WO2014025234A2 - 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2014025234A2
WO2014025234A2 PCT/KR2013/007212 KR2013007212W WO2014025234A2 WO 2014025234 A2 WO2014025234 A2 WO 2014025234A2 KR 2013007212 W KR2013007212 W KR 2013007212W WO 2014025234 A2 WO2014025234 A2 WO 2014025234A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
nucleic acid
cancer
sequence
acid aptamer
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/007212
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014025234A3 (ko
Inventor
송시영
김윤진
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Publication of WO2014025234A2 publication Critical patent/WO2014025234A2/ko
Publication of WO2014025234A3 publication Critical patent/WO2014025234A3/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid aptamer and its use specifically binding to cancer stem cells.
  • Pancreatic cancer is a deadly cancer with a 5-year survival rate of 1-43 ⁇ 4 and a 5-month survival period. It has the poorest prognosis among human cancers. Since the prognosis is extremely poor and the treatment is mainly dependent on chemotherapy, 80-90% of patients are found in a state where no radical resection is possible at diagnosis. Therefore, early diagnosis is urgently needed than any human cancer.
  • cancer stem cells which survive and cause cancer recurrence or exacerbation, have stem cell characteristics of self-renewal, differentiation, and proliferation, and are thought to be involved in the initial onset of cancer. Involvement in the regeneration of cancer cells has been reported to have a profound effect on cancer recurrence or metastasis and induction of chemotherapy resistance (1). Therefore, the early diagnosis and fundamental treatment of cancer should focus on the cancer stem cells that occupy only a small part of the cancer tissue and play a key role in the development, maintenance and recurrence of cancer.
  • aptamers that target targets based on physical and structural features in targeting cancer stem cells may become new concept targets. Aptamers are single-stranded nucleic acid or peptide molecules that refer to characteristic sequences that specifically bind to a variety of chemicals, proteins, and cells.
  • Aptamers are often compared to antibodies and have the advantages of being relatively easy to synthesize, inexpensive and usable at room temperature. Because of its advantages and biocompatibility, it is already widely studied for the diagnosis and treatment of cancer (6). As an example, aptamers (7) specific for HER2, a breast cancer stem cell marker, have been developed, and aptamers that recognize proteins whose roles have been identified in cancer (8). In addition, studies are underway to explore the potential for diagnosis, drug delivery, and in vivo imaging with aptamers (9-13).
  • Aptamers can be obtained using the cell-SELEX technique for complex targets, ie living cells and tissues.
  • the cell-SELEX technique has the advantage of developing aptamers for diseased cells even when no surface marker target is known. have.
  • the isolated protein may not exhibit its original properties, so that the target protein in the physiological state allows a more functional approach in the selection process.
  • nucleic acid aptamer that can specifically bind to cancer cells for the diagnosis of cancer .
  • Research effort As a result, it was found that nucleic acid aptamers of 43-100 nucleotides in length, including nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7, specifically bind cancer cells, particularly cancer stem cells.
  • the present invention has been completed by confirming that the composition comprising a tammer can be used to diagnose cancer.
  • nucleic acid aptamer comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7 sequences.
  • Another object of the present invention to provide a composition for binding cancer cells. Another object of the present invention to provide a kit for detecting cancer stem cells.
  • Another object of the present invention to provide a composition for diagnosing or prognostic cancer.
  • Another object of the present invention to provide a method for detecting cancer stem cells.
  • the present invention comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7
  • Nucleic acid aptamers of 43-100 nucleotides in length are provided.
  • the inventors have tried to develop nucleic acid aptamers that can specifically bind to cancer cells.
  • the nucleic acid aptamers of 43-100 nucleotides in length comprising nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7 bind specifically to cancer cells, in particular cancer stem cells. It was confirmed that cancer can be diagnosed using a composition comprising a.
  • nucleic acid aptamer means a nucleic acid molecule capable of binding high affinity and specificity to a specific molecule, and the nucleic acid means DNA, RNA or nucleic acid variants.
  • nucleotide herein refers to a nucleotide polymer that is generally less than about 200 in length.
  • Nucleotides can be any substrate that can be introduced into the polymer by deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases and / or analogs thereof, or by DNA or RNA polymerase or by synthetic reactions. If modifications to the nucleotide structure are present, such modifications may be added before or after the synthesis of the oligonucleotide polymer. Nucleotide sequences can be amplified by non-nucleotide components. Oligonucleotides can be further modified after synthesis, for example by binding to a label.
  • Nucleic acid aptamers of the invention are typically obtainable by in vitro selection methods for binding of target molecules.
  • Methods of selecting aptamers that specifically bind to a target molecule are known in the art.
  • organic molecules, nucleotides, amino acids, polypeptides, marker molecules on the cell surface, ions, metals, salts, polysaccharides can be suitable target molecules that separate aptamers that can specifically bind to each ligand.
  • the selection of aptamers can utilize in vivo or in vitro selection techniques known by the Systematic Evolution of Ligand by Exponent ia 1 Enrichment (SELEX) method (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; and Tuerk et.
  • SELEX Systematic Evolution of Ligand by Exponent ia 1 Enrichment
  • Oligonucleotides can be modified or unmodified DNA, RNA or DNA / RNA isomers.
  • the oligonucleotide pool is 1003 ⁇ 4> random or partially randomized ligonucleotides, preferably the oligonucleotide pool is comprised of random or partially random oligonucleotides having at least one fixed sequence and / or conserved sequence included in a random sequence site. Can be.
  • the oligonucleotide pool is random or partially randomized comprising at least one fixed sequence and / or conserved sequence which may consist of sequences whose 5 'and / or 3' ends are shared by all molecules of the oligonucleotide pool. And may be composed of nucleotides. Oligonucleotide pools preferably contain not only random sequence portions, but also fixed sequences that are essential for effective replication. The oligonucleotides of the initial pool contain fixed 5 'and 3' terminal sequences with 35-50 random nucleotides inserted therein. Random nucleotides can be produced by selecting from chemical synthesis and randomly truncated intracellular nucleic acids.
  • the random sequence portion of the oligonucleotides may be of any length, may consist of ribonucleotides and / or deoxyribonucleotides, and may be natural or nucleotide analogs modified or unmodified (US Patent No. 5,958,691; US Patent No. 5,660,985; US Patent No. 5,958,691; US Patent Nos. 5,698, 687; US Patent No. 5,817, 635; US Patent No. 5,672,695, and PCT Publication W0 92/07065).
  • Random oligonucleotides are solid phases well known in the art Oligonucleotide synthesis techniques can be used to synthesize from phosphodiester-linked nucleotides (Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986), Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575 -5578 (1986)). Random ligonucleotides can also be synthesized using liquid phase separation, such as the ester synthesis method (Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977), Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449 (1978).
  • the oligonucleotide initial library can be RNA or DNA.
  • the RNA library is produced by transcribing the DNA library in vitro using T7 RNA polymerase or modified T7 RNA polymerase.
  • the RNA or DNA library is compatible with the target under appropriate binding conditions and repeats the binding, isolation and amplification processes in accordance with general screening procedures to achieve binding affinity and selectivity criteria.
  • nucleic acids that specifically bind and non-binding nucleic acids to the target molecule
  • the method for screening RNA aptamers further comprises reverse transcription of the nucleic acid isolated from the nucleic acid-target complex prior to amplification in the SELEX method step (d) and transcripting the amplified nucleic acid in step (d) prior to restart. do.
  • Nucleic acid aptamers of the invention may include chemically modified forms. In general, wild type RNA or DNA molecules that do not have chemical modifications are vulnerable to degradation by nucleases. Thus, the nucleic acid aptamers of the present invention may introduce any form of chemical modification that confers a variety of nuclease resistance known in the art.
  • the chemical modification includes 2'-amino pyrimidine, 2'-fluoro pyrimidine, 2'-0-methyl ribose purine and pyrimidine, and the like of the backbone. There is a method of modifying phosphodiester bonds to phosphorothioate bonds.
  • RNA polymerases capable of performing in vitro transcription using these modified nucleotide triphosphates, which can be used to introduce chemical modifications from the SELEX process. Can be. Meanwhile, by connecting the 3'-terminus of the two nucleotides 3'-3 ', capping of the 3'-terminus can increase the resistance to nucleases, and by attaching PEG (polyethyleneglycol) as a polymer, kidney filtration (renal filtration) can reduce the rate.
  • PEG polyethyleneglycol
  • the nucleotide length of the nucleic acid aptamer is preferably 43-100, and more preferably comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7 of the present invention. Preferably 43-90, even more preferably 43-85.
  • thymidine described in SEQ ID NOS: 1 to 7 may be replaced with uracil.
  • 'V is adenine (a), guanine (g), cytosine (c), thymine (t) and uracil (u) It may be any nucleotide selected from the group consisting of.
  • SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, or SEQ ID NO 21
  • SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23
  • SEQ ID No. 4 is 24 or SEQ ID NO: 25
  • SEQ ID No. 5 is SEQ ID NO: 26 Or SEQ ID NO: 27 sequence.
  • the aptamers described in SEQ ID NOS: 1 to 27 are specifically designed for the aptamer of the present invention to specifically bind to cancer stem cells. It is an essential sequence required. As long as the essential sequence is included, the aptamer of the present invention has the ability to specifically bind to cancer stem cells. Accordingly, the present invention includes all nucleic acid aptamers of 43-100 nucleotides in length comprising the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-27.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention is a nucleic acid aptamer comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 28 to 49.
