KR101568400B1 - 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포 특히 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 암의 진단 및 표적뿐만 아니라, 췌장암의 진단 또는 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 췌장암 진단에 활용되고 있는 췌장암 결합 항체를 대체할 수 있으며, 췌장암을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도{Nucleic Acid Aptamers Specifically Binding to Cancer Stem Cells and Their Uses}
본 특허출원은 2012년 08월 09일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0087272 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 80-90% 환자에서 진단 시 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 극히 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다. 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타빈, 타르세바를 포함한 몇몇 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하여 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 새로운 치료법 개발이 필요하다.
항암치료에도 불구하고 생존하여 암의 재발 또는 악화의 원인이 되는 암 줄기세포는 자가 재생, 분화, 증식의 줄기세포 특징을 가지며 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고되었다(1). 따라서, 암의 조기진단 및 근본적인 치료를 하기 위해서는 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 할 것이다.
백혈병을 시작으로 장기별로 암 줄기세포 표적 치료와 진단을 위하여 분자적 특징(molecular characteristics)을 규명하는 연구가 진행 중이며(2) 그 중에서도 췌장암에서는 두 종류의 암 줄기세포 마커군이 발표되었지만(3, 4) 반박논문이 나오는 등(5) 아직 췌장암에서 암줄기세포로 규정할 수 있는 확실한 표지자에 대해서는 좀 더 연구가 필요하다.
암 줄기세포를 규명하려는 끊임없는 노력에도 불구하고 논란이 지속되는 이유는 현재 암 줄기세포를 규명하기 위한 유일한 접근이 수술을 통해 제거된 조직을 이용하여 암 줄기세포 표지자 가능성이 있는 특정 단백질 양성 세포 분획을 SCID-nod 마우스에 이식하여 표지자 양성 및 음성 군 사이에 종양성장속도를 비교하는 연구에 기초하고 있기 때문이다. 따라서, 단순히 암 줄기세포 표지자를 규명하는 데에서 벗어나 줄기세포의 특성을 가지는 암세포를 아우르는 새로운 표적 규명이 절실히 필요하다.
분자적 특징을 제외하고 암 줄기세포를 표적화하는 작업으로 물리적, 구조적 특징을 기반으로 타겟과 결합하는 앱타머가 신개념 표적이 될 수 있다. 앱타머는 단일가닥의 올리고 핵산 또는 펩타이드 분자로서 화학물질, 단백질 그리고 세포까지 다양한 물질에 특이적으로 결합하는 특징적 서열을 의미한다. 앱타머는 흔히 항체와 비교되며 비교적 합성이 용이하고 값이 저렴하며 실온에서 사용 가능한 장점을 지니고 있다. 앞선 장점들과 생체친화적인 점 때문에 암의 진단 및 치료목적으로도 이미 널리 연구되고 있다(6). 그 예로써 유방암 암 줄기세포 마커인 HER2에 특이적인 앱타머(7)가 개발되었으며 암에서 역할이 규명된 단백질을 인식하는 앱타머 등이 있다(8). 이밖에도 앱타머로 진단, 약물전달체, in vivo 이미징으로의 가능성을 타진한 연구도 활발히 진행되고 있다(9-13).
앱타머는 복합 타겟, 즉 살아있는 세포 및 조직에 대해 cell-SELEX 기법을 이용하여 얻을 수 있는데, cell-SELEX 기법은 표면 마커 타겟이 알려져 있지 않을 때조차도, 질환 세포에 대한 앱타머를 개발할 수 있는 장점이 있다. 더욱이, 분리된 상태에서는 그 본래의 특성을 나타내지 않을 수도 있어, 생리적 상태에 있는 타겟 단백질은 선별과정에서 더 기능적인 접근을 가능하게 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다
본 발명자들은 암의 진단을 위해 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머가 암 세포 특히 암 줄기세포에 특이적으로 결합한다는 것을 규명하였고, 이들 앱타머를 포함하는 조성물을 이용하면 암을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포 결합용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단 또는 예후판단 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 제공한다.
