단백질 또는 엠비진의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 암 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 엠비진-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 상기 엠비진 단백질의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 상기 엠비진 단백질의 발현을 억제시키면 암 치료제로 판단된다.
제 12 항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
엠비진(embigin)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.