  • the nucleotides of SEQ ID NO: 28 to 43 and SEQ ID NO: 45 to 49 are 5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3 at the 5 'end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 to 23 and SEQ ID NO: 25 to 27
  • the nucleotide to which the nucleotide of the 5'-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3 'sequence is additionally bound at the' and 3 'ends, and the nucleotide of SEQ ID NO: 44 is 5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATC-3 at the nucleotide sequence 5 'end of SEQ ID NO: 24 Nucleotides of the 5'-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3 'seque
  • the nucleotide sequence which may be additionally bound to the 5 'end and 3' end of the nucleotides of SEQ ID NO: 28-49, may be used as a primer sequence in PCR with a sequence introduced for nucleic acid library synthesis and nucleic acid aptamer selection.
  • the present invention provides a composition for binding cancer cells comprising the nucleic acid aptamer.
  • the cancer cells are preferably cancer stem cells or pancreatic cancer cells, more preferably pancreatic cancer stem cells.
  • Nucleic acid aptamer of the present invention specifically binds to cancer cells, wherein the nucleic acid 3 ⁇ 4 tammer is capable of distinguishing cancer cells from cancer stem cells, that is, capable of specifically binding to cancer enjoyment cells as compared to cancer cells. Has characteristics.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention may be an indicator for the development and development of cancer, and may be used for diagnosis and target of cancer.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, a particular disease or Determining the prognosis of a subject with a disease (eg, identifying a metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the response of the cancer to treatment), or therametrics (such as Monitoring the condition of the object to provide information about the efficacy of the treatment).
  • a disease eg, identifying a metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the response of the cancer to treatment
  • therametrics such as Monitoring the condition of the object to provide information about the efficacy of the treatment.
  • the diagnosis of the present invention can be carried out with a slight modification of the conventional immunoassay method or protocol.
  • the conventional immunoassay instead of the antibody, the aptamer of the present invention can be used, and the process can be performed in the same manner to diagnose the present invention.
  • ELISA enzyme- 1 inked immunosorbant assay
  • ELONAC ELONACenzyme-linked oligonucleotide assay
  • the immunoassay that can be applied to the present invention can be performed according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the prior art.
  • the immunoassay format includes radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, EL ISA (enzyme-linked immunosorbant assay), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, Immunofluorescent staining and immunoaffinity purification, but not limited to the above.
  • the immunoassay or method of immunostaining is performed using Maggio, ET Enzyme- Immunoassay. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc.
  • a nucleic acid aptamer labeled with a radioisotope may be used to detect cancer cells. It can be used to detect or target.
  • a radioisotope eg, C w , I 125 , P 32 and S 35
  • various markers known in the art can be labeled in the nucleic acid aptamers of the present invention and used to diagnose or target cancer cells.
  • a specific embodiment of the present invention comprises the steps of: (i) coating an unknown cell sample lysate to be analyzed on the surface of the solid substrate; (ii) aptamers with enzymes and cell lysates Reacting; And (iv) measuring the activity of the enzyme.
  • Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (such as polystyrene and polypropylene), glass, metal or gels, most preferably microtiter plates.
  • the enzyme bound to the 3 ⁇ 4 timer includes, but is not limited to, enzymes catalyzing color reaction, fluorescence reaction, luminescence reaction or infrared reaction, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, hose Radish peroxidase luciferase and cytokine ⁇ 450.
  • alkaline phosphatase is used as the enzyme binding to the aptamer
  • bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium ( ⁇ ), and naph are -AS-B1-phosphate (naphthol-) as substrates.
  • aS-Bl-phosphate a color-developing reaction substrate, such as enhanced chemi fluorescence
  • ECF a color-developing reaction substrate, such as enhanced chemi fluorescence
  • a horseradish peroxidase used is a chloro naphthyl, aminoethyl carbazole, diaminobenzidine, D- luciferin, Lucigenin (bis-N—methylacridinium nitrate) resorphin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl—3, 7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazol ine sulfonate]), o—phenylenediamine (OPD) and naph / pyronine,
  • a particular embodiment of the present invention comprises the steps of: (i) coating the surface of the solid substrate with the aptamer of the present invention as a capturing aptamer; ( ⁇ ) reacting the capture aptamer and the sample; (iii) reacting the result of step () with a detecting antibody having a label generating a signal; And (iv) measuring the signal resulting from the label.
  • the detection antibody carries a label which generates a detectable signal.
  • the label may include chemicals (e.g.
  • biotin biotin
  • enzymes alkaline phosphatase, -galactosidase, horse radish peroxidase and cytokine ⁇ 450
  • radioactive materials e.g. C 14 , I 125 , ⁇ 32.
  • S 35 fluorescent material (eg fluorescein), luminescent material, chemiluminescent material (chemi luminescent) and FRET (f luorescence resonance energy transfer), but are not limited thereto.
  • fluorescent material eg fluorescein
  • luminescent material eg chemiluminescent material (chemi luminescent)
  • FRET f luorescence resonance energy transfer
  • Measurement of the final enzyme activity or signal in the EL0NA method and capture-EL0NA method can be carried out according to various methods known in the art. Detection of such signals allows for qualitative or quantitative analysis of the nucleic acid aptamers of the invention. If biotin is used as a label, the signal can be easily detected with streptavidin and luciferase if luciferase is used.
  • Cancer can be diagnosed by analyzing the final signal intensity by the above-described immunoassay process. That is, if the immunoassay signal is stronger in the biological sample than the normal biological sample (eg, normal tissue, blood, plasma or serum) by nucleic acid aptamer binding of the present invention, the cancer is diagnosed.
  • the normal biological sample eg, normal tissue, blood, plasma or serum
  • Cancer cell binding composition comprising a nucleic acid aptamer of the present invention can specifically target the cancer by binding specifically to the cancer cells, by binding the cancer treatment material to the nucleic acid aptamer specifically to cancer cells or tissues It can deliver a substance for treating cancer. Therefore, it is apparent to those skilled in the art that the composition for cancer cell binding comprising the nucleic acid aptamer of the present invention can be provided as a composition for treating cancer.
  • the cancer treatment substance that can be applied to the nucleic acid aptamer of the present invention may use various cancer treatment substances known in the art, and preferably, by attaching aptamer to the surface of liposomes or nanoparticles, liposomes or nanoparticles
  • Anticancer agents, toxins, cancer growth inhibitory genes, small interfering RNA (siRNA), ⁇ , etc., which are mounted inside the particles, may be specifically transmitted to cancer cells or tissues.
  • Known suicides such as cancer specific drugs known to the nucleic acid aptamers of the present invention, toxins and anticancer agents that induce cancer cell death, or HSV-TK (Herpes simplex virusthymidine kinase), cytosine deaminase (CD), etc.
  • siRNA small interfering RNA
  • the present invention can be provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid aptamer (aptamer-siRNA conjugate: Silence. 1; 1 (1): 4 (2010), Zhou J, Rossi JJ .; aptamer ⁇ toxin conjugate: Cancer Res. 15; 66 (12): 5989 ⁇ 92 (2006), Chu
  • AD Levy M .; aptamer-1 iposome: Chem CommuniZm) 14; 46 (2): 249-51 (2010) Epub 2009 Nov 23.
  • composition of the present invention when the composition of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbet, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cells. Loose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, a sorbidextr, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or transdermal administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction in response to the patient. Typically, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily inspected by those skilled in the art.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axes, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides a kit for pancreatic cancer stem cell detection.
  • the pancreatic cancer stem cell detection kit of the present invention is preferably a kit for immunoassay (i ⁇ unoassay), more preferably a luminex assay kit or EL0NA kit.
  • kits for immunoassay i ⁇ unoassay
  • luminex assay kit or EL0NA kit examples include immunochromatography strip kits, luminex assay kits, protein microarray kits, eliza kits, or immunological dot kits. kind is not limited.
  • the kit may further include the necessary elements necessary to perform EL0NA.
  • the EL0NA kit includes nucleic acid aptamers specific for pancreatic cancer cancer stem cells.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention is an aptamer having high specificity and affinity for pancreatic cancer stem cells and having little cross reaction to other cells.
  • the EL0NA kit can also include aptamers specific for the control protein.
  • Other EL0NA kits can bind to reagents capable of detecting bound aptamers, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with antibodies) and their substrates or antibodies. Other substances, and the like.
  • pancreatic cancer stem cells can be detected by determining whether antigen-aptamer complex formation is increased.
  • the term “antigen-aptamer complex” refers to a combination of pancreatic cancer stem cells and aptamer specific thereto, and the amount of antigen-aptamer complex formed through the magnitude of a signal of a detection label. It can be measured quantitatively.
  • detection labels include enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials and microparticles.
  • microparticles redox molecules and radioisotopes may be selected from, but are not necessarily limited to.
  • the available enzymes include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholine Esterases, glucose oxidases, nucleokinases and GDPases, RNases, glucose oxidases and luciferases, phosphofructokinases, phosphoenolpituate carboxylase, aspartate aminotransferases, phosphphenolpyruvates Decarboxylase, ⁇ -latamase and the like, but are not limited thereto.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein isothiocyanate Rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin allophycocyanin, 0-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8 , [0s (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [M0 (CN) 8 ] 4, and the like.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 C1, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 1, 186 Re, and the like. .
  • EL0NA is a direct EL0NA using a labeled aptamer that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect EL0NA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an aptamer that recognizes an antigen attached to a solid support, a solid support Direct sandwich EL0NA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the attached aptamer and antigen, reaction with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the aptamer and antigen attached to the solid support. And various EL0NA methods such as indirect sandwich EL0NA using labeled secondary antibodies.
  • 3 ⁇ 4 tammer is attached to the solid support and the sample is reacted, followed by enzymatic coloration or antigen-antibody by attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen -3 ⁇ 4 tar complex.