본 발명자들은 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머가 암 세포 특히 암 줄기세포에 특이적으로 결합한다는 것을 규명하였고, 이들 앱타머를 포함하는 조성물을 이용하여 암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 “핵산 앱타머”는 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 변형체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만인 뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
SELEX는 무작위 서열(randomized sequences)로 구성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀(pool) 또는 라이브러리를 필요로 한다. 올리고뉴클레오타이드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 풀은 100% 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열이 무작위 서열 부위에 포함된 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 5’ 및/또는 3’말단이 올리고뉴클레오타이드 풀의 모든 분자에서 공유되는 서열로 구성될 수 있는 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열을 포함하는 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레이타이드 풀은 바람직하게는 무작위 서열 부분뿐 만 아니라 효과적인 복제를 위해 필수적인 고정된 서열(fixed sequences)을 포함한다. 초기 풀의 올리고뉴클레오타이드는 고정된 5’및 3’ 말단 서열을 포함하는데 그 내부에 35-50개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된다. 무작위 뉴클레오타이드는 화학적 합성 및 무작위로 절단된 세포 내 핵산으로부터 선택함으로써 생산할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 무작위 서열 부분은 어떠한 길이일 수 있고, 리보뉴클레오타이드 및/또는 디옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 변형 또는 변형되지 않은 자연형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그일 수 있다(U.S. Patent No. 5,958,691; U. S. Patent No. 5,660,985; U.S. Patent No. 5,958,691; U.S. Patent No. 5,698, 687; U.S. Patent No. 5,817, 635; U.S. Patent No. 5,672,695, 및 PCT Publication WO 92/07065). 무작위 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-연결 뉴클레오타이드로부터 합성할 수 있다(Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986), Froehler et al., Tet . Lett . 27:5575-5578(1986)). 또한, 무작위 올리고뉴클레오타이드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 액체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다(Sood et al., Nucl . Acid Res. 4:2557(1977), Hirose et al., Tet . Lett., 28:2449(1978)).
올리고뉴클레오타이드 초기 라이브러리는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예컨대, 초기 라이브러리로서 RNA 라이브러리가 이용될 경우, 상기 RNA 라이브러리는 T7 RNA 중합효소 또는 변형된 T7 RNA 중합효소를 이용하여 DNA 라이브러리를 인 비트로상에서 전사시킴으로써 생산한다. RNA 또는 DNA 라이브러리는 적절한 결합 조건하에서 타겟과 혼합하고, 결합 친화성 및 선별성 기준을 달성하기 위해 일반적인 선별 과정에 따라 결합, 분리 및 증폭 과정을 반복한다.
보다 상세한 SELEX 방법은 다음과 같다:
(a) 핵산 라이브러리를 적절한 결합 조건하에서 타겟과 접촉시킨다; (b) 타겟 분자에 특이적으로 결합한 핵산 및 결합하지 못한 핵산을 분리한다; (c) 핵산-타겟 복합체를 해리시킨다; (d) 핵산-타겟 복합체로부터 분리된 핵산을 증폭시킨다; 및 (e) 타겟 분자에 대해 높은 특이성 및 친화성을 갖는 핵산을 수득하기 위해 상기 결합, 분리 및 증폭 과정을 반복한다.
RNA 앱타머를 선별하는 방법은 상기 SELEX 방법 단계 (d)에서 증폭하기 전에 핵산-타겟 복합체로부터 분리된 핵산을 역전사시키는 단계 및 재시작에 앞서 단계(d)에서 증폭된 핵산을 전사시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 핵산 앱타머는 화학적으로 변형된 형태를 포함할 수 있다. 일반적으로, 화학적 변형을 가지고 있지 않은 야생형 RNA 나 DNA 분자들은 핵산 분해효소에 의한 분해(degradation)에 취약하다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 당업계에 공지된 다양한 핵산 분해효소 저항성을 부여하는 어떠한 형태의 화학적 변형을 도입할 수 있다. 바람직하게는 화학적 변형에는 2’-아미노 피리미딘, 2’-플루오르 피리미딘, 2’-O-메틸 리보오스 퓨린 및 피리미딘 등이 있으며, 백본(backbone)의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변형하는 방법이 있다. 2’-플루오르나 2’-O-메틸 변형의 경우는 이들 변형된 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 이용하여 인 비트로 전사를 수행할 수 있는 돌연변이 RNA 중합효소들이 존재함으로 이들을 이용하여 SELEX 과정에서부터 화학적 변형을 도입할 수 있다. 한편, 두 뉴클레오타이드의 3’-말단을 3’-3’ 연결시킴으로써 3’-말단을 캡핑(capping)하여 핵산 분해효소에 대한 저항성을 증가시킬 수 있으며, 고분자로서 PEG(polyethyleneglycol)을 부착하여 신장 여과(renal filtration) 속도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머의 뉴클레오타이드 길이는 바람직하게는 43-100개이고, 보다 바람직하게는 43-90개이며, 보다 더 바람직하게는 43-85개이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 앱타머가 RNA인 경우, 상기 서열목록 제1서열 내지 제7서열에 기재된 티미딘은 우라실로 대체될 수 있다. 서열목록 제1서열 내지 제5서열에 기재된 서열에서 "n"은 아데닌(adenine, a), 구아닌(guanine, g), 시토신(cytosine, c), 티민(thymine, t) 및 우라실(uracil, u)로 구성된 군으로부터 선택되는 어떠한 뉴클레오타이드일 수 있다.
