KR20110086433A - Ｈｅｒ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도 - Google Patents

Ｈｅｒ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도

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Abstract

본 발명은 HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직을 특이적으로 인지하여 결합함으로써 유방암의 진단 및 치료에 이용될 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 압타머는 세포 표면에 발현된 HER-2를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 HER-2 과발현 유방암 세포를 in vivo 이미징하거나 약물전달을 위한 타겟으로 할 수 있는바, 유방암 진단 및 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있어 유방암 환자의 생존율을 높이는 데 기여할 수 있다.

Description

ＨＥＲ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도{Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to HER-2-Overexpressing Breast Cancer Cell or Tissue and Use Thereof}
본 발명은 HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직을 특이적으로 인지하여 결합함으로써 유방암의 진단 및 치료에 이용될 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도에 관한 것이다.
암세포 표면 단백질과 높은 친화성을 가지고 특이적으로 암세포에 결합할 수 있는 리간드 물질은 암 진단 및 치료제 개발에 중요하다. 한편, 이러한 리간드 물질은 암 바이오마커로도 사용될 수 있다. 이러한 바이오마커에 대한 이해는 추가적으로 신규 암 치료제의 개발을 촉진할 수 있다.
HER-2/ErbB2/Neu (HER-2)는 트랜스멤브레인 수용체 티로신 키나제로서, 상피세포성장인자 수용체 족의 하나이다 (Roskoski, R., Jr. Biochem . Biophys . Res . Commun., 319:1, 2004). 즉, HER-2는 세포막에 존재하며 리간드와 결합하는 세포 외 영역과 단백질 활성화를 일으키는 세포 내 영역으로 구성된 수용체 형태의 단백질로서, HER-2의 과발현은 유방암 세포주의 20 내지 30%에서 관찰된다. HER-2 ectodomain-directed 모노클론항체 (trastuzumab 또는 Herceptin)는 유방암을 치료하는 것으로 승인되었는데(Roskoski, R., Jr. Biochem . Biophys . Res . Commun ., 319:1, 2004), HER-2는 또한 유방암에 대한 약물 전달의 타겟 (Chiu, S. J. et al., J. Control . Release , 97:357, 2004) 및 in vivo 이미징에 대한 매력적인 타겟 (Tolmachev, V., Curr . Pharm . Des ., 14:2999, 2008)이 될 수 있다.
압타머는 타겟에 대하여 높은 친화성과 특이성을 가지고 결합되도록 특이적인 3차원 구조로 접힐 수 있는 단일가닥 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 압타머에 대한 타겟은 작은 물질, 펩타이드, 단백질이 될 수 있으며, 세포 자체가 될 수도 있다(Dua, P. et al., Recent Pat . DNA Gene Seq ., 2:172, 2008).
이러한 압타머는 항체에 비하여, 더 작은 사이즈, 더 우수한 조직 침투성, 화학적 조작의 용이성 및 면역반응을 야기하지 않음 등의 장점들을 가진다. 또한, in vivo 이미징 적용 시, 압타머는 그 작은 크기 덕분에 항체에 비하여 더 빠른 반응속도와 더 우수한 신호-노이즈 비를 가진다. 압타머는 또한, 이미지 특이성을 향상시키기 위하여, 자기나노입자 표면에 부착되어 자기공명영상(MRI)에 사용될 수 있다.
암치료제로서, 압타머는 성장인자 또는 성장인자 수용체를 블로킹함으로써 암 성장 신호경로를 직접 억제하거나, 세포독성제, radionuclides, 또는 siRNA와 같은 치료분자를 타겟세포로 운반하는 "escort aptamers"로서 사용될 수 있다. 그러므로, 다른 암세포 타입 또는 암세포 표면 단백질을 타겟팅하는 특이적인 압타머의 수득은 신규 암진단제 및 치료제의 개발에 도움이 된다.
그렇지만, 많은 암 세포타입에서, 특이적인 세포 표면 바이오마커 단백질이 알려져 있지 않아 특정 암세포 타입을 타겟팅하는 압타머의 분리가 어려웠다. 또한, 설사 세포 표면 바이오마커 단백질이 알려져 있는 경우에도 막단백질은 발현 및 분리가 전형적으로 어렵거나, 분리된 막단백질은 세포막에 존재하는 것과 같은 본래의 구조를 가지지 않을 것이기에, 분리된 단백질에 대하여 선별된 압타머는 세포 표면의 동일한 단백질을 인식할 수 없는 어려움이 있었다 (Cerchia, L. et al., PLoS Biol ., 3:e123, 2005).
이에 본 발명자는 HER-2 과발현하는 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하여 유방암의 진단 및 치료에 이용할 수 있는 압타머를 분리하고자 예의 노력한 결과, 신규 음성 선별전략을 통하여 Cell SELEX (Syetematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 공정을 수행함으로써 HER-2 과발현 유방암 세포주에만 특이적으로 결합하는 압타머를 선별한 다음, 선별된 압타머가 HER-2를 과발현하는 유방암 세포 또는 HER-2를 인위적으로 과발현시킨 세포에 특이적으로 결합함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 압타머를 이용한 유방암의 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9, 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 15~60nts의 핵산 압타머 (여기서, 상기 핵산 압타머가 DNA인 경우에는, 상기 핵산서열에서 U는 T임을 특징으로 함)를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 9, 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2에 특이적으로 결합할 수 있는 15~60nts의 핵산 압타머 (여기서, 상기 핵산 압타머가 DNA인 경우에는, 상기 핵산서열에서 U는 T임을 특징으로 함)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 유방암의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머를 함유하는 유방암의 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머가 고정되어 있는 유방암 진단용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머를 함유하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유방암 진단용 센서 또는 유방암 진단용 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 유방암의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머를 함유하는 유방암 특이적 약물전달 조성물을 제공한다.