  • Detection is performed by a sandwich EL0NA method in which a labeled secondary antibody is attached to an antibody that recognizes an antigen of the complex and enzymatically developed.
  • pancreatic cancer enjoyment cells and aptamer complexes can be confirmed by the presence of pancreatic cancer stem cells.
  • the present invention provides a pancreatic cancer diagnostic or prognostic composition comprising a nucleic acid aptamer.
  • prognosis in the context of the present invention encompasses the predictive process of disease progression, in particular in terms of the degree of disease, the regeneration of the disease, tumor recurrence, metastasis and the likelihood of death.
  • the prognosis in the present invention means that the disease of the pancreatic cancer patient is cured.
  • the invention provides a method for detecting cancer stem cells comprising the following steps:
  • nucleic acid aptamer of 43-100 nucleotides in length comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7;
  • step (b) detecting the nucleic acid aptamer-cell binding reaction in the product of step (a).
  • the cancer stem cell detection method of the present invention can be used for any kind of cancer as long as it has cancer stem cells.
  • the cancer is pancreatic cancer.
  • the term "biological sample” refers to all samples obtained from the human body or mammal, such as tissues, cells, blood, serum, plasma, lymph, bone marrow fluid, saliva, milk, urine, feces, ocular fluid, semen, brain extracts. , Spinal fluid, joint fluid, thymus fluid, ascites, amniotic fluid and cellular tissue fluid, but are not limited thereto.
  • the detection of step (b) may use any method known in the art as long as it can detect nucleic acid aptamer—cell binding reaction. Since the method of the present invention uses the aptamer described above, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the invention provides a method for diagnosing or prognosticing a cancer comprising the following steps:
  • nucleic acid aptamer having a length of 43-100 nucleotides comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7;
  • step (b) detecting the nucleic acid aptamer-cell binding reaction in the product of step (a).
  • the cancer diagnosis or prognosis determination method of the present invention can be used for any kind of cancer as long as it has cancer cells.
  • the cancer is pancreatic cancer.
  • the present invention relates to a nucleic acid aptamer and its use comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7 sequences.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention has the property of specifically binding to cancer cells, particularly pancreatic cancer stem cells. Accordingly, the nucleic acid aptamers of the present invention can be used for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer as well as for diagnosis and target of cancer.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention may be substituted for pancreatic cancer-binding antibodies used for pancreatic cancer diagnosis, and is expected to be able to diagnose pancreatic cancer more quickly and economically.
  • Figure 1 is in the process of screening cancer stem cell-specific aptamers It is a schematic diagram.
  • Figure 2 is a graph showing the results of positive selection of aptamers binding to the human pancreatic cancer cell line HPAC sphere.
  • Figure 4 is a diagram showing the result of comparing the homology to the nucleotides of SEQ ID NO: 6 to 27 sequences.
  • 5 is a diagram showing the secondary structure prediction results of the nucleotides of SEQ ID NO: 28 to 49 sequence.
  • Figure 6 is a graph showing the result of measuring the binding affinity sensitivity of nucleic acid aptamers to pancreatic cancer cell line using flow cytometry.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding specificity measurement results of nucleic acid aptamers on pancreatic cancer cell lines using flow cytometry.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding affinity measurement results of nucleic acid aptamers using fluorescence immunostaining.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results confirmed by performing the RT-PCR molecular properties of the cells isolated by aptamers.
  • FIG. 10 is a diagram showing the binding pattern of the pancreatic cancer cancer stem cell marker and aptamer. '
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of sphere formation ability test of aptamer-specific pancreatic cancer cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing the detection results of aptamer-specific circulating cancer cells.
  • FIG. 13 shows the results of detecting 3 ⁇ 4timer-specific microparticles.
  • the initial pool contained 7 ⁇ 10 13 molecules.
  • Primers for PCR amplification are as follows.
  • Human pancreatic cancer cell line Hpac is available from the AT XAmerican Type Culture Collection;
  • Manassas, VA Manassas, VA and cell lines were cultured in growth medium by the protocol presented by ATCC (DMEM / Ham F12 (D / F12; Invitrogen Gibco) with 103 ⁇ 4 »FBS).
  • Pancreatic cancer HPAC cells were cultured for E. coli (10 ng / ml; R & D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF (10 ng / l, R & D Systems Inc.), lXlTS (insul in transferring selenium, Gibco) for sphere culture.
  • N40 single-stranded DNA (hereinafter referred to as ssDNA) library was denatured in binding buffer (4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2 , PBS containing 0.1 mg / ml yeast tRNA and 1 mg / ml BSA) at 95 ° C. for 5 minutes. And then popped on ice. Then, HPAC spheres were isolated into single cells by treatment with protein-preserved accutase (accutaseKsigma). After 45 minutes of treatment of the library with the cells at 4 ° C., the unbound sequences were washed with complete solution (4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2) .
  • binding buffer 4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2 , PBS containing 0.1 mg / ml yeast tRNA and 1 mg / ml BSA
  • the positive screening process was performed 11 times, and cancer cells having low cancer stem cell capacity (cd44— / cd24 ⁇ / esa-) were separated through flow cytometry (FIG. 3), followed by two negative screening processes.
  • two negative screening processes were performed for normal pancreatic cell lines, HPDE and hYGIC6. The positive screening process was carried out alternately.
  • the positive screening process was performed 13 times, and the negative screening process was performed 4 times.
  • aptamers 1, 154, 163, 27, and 39 had similar sequences and their secondary structures were also very similar.
  • 23, 146, 19, 25, 28, 132F, and 1 were also predicted to have similar nucleotide sequences and secondary structures.
  • the secondary structure of the aptamer was predicted by the m-fold program.
  • 5 'FAM labeled aptamers were used to measure binding affinity through fluorescence detection.
  • Aptamers were prepared at concentrations of 10, 25, 50, 100, 150 and 200 nM on conjugation buffer for FACS (4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2> 1 mg / ml BSA, PBS with 10% FBS). After preparation, the reaction was repeated for 45 minutes with the same amount of HPAC sphere. After two washes, the whole live Among the cells, the cells with 3 ⁇ 4 timer attached were shown in a graph.
  • Example 6 Determination of Dissociation Constants for Pancreatic Cancer Cell Lines by Equilibrium Filtration The binding assay was equilibrated for 39, 19, 40, 23, 25, 15, 108 and 1, 146 aptamers with high copy numbers. Was performed by. In other words, each aptamer was incubated with a cell line of 5 ⁇ 10 6 at a concentration range of 10 nM to 200 ⁇ , and then the binding reaction was shown graphically. Using prism 4.0 software to calculate dissociation constants, the percentages of ssRNA concentration versus pancreatic cancer cell lines bound in the following equilibrium were plotted and the data points were fixed by nonlinear regression analysis.
  • Example 7 Confirmation of binding specificity for pancreatic cancer cell lines using flow cytometry The binding specificity was confirmed through fluorescence detection in the same manner as in the sensitivity experiment. 5 'FAM labeled aptamer was added to 10, 25, 50, 100, 150; on conjugated complete solution for FACS (4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2 , 1 mg / ml BSA, PBS containing 10% FBS). Aptamers were prepared at a concentration of 200 nM and reacted with the same amount of HPAC spheres or HPDE cells for 45 minutes. Thereafter, after washing twice, the aptamer-attached cells in the total living cells were proportionally graphed through a flow cytometer. The experiment was repeated three times (FIG. 7).
  • Example 8 Fluorescence Immunostaining
  • 5 'TAMRA labeled aptamer was used to measure binding affinity through fluorescence detection.
  • Example 9 Characteristics of Stem Cells in Aptamer Specific Cancer Cells
  • HPAC cells were isolated by flow cytometry 1, 146 aptamers and stem cell characteristics of cancer cells attached to aptamers compared to cancer cells not attached to aptamers at the RNA level by RT-PCR technique (FIG. 9).
  • the embryonic stem cell-related genes oct4 and nanog were increased, and the hedgehog-related gene, which is one of cancer stem cell-related signals, was also increased, and the expression of known cancer stem cell markers, cd44, cd24 and c-met genes, was also increased. there was.
  • the aptamer developed based on these results is expected to specifically recognize cancer cells with stem cell characteristics.
  • CD24 CD44, which have been previously published as markers of pancreatic cancer stem cells
  • Fluorescence detection was performed to confirm the correlation between EpCAMCBD biosciences), CD133 (Miltenyi biotech) and aptamers.
  • Nuclei were stained with Hoechst33342 and CD24, CD44, EpCAM and FVIII labeled Aptame or 146 labeled with PE were used.
  • conjugated monolayer solution 4.5 g / L glucose, 5 mM MgCl 2 , 1 mg / ml BSA, 10% FBS in PBS
  • PE-labeled CD24, CD44, EpCAM Antibodies and FAM-labeled aptamers No. 1 or No. 146 were incubated at 37 ° C. for 45 min in binding buffer at a concentration of 200 ⁇ and then washed twice quickly with washed complete solution.
  • aptamer 1 positive cells formed larger and more spheres than the aptamer negative cells (FIG. 11).
  • Example 12 Detection of Aptamer Specific Circulating Tumor Cells
  • Circulating Tumor Cells were isolated by using an Oncoquick tube of 15 ml of blood from metastatic cancer patients derived from pancreatic cancer. Cy5 labeled aptameburn was coupled to the isolated CTCs in order to ensure the detection of CTCs through cancer stem cell specific aptamers.
  • FITC binding cytokeratin which proves to be epithelial cells in blood, was simultaneously stained with PE binding EpCAM, CD24 or CD133 to confirm cancer stem cell characteristics.