바람직하게는 서열목록 제1서열은 서열목록 제8서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제10서열, 서열목록 제11서열 또는 서열목록 제12서열이고, 서열목록 제2서열은 서열목록 제13서열, 서열목록 제14서열, 서열목록 제15서열, 서열목록 제16서열, 서열목록 제17서열, 서열목록 제18서열, 서열목록 제19서열, 서열목록 제20서열 또는 서열목록 제21서열이며, 서열목록 제3서열은 서열목록 제22서열 또는 서열목록 제23서열이고, 서열목록 제4서열은 서열목록 제24서열 또는 서열목록 제25서열이며, 서열목록 제5서열은 서열목록 제26서열 또는 서열목록 제27서열이다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이(특히, 앱타머의 2차 구조에 대한 실시예 4), 서열목록 제1서열 내지 제27서열에 기재된 앱타머는 본 발명의 앱타머가 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 데 필요한 필수적인 서열이다. 이러한 필수적 서열을 포함하는 한, 본 발명의 앱타머는 암 줄기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖게 된다. 따라서, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제27서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 모든 핵산 앱타머를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 앱타머는 상기 핵산 앱타머는 서열목록 제28서열 내지 제49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머이다. 서열목록 제28서열 내지 제43서열 및 제45서열 내지 제49서열의 뉴클레오타이드는 서열목록 제6서열 내지 제23서열 및 제25서열 내지 제27서열의 뉴클레오타이드 서열 5’말단에 5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’및 3’말단에 5’-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’서열의 뉴클레오타이드가 추가적으로 결합되어 있는 뉴클레오타이드이며, 서열목록 제44서열의 뉴클레오타이드는 서열목록 제24서열의 뉴클레오타이드 서열 5’말단에 5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATC-3’및 3’말단에 5’-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’서열의 뉴클레오타이드가 추가적으로 결합되어 있는 뉴클레오타이드이다. 서열목록 제28서열 내지 제49서열의 뉴클레오타이드의 5’말단 및 3’말단에 추가적으로 결합될 수 있는 상기 뉴클레오타이드 서열은 핵산 라이브러리 합성 및 핵산 앱타머 선별을 위해 도입된 서열로 PCR에 있어서 프라이머 서열로 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물을 제공한다. 상기 암 세포는 바람직하게는 암 줄기세포 또는 췌장암 세포이고, 보다 바람직하게는 췌장암 암 줄기세포이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포에 특이적으로 결합하는데, 상기 핵산 앱타머는 암 세포와 암 줄기세포를 구별할 수 있는 능력, 즉 암 세포와 비교하여 암 줄기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 특징을 갖는다.
본 발명의 핵산 앱타머는 암의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 암의 진단 및 표적에 이용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 조금 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 앱타머를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.
상기 본 발명에 적용될 수 있는 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Maggio, E.T. Enzyme-Immunoassay. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc.(1980); Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ(1984); 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 암의 진단 또는 표적이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 핵산 앱타머가 암 세포를 검출 또는 표적화하는데 이용될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다양한 표지자를 본 발명의 핵산 앱타머에 레이블링하여 암 세포를 진단 또는 표적화 하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 진단이 ELONA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 효소가 결합된 앱타머와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 앱타머에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 앱타머에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 진단이 캡처-ELONA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획 앱타머(capturing aptamer)로서 본 발명의 앱타머를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획 앱타머와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELONA 방법 및 캡처-ELONA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 핵산 앱타머의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 핵산 앱타머 결합에 의해 면역분석 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물은 암 세포에 특이적으로 결합하여 암을 표적화 할 수 있으며, 상기 핵산 앱타머에 암 치료용 물질을 결합하면 암 세포 또는 조직에 특이적으로 암 치료용 물질을 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물이 암 치료를 위한 조성물로 제공될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명하다.
본 발명의 핵산 앱타머에 적용할 수 있는 암 치료용 물질은 당업계에 공지된 다양한 암 치료용 물질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 앱타머를 리포좀이나 나노입자의 표면에 부착함으로써, 리포좀 또는 나노입자 내부에 탑재된 항암제, 톡신, 암 성장 저해 유전자, siRNA(small interfering RNA), PNA 등을 암 세포 또는 조직 특이적으로 전달할 수 있다. 본 발명의 핵산 앱타머에 공지된 암 특이적 약물, 암세포 사멸을 유도하는 톡신 및 항암제, 또는 HSV-TK(Herpes simplex virusthymidine kinase), 사이토신 데아미네이즈(cytosine deaminase, CD) 등과 같은 공지된 자살 유전자, 또는 췌장암 성장 및 전이에 중요한 역할을 하는 유전자의 발현을 저해하는 siRNA(small interfering RNA)를 직접 부착하여 암 세포주로 전달할 수 있는바, 본 발명은 상기 핵산 압타머를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다(aptamer-siRNA conjugate: Silence. 1;1(1):4(2010), Zhou J, Rossi JJ.; aptamer-toxin conjugate: Cancer Res. 15;66(12):5989-92(2006), Chu
TC, Marks JW 3rd, Lavery LA, Faulkner S, Rosenblum MG, Ellington AD, Levy M.; aptamer-liposome: Chem Commun(Camb) 14;46(2):249-51(2010), Epub 2009 Nov 23. Kang H, O'Donoghue MB, Liu H, Tan W.).