본 발명은 HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 이를 이용한 유방암의 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 핵산 압타머는 세포 표면에 발현된 HER-2를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 HER-2 과발현 유방암 세포를 in vivo 이미징하거나 약물전달을 위한 타겟으로 할 수 있는바, 유방암 진단 및 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있어 유방암 환자의 생존율을 높이는 데 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별 과정의 개략도이다.
도 2는 상기 도 1의 개략도에 따라 Cell-SELEX 과정을 수행하여 수득한 최종 압타머 풀의 서열을 분석한 결과이다.
도 3A는 초기 RNA 라이브러리 풀(Pool)과 MDA-MB-231 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 최종 압타머 풀(m15R)과 HER-2 특이적인 siRNA를 이용하여 HER-2 발현을 억제시킨 SK-BR-3 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 압타머 풀(si15R)의 유방암 세포주에 대한 결합 친화도를 정량 PCR으로 측정한 결과 그래프이고, 3B는 SK-BR-3 세포주 및 MDA-MB-231 세포주의 HER-2 단백질의 웨스턴 블라팅 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 초기 라이브러리 풀(Pool)과 선별된 압타머의 SK-BR-3 및 MDA-MB-231 세포주에 대한 친화도를 형광검출방법을 이용하여 확인한 사진이다.
도 5A는 S6 압타머의 2차 구조를 나타내고, 5B는 S6 압타머의 SK-BR-3 세포주에 대한 결합친화도를 평형여과법에 의하여 수행하여 HER-2-과발현 유방암 세포주인 SK-BR-3에 대한 해리상수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 S6 압타머의 NIH-3T6.7 세포주 (NIH-3T3/HER-2) 및 NIH-3T3 세포주에 대한 결합친화도를 형광검출방법을 이용하여 확인한 사진이다.
도 7A는 S6 압타머의 NIH-3T6.7 세포주 (NIH-3T3/HER-2) 및 NIH-3T3 세포주에 대한 결합친화도를 정량 PCR을 이용하여 확인한 그래프이고, 7B는 NIH-3T6.7 세포주 및 NIH-3T3 세포주의 HER-2 단백질의 웨스턴 블라팅 분석 결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "핵산 압타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.
본원에서 "시료"란, 유방암 마커를 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 유방 조직, 유방 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨 등이 해당될 수 있다.
본원에서 "90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있는 것으로 유사한 HER-2 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 압타머는 다음의 서열번호 1 내지 12로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
M11, S4: 5'-UCUAGCUCUCCUCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUG-3' (서열번호 1)
S16: 5'-UC-AGCUCUCUUCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUGG-3' (서열번호 2)
M9: 5'-AGAGAGGGAUUGGAUAGGCGUCUGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 3)
M2,M5,M29,S1: 5'-AGAGAGAGAUUGGAUAGGCGUCUGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 4)
M8: 5'-UCGAGUGGGCCUUGAGAUUGGAUAACUGGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 5)
S15,S17: 5'-UGGAUGGGGAGAUCCGUUGAGUAAGCGGGCGUGUCUCUCUGCCAC-- UACUAUGGGG -3' (서열번호 6)
S6: 5'-UGGAUGGGGAGAUCCGUUGAGUAAGCGGGCGUGUCUCUCUGCCGCCUUGCUAUGGGG-3' (서열번호 7)
M1,S14:
5'-GUAAGACGAGGUUCGCCGGCCUCGCGAUUGGAUUUGCUGGUCAGUCUGCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 8)
M16,S5,S10,S27:
5'-GUAAGACGAGGUUCGCCCGCCUCGCGAUUGGAUUUGCUGGUCAGUCUGCUUACUAUG-3' (서열번호 9)
S9: 5'-UUCGAAUGGUUCCUCGUCUUCCAAGAUCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 10)
M13: 5'-CUAGUGGGCCUAGGAUUGUAGGCGAGUCUCCUUUCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 11)
S13: 5'-AAGCAACUCCUGCCUUUCUAGCUGCAAAGUGGGCCUUUGU-3' (서열번호 12)
상기에서, 서열번호 1 및 2의 핵산서열은 공통적으로 UCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUU (서열번호 13)을 가지며, 서열번호 3 내지 7의 핵산서열은 공통적으로 GCGUGUCUCUCUGCCACUACUAUGGGG (서열번호 14) 또는 GCGUGUCUCUCUGCCGCCUUGCUAUGGGG (서열번호 15)의 서열을 가진다. 이때, 서열번호 3 내지 7의 핵산서열은 5' 쪽 서열은 다양하나, 3' 쪽 반쪽은 보존되어 GCGUGUCUCUCUGCC (서열번호 16) 및 URCUAUGGGG (R은 A 또는 G임; 서열번호 17)의 공통적으로 보존되는 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 서열번호 8, 10 및11의 핵산서열도 URCUAUGGGG (R은 A 또는 G임; 서열번호 17)의 공통적으로 보존되는 서열을 가지는 것으로 나타났다. 아울러, 서열번호 9의 핵산서열도 상기 서열번호 17의 핵산서열에서 3' 말단에서 GGG가 절단된 URCUAUG (R은 A 또는 G임)의 서열을 가짐을 확인할 수 있었다. 한편, 서열번호 12의 핵산서열은, 서열번호 1 및 2의 핵산서열과 공통적으로 AGUGGGCCU의 핵산서열을 가진다.