  • Aptamer was tested by plasma removal of blood cells from peripheral blood components obtained from normal and pancreatic cancer patients to determine the possibility of early diagnosis of pancreatic cancer.
  • the number of microparticles was confirmed by flow cytometry for easy testing in plasma.
  • a 10 ⁇ -derived human plasma was suspended in annexin V-binding solution (BD biosciences), and APC-bound annexin V (BD biosciences), a microparticle marker, was combined with aptamer No. 1 (normal value 64.5).
  • aptamer No. 1 normal value 64.5

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포 특히 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 암의 진단 및 표적뿐만 아니라, 췌장암의 진단 또는 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 췌장암 진단에 활용되고 있는 췌장암 결합 항체를 대체할 수 있으며, 췌장암을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 [기술분야】
본 특허출원은 2012년 08월 09일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0087272 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
췌장암은 5년 생존율이 1-4¾， 증앙생존기간 5개월에 이르는 치명작인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 80-90% 환자에서 진단 시 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 극히 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다. 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실， 젬시타빈, 타르세바를 포함한 몇몇 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반웅율은 15% 내외에 불과하여 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 새로운 치료법 개발이 필요하다.
항암치료에도 불구하고 생존하여 암의 재발 또는 악화의 원인이 되는 암 줄기세포는 자가 재생, 분화, 증식의 줄기세포 특징을 가지며 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라， 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고되었다 (1). 따라서， 암의 조기진단 및 근본적인 치료를 하기 위해서는 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지， 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 할 것이다.
백혈병을 시작으로 장기별로 암 줄기세포 표적 치료와 진단을 위하여 분자적 특징 (molecular character ist ics)을 규명하는 연구가 진행 중이며 (2) 그 중에서도 췌장암에서는 두 종류의 암 줄기세포 마커군이 발표되었지만 (3， 4) 반박논문이 나오는 등 (5) 아직 췌장암에서 암줄기세포로 규정할 수 있는 확실한 표지자에 대해서는 좀 더 연구가 필요하다.
암 줄기세포를 규명하려는 끊임없는 노력에도 불구하고 논란이 지속되는 이유는 현재 암 줄기세포를 규명하기 위한 유일한 접근이 수술을 통해 제거된 조직을 이용하여 암 줄기세포 표지자 가능성이 있는 특정 단백질 양성 세포 분획을 SCID-nod 마우스에 이식하여 표지자 양성 및 음성 군 사이에 종양성장속도를 비교하는 연구에 기초하고 있기 때문이다. 따라서， 단순히 암 줄기세포 표지자를 규명하는 데에서 벗어나 줄기세포의 특성을 가지는 암세포를 아우르는 새로운 표적 규명이 절실히 필요하다. 분자적 특징을 제외하고 암 줄기세포를 표적화하는 작업으로 물리적, 구조적 특징을 기반으로 타켓과 결합하는 앱타머가 신개념 표적이 될 수 있다. 앱타머는 단일가닥의 을리고 핵산 또는 펩타이드 분자로서 화학물질， 단백질 그리고 세포까지 다양한 물질에 특이적으로 결합하는 특징적 서열을 의미한다. 앱타머는 흔히 항체와 비교되며 비교적 합성이 용이하고 값이 저렴하며 실온에서 사용 가능한 장점을 지니고 있다. 앞선 장점들과 생체친화적인 점 때문에 암의 진단 및 치료목적으로도 이미 널리 연구되고 있다 (6). 그 예로써 유방암 암 줄기세포 마커인 HER2에 특이적인 앱타머 (7)가 개발되었으며 암에서 역할이 규명된 단백질을 인식하는 앱타머 등이 있다 (8). 이밖에도 앱타머로 진단， 약물전달체, in vivo이미징으로의 가능성을 타진한 연구도 활발히 진행되고 있다 (9-13).
앱타머는 복합 타겟, 즉 살아있는 세포 및 조직에 대해 cell-SELEX 기법을 이용하여 얻을 수 있는데, cell-SELEX 기법은 표면 마커 타겟이 알려져 있지 않을 때조차도, 질환 세포에 대한 앱타머를 개발할 수 있는 장점이 있다. 더욱이, 분리된 상태에서는 그 본래의 특성을 나타내지 않을 수도 있어 생리적 상태에 있는 타겟 단백질은 선별과정에서 더 기능적인 접근을 가능하게 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 암의 진단을 위해 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 개발하기 위해.연구 노력하였다. 그 결과, 서열목톡 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머가 암 세포 특히 암 줄기세포에 특이적으로 결합한다는 것을 규명하였고， 이들 앱타머를 포함하는 조성물을 이용하면 암을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 게 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포 결합용 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단 또는 예후판단 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 제공한다. 본 발명자들은 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머가 암 세포 특히 암 줄기세포에 특이적으로 결합한다는 것을 규명하였고， 이들 타머를 포함하는 조성물을 이용하여 암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 "핵산 앱타머" 는 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하며， 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 변형체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "을리고뉴클레오타이드" 는 일반적으로 길이가 약 200개 미만인 뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보 뉴클레오타이드， 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및 /또는 이들의 유사체， 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반웅에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 증단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드， 아미노산, 폴리펩타이드， 세포 표면상의 마커분자， 이온, 금속， 염， 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponent i a 1 Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990； 및 Tuerk et al. , Science 249， 505—10， 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, W0 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al ..Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656—665 (1995)， W0 99/54506, 0 99/27133, W0 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
SELEX는 무작위 서열 (randomized sequences)로 구성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀 (pool) 또는 라이브러리를 필요로 한다. 올리고뉴클레오타이드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 흔성체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 풀은 100¾> 무작위 또는 부분적 무작위 을리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및 /또는 보존 서열이 무작위 서열 부위에 포함된 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 5' 및 /또는 3' 말단이 올리고뉴클레오타이드 풀의 모든 분자에서 공유되는 서열로 구성될 수 있는 적어도 하나의 고정된 서열 및 /또는 보존 서열을 포함하는 무작위 또는 부분적 무작위 을리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레이타이드 풀은 바람직하게는 무작위 서열 부분뿐 만 아니라 효과적인 복제를 위해 필수적인 고정된 서열 (fixed sequences)을 포함한다. 초기 풀의 올리고뉴클레오타이드는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 포함하는데 그 내부에 35-50개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된다. 무작위 뉴클레오타이드는 화학적 합성 및 무작위로 절단된 세포 내 핵산으로부터 선택함으로써 생산할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 무작위 서열 부분은 어떠한 길이일 수 있고， 리보뉴클레오타이드 및 /또는 디옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 변형 또는 변형되지 않은 자연형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그일 수 있다 (U.S. Patent No. 5,958,691； U. S. Patent No. 5,660,985； U.S. Patent No. 5,958,691； U.S. Patent No. 5,698, 687； U.S. Patent No. 5,817, 635； U.S. Patent No. 5,672,695, 및 PCT Publication W0 92/07065) . 무작위 을리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르 -연결 뉴클레오타이드로부터 합성할 수 있다 (Froehler et al . , Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986), Froehler et al . , Tet. Lett. 27:5575-5578(1986)). 또한， 무작위 을리고뉴클레오타이드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 액체상 방뉩을 이용하여 합성할 수 있다 (Sood et al. , Nucl. Acid Res. 4:2557(1977), Hirose et al .， Tet. Lett. , 28:2449(1978)).
올리고뉴클레오타이드 초기 라이브러리는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예컨대, 초기 라이브러리로서 RNA 라이브러리가 이용될 경우， 상기 RNA 라이브러리는 T7 RNA 중합효소 또는 변형된 T7 RNA 중합효소를 이용하여 DNA 라이브러리를 인 비트로상에서 전사시킴으로써 생산한다. RNA 또는 DNA 라이브러리는 적절한 결합 조건하에서 타겟과 흔합하고， 결합 친화성 및 선별성 기준을 달성하기 위해 일반적인 선별 과정에 따라 결합， 분리 및 증폭 과정을 반복한다.
보다 상세한 SELEX 방법은 다음과 같다:
(a) 핵산 라이브러리를 적절한 결합 조건하에서 타겟과 접촉시킨다;
(b) 타겟 분자에 특이적으로 결합한 핵산 및 결합하지 못한 핵산을 분리한다; (c) 핵산 -타겟 복합체를 해리시킨다; (d) 핵산 -타겟 복합체로부터 분리된 핵산을 증폭시킨다; 및 (e) 타겟 분자에 대해 높은 특이성 및 친화성을 갖는 핵산을 수득하기 위해 상기 결합, 분리 및 증폭 과정을 반복한다.