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트는 바람직하게는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 보다 바람직하게는 루미넥스 분석 키트 또는 ELONA 키트이다. 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 ELONA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELONA 키트는 췌장암 암 줄기세포에 대한 특이적인 핵산 앱타머를 포함한다. 본 발명의 핵산 앱타머는 췌장암 암 줄기세포에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 세포에 대한 교차 반응성이 거의 없는 앱타머이다. 또한 ELONA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 앱타머를 포함할 수 있다. 그 외 ELONA 키트는 결합된 앱타머를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
상기 분석 방법들을 통하여, 대조군에서의 항원-앱타머 복합체의 형성량과 췌장암 암 줄기세포를 포함하는 시료에서의 항원-앱타머 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 항원-앱타머 복합체 형성량을 비교하여 항원-앱타머 복합체 형성 증가 여부를 판단하여, 췌장암 암 줄기세포를 검출할 수 있다.
본 발명에서 용어“항원-앱타머 복합체”는 췌장암 암 줄기세포와 이에 특이적인 앱타머의 결합물을 의미하고, 항원-앱타머 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
췌장암 암 줄기세포의 검출은 바람직하게는, ELONA을 이용하는 것이다. ELONA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 앱타머를 이용하는 직접적 ELONA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 앱타머의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELONA, 고체 지지체에 부착된 앱타머와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELONA, 고체 지지체에 부착된 앱타머와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELONA 등 다양한 ELONA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 앱타머를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-앱타머 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELONA 방법에 의해서 검출한다. 췌장암 암 줄기세포와 앱타머의 복합체 형성 정도를 확인하여, 췌장암 암 줄기세포 존재 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 용어 “예후”는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 종양 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 췌장암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 줄기세포를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉(contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계(a)의 결과물에서 핵산 앱타머-세포 결합 반응을 검출하는 단계.
본 발명의 암 줄기세포 검출 방법은 암 줄기세포를 갖는 한 어떤 종류의 암에도 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암이다.
본 발명에서 용어 “생물학적 시료”는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 단계 (b)의 검출은, 핵산 앱타머-세포 결합 반응을 검출할 수 있는 한, 당업계에 알려진 어떠한 방법도 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 앱타머를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 진단 또는 예후 판단 방법을 제공한다:
(a) 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉(contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계(a)의 결과물에서 핵산 앱타머-세포 결합 반응을 검출하는 단계.
본 발명의 암 진단 또는 예후 판단 방법은 암세포를 갖는 한 어떤 종류의 암에도 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암이다.
본 발명의 방법은 상술한 앱타머를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포 특히 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 암의 진단 및 표적뿐만 아니라, 췌장암의 진단 또는 예후 판단 용도로 사용될 수 있다.
(c) 본 발명의 핵산 앱타머는 췌장암 진단에 활용되고 있는 췌장암 결합 항체를 대체할 수 있으며, 췌장암을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 암 줄기세포 특이적인 앱타머를 선별하는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 인간 췌장암 세포주 HPAC 스피어에 결합하는 앱타머를 양성 선별한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 암 줄기세포 능력이 적은 암세포(cd44-/cd24-/esa-)에서 앱타머를 음성 선별하여 분리한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 서열목록 제6서열 내지 제27서열의 뉴클레오타이드에 대한 상동성을 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 서열목록 제28서열 내지 제49서열의 뉴클레오타이드의 2차 구조 예측 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 핵산 앱타머의 결합 친화도 민감도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 핵산 앱타머의 결합 특이도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 형광면역염색법을 이용한 핵산 앱타머의 결합 친화도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 앱타머로 분리한 세포의 분자적 특성을 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 췌장암 암줄기세포 마커와 앱타머의 결합양상을 나타낸 그림이다.
도 11은 앱타머 특이 췌장암 세포의 구 형성능 시험 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 앱타머 특이 혈중순환암세포 검출 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 앱타머 특이 마이크로파티클 검출 결과를 나타낸 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: ssDNA 라이브러리 및 PCR 증폭을 위한 프라이머의 준비
다음의 서열을 가지는 랜덤한 ssDNA 라이브러리를 화학적으로 합성하고 PAGE로 분리하였다. 5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’
초기 풀은 7×1013 분자를 포함하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머: 5’FAM-AAG GAG CAG CGT GGA GGA TA-3’
역방향 프라이머: 5’A20-C18-ACC ACG ACG ACA CCA CCT AA-3’
실시예 2: 세포배양 및 준비
인체 췌장암 세포주 Hpac는 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다(10% FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco)). 스피어(Sphere) 배양을 위하여 췌장암 HPAC 세포를 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1?ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 DMEM/F12 배지에 1000 세포/㎖의 비율로 T75 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7일 동안 배양하였다. 인체 정상 췌장 세포주 HPDE는 케라티노사이트(invitrogen Gibco)에서 배양하였으며 인체 정상 췌장 세포주 hYGIC6는 실험실 내에서 자체적으로 구축한 정상 세포주로 10% FBS를 포함하는 waymouth에서 배양하였다.