이때, 상기 핵산 압타머를 구성하는 총 뉴클레오티드의 수는 15~200nts일 수 있으나, 바람직하게는 15~60nts인 것을 특징으로 할 수 있다. 총 뉴클레오티드의 수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고 생체 내 안정성도 높으며 독성도 낮게 된다. 아울러, 상기 핵산 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있는데, 예컨대, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기 (예:-O-CH3), -O-아실기 (예, -O-CHO), 아미노기(예, -NH2)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 핵산 압타머는 단일가닥 RNA 또는 DNA로서 제공되는 것으로서, 본 발명에서 상기 핵산이 DNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 U는 T로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
본 발명에 따른 핵산 압타머는 URCUAUGGGG (R은 A 또는 G임; 서열번호 17), 서열번호 13 내지 16의 핵산서열 등과 같은 공통적으로 보존되는 영역을 가지는 것으로 나타나는데, 이러한 공통적으로 보존되는 영역의 존재는 상기 서열번호 1 내지 12로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열과 90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열은 유방암 세포주에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머임을 의미한다. 본 발명에 따른 핵산 압타머 상호 간의 서열의 유사성을 볼 때, 상기 서열번호 1 내지 12로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열에 대하여 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있다면, 본 발명에 따른 핵산 압타머와 유사한 HER-2 과발현 유방암 세포주 결합능을 보일 것임은 자명하다고 할 것이다.
본 발명의 실시예에서는 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 서열번호 1 내지 12로 표시되는 핵산서열의 압타머를 Cell-SELEX 공정을 통하여 선별해 낸 다음, 리얼타임 PCR 방법 및 형광검출 방법을 통하여 상기 서열번호 1 내지 12로 표시되는 핵산서열이 HER-2 과발현 유방암 세포주에 대하여 특이적으로 결합함을 확인하였다. 이러한 유방암 세포주에 대한 특이적인 결합은 본 발명에 따른 핵산 압타머가 실질적인 유방암의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 핵산 압타머를 함유하는 유방암 진단용 조성물에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산 압타머를 이용한 유방암의 검출방법에 관한 것이다. 이때, 상기 방법은 상기 핵산 압타머와 유방 조직, 유방 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨 중에서 선택되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 시료는 포유류, 바람직하게는 인체에서 분리된 것으로, 최소 침습으로 확보가능한 시료 또는 분비체액, in vitro 세포배양액 성분 시료 등 유방암 마커인 HER-2를 포함하고 있을 수 있는 시료이면, 상기에 한정되지 않음은 자명하다.
상기 핵산 압타머를 시료와 접촉시키는 경우, 시료 중 존재하는 유방암 마커인 HER-2와 상기 핵산 압타머간 특이적인 결합이 일어나게 된다. 따라서, 형광 등으로 핵산 압타머를 표지하여 결합시킨 다음 시그널의 존부를 확인함으로써, 유방암을 검출할 수 있게 된다.
한편, 상기 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머는 비드, 입자, 딥스틱(dipstick), 섬유, 필터, 막 및 유리 슬라이드와 같은 통상적인 지지체 및 실란 또는 실리케이트 지지체 등의 고체 지지체에 고정되어 검출센서로 제공됨으로써, 유방암 진단에 이용될 수 있는바, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머가 고정되어 있는 유방암 진단용 센서에 관한 것이다.