RNA 앱타머를 선별하는 방법은 상기 SELEX 방법 단계 (d)에서 증폭하기 전에 핵산 -타겟 복합체로부터 분리된 핵산을 역전사시키는 단계 및 재시작에 앞서 단계 (d)에서 증폭된 핵산을 전사시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 핵산 앱타머는 화학적으로 변형된 형태를 포함할 수 있다. 일반적으로, 화학적 변형을 가지고 있지 않은 야생형 RNA 나 DNA 분자들은 핵산 분해효소에 의한 분해 (degradation)에 취약하다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 당업계에 공지된 다양한 핵산 분해효소 저항성을 부여하는 어떠한 형태의 화학적 변형을 도입할 수 있다. 바람직하게는 화학적 변형에는 2' -아미노 피리미딘， 2' -플루오르 피리미딘， 2' -0-메틸 리보오스 퓨린 및 피리미딘 등이 있으며, 백본 (backbone)의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변형하는 방법이 있다. 2' -플루오르나 2' — 0-메틸 변형의 경우는 이들 변형된 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 이용하여 인 비트로 전사를 수행할 수 있는 돌연변이 RNA 중합효소들이 존재함으로 이들을 이용하여 SELEX 과정에서부터 화학적 변형을 도입할 수 있다. 한편， 두 뉴클레오타이드의 3' -말단을 3' -3' 연결시킴으로써 3' -말단을 캡핑 (capping)하여 핵산 분해효소에 대한 저항성을 증가시킬 수 있으며， 고분자로서 PEG(polyethyleneglycol)을 부착하여 신장 여과 (renal filtration) 속도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는.핵산 앱타머의 뉴클레오타이드 길이는 바람직하게는 43-100개이고， 보다 바람직하게는 43-90개이며, 보다 더 바람직하게는 43-85개이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 핵산 앱타머가 RNA인 경우， 상기 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열에 기재된 티미딘은 우라실로 대체될 수 있다. 서열목톡 게 1서열 내지 제 5서열에 기재된 서열에서 'V은 아데닌 (adenine, a), 구아닌 (guanine, g)， 시토신 (cytosine, c), 티민 (thymine, t) 및 우라실 (uracil, u)로 구성된 군으로부터 선택되는 어떠한 뉴클레오타이드일 수 있다.
바람직하게는 서열목록 제 1서열은 서열목록 제 8서열, 서열목록 제 9서열, 서열목톡 제 10서열， 서열목록 제 11서열 또는 서열목록 제 12서열이고， 서열목톡 제 2서열은 서열목록 제 13서열， 서열목록 제 14서열, 서열목록 제 15서열， 서열목록 제 16서열， 서열목록 제 17서열， 서열목록 제 18서열， 서열목록 제 19서열， 서열목록 제 20서열 또는 서열목록 제 21서열이며, 서열목톡 제 3서열은 서열목록 제 22서열 또는 서열목록 제 23서열이고， 서열목톡 게 4서열은 서열목록 제 24서열 또는 서열목록 제 25서열이며, 서열목톡 게 5서열은 서열목록 제 26서열 또는 서열목록 제 27서열이다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이 (특히 앱타머의 2차 구조에 대한 실시예 4)， 서열목록 제 1서열 내지 제 27서열에 기재된 앱타머는 본 발명의 앱타머가 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 데 필요한 필수적인 서열이다. 이러한 필수적 서열을 포함하는 한， 본 발명의 앱타머는 암 줄기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖게 된다. 따라서， 본 발명은 서열목록 제 1서열 내지 제 27서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 모든 핵산 앱타머를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 앱타머는 상기 핵산 앱타머는 서열목록 제 28서열 내지 제 49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머이다. 서열목록 제 28서열 내지 제 43서열 및 제 45서열 내지 제 49서열의 뉴클레오타이드는 서열목록 제 6서열 내지 제 23서열 및 제 25서열 내지 제 27서열의 뉴클레오타이드 서열 5' 말단에 5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3 ' 및 3' 말단에 5' -TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3 ' 서열의 뉴클레오타이드가 추가적으로 결합되어 있는 뉴클레오타이드이며, 서열목록 제 44서열의 뉴클레오타이드는 서열목톡 제 24서열의 뉴클레오타이드 서열 5' 말단에 5' - AAGGAGCAGCGTGGAGGATC-3 ' 및 3' 말단에 5' -TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT- 3' 서열의 뉴클레오타이드가 추가적으로 결합되어 있는 뉴클레오타이드이다. 서열목록 제 28서열 내지 제 49서열의 뉴클레오타이드의 5' 말단 및 3' 말단에 추가적으로 결합될 수 있는 상기 뉴클레오타이드 서열은 핵산 라이브러리 합성 및 핵산 앱타머 선별을 위해 도입된 서열로 PCR에 있어서 프라이머 서열로 이용할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물을 제공한다 . 상기 암 세포는 바람직하게는 암 줄기세포 또는 췌장암 세포이고, 보다 바람직하게는 췌장암 암 줄기세포이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포에 특이적으로 결합하는데, 상기 핵산 ¾타머는 암 세포와 암 줄기세포를 구별할 수 있는 능력, 즉 암 세포와 비교하여 암 즐기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 특징을 갖는다. 본 발명의 핵산 앱타머는 암의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며， 암의 진단 및 표적에 이용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "진단" 은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis) (예컨대， 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정， 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반웅성 결정)를 판정하는 것， 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예컨대， 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진단은 종래의 면역분석 (immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 조금 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대， 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 앱타머를 사용하고， 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. '예를 돌어， ELISA( enzyme- 1 inked immunosorbant assay)는 ELONACenzyme- linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.
상기 본 발명에 적용될 수 있는 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석， 방사능면역침전， 면역침전, 면역조직화학염색， EL ISA (enzyme- linked immunosorbant assay) , 캡처 -ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석， 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다ᅳ 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Maggio, E.T. Enzyme- Immunoassay. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc. (1980)； Gaastra, W. , Enzyme- 1 inked immunosorbent assay(ELISA) , in Methods in Molecular Biology, Vol. 1， Walker, J.M. ed. , Humana Press, NJ(1984); 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되.어 있으며 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어， 본 발명의 암의 진단 또는 표적이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소 (예컨대， Cw, I125， P32 및 S35)로 레이블링된 핵산 앱타머가 암 세포를 검출 또는 표적화하는데 이용될 수 있다. 또한， 당업계에 공지된 다양한 표지자를 본 발명의 핵산 앱타머에 레이블링하여 암 세포를 진단 또는 표적화 하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 진단이 EL0NA 방식으로 실시되는 경우， 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 효소가 결합된 앱타머와 상기 세포 분해물을 반웅시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머 (예컨대， 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 ¾타머에 결합된 효소는 발색반응, 형광반웅， 발광반응 또는 적외선 반웅을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 , 알칼린 포스파타아제， β-갈락토시다아제 , 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 루시퍼라아제 및 사이토크름 Ρ450을 포함한다. 상기 앱타머에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는， 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (ΝΒΤ), 나프를 -AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-Bl-phosphate)' 및 ECF(enhanced chemi fluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고， 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프를, 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스 -N—메틸아크리디늄 니트레이트) 레소루핀 벤질 에테르， 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸—3， 7- 디하이드톡시페녹사진), HYR ( p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol ) , TMB(tetramethylbenzidine) , ABTS (2,2 '-Azine-di [3-ethylbenzthiazol ine sulfonate]), o—페닐렌디아민 (OPD) 및 나프를 /파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 진단이 캡처 -EL0NA 방식으로 실시되는 경우 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획 앱타머 (capturing aptamer)로서 본 발명의 앱타머를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (Π) 포획 앱타머와 시료를 반웅시키는 단계; (iii) 상기 단계 ( )의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체 (detecting antibody)와 반웅시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예컨대， 바이오틴)， 효소 (알칼린 포스파타아제， -갈락토시다아제， 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크름 Ρ450), 방사능물질 (예컨대, C14, I125, Ρ32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신)， 발광물질， 화학발광물질 (chemi luminescent ) 및 FRET( f luorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 EL0NA방법 및 캡처 -EL0NA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 핵산 앱타머의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로， 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉， 생물학적 시료에서 본 발명의 핵산 앱타머 결합에 의해 면역분석 시그널이 정상 생물학적 시료 (예컨대, 정상 조직, 혈액， 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물은 암 세포에 특이적으로 결합하여 암을 표적화 할 수 있으며， 상기 핵산 앱타머에 암 치료용 물질을 결합하면 암 세포 또는 조직에 특이적으로 암 치료용 물질을 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 암 세포 결합용 조성물이 암 치료를 위한 조성물로 제공될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명하다.
본 발명의 핵산 앱타머에 적용할 수 있는 암 치료용 물질은 당업계에 공지된 다양한 암 치료용 물질을 이용할 수 있으며， 바람직하게는 앱타머를 리포좀이나 나노입자의 표면에 부착함으로써， 리포좀 또는 나노입자 내부에 탑재된 항암제 , 톡신， 암 성장 저해 유전자， siRNA(small interfering RNA) , ΡΝΑ 등을 암 세포 또는 조직 특이적으로 전달할 수 있다. 본 발명의 핵산 앱타머에 공지된 암 특이적 약물, 암세포 사멸을 유도하는 톡신 및 항암제， 또는 HSV-TK(Herpes simplex virusthymidine kinase) , 사이토신 데아미네이즈 (cytosine deaminase, CD) 등과 같은 공지된 자살 유전자， 또는 췌장암 성장 및 전이에 중요한 역할을 하는 유전자의 발현을 저해하는 siRNA(small interfering RNA)를 직접 부착하여 암 세포주로 전달할 수 있는바, 본 발명은 상기 핵산 압타머를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다 (aptamer-siRNA conjugate: Silence. 1; 1(1) :4(2010)， Zhou J, Rossi JJ.； aptamerᅳ toxin conjugate: Cancer Res. 15 ;66(12) :5989一 92(2006), Chu
TC, Marks JW 3rd, Lavery LA, Faulkner S, Rosenblum MG, El 1 ington
AD, Levy M.； aptamer-1 iposome: Chem CommuniZm ) 14;46(2) :249-51(2010) Epub 2009 Nov 23. Kang H, 0'Donoghue MB, Liu H, Tan W. ) .