실시예 3: HPAC 스피어에 특이적으로 결합하는 앱타머의 선별( cell - SELEX )
인간 췌장암 세포주인 HPAC 스피어에 대하여 양성선별을 수행하되, 5, 9번째 라운드에서는 초기 계대배양 세포를 키워 수행하였다. N40 단일가닥 DNA(이하 ssDNA) 라이브러리를 95℃에서 5분간 결합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2, 0.1 mg/ml 효모 tRNA 및 1 mg/ml BSA를 포함하는 PBS)에서 변성시킨 다음, 얼음상에 급냉시켰다. 그 다음, HPAC 스피어를 단백질이 보존 가능한 아큐타아제(accutase)(sigma)를 처리하여 단일세포로 분리하였다. 상기 라이브러리를 세포와 함께 4℃에서 45분간 처리 후, 결합되지 못한 서열들은 세척용 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2를 포함하는 PBS)으로 각 5분간 3번의 연속적인 세척을 통하여 제거하였다. 세척용 완충용액으로 상기 세포들을 수집한 다음 95℃에서 5분간 가열함으로서 세포 표면에 결합된 서열들을 세포로부터 분리 후 추출하였다. 얻어진 ssDNA는 PCR 증폭하였다. 도 2와 같이, 상기 양성 선별과정을 11회 수행한 다음, 암줄기세포 능력이 적은 암세포(cd44-/cd24-/esa-)를 유세포 분석을 통해 분리하여(도 3) 2번의 음성 선별과정을 거쳤으며, 정상 췌장 세포주인 HPDE와 hYGIC6에 대해서도 2번의 음성 선별과정을 수행하였다. 양성 선별과정이 함께 번갈아 수행되어 결국, 양성 선별과정은 총 13회 수행되었으며, 음성선별과정은 총 4회 수행되었다.
높은 친화도와 특이성을 갖는 앱타머의 선별을 위하여, 세척의 지속시간을 점차적으로 15분까지 증가시켰다. 17번째 라운드에서 80%의 수율을 보였기 때문에 17번째 라운드의 산물은 TA 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 총 94개의 콜로니를 획득하여 서열을 분석하고 클론상에서의 공통되는 서열을 분석하였다. 그 결과 도4와 같이, 22종의 서열을 수득하였으며, 이로부터 얻은 본 발명에 따른 DNA 앱타머 서열을 다음과 같다. 빨간색으로 표시된 염기는 프라이머 부분이다.
실시예 4: 앱타머의 염기서열별, 2차구조별 분류
클로닝으로부터 얻은 22 종류의 앱타머를 염기서열이 비슷한 집단으로 구분하였을 때, 1, 154, 163, 27, 39번 앱타머는 비슷한 염기서열을 가졌으며 그 2차구조 또한 매우 유사하다. 마찬가지 방법으로 23, 146, 19, 25, 28, 132F, 171도 비슷한 염기서열을 가지면서 2차구조도 유사한 형태를 가지는 것으로 예측되었다. 앱타머의 2차구조는 m-fold 프로그램을 통하여 예측하였다.
실시예 5: 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 결합 친화도 측정
형광검출을 통하여 결합 친화도를 측정하기 위해 5’FAM 표지된 앱타머를 이용하였다. FACS용 접합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상에서 10, 25, 50, 100, 150, 200 nM의 농도로 앱타머를 준비 후 동량의 HPAC 스피어와 45분간 반응시켰다. 이후 두 번의 세척 후에 유세포분석기를 통하여 전체 살아있는 세포 중 앱타머가 붙은 세포를 비율화 하여 그래프로 나타내었다. 실험은 3회 반복하였다(도 6).
실시예 6: 평형 여과법에 의한 췌장암 세포주에 대한 해리상수( K d )의 측정
39, 19, 40, 23, 25, 15, 108번 및 카피수가 높게 나타난 1, 146번 앱타머에 대하여, 결합 어세이를 평형 여과법에 의하여 수행하였다. 즉, 10 nM 내지 200 nM 농도 범위에서 각 앱타머를 5×106의 세포주와 배양한 다음 결합반응을 그래프로 나타내었다. 해리상수를 산출하기 위하여 prism 4.0 소프트웨어를 이용하여, 다음의 평형식으로 결합된 췌장암 세포주 대 ssRNA 농도의 퍼센트를 플롯화하고, 데이터 포인트를 비선형 회귀분석에 의해 고정하였다.
Y=(Bmax × ssDNA)/(Kd +ssDNA)
이 때, y는 포화도의 정도이고, Bmax는 최대결합지점의 수이고, Kd는 해리상수이다. 그 결과, 췌장암 줄기세포에 대하여 강한 결합력을 보임을 확인할 수 있었는데, 특히 서열번호 146의 경우 22.1 nM로 실험을 수행한 앱타머 중 가장 강한 친화도를 가지는 것으로 나타났다(표 1).