상기 고체 지지체는 적어도 하나의 실질적으로 단단한 표면을 포함하는데, 그 표면 위에 상기 핵산 압타머들이 움직일 수 없게 고정될 수 있다. 이때, 상기 핵산 압타머는 모든 통상적인 화학적 커플링 방법에 의하여 고정화될 수 있다. 예컨대, 상기 핵산 압타머의 말단에 바이오틴을 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 칩 등의 기판 표면에 스트렙타비딘을 고정화시켜, 상기 바이오틴과 기판 표면에 고정화된 스트렙타비딘의 상호작용에 의하여 상기 핵산 압타머를 기판 표면에 고정화시길 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머를 함유하는 유방암 진단용 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 이 유방암 진단용 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
아울러, 암 세포주에 특이적으로 결합하는 압타머를 암세포주에 결합시킴으로써, 암의 기작을 저해하여 해당 암의 치료에 이용할 수 있음은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 사실인 바, 본 발명에 따른 압타머가 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하여 유방암 기작을 저해할 것인 바, 이를 함유하는 조성물이 유방암 치료를 위한 조성물로 제공할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명하다. 특히, HER-2 ectodomain-directed 모노클론항체 (trastuzumab 또는 Herceptin)가 유방암을 치료하는 것으로 승인된바(Roskoski, R., Jr. Biochem. Biophys . Res . Commun ., 319:1, 2004), 본 발명에 따른 핵산 압타머가 유방암 치료를 위하여 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 압타머에 공지된 유방암 특이적 약물 또는 Herpes simplex virus-thymidine kinase(HSV-TK), 사이토신 데아미네이즈(cytosine deaminase, CD) 등과 같은 공지된 세포자멸사 유전자, 또는 유방암 성장 및 전이에 중요한 역할을 하는 유전자 등의 발현을 저해하는 siRNA(small interfering RNA)를 붙여 유방암 세포주로 전달할 수 있으며, 이미 HER-2는 또한 유방암에 대한 약물 전달의 타겟 (Chiu, S. J. et al ., J. Control . Release , 97:357, 2004)이 될 수 있음은 보고되고 있는바, 본 발명은 상기 핵산 압타머를 함유하는 유방암 특이적 약물전달 조성물의 형태로 제공될 수 있음은 자명하다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 제형화될 수 있는데, 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들면, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 압타머가 HER-2 과발현 유방암 세포주 뿐만 아니라, HER-2를 과발현시킨 다른 세포주에 대하여도 특이적으로 결합할 수 있음을 형광검출 및 정량 PCR을 통하여 확인함으로써, HER-2 타겟팅 압타머로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 본 발명은 또한, 서열번호 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 15~60nts의 핵산 압타머 (여기서, 상기 핵산 압타머가 DNA인 경우에는, 상기 핵산서열에서 U는 T임을 특징으로 함)에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HER -2 과발현 유방암 세포주에 특이적으로 결합하는 압타머의 분리
1-1: ssRNA 라이브러리 및 PCR 증폭과 cDNA 합성을 위한 프라이머의 준비
다음의 서열을 가지는 랜덤한 ssDNA 라이브러리를 화학적으로 합성하고 PAGE(Genotech Inc., Korea)로 분리하였다.
5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NAG ATA GTA AGT GCA ATC T-3' (서열번호 18)
초기 풀은 3×1013 분자를 포함하였다. 서열번호 19의 N40 업스트림 프라이머(upstream primer)와 서열번호 20의 N40 다운스트림 프라이머(downstream primer)가 PCR 증폭과 cDNA 합성에 사용하였다.
Upstream primer: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 19)
Downstream primer: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 20)
증폭된 라이브러리를 Durascribe T7 RNA 폴리머라제(Eqicentre)를 이용하여 RNA로 변환하였다. 이때, 2'-F UTP와 2'-F CTP를 각각 UTP, CTP 대신 사용하여 RNA의 U와 C가 2'-OH 대신 2'-F를 가지게 만들 수 있는데, 이는 RNA 가수분해효소에 대한 저항력을 높임으로써 생체 응용이 가능하게 하기 위함이다.
1-2: HER -2 과발현 유방암 세포주에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별
도 1에 나타난 바와 같이, 먼저 HER-2를 과발현하는 것으로 알려진 유방암 세포주인 SK-BR-3 (American Tissue Culture Collection)에 대하여 양성선별을 수행하였다.
SK-BR-3 세포주는 37℃의 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제(100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스텝토마이신; Gibco BRL)을 첨가한 McCoy's 5A 배지(Welgene)에서 배양하였다. 그 다음 세포를 트립신 처리하여 회수한 다음, 1×106 세포들을 37℃의 완전배지에 recover하였다.
한편, 상기 실시예 1-1의 160pmole의 N40 RNA 라이브러리를 95℃에서 5분간 결합 완충용액(4.5g/L glucose, 5 mM MgCl2, 0.1 mg/ml yeast tRNA, 1 mg/ml BSA in Dulbecco's PBS)에서 변성시킨(denaturing) 다음, 얼음상에 급냉시켰다. 그 다음, 상기 recover한 세포주를 세척용 완충용액 (4.5 g/L glucose, 5 mM MgCl2 in Dulbecco's PBS)으로 두번 세척한 다음, 결합 완충용액상의 상기 준비한 RNA 라이브러리를 4℃에서 45분간 배양시켰다. 비결합된 서열들은 세척용 완충용액으로 2번의 연속적인 세척을 통하여 분획해 내었다. 그리고 나서, 95℃에서 5분간 가열함으로써 세포 표면에 결합된 서열들을 용출시키고 PCI 추출(phenol:chloroform:isoamyl alcohol etraction: Bioneer, Korea)로 분리하였다. 얻어진 RNA는 ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega, USA)를 이용하여 역전사하고, PCR 증폭하였다. 분리된 PCR 산물은 T7 폴리머라제(Ambion, USA)을 이용하여 in vitro 전사과정을 수행하였다.
상기 양성 선별과정을 14회 수행한 후, 상기 RNA 라이브러리의 결합 압타머에 대한 농축은 포화상태에 이르렀다. 이에 도 1과 같이, 병렬적으로 2개의 음성 선별과정을 각각 수행하였다. 이때, 번갈아 가며 음성선별 과정을 거치면 HER-2를 과발현하는 SK-BR-3 세포주에 대하여 양성선별과정을 다시 수행하였다.