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우， 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비틀， 만니를, 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciencesi 19th ed. , 1995 )에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입， 근육 주입 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령， 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실사할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제, 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 본 발명의 췌장암 암 줄기세포 검출용 키트는 바람직하게는 면역분석 (i隱 unoassay)용 키트이며， 보다 바람직하게는 루미넥스 분석 .키트 또는 EL0NA 키트이다. 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트， 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 EL0NA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. EL0NA 키트는 췌장암 암 줄기세포에 대한 특이적인 핵산 앱타머를 포함한다. 본 발명의 핵산 앱타머는 췌장암 암 줄기세포에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 세포에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 앱타머이다. 또한 EL0NA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 앱타머를 포함할 수 있다. 그 외 EL0NA 키트는 결합된 앱타머를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면, 표지된 2차 항체， 발색단 (chromophores), 효소 (예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
상기 분석 방법돌을 통하여， 대조군에서의 항원-앱타머 복합체의 형성량과 췌장암 암 줄기세포를 포함하는 시료에서의 항원—엽타머 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 항원-앱타머 복합체 형성량을 비교하여 항원- 앱타머 복합체 형성 증가 여부를 판단하여, 췌장암 암 줄기세포를 검출할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-앱타머 복합체 "는 췌장암 암 줄기세포와 이에 특이적인 앱타머의 결합물을 의미하고, 항원-앱타머 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소， 형광물, 리간드, 발광물， 미소입자
(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， β-D- 글투코시다제， β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제， 글루코즈 옥시다제, 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제， 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피투베이트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제， β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신 이소티오시아네이트ᅳ 로다민 , 피코에리테린， 피코시아닌 알로피코시아닌, 0-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센， 루테늄 착화합물， 바이을로젠, 퀴논, Ti 이온， Cs 이온， 디이미드， 1，4-벤조퀴논， 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [0s(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [M0(CN)8]4등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 1311, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
췌장암 암 줄기세포의 검출은 바람직하게는， EL0NA을 이용하는 것이다. EL0NA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 앱타머를 이용하는 직접적 EL0NA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 앱타머의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 EL0NA, 고체 지지체에 부착된 앱타머와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 EL0NA, 고체 지지체에 부착된 앱타머와 항원의 복합체에서 항원올 인지하는 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 EL0NA 등 다양한 EL0NA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 ¾타머를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원 -¾타머 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 EL0NA 방법에 의해서 검출한다. 췌장암 암 즐기세포와 앱타머의 복합체 형성 정도를 확인하예 췌장암 암 줄기세포 존재 여부를 확인할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예후" 는 질병의 진행 가능성 과정 특히， 질병의 차도， 질병의 재생, 종양 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는， 본 발명에서의 예후는 췌장암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 줄기세포를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉 (contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 핵산 앱타머 -세포 결합 반웅을 검출하는 단계 .
본 발명의 암 줄기세포 검출 방법은 암 줄기세포를 갖는 한 어떤 종류의 암에도 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 암은 췌장암이다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료" 는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대， 조직， 세포, 혈액， 혈청, 혈장, 림프， 골수액， 타액， 우유， 소변, 분변, 안구액, 정액， 뇌 추출물, 척수액， 관절액， 흉선액, 복수， 양막액 및 세포 조직액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한， 본 발명에서 상기 단계 (b)의 검출은, 핵산 앱타머—세포 결합 반웅을 검출할 수 있는 한 당업계에 알려진 어떠한 방법도 이용할 수 있다. 본 발명의 방법은 상술한 앱타머를 이용하기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성올 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 진단 또는 예후 판단 방법을 제공한다:
(a) 서열목록 계 1서열 내지 게 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉 (contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 핵산 앱타머 -세포 결합 반응을 검출하는 단계 .
본 발명의 암 진단 또는 예후 판단 방법은 암세포를 갖는 한 어떤 종류의 암에도 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암이다.
본 발명의 방법은 상술한 앱타머를 이용하기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 서열목톡 게 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 핵산 앱타머는 암 세포 특히 췌장암 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 암의 진단 및 표적뿐만 아니라 췌장암의 진단 또는 예후 판단 용도로 사용될 수 있다.
(c) 본 발명의 핵산 앱타머는 췌장암 진단에 활용되고 있는 췌장암 결합 항체를 대체할 수 있으며， 췌장암을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 암 줄기세포 특이적인 앱타머를 선별하는 과정에
Figure imgf000018_0001
모식도이다. 도 2는 인간 췌장암 세포주 HPAC 스피어에 결합하는 앱타머를 양성 선별한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은. 암 줄기세포 능력이 적은 암세포 (cd44-/cd24-/esa-)에서 앱타머를 음성 선별하여 분리한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 서열목톡 제 6서열 내지 제 27서열의 뉴클레오타이드에 대한 상동성을 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 서열목록 제 28서열 내지 제 49서열의 뉴클레오타이드의 2차 구조 예측 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 핵산 앱타머의 결합 친화도 민감도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 핵산 앱타머의 결합 특이도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 형광면역염색법을 이용한 핵산 앱타머의 결합 친화도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 앱타머로 분리한 세포의 분자적 특성을 RT-PCR을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10욘 췌장암 암줄기세포 마커와 앱타머의 결합양상을 나타낸 그림이다. '
도 11은 앱타머 특이 췌장암 세포의 구 형성능 시험 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 앱타머 특이 혈증순환암세포 검출 결과를 나타낸 그림이다. 도 13은 ¾타머 특이 마이크로파티클 검출 결과를 나타낸 그림이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: ssDNA라이브러리 및 PCR증폭을 위한 프라이머의 준비 다음의 서열을 가지는 랜덤한 ssDNA 라이브러리를 화학적으로 합성하고 PAGE로 분리하였다. 5' — MGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40- TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3 '
초기 풀은 7X1013 분자를 포함하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머: 5' FAM-AAG GAG CAG CGT GGA GGA TA-3'
역방향 프라이머: 5' A20-C18-ACC ACG ACG ACA CCA CCT AA-3' 실시예 2: 세포배양 및 준비
인체 췌장암 세포주 Hpac는 AT XAmerican Type Culture Collection;
Manassas, VA)로부터 구입하였으며， ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다 (10¾» FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco)). 스피어 (Sphere) 배양을 위하여 췌장암 HPAC 세포를 EGF(10 ng/ml， R&D Systems Inc. , Minneapolis, ΜΝ), bFGF(10 ng/ l , R&D Systems Inc.), lXlTS(insul in transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보층한 혈청 프리 DMEM/F12 배지에 1000 세포 /m£의 비율로 T75 울트라 로우 클러스터 플레이트 (Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7일 동안 배양하였다. 인체 정상 췌장 세포주 HPDE는 케라티노사이트 (invitrogen Gibco)에서 배양하였으며 인체 정상 췌장 세포주 hYGIC6는 실험실 내에서 자체적으로 구축한 정상 세포주로 10¾> FBS를 포함하는 waymouth에서 배양하였다. 실시예 3: HPAC스피어에 특이적으로 결합하는 앱타머의 선별 (cell-SELEX) 인간 췌장암 세포주인 HPAC 스피어에 대하여 양성선별을 수행하되 , 5, 9번째 라운드에서는 초기 계대배양 세포를 키워 수행하였다. N40 단일가닥 DNA (이하 ssDNA) 라이브러리를 95°C에서 5분간 결합 완충용액 (4.5 g/L 글루코오스， 5 mM MgCl2, 0.1 mg/ml 효모 tRNA 및 1 mg/ml BSA를 포함하는 PBS)에서 변성시킨 다음, 얼음상에 급넁시켰다. 그 다음， HPAC 스피어를 단백질이 보존 가능한 아큐타아제 (accutaseKsigma)를 처리하여 단일세포로 분리하였다. 상기 라이브러리를 세포와 함께 4°C에서 45분간 처리 후, 결합되지 못한 서열들은 세척용 완층용액 (4.5 g/L 글루코오스， 5 mM MgCl2를 포함하는 PBS)으로 각 5분간 3번의 연속적인 세척을 통하여 제거하였다. 세척용 완층용액으로 상기 세포들을 수집한 다음 95°C에서 5분간 가열함으로서 세포 표면에 결합된 서열들을 세포로부터 분리 후 추출하였다. 얻어진 ssDNA는 PCR 증폭하였다. 도 2와 같이， 상기 양성 선별과정을 11회 수행한 다음, 암줄기세포 능력이 적은 암세포 (cd44— /cd24-/esa-)를 유세포 분석을 통해 분리하여 (도 3) 2번의 음성 선별과정을 거쳤으며， 정상 췌장 세포주인 HPDE와 hYGIC6에 대해서도 2번의 음성 선별과정을 수행하였다. 양성 선별과정이 함께 번갈아 수행되어 결국， 양성 선별과정은 총 13회 수행되었으며, 음성선별과정은 총 4회 수행되었다.