앱타머 K d (nM)
146 22.18
1 22.62
39 42.6
15 45.18
23 49.69
19 52.64
40 54.28
108 62.8
25 65.79
실시예 7: 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 결합 특이도 확인
민감도 실험과 동일한 방법으로 형광검출을 통하여 결합 특이도를 확인하였다. 5’FAM 표지된 앱타머를 FACS용 접합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상에서 10, 25, 50, 100, 150, 200 nM의 농도로 앱타머를 준비 후 동량의 HPAC 스피어 세포 또는 HPDE 세포와 45분간 반응시켰다. 이후 두 번의 세척 후에 유세포분석기를 통하여 전체 살아있는 세포 중 앱타머가 붙은 세포를 비율화 하여 그래프로 나타내었다. 실험은 3회 반복하였다(도 7).
실시예 8: 형광면역염색법
형광검출을 통하여 결합 친화도를 측정하기 위하여 5’TAMRA 표지된 앱타머를 이용하였다. 먼저, 접합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상의 TAMRA 표지된 앱타머 1번과 146번 챔버 슬라이드에 키운 HPAC 세포에 상기 200 μM의 표지된 앱타머 풀과 결합 완충용액상에서 45분간 37℃로 배양한 다음 세척 완충용액으로 빠르게 2번 세척한 다음, 형광현미경으로 형광을 100X 배율로 검출하였다. 그 결과, cell-SELEX 과정을 거침으로 인하여 초기 풀에 비해 1, 146번 앱타머가 hpac 세포주 더 많이 인식함을 알 수 있었다(도 8).
실시예 9: 앱타머 특이적인 암세포에서의 줄기세포의 특성
유세포 분석을 통하여 1, 146 앱타머로 HPAC세포를 분리 후 앱타머에 붙지 않은 암세포 대비 앱타머에 붙은 암세포에서 줄기세포의 특성을 RT-PCR기법으로 RNA수준에서 확인하였다(도 9). 그 결과 배아 줄기세포 관련 유전자인 oct4, nanog가 증가되어있었고 암 줄기세포 관련 시그널 중 하나인 hedgehog 관련 유전자도 증가되어있었으며 기존에 알려진 암줄기세포 마커인 cd44, cd24, c-met 유전자의 발현도 증가되어 있었다. 이러한 결과를 토대로 개발된 앱타머는 줄기세포의 특성을 가진 암세포에 특이적으로 인식할 것으로 생각된다.
PCR기법에 사용된 프라이머는 다음과 같다(표 2).
프라이머 염기서열
유전자 정방향 프라이머 염기서열 (5’-3’) 역방향 프라이머 염기서열 (5’-3’)
Oct4 GTGGAGGAAGCTGACAACAA AGCAGCCTCAAAATCCTCTC
Nanog ACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCT AGAGTAAAGGCTGGGGTAGGTA
Ihh CCTGAACTCGCTGGCTATCT AATACACCCAGTCAAAGCCG
Gli1 AGAGTCCAGGGGGTTACATA AGAGTCCAGGGGGTTACATA
PTCH GCAGTGGTGAGAGAAAAGGA CTCGGATTGGTGACCATAAG
smo GAATCGCTACCCTGCTGTTA TGAGCAGGTGGAAGTAGGAG
cd44 CACCATTTCAACCACACCAC GGTGTTGTCCTTCCTTGCAT
cd24 ACCACGAAGAGACTGGCTGT CCCACGCAGATTTATTCCAG
C-met CAATGTGAGATGTCTCCAGC CCTTGTAGATTGCAGGCAGA
U6 AACGCTTCACGAATTTGCGT CTCGCTTCGGCAGCACA
실시예 10: 알려진 췌장암 암줄기세포 마커 양성세포에서 앱타머의 결합양상
기존의 췌장암 암줄기세포 마커로 발표된 바 있는 CD24, CD44, EpCAM(BD biosciences), CD133(Miltenyi biotech)과 앱타머의 상관관계를 확인하기 위하여 형광검출법을 시행하였다.
핵은 Hoechst33342로 염색하였으며 PE로 표지된 CD24, CD44, EpCAM과 FAM 표지된 앱타머1 또는 146번을 사용하였다. 먼저 아큐타아제로 단일세포 처리한 HPAC세포를 접합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS in PBS)으로 부유시킨 후 PE 표지된 CD24, CD44, EpCAM 항체와 FAM 표지된 앱타머 1번 또는 146번을 200 μM의 농도로 결합 완충용액상에서 45분간 37℃로 배양 후 세척 완충용액으로 빠르게 2번 세척하였다. 준비된 세포는 공초점현미경으로 400X 배율로 관찰하였다. 그 결과 HPAC 세포에서 많이 발현하고 있는 CD24, CD44, EpCAM 양성 세포에서는 모든 양성세포에 앱타머가 붙지는 않았지만 양성중에서도 과발현된 세포에 앱타머가 결합함을 관찰하였다. HPAC 세포주에서 발현양이 적은 CD133 양성세포는 모든 양성세포에 앱타머가 결합함을 관찰하였다. 이로써 기존의 췌장암 암줄기세포 마커 양성세포에서 앱타머 결합양상은 완벽히 일치하지 않지만 교집합이 존재함을 알 수 있었다(도 10).