한쪽 선별과정은 HER-2를 거의 발현하지 않는 세포주인 MDA-MB-231 (American Tissue Culture Collection)을 음성 선별을 위한 세포주로 이용하여 이 세포주에 결합하는 압타머를 제거하였다. MDA-MB-231 세포주는 37℃의 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제(100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스텝토마이신; Gibco BRL)을 첨가한 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL)에서 배양한 다음, 회수하여 상기와 동일한 방법으로 처리하되, 세포주에 결합하는 압타머를 제거하고 비결합된 압타머를 수집하였다.
다른 쪽 선별과정은 새로운 음성 선별 전략으로서 HER-2 특이적인 siRNA를 이용하여 HER-2 발현을 억제시킨 SK-BR-3 세포주를 이용하여 이에 결합하는 압타머를 제거하였다. siRNA의 트랜스펙션은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, SK-BR-3 세포주를 항생제 없는 완전배지로 60mm 플레이트에 플레이팅한 다음, 50% confluency에 도달할 때까지 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 10nM의 siRNA (bioneer, Korea)를 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 트랜스펙션된 세포들을 계수하여 1×106의 세포들을 압타머풀에 상기와 같은 방법으로 처리하되, 세포주에 결합하는 압타머를 제거하고 비결합된 압타머를 수집하였다.
수집된 각 선별의 산물은 TA 벡터(RBC, Korea)을 이용하여 클로닝한 다음, 제조된 클론은 multialign 소프트웨어 (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/ multalin.html)을 이용하여 서열분석하고, 클론 상에서의 공통되는 서열을 분석하였다.
수득된 음성 선별과정을 거쳐 수득된 압타머 풀에서 수집되어 서열분석된 클론 상의 서열은 도 2와 같으며, 이로부터 얻은 본 발명에 따른 RNA 압타머 서열은 다음과 같다.
M11, S4: 5'-UCUAGCUCUCCUCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUG-3' (서열번호 1)
S16: 5'-UC-AGCUCUCUUCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUGG-3' (서열번호 2)
M9: 5'-AGAGAGGGAUUGGAUAGGCGUCUGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 3)
M2,M5,M29,S1: 5'-AGAGAGAGAUUGGAUAGGCGUCUGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 4)
M8: 5'-UCGAGUGGGCCUUGAGAUUGGAUAACUGGCGUGUCUCUCUGCCAC--UACUAUGGGG -3' (서열번호 5)
S15,S17: 5'-UGGAUGGGGAGAUCCGUUGAGUAAGCGGGCGUGUCUCUCUGCCAC-- UACUAUGGGG -3' (서열번호 6)
S6: 5'-UGGAUGGGGAGAUCCGUUGAGUAAGCGGGCGUGUCUCUCUGCCGCCUUGCUAUGGGG-3' (서열번호 7)
M1,S14:
5'-GUAAGACGAGGUUCGCCGGCCUCGCGAUUGGAUUUGCUGGUCAGUCUGCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 8)
M16,S5,S10,S27:
5'-GUAAGACGAGGUUCGCCCGCCUCGCGAUUGGAUUUGCUGGUCAGUCUGCUUACUAUG-3' (서열번호 9)
S9: 5'-UUCGAAUGGUUCCUCGUCUUCCAAGAUCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 10)
M13: 5'-CUAGUGGGCCUAGGAUUGUAGGCGAGUCUCCUUUCUUACUAUGGGG-3' (서열번호 11)
S13: 5'-AAGCAACUCCUGCCUUUCUAGCUGCAAAGUGGGCCUUUGU-3' (서열번호 12)
상기에서, 서열번호 1 및 2의 핵산서열은 공통적으로 UCUAGAGUGGGCCUCUAGAGUUUGACUU (서열번호 13)을 가지는 것으로 확인되었고, 서열번호 3 내지 7의 핵산서열은 공통적으로 GCGUGUCUCUCUGCCACUACUAUGGGG (서열번호 14) 또는 GCGUGUCUCUCUGCCGCCUUGCUAUGGGG (서열번호 15)의 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 즉, 서열번호 3 내지 7의 핵산서열은 5' 쪽 서열은 다양하나, 3' 쪽 반쪽은 보존되어 GCGUGUCUCUCUGCC (서열번호 16) 및 URCUAUGGGG (R은 A 또는 G임; 서열번호 17)의 공통적으로 보존되는 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 서열번호 8, 10 및 11의 핵산서열도 URCUAUGGGG (R은 A 또는 G임; 서열번호 17)의 공통적으로 보존되는 서열을 가지는 것으로 나타났다. 아울러, 서열번호 9의 핵산서열도 상기 서열번호 17의 핵산서열에서 3' 말단에서 GGG가 절단된 URCUAUG (R은 A 또는 G임)의 서열을 가짐을 확인할 수 있었다. 한편, 서열번호 12의 핵산서열은, 서열번호 1 및 2의 핵산서열과 공통적으로 AGUGGGCCU의 핵산서열을 가지는 것으로 확인되었다. 한편, SELEX 사이클 동안 몇몇 서열이 삽입되어 몇몇 압타머는 40mer 이상의 서열을 가지는 것으로 나타났다.
실시예 2: Cell - SELEX 를 수행한 압타머 풀의 HER -2 과발현 유방암 세포주에 대한 결합친화도 측정
정량 PCR 방법을 이용하여, SELEX 방법을 수행하기 전의 초기 ssRNA 풀 (pool) 및 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 용출물과 상기 HER-2 특이적인 siRNA를 이용하여 HER-2 발현을 억제시킨 SK-BR-3 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 용출물에 대하여 결합친화도를 측정하였다.