높은 친화도와 특이성을 갖는 앱타머의 선별을 위하여, 세척의 지속시간을 점차적으로 15분까지 증가시켰다. 17번째 라운드에서 80%의 수율을 보였기 때문에 17번째 라운드의 산물은 TA 백터를 이용하여 클로닝하였다. 총 94개의 콜로니를 획득하여 서열을 분석하고 클론상에서의 공통되는 서열을 분석하였다. 그 결과 도 4와 같이， 22종의 서열을 수득하였으며， 이로부터 얻은 본 발명에 따른 DNA 앱타머 서열을 다음과 같다. 빨간색으로 표시된 염기는 프라이머 부분이다. 실시예 4: 앱타머의 염기서열별， 2차구조별 분류
클로닝으로부터 얻은 22 종류의 앱타머를 염기서열이 비슷한 집단으로 구분하였을 때， 1, 154, 163， 27， 39번 앱타머는 비슷한 염기서열을 가졌으며 그 2차구조 또한 매우 유사하다. 마찬가지 방법으로 23， 146, 19， 25， 28, 132F, 1기도 비슷한 염기서열을 가지면서 2차구조도 유사한 형태를 가지는 것으로 예측되었다. 앱타머의 2차구조는 m-fold 프로그램을 통하여 예측하였다. 실시예 5: 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 결합 친화도 측정
형광검출을 통하여 결합 친화도를 측정하기 위해 5' FAM 표지된 앱타머를 이용하였다. FACS용 접합 완충용액 (4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2> 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상에서 10， 25， 50, 100, 150, 200 nM의 농도로 앱타머를 준비 후 동량의 HPAC 스피어와 45분간 반웅시켰다. 이후 두 번의 세척 후에 유세포분석기를 통하여 전체 살아있는 세포 중 ¾타머가 붙은 세포를 비율화 하여 그래프로 나타내었다. 실험은
3회 반복하였다 (도 6). 실시예 6: 평형 여과법에 의한 췌장암 세포주에 대한 해리상수 의 측정 39， 19, 40, 23, 25， 15， 108번 및 카피수가 높게 나타난 1， 146번 앱타머에 대하여， 결합 어세이를 평형 여과법에 의하여 수행하였다. 즉， 10 nM 내지 200 ηΜ 농도 범위에서 각 앱타머를 5X106의 세포주와 배양한 다음 결합반웅을 그래프로 나타내었다. 해리상수를 산출하기 위하여 prism 4.0 소프트웨어를 이용하여， 다음의 평형식으로 결합된 췌장암 세포주 대 ssRNA 농도의 퍼센트를 플롯화하고, 데이터 포인트를 비선형 회귀분석에 의해 고정하였다.
Y=(Bmax x ssDNA)/(Kd +ssDNA)
이 때, y는 포화도의 정도이고， Bmax는 최대결합지점의 수이고, Kd는 해리상수이다. 그 결과, 췌장암 줄기세포에 대하여 강한 결합력을 보임을 확인할 수 있었는데, 특히 서열번호 146의 경우 22.1 nM로 실험을 수행한 앱타머 중 가장 강한 친화도를 가지는 것으로 나타났다 (표 1).
【표 1】
Figure imgf000022_0001
실시예 7: 유세포분석을 이용한 췌장암 세포주에 대한 결합 특이도 확인 민감도 실험과 동일한 방법으로 형광검출을 통하여 결합 특이도를 확인하였다. 5' FAM 표지된 앱타머를 FACS용 접합 완층용액 (4.5 g/L 글루코오스， 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상에서 10, 25, 50, 100, 150， 200 nM의 농도로 앱타머를 준비 후 동량의 HPAC 스피어 세포 또는 HPDE 세포와 45분간 반웅시켰다. 이후 두 번의 세척 후에 유세포분석기를 통하여 전체 살아있는 세포 중 앱타머가 붙은 세포를 비율화 하여 그래프로 나타내었다. 실험은 3회 반복하였다 (도 7). 실시예 8: 형광면역염색법
형광검출을 통하여 결합 친화도를 측정하기 위하여 5' TAMRA 표지된 앱타머를 이용하였다. 먼저， 접합 완층용액 (4.5 g/L 글루코오스， 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS를 포함하는 PBS) 상의 TAMRA 표지된 앱타머 1번과 146번 챔버 슬라이드에 키운 HPAC 세포에 상기 200 μΜ의 표지된 앱타머 풀과 결합 완층용액상에서 45분간 37°C로 배양한 다음 세척 완충용액으로 빠르게 2번 세척한 다음, 형광현미경으로 형광을 100X 배율로 검출하였다. 그 결과, cell-SELEX 과정을 거침으로 인하여 초기 풀에 비해 1, 146번 앱타머가 hpac 세포주 더 많이 인식함을 알 수 있었다 (도 8). 실시예 9: 앱타머 특이적인 암세포에서의 줄기세포의 특성
유세포 분석을 통하여 1, 146 앱타머로 HPAC세포를 분리 후 앱타머에 붙지 않은 암세포 대비 앱타머에 붙은 암세포에서 줄기세포의 특성을 RT- PCR기법으로 RNA수준에서 확인하였다 (도 9). 그 결과 배아 줄기세포 관련 유전자인 oct4, nanog가 증가되어있었고 암 줄기세포 관련 시그널 중 하나인 hedgehog 관련 유전자도 증가되어있었으며 기존에 알려진 암줄기세포 마커인 cd44, cd24, c-met 유전자의 발현도 증가되어 있었다. 이러한 결과를 토대로 개발된 앱타머는 줄기세포의 특성을 가진 암세포에 특이적으로 인식할 것으로 생각된다.
PCR기법에 사용된 프라이머는 다음과 같다 (표 2). 【표 2】 프라이머 염기서열
Figure imgf000024_0001
실시예 10: 알려진 췌장암 암줄기세포 마커 양성세포에서 앱타머의 결합양상
기존의 췌장암 암줄기세포 마커로 발표된 바 있는 CD24, CD44,
EpCAMCBD biosciences), CD133(Mi ltenyi biotech)과 앱타머의 상관관계를 확인하기 위하여 형광검출법을 시행하였다.
핵은 Hoechst33342로 염색하였으며 PE로 표지된 CD24, CD44, EpCAM과 F雇 표지된 앱타메 또는 146번을 사용하였다. 먼저 아큐타아제로 단일세포 처리한 HPAC세포를 접합 완층용액 (4.5 g/L글루코오스, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 10% FBS in PBS)으로 부유시킨 후 PE 표지된 CD24, CD44, EpCAM 항체와 FAM 표지된 앱타머 1번 또는 146번을 200 μΜ의 농도로 결합 완충용액상에서 45분간 37°C로 배양 후 세척 완층용액으로 빠르게 2번 세척하였다. 준비된 세포는 공초점현미경으로 400X 배율로 관찰하였다. 그 결과 HPAC 세포에서 많이 발현하고 있는 CD24, CD44, EpCAM 양성 세포에서는 모든 양성세포에 앱타머가 붙지는 않았지만 양성중에서도 과발현된 세포에 앱타머가 결합함을 관찰하였다. HPAC 세포주에서 발현양이 적은 CD133 양성세포는 모든 양성세포에 앱타머가 결합함을 관찰하였다. 이로써 기존의 췌장암 암줄기세포 마커 양성세포에서 앱타머 결합양상은 완벽히 일치하지 않지만 교집합이 존재함을 알 수 있었다 (도 10). 실시예 11: 앱타머 특이 췌장암 세포의 구 (sphere) 형성능 시험
암줄기세포의 보편적 특징 증 하나인 구 형성능을 시험하기 위하여 앱타메번 양성， 음성세포를 유세포분석기로 각각 분리 후 스피어 배지 (EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc. , Minneapolis, 丽), bFGFdO ng/ml, R&D Systems Inc. ) , 1XITS( insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 DMEM/F12)에 100 세포 의 비율로 6웰 울트라 로우 클러스터 플레이트 (Corning Inc. , Corning NY)에 접종 후 7일 동안 배양하였다. 그 결과 앱타머 1번 양성세포가 앱타머 음성세포에 비하여 더 크고 많은 스피어를 형성함을 관찰하였다 (도 11). 실시예 12: 앱타머 특이적인 혈증순환암세포 (Circulating Tumor Cell) 검출 췌장암에서 기인한 전이암환자의 혈액 15 ml을 채취하여 온코퀵 튜브로 혈중순환암세포 (Circulating Tumor Cell; CTC)를 분리하였다. 암줄기세포 특이 앱타머를 통해 CTC의 검출 가능성을 확보하고자 분리된 CTC에 Cy5 표지된 앱타메번을 결합시켰다. 혈액 내 상피세포임을 증명하는 FITC 결합 사이토케라틴을 암줄기세포 특징을 확인하기 위하여 PE 결합 EpCAM, CD24 또는 CD133을 동시에 염색하였다. 그 결과 EpCAM 양성 CTC와 EpCAM 음성 CTC 모두 검출이 가능했으며, 백혈구에도 발현하지만 암줄기세포 마커로도 알려진 CD24를 염색하였을 경우, CTC 세포임을 증명하는 사이토케라틴과 동시에 염색된 세포만이 앱타머가 결합하였다. 마찬가지로 췌장암 암줄기세포 마커인 CD133과 앱타머 1번을 동시에 염색하였을 때 CD133 양성이면서 사이토케라틴 양성인 CTC에 앱타머가 결합함을 확인하였다. 이로써 앱타머는 CTC 중에서도 암줄기세포 특징을 지닌 세포에 결합함을 알 수 있다 (도 12). 실시예 13: 환자 말초혈액성분에서의 앱타머 특이물질 검출
앱타머가 췌장암조기진단제의 가능여부를 확인하기 위하여 정상과 췌장암환자에게서 얻어진 말초혈액성분에서 혈구세포를 제거한 플라즈마 (plasma)로 시험하였다. 플라즈마에서 손쉽게 시험할 수 있도록 유세포분석기를 통해 마이크로파티클의 갯수를 확인하였다. 10 μ ΐ의 인체 유래 플라즈마를 아넥신 V 결합완층용액 (BD biosciences)에 부유시킨 뒤 마이크로파티클 표지자인 APC 결합 아넥신 V(BD biosciences)와 앱타머 1번을 결합한 결과 정상 (증간값 64.5)에 비해 췌장암 환자 (중간값 1131)에서 훨씬 많은 수의 앱타머 양성 마이크로파티클이 관찰되었고 그 중에서도 전이 환자에서 더 많은 마이크로파티클이 관찰되었다 (도 13). 참고문헌
1. BB Zhou et al .， Nature Reviews Drug Discovery, 8:806-823(2009)
2. Dick JE et al . , Nat Med. 3(7) :730(1997)
3. Simeone DM et al .， Cancer Res. 67(3)： 1030(2007)
4. Hermann PC et al. , Cell stem cell. 1:313(2007)
5. Dittfeld C. et al . , Radiother Oncol. 94(3) :375-83(2010)
6. Ni X. et al, Curr Med Chem. 18(27) :4206-14(2011)
7. Dastjerdi K. et al . , Biotechnol Appl Biochem. 58(4) :226-30(2011) 8. Na Li et al . , PLoS One. 6(6) :e20299(2011)
9. Lihan Tan et al. , J Pharm Sci. 101(5)： 1672-1677(2012)
10. Kehai Liu et al . , Int J Nanomedicine. 6: 174그 56(2011)
11. Car la Lucia Esposito et al. , PLoS One. 6(9) :e24071(2011)
12. Jin Kyeoung Kim et al., Biomaten'als. 33(1) :207-17(2012)
13. Talanta et al .， 30；85(4) :2113-20(2011) 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 계 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA이며，
Figure imgf000027_0001
핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열에 기 티미딘은 우라실인 것을 특징으로 하는 앱타머.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 서열목록 게 1서열은 서열목록 제 8서열, 서열목록 제 9서열， 서열목록 제 10서열 서열목록 제 11서열 또는 서열목록 제 12서열이고; 서열목록 제 2서열은 서열목록 제 13서열， 서열목록 제 14서열， 서열목록 제 15서열, 서열목록 제 16서열, 서열목록 제 17서열, 서열목록 제 18서열， 서열목톡 제 19서열, 서열목록 제 20서열 또는 서열목록 제 21서열이며 서열목록 제 3서열은 서열목록 제 22서열 또는 서열목록 제 23서열이고 서열목록 제 4서열은 서열목톡 제 24서열 또는 서열목톡 제제 2255서서열열이이며며 ; 그리고 서열목록 제 5서열은 서열목록 제 26서열 또는 서열목록 제 27서열인 것을 특징으로 하는 앱타머.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 서열목톡 제 28서열 내지 제 49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머 .