실시예 11: 앱타머 특이 췌장암 세포의 구( sphere ) 형성능 시험
암줄기세포의 보편적 특징 중 하나인 구 형성능을 시험하기 위하여 앱타머1번 양성, 음성세포를 유세포분석기로 각각 분리 후 스피어 배지(EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1?ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 DMEM/F12)에 100 세포/㎖의 비율로 6웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7일 동안 배양하였다. 그 결과 앱타머 1번 양성세포가 앱타머 음성세포에 비하여 더 크고 많은 스피어를 형성함을 관찰하였다(도 11).
실시예 12: 앱타머 특이적인 혈중순환암세포( Circulating Tumor Cell ) 검출
췌장암에서 기인한 전이암환자의 혈액 15 ml을 채취하여 온코퀵 튜브로 혈중순환암세포(Circulating Tumor Cell; CTC)를 분리하였다. 암줄기세포 특이 앱타머를 통해 CTC의 검출 가능성을 확보하고자 분리된 CTC에 Cy5 표지된 앱타머1번을 결합시켰다. 혈액 내 상피세포임을 증명하는 FITC 결합 사이토케라틴을 암줄기세포 특징을 확인하기 위하여 PE 결합 EpCAM, CD24 또는 CD133을 동시에 염색하였다. 그 결과 EpCAM 양성 CTC와 EpCAM 음성 CTC 모두 검출이 가능했으며, 백혈구에도 발현하지만 암줄기세포 마커로도 알려진 CD24를 염색하였을 경우, CTC 세포임을 증명하는 사이토케라틴과 동시에 염색된 세포만이 앱타머가 결합하였다. 마찬가지로 췌장암 암줄기세포 마커인 CD133과 앱타머 1번을 동시에 염색하였을 때 CD133 양성이면서 사이토케라틴 양성인 CTC에 앱타머가 결합함을 확인하였다. 이로써 앱타머는 CTC 중에서도 암줄기세포 특징을 지닌 세포에 결합함을 알 수 있다(도 12).
실시예 13: 환자 말초혈액성분에서의 앱타머 특이물질 검출
앱타머가 췌장암조기진단제의 가능여부를 확인하기 위하여 정상과 췌장암환자에게서 얻어진 말초혈액성분에서 혈구세포를 제거한 플라즈마(plasma)로 시험하였다. 플라즈마에서 손쉽게 시험할 수 있도록 유세포분석기를 통해 마이크로파티클의 갯수를 확인하였다. 10 μl의 인체 유래 플라즈마를 아넥신 V 결합완충용액(BD biosciences)에 부유시킨 뒤 마이크로파티클 표지자인 APC 결합 아넥신 V(BD biosciences)와 앱타머 1번을 결합한 결과 정상(중간값 64.5)에 비해 췌장암 환자(중간값 1131)에서 훨씬 많은 수의 앱타머 양성 마이크로파티클이 관찰되었고 그 중에서도 전이 환자에서 더 많은 마이크로파티클이 관찰되었다(도 13).
참고문헌
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Nucleic Acid Aptamers Specifically Binding to Cancer Stem Cells and Their Uses <130> PN120387 <160> 49 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n denotes a, g, c, t or u. <400> 1 tccgttcgta ctcncaagct gatcngcngc gcgacntgtg acaa 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n denotes a, g, c, t or u. <400> 2 nccantngtn taaaanacag cnntagagcc ggnaccggng ccnn 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n denotes a, g, c, t or u. <400> 3 gcgcnncnna nnnnnnnatn nnannncang cnngnnngnn nncn 44 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n denotes a, g, c, t or u. <400> 4 tggncncnnn nnnnnnnnna gnnnnnnntc nnnnnnngnn gna 43 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n denotes a, g, c, t or u. <400> 5 gggnnnnnnn ngnnnanatn nnagnnnnnn ngnnnnnnng ncnn 44 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Aptamer #127 partial sequence <400> 6 cgcgagaact gtgcaactac ggacggtact agcttgtggg gtgct 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Aptamer #15 partial sequence <400> 7 ccgatgccag acacaattgt tatcccgcgc atgccaccat ccgtc 45 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #1 partial sequence <400> 8 tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcggc gcgacttgtg acaa 44 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #154 partial sequence <400> 9 tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcggc gcgacatgtg acaa 44 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #163 partial sequence <400> 10 tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcagc gcgacttgtg acaa 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #27 partial sequence <400> 11 tccgttcgta ctcccaagct gatccgcggc gcgacttgtg acaa 44 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #39 partial sequence <400> 12 tccgttcgta ctcgcaagct gatctgcggc gcgacttgtg acaa 44 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #23 partial sequence <400> 13 tccattagtc taaaacacag ccttagagcc gggaccggag ccgc 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #23F partial sequence <400> 14 tccattcgtg taaaagacag cagtagagcc gggaccggtg ccaa 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #146 partial sequence <400> 15 accactagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccac 44 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #19 partial sequence <400> 16 accactagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccgc 44 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #25 partial sequence <400> 17 accattagtt taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccac 44 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #25F partial sequence <400> 18 accattagtt taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccaa 44 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #28 partial sequence <400> 19 accattagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccac 44 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #132F partial sequence <400> 20 accattagtg taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg ccac 44 <210> 21 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #171 partial sequence <400> 21 accactagtc taaaagacag ccgtagagcc ggtaccggtg ccac 44 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Aptamer #40 partial sequence <400> 22 gcgctcccaa cggccacata ccagtacacg cgggaccgcg gcctg 45 <210> 23 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #7 partial sequence <400> 23 