즉, 상기 초기 라이브러리 및 최종 라운드의 RNA 풀을 HER-2 과발현 유방암세포주인 SK-BR-3 세포주에 각각 처리하였다. 이때, 대조군으로서 HER-2를 거의 발현하지 않는 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 이용하였다.
결합전 (in-put) 압타머 풀과 결합 후 (out-put) 압타머 풀 모두 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용되었는데, cDNA 합성은 ImProm-Ⅱ™ Reverse Transcription System (Promega)로 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. cDNA 반응 혼합물의 분취액(1/250)은 Step-One real-time PCR machine (Applied Biosystems)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 정량 PCR에 의해 분석하고, input에 대한 output 신호의 비를 계산하였다. 이때, 상기 PCR에 사용된 프라이머는 상기 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머와 동일하다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 초기 라이브러리의 풀의 경우 SK-BR-3 및 MDA-MB-231 세포주 모두 친화도를 보이지 않는 것으로 나온 것과 달리, MDA-MB-231 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 최종 압타머 풀과 HER-2 특이적인 siRNA를 이용하여 HER-2 발현을 억제시킨 SK-BR-3 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 최종 압타머 풀 모두 HER-2를 거의 발현하지 않는 세포주인 MDA-MB-231 세포주과 달리, HER-2 과발현 세포주인 SK-BR-3 세포주에 대하여 높은 결합 친화도를 보임을 확인할 수 있었다.
즉, Cell-SELEX 과정을 거침으로 인하여 HER-2를 과발현하는 유방암 세포주만을 특이적으로 인식하는 압타머 풀로 농축되어짐을 확인할 수 있었다.
한편, 도 3B는 HER-2 단백질의 발현을 웨스턴 블라팅 분석을 통하여 검출한 것으로 HER-2가 SK-BR-3 세포주에서는 과발현되어 있으나, MDA-MB-231 세포에서는 거의 발현되지 않음을 나타내는 사진이다. HER-2 단백질의 발현 확인을 위한 웨스턴 블라팅 분석은 다음과 같이 수행하였다. 세포들을 차가운 PBS (phosphate-buffedred saline)으로 두번 세척한 다음 RIPA 완충용액 (50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate 및 0.1% SDS)으로 용출시켰다. 4℃에서 30분간 볼텍싱함으로써 세포 용출을 시킨 후, 12000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 수집하여 Protein Assay Reagent (Pierce)로 단백질을 정량화하였다. 50㎍의 단백질은 SDS-PAGE로 분리된 후, PVDF 막 (Millipore)로 전기이동시켰다. 블랏은 TBS 상의 5% skim milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹시킨 후, 1: 500으로 희석시킨 일차 항체 (mouse monoclonal anti-c-ErbB2/c-Neu antibody, Calbiochem 사)로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 블랏들은 TBS-Tween 20으로 5분간 3번 세척한 다음, TBS-Tween 상에 1:2000으로 희석한 horse-radish peroxidase 표지된 goat anti-mouse IgG (BIO-RAD사)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 6분간 TBS-Tween으로 5회 세척한 다음, 단백질들은 ECL plus 시약(Amersham Bioscience)로 시각화하였다.
실시예 3: 분리된 각 압타머의 HER -2 과발현 유방암 세포주에 대한 검출활성 측정
실시예 1에서 분리된 각 압타머의 HER-2 과발현 유방암 세포주 SK-BR-3 및 HER-2를 거의 발현하지 않는 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 대한 결합 친화도를 형광검출을 통하여 측정하기 위하여, 5' TAMRA (tetramethylrhodamine) 표지된 다운스트림 프라이머를 이용하였다. TAMRA-표지된 3' 프라이머로는 5'-TAMRA-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 21)를 이용하였다.
먼저, 접합(annealing) 완충용액 (30 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 50 mM NH4Ac) 상의 TAMRA 표지된 프라이머를 초기 RNA 라이브러리(Pool)과 선별된 압타머들에 각각 동일한 농도로 혼합한 다음, 90℃에서 2분간 열변성을 시킨 후 점차 냉각시키는 과정을 거쳐 37℃에서 60분간 정치(incubation)하는 과정을 거치면서 접합시켰다. 페트리디쉬 바닥에 자란 세포주를 상기 1μM의 표지된 RNA 라이브러리 또는 압타머들과 결합 완충용액 (4.5g/L glucose, 5 mM MgCl2, 0.1 mg/ml yeast tRNA, 1 mg/ml BSA in Dulbecco's PBS) 상에서 45분간 4℃로 배양한 다음, 세척 완충용액 (4.5 g/L glucose, 5 mM MgCl2 in Dulbecco's PBS)으로 빠르게 2번 세척한 다음, 형광현미경 (fluorescence microscope: Olympus)로 형광을 400× 배율로 검출하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 초기 라이브러리의 풀의 경우 SK-BR-3 및 MDA-MB-231 세포주 모두 강한 친화도를 보이지 않는 것으로 나온 것과 달리, 본 발명에 따른 압타머들은 MDA-MB-231 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 최종 압타머 풀과 HER-2 특이적인 siRNA를 이용하여 HER-2 발현을 억제시킨 SK-BR-3 세포주를 이용해 음성 선별과정을 거쳐 수득한 최종 압타머 풀 모두 HER-2를 거의 발현하지 않는 세포주인 MDA-MB-231 세포주과 달리, HER-2 과발현 세포주인 SK-BR-3 세포주에 대하여 높은 결합 친화도를 보임을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 압타머가 HER-2 과발현 세포주를 특이적으로 인식하여 유방암의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
한편, 테스트한 압타머 중 특히 서열번호 7의 S6 압타머가 MDA-MB-231 세포주에 대하여 약하면서도 SK-BR-3 세포주에 대한 결합력은 가장 강한 것으로 나타났으며, 이에 S6 압타머에 대하여 이하의 실험을 수행하였다.