【청구항 5】
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 포함하는 세포 결합용 조성물.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서, 상기 암 세포는 암 즐기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 7】
제 5 항에 있어서, 상기 암 세포는 췌장암 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 5 항에 있어서， 상기 조성물은 암의 진단에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 암의 표적에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 암 즐기세포 검출용 키트.
【청구항 11]
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산 앱타머를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후판단용 조성물.
【청구항 12】
다음 단계를 포함하는 암 줄기세포를 검출하는 방법:
(a) 서열목톡 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉 (contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 핵산 앱타머 -세포 결합 반웅올 검출하는 단계 .
【청구항 13】
제 12 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 . RNA이며, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열에 기재된 티미딘은 우라실인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14】
제 12 항에 있어서， 상기 서열목록 제 1서열은 서열목록 제 8서열， 서열목록 제 9서열， 서열목록 제 10서열, 서열목록 제 11서열 또는 서열목록 제 12서열이고; 서열목톡 제 2서열은 서열목록 제 13서열, 서열목록 제 14서열, 서열목록 제 15서열， 서열목록 제 16서열, 서열목록 제 17서열， 서열목록 제 18서열, 서열목록 제 19서열, 서열목톡 제 20서열 또는 서열목록 제 21서열이며; 서열목록 게 3서열은 서열목특 제 22서열 또는 서열목록 제 23서열이고; 서열목록 제 4서열은 서열목록 제 24서열 또는 서열목록 제 25서열이며; 그리고 서열목록 제 5서열은 서열목록 제 26서열 또는 서열목록 제 27서열인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 15】
제 12 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 서열목록 제 28서열 내지 제 49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16]
제 12 항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 17】
다음 단계를 포함하는 암 진단 또는 예후 판단 방법 :
(a) 서열목톡 제 1서열 내지 제 7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 43-100 뉴클레오타이드 길이의 핵산 앱타머를 생물학적 시료에 접촉 (contacting)하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 핵산 앱타머 -세포 결합 반웅을 검출하는 단계 .
【청구항 18】
제 17 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA이며， 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제 1서열 내지 제 7서열에 기재된 티미딘은 우라실인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 19]
제 17 항에 있어서, 상기 서열목톡 제 1서열은 서열목록 제 8서열， 서열목록 게 9서열， 서열목록 제 10서열， 서열목록 제 11서열 또는 서열목록 제 12서열이고; 서열목록 제 2서열은 서열목록 제 13서열， 서열목록 제 14서열， 서열목록 제 15서열, 서열목특 제 16서열， 서열목록 제 17서열, 서열목톡 제 18서열, 서열목록 제 19서열， 서열목톡 제 20서열 또는 서열목록 제 21서열이며 서열목록 제 3서열은 서열목록 제 22서열 또는 서열목록 제 23서열이고 서열목록 게 4서열은 서열목록 제 24서열 또는 서열목록 제 25서열이며 그리고 서열목록 제 5서열은 서열목록 제 26서열 또는 서열목록 제 27서열인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 20】
제 17 항에 있어서， 상기 핵산 앱타머는 서열목록 제 28서열 내지 제 49서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 21】
제 17 항에 있어서， 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2013/007212 2012-08-09 2013-08-09 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도 WO2014025234A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120087272 2012-08-09
KR10-2012-0087272 2012-08-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014025234A2 true WO2014025234A2 (ko) 2014-02-13
WO2014025234A3 WO2014025234A3 (ko) 2014-04-03

Family

ID=50068660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/007212 WO2014025234A2 (ko) 2012-08-09 2013-08-09 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101568400B1 (ko)
WO (1) WO2014025234A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866064A (zh) * 2018-07-10 2018-11-23 中国医科大学 一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020130225A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 국립암센터 췌장암 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
KR102212149B1 (ko) * 2019-03-28 2021-02-04 부산대학교 산학협력단 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080132423A1 (en) * 2004-11-12 2008-06-05 Toru Kondo Methods And Means Related To Cancer Stem Cells
US20090202564A1 (en) * 2006-05-02 2009-08-13 Stelic Institute Of Regenerative Medicine, Stelic Institute & Co. Methods of isolating stem cells
KR20100129709A (ko) * 2009-06-01 2010-12-09 성균관대학교산학협력단 췌장암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
KR20110086433A (ko) * 2010-01-22 2011-07-28 성균관대학교산학협력단 Ｈｅｒ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
US20110184042A1 (en) * 2009-03-17 2011-07-28 Postech Academy-Industry Foundation RNA Aptamer Specifically Binding to Carcinoembryonic Antigen and Use thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080132423A1 (en) * 2004-11-12 2008-06-05 Toru Kondo Methods And Means Related To Cancer Stem Cells
US20090202564A1 (en) * 2006-05-02 2009-08-13 Stelic Institute Of Regenerative Medicine, Stelic Institute & Co. Methods of isolating stem cells
US20110184042A1 (en) * 2009-03-17 2011-07-28 Postech Academy-Industry Foundation RNA Aptamer Specifically Binding to Carcinoembryonic Antigen and Use thereof
KR20100129709A (ko) * 2009-06-01 2010-12-09 성균관대학교산학협력단 췌장암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
KR20110086433A (ko) * 2010-01-22 2011-07-28 성균관대학교산학협력단 Ｈｅｒ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIGDAR, SARAH ET AL.: 'RNA aptamer against a cancer stem cell marker epithelial cell adhesion molecule' CANCER SCIENCE vol. 102, no. 5, May 2011, pages 991 - 998 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866064A (zh) * 2018-07-10 2018-11-23 中国医科大学 一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140021973A (ko) 2014-02-21
WO2014025234A3 (ko) 2014-04-03
KR101568400B1 (ko) 2015-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9926566B2 (en) Multiaptamer target detection
Ulrich et al. RNA and DNA aptamers in cytomics analysis
US20090117549A1 (en) Aptamer-based methods for identifying cellular biomarkers
KR102161733B1 (ko) 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법
WO2010131195A1 (en) Phosphodiesterase 4d7 as prostate cancer marker
WO2022095141A1 (zh) 一种gpc1 dna适配体及其应用
CN101835893A (zh) 癌症相关基因cdca5、epha7、stk31和wdhd1
CN107532199B (zh) 与间质上皮转化因子抑制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途
WO2019149115A1 (zh) 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体或肿瘤检测中的应用
KR101568400B1 (ko) 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도
Li et al. Cell-SELEX-based selection of ssDNA aptamers for specifically targeting BRAF V600E-mutated melanoma
WO2010131193A1 (en) Phosphodiesterase 9a as prostate cancer marker
CN110938675B (zh) siRNA定向自组装量子点生物传感器及其检测方法和应用
US20220135979A1 (en) Diagnosis and treatment of medulloblastoma
KR101641920B1 (ko) EpCAM에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도
US20150031585A1 (en) Multiaptamer Target Detection
US10316319B2 (en) Composition for diagnosis of liver metastasis of colorectal cancer and the use thereof
WO2008085898A2 (en) Methods for identifying essential proteins and therapeutic agents
KR20150057517A (ko) 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도
KR20130111779A (ko) Ａｌｐｐｌ２ 단백질을 이용한 췌장암 진단 방법
CN114317546B (zh) 一种用于检测evd68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114381460B (zh) 一种用于检测腮腺炎病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
Berg et al. SELEX of cell-specific RNA aptamers
김윤진 The Development of Cancer Stem Cell Specific Aptamers for Pancreatic Cancer
KR20230136399A (ko) EGFRvIII 특이적 압타머 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13827376

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2