gcgcgacgca aaaagggatg tgaagtcagg ctagtagggc atcg 44 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #106 partial sequence <400> 24 tggcctcggt cccgcaagta gaggcatgtc gccgttggga gcaa 44 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> Aptamer #140 partial sequence <400> 25 tggtcaccta caacattaca ggtcaggctc attaagcgtt gaa 43 <210> 26 <211> 44 <212> DNA <213> Aptamer #108 partial sequence <400> 26 ggggatagcg ggtgtatatt taagctttac ggctgtgtgg tctg 44 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Aptamer #113 partial sequence <400> 27 gggctcccaa cggtcacata ccagtacacg cggaaccgcg gcctg 45 <210> 28 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #1 <400> 28 aaggagcagc gtggaggata tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcggc gcgacttgtg 60 acaattaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 29 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #154 <400> 29 aaggagcagc gtggaggata tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcggc gcgacatgtg 60 acaattaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 30 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #163 <400> 30 aaggagcagc gtggaggata tccgttcgta ctcgcaagct gatccgcagc gcgacttgtg 60 acaattaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 31 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #27 <400> 31 aaggagcagc gtggaggata tccgttcgta ctcccaagct gatccgcggc gcgacttgtg 60 acaattaagg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 32 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #39 <400> 32 aaggagcagc gtggaggata tccgttcgta ctcgcaagct gatctgcggc gcgacttgtg 60 acaattaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 33 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #23 <400> 33 aaggagcagc gtggaggata tccattagtc taaaacacag ccttagagcc gggaccggag 60 ccgcttaggg tgtgtctgct tggt 84 <210> 34 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #23F <400> 34 aaggagcagc gtggaggata tccattcgtg taaaagacag cagtagagcc gggaccggtg 60 ccaattaggg tgtgtcgtct cggt 84 <210> 35 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #146 <400> 35 aaggagcagc gtggaggata accactagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccacttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 36 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #19 <400> 36 aaggagcagc gtggaggata accactagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccgcttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 37 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #25 <400> 37 aaggagcagc gtggaggata accattagtt taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccacttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 38 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #25F <400> 38 aaggagcagc gtggaggata accattagtt taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccaattaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 39 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #28 <400> 39 aaggagcagc gtggaggata accattagtc taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccacttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 40 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #132F <400> 40 aaggagcagc gtggaggata accattagtg taaaagacag ccgtagagcc gggaccggtg 60 ccacttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 41 <211> 84 <212> DNA <213> Aptamer #171 <400> 41 aaggagcagc gtggaggata accactagtc taaaagacag ccgtagagcc ggtaccggtg 60 ccacttaggg tgtgtcgtcg tggt 84 <210> 42 <211> 85 <212> DNA <213> Aptamer #40 <400> 42 aaggagcagc gtggaggata gcgctcccaa cggccacata ccagtacacg cgggaccgcg 60 gcctgttagg 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49 aaggagcagc gtggaggata ccgatgccag acacaattgt tatcccgcgc atgccaccat 60 ccgtcttagg gtgtgtcgtc gtggt 85

Claims (21)

  1. 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지거나, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머로서, 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머는 서열목록 제8서열 내지 제49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA이며, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제1서열 내지 제7서열에 기재된 티미딘은 우라실인 것을 특징으로 하는 앱타머.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 세포 결합용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 췌장암 세포는 췌장암 암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 췌장암의 진단에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 췌장암의 표적에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후판단용 조성물.
  12. 다음 단계를 포함하는 췌장암 암 줄기세포를 검출하는 방법:
    (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산 앱타머를 생체 외(外) 생물학적 시료에 접촉(contacting)하는 단계; 및
    (b) 상기 단계(a)의 결과물에서 핵산 앱타머-세포 결합 반응을 검출하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA이며, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제1서열 내지 제7서열에 기재된 티미딘은 우라실인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
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