실시예 4: S6 압타머의 평형 여과법에 의한 HER -2 과발현 유방암 세포주에 대한 해리 상수( Kd ) 측정
실시예 3에서 확인한 S6 압타머의 2차 구조는 Mfold 프로그램을 사용하여 예측하였으며, 이는 도 5A와 같다.
한편, 상기 S6 압타머의 해리상수를 측정하기 위해 비선형 회귀분석을 수행하였다. 즉 결합 완충용액상의 희석한 S6 압타머 (10nM 에서 1μM 농도 범위) 및 RNA 라이브러리 풀을 1×105의 HER-2-과발현 SK-BR-3 세포주와 60mm 배양 접시에서 45분간 4℃에서 배양한 다음, 2차례 세척과정을 거친 후 세포를 수집한 다음, 실시예 1의 Cell-SELEX 공정과 동일하게 결합된 RNA들을 용출하였다. 그 후, 세포에 결합된 압타머의 양은 상기 실시예 2의 정량 PCR을 이용하여 정량하였다.
해리 상수를 산출하기 위하여, Sigmaplot 10.0 소프트웨어를 이용하여, 다음의 평형식으로 결합된 유방암 세포주 대 처음 넣어준 압타머 농도의 백분율을 계산한 후 비선형 회귀 분성을 통해 해리 상수를 산출하였다.
y=(B max ·ssRNA)/(K d +ssRNA)
이때, y는 포화도(saturation)의 정도이고, B max 는 최대결합지점의 수이고, K d 는 해리(dissociation) 상수이다.
그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, S6 압타머의 해리 상수는 94.6nM로 측정되어 HER-2-과발현 SK-BR-3 유방암 세포주에 강한 결합력을 보임을 확인할 수 있었다.
다만, S6 압타머가 HER-2를 타겟으로 하는 것이 아니라, HER-2를 거의 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포보다는 SK-BR-3에서 더 많이 발현되는 다른 어떤 수용체를 타겟으로 하는 것은 아닌지 확인하기 위하여 다음의 실험을 추가로 수행하였다.
실시예 4: S6 압타머의 HER -2에 대한 결합친화도 측정
4-1: 형광 검출을 통한 NIH -3 T3 / HER -2 ( NIH -3 T6 .7)에 대한 결합친화도 측정
S6 압타머가 HER-2를 타겟으로 하는지 확인하기 위하여, 추가적으로 인간 HER-2를 과발현시킨 NIH-3T3 세포주인 NIH-3T6.7 세포 (ATCC CCL-96) 및 HER-2를 발현하지 않는 NIH-3T3 세포주 (American Tissue Culture Collection) 에 대한 결합친화도를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 5' TAMRA 표지된 3' 프라이머를 이용한 형광검출을 수행하였다. 이때, NIH-3T3 세포주는 37℃의 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제(100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스텝토마이신; Gibco BRL)을 첨가한 DMEM 배지 (Gibco BRL)에서 배양하였고, NIH3T6.7 세포는 DMEM 배지에서 유지시켰다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, S6 압타머는 HER-2를 발현하지 않는 본래 세포주인 NIH-3T3 세포주에 비하여, NIH-3T6.7 세포 (HER-2를 과발현하는 NIH-3T3 세포; NIH-3T3/HER2)에 대하여 높은 친화도를 나타내는 것으로 확인되었다.
4-2: 정량 PCR 을 통한 NIH -3 T3 / HER -2 ( NIH -3 T6 .7)에 대한 결합친화도 측정
아울러, 인간 HER-2를 과발현시킨 NIH-3T3 세포주인 NIH-3T6.7 세포 및 HER-2를 발현하지 않는 NIH-3T3 세포주에 대한 결합친화도를 실시예 2와 동일한 방법으로 정량 PCR 방법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, 역시 S6 압타머는 HER-2를 발현하지 않는 본래 세포주인 NIH-3T3 세포주에 비하여, NIH-3T6.7 세포 (HER-2를 과발현하는 NIH-3T3 세포; NIH-3T3/HER2)에 대하여 높은 친화도를 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 실시예 4-1의 결과와 함께, S6 압타머의 타겟은 SK-BR-3 세포주 표면의 다른 단백질이 아니라, HER-2임을 제시한다.
도 7B는 NIH-3T3 세포주가 HER-2를 발현하지 않으나, NIH-3T6.7 세포주는 HER-2를 발현함을 보이는 웨스턴 블라팅 분석 결과로서 이는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to HER-2-overexpressing Breast Cancer Cell or Tissue and Use Thereof <130> P09-B203 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M11, S4 <400> 1 ucuagcucuc cucuagagug ggccucuaga guuugacug 39 <210> 2 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer S16 <400> 2 ucagcucucu ucuagagugg gccucuagag uuugacugg 39 <210> 3 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M9 <400> 3 agagagggau uggauaggcg ucugcguguc ucucugccac uacuaugggg 50 <210> 4 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M2, M5, M29 and S1 <400> 4 agagagagau uggauaggcg ucugcguguc ucucugccac uacuaugggg 50 <210> 5 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M8 <400> 5 ucgagugggc cuugagauug gauaacuggc gugucucucu gccacuacua ugggg 55 <210> 6 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer S15 and S17 <400> 6 uggaugggga gauccguuga guaagcgggc gugucucucu gccacuacua ugggg 55 <210> 7 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer S6 <400> 7 uggaugggga gauccguuga guaagcgggc gugucucucu gccgccuugc uaugggg 57 <210> 8 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M1 and S14 <400> 8 guaagacgag guucgccggc cucgcgauug gauuugcugg ucagucugcu uacuaugggg 60 60 <210> 9 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M16, S5, S10 and S27 <400> 9 guaagacgag guucgcccgc cucgcgauug gauuugcugg ucagucugcu uacuaug 57 <210> 10 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer S9 <400> 10 uucgaauggu uccucgucuu ccaagaucuu acuaugggg 39 <210> 11 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer M13 <400> 11 cuagugggcc uaggauugua ggcgagucuc cuuucuuacu augggg 46 <210> 12 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer S13 <400> 12 aagcaacucc ugccuuucua gcugcaaagu gggccuuugu 40 <210> 13 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common region of aptamer <400> 13 ucuagagugg gccucuagag uuugacuu 28 <210> 14 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common region of aptamer <400> 14 gcgugucucu cugccacuac uaugggg 27 <210> 15 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common region of aptamer <400> 15 gcgugucucu cugccgccuu gcuaugggg 29 <210> 16 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common region of aptamer <400> 16 gcgugucucu cugcc 15 <210> 17 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common region of aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> R means A or G. <400> 17 urcuaugggg 10 <210> 18 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library for Cell-SELEX <400> 18 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N40 upstream primer <400> 19 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N40 downstream primer <400> 20 agattgcact tactatct 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAMRA-labeled 3' primer <400> 21 agattgcact tactatct 18 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M11, S4 <400> 22 tctagctctc ctctagagtg ggcctctaga gtttgactg 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer S16 <400> 23 tcagctctct tctagagtgg gcctctagag tttgactgg 39 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M9 <400> 24 agagagggat tggataggcg tctgcgtgtc tctctgccac tactatgggg 50 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M2, M5, M29 and S1 <400> 25 agagagagat tggataggcg tctgcgtgtc tctctgccac tactatgggg 50 <210> 26 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M8 <400> 26 tcgagtgggc cttgagattg gataactggc gtgtctctct gccactacta tgggg 55 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer S15 and S17 <400> 27 tggatgggga gatccgttga gtaagcgggc gtgtctctct gccactacta tgggg 55 <210> 28 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer S6 <400> 28 tggatgggga gatccgttga gtaagcgggc gtgtctctct gccgccttgc tatgggg 57 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M1 and S14 <400> 29 gtaagacgag gttcgccggc ctcgcgattg gatttgctgg tcagtctgct tactatgggg 60 60 <210> 30 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M16, S5, S10 and S27 <400> 30 gtaagacgag gttcgcccgc ctcgcgattg gatttgctgg tcagtctgct tactatg 57 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer S9 <400> 31 ttcgaatggt tcctcgtctt ccaagatctt actatgggg 39 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer M13 <400> 32 ctagtgggcc taggattgta ggcgagtctc ctttcttact atgggg 46 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding RNA aptamer S13 <400> 33 aagcaactcc tgcctttcta gctgcaaagt gggcctttgt 40

Claims (19)

  1. 서열번호 9, 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 15~60nts의 핵산 압타머:
    여기서, 상기 핵산 압타머가 DNA인 경우에는, 상기 핵산서열에서 U는 T임을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 17로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 15 또는 16의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 17로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 3 내지 8, 10 및 11로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 1 또는 2의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  5. 제1항에 있어서, 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 압타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  7. 서열번호 9, 12, 13 및 17로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, HER-2에 특이적으로 결합할 수 있는 15~60nts의 핵산 압타머:
    여기서, 상기 핵산 압타머가 DNA인 경우에는, 상기 핵산서열에서 U는 T임을 특징으로 함.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호 17로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 15 또는 16의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  9. 제7항에 있어서, 서열번호 17로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 3 내지 8, 10 및 11로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  10. 제7항에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는 서열번호 1 또는 2의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  11. 제7항에 있어서, 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 압타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 유방암의 검출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산 압타머와 유방 조직, 유방 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨 중에서 선택되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 함유하는 유방암 진단용 조성물.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머가 고정되어 있는 유방암 진단용 센서.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 함유하는 유방암 진단용 키트.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 함유하는 유방암 치료용 조성물.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 함유하는 유방암 특이적 약물전달 조성물.
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