JP2018530994A - インスリン受容体アプタマーおよびこれを含む薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、インスリン受容体に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを有効成分として含有する糖尿病治療用組成物および糖尿病診断用組成物に関し、前記アプタマーは、既存のインスリンとは異なる結合機序を有することによって、癌発病率の増加および粥状動脈硬化のようなインスリンによる副作用を生じることなく、効果的に糖尿病を治療し診断できることを特徴とする。

Description

本発明は、インスリン受容体に特異的に結合するアプタマーおよびこれを用いてインスリン作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として使用することができ、またはインスリン受容体に関連する疾患の治療または診断用薬学組成物に関する。

インスリン受容体（ＩＲ、Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、チロシンキナーゼ受容体であって、インスリン、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２によって活性化される膜貫通受容体（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。インスリン結合部を含むα鎖（７１９残基）２個と膜貫通部を含むβ鎖（６２０残基）２個とがＳ−Ｓ結合で連結された４量体構造となっている。インスリンが受容体と結合すると、β鎖の細胞内領域にあるチロシンキナーゼ活性が活発になり、受容体チロシン残基のリン酸化が起こる。この自己リン酸化が他の蛋白質のリン酸化を起こす。

インスリン受容体が活性化される場合、グルコース吸収を引き起こすが、インスリン受容体の信号伝達が減少する場合、グルコースの吸収が阻害され、第２糖尿またはこれに関連する合併症および過血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）などが引き起こされる。

アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、ペプチドからなる抗体とは異なって４種類の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなり、そのシーケンスの組み合わせに応じて対象蛋白質に対する特異性を示す物質である。対象蛋白質に特異的なアプタマーは、試験管でＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により作られるが、この過程は、ランダムな組み合わせから構成されたアプタマーのプール（ｐｏｏｌ）で精製された蛋白質に特異的に結合するアプタマーを探し、ＰＣＲにより増幅する過程を含む。代表的な単鎖ＤＮＡアプタマー新薬のペガプタニブは、血管表皮成長因子を対象として血管表皮成長因子が血管表皮成長因子受容体に結合することを妨げる抗癌剤であって、ＦＤＡの承認を受けて臨床に使用されている。

現在、機能的アプタマーを発掘するためのほとんどの努力は、標的に対するアプタマーの阻害能力に焦点が当てられている。特に、臨床的応用のために標的分子の活性を妨げる多様な種類の阻害性アプタマー（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｐｔａｍｅｒ）が疾病治療のために開発されてきた（ｅ．ｇ Ｍａｃｇｅｎ，ＡＳ１４１１）。しかし、分子間の相互作用は必然的に構造的な変化を伴う点を踏まえた時、もし、アプタマー−蛋白質結合が蛋白質の適切な構造変化を誘導することができれば蛋白質機能の活性化が可能になると見られる。したがって、理論的にアプタマーは、特定の蛋白質−蛋白質結合を模倣することによって、機能的作用剤としての役割を果たせる潜在力を有する。しかし、現在、標的の機能を活性化させるアゴニストアプタマーの開発は難題として残されている。

また、今日、糖尿病患者の血糖を正常に調節するために多くの種類のインスリン誘導体が開発されて使用されているが、インスリンはブドウ糖吸収以外にも細胞分裂を誘導し、いくつかのインスリン誘導体に導入されたアミノ酸配列の変化はＩＧＦ−１受容体に対する結合力と活性化を増加させる。したがって、糖尿病治療のための長期間のインスリン投与は、逆に癌発生率を高めることがあり、粥状動脈硬化のようなインスリンによる副作用への懸念が持続的に提起されてきた。また、いくつかの疫学調査により持続したインスリン投与と癌発病率の増加との間に有意な相関関係があるという内容も報告された。したがって、細胞分裂を誘導せず、ブドウ糖吸収のみを増加させるインスリン受容体に対するバイアスアゴニスト（ｂｉａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）の開発は、インスリン投与に対する良い代案を提示するであろう。

したがって、インスリン受容体に特異的に結合するアプタマーおよびこれを用いた糖尿病の治療または診断技術の開発が求められる。

そこで、本発明は、インスリン受容体に特異的に結合し、５’−位置が疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシルを含む、インスリン受容体アプタマーを提供することを目的とする。

また、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを有効成分として含む糖尿病治療用組成物、前記インスリン受容体アプタマーの薬学的有効量を糖尿病患者に投与する段階を含む糖尿病の治療方法および糖尿治療のための用途を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを有効成分として含む糖尿病診断用組成物、および糖尿病診断のための用途を提供することを目的とする。

なお、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを用いて糖尿病の診断に情報を提供する方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明は、インスリン受容体の細胞外領域（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）に特異的に結合し、インスリン受容体のリン酸化を促進する、インスリン受容体アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を提供する。

本明細書において、インスリン受容体アプタマーとは、インスリンに特異的な親和度で結合できるアプタマーを意味する。前記インスリン受容体は、ヒトインスリン受容体蛋白質に由来するものであってもよいが、これに限定されない。

前記インスリン受容体アプタマーは、５’−位置が疎水性官能基で置換されている修飾された塩基を含むことができる。前記アプタマーは、２５〜９０個、好ましくは２７〜８０個、さらに好ましくは２７〜３３個の塩基からなり、インスリン受容体に特異的に結合することを特徴とする。前記修飾された塩基以外の本発明のインスリン受容体アプタマーに使用される塩基は、特別な言及がない限り、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびこれらのデオキシ形態の塩基からなる群より選択されたものである。

インスリン受容体アプタマーの前記修飾された塩基の個数は、５〜１５個、好ましくは６〜８個であってもよい。

好ましくは、前記アプタマーは、ＩＲ−Ａ４８と命名された配列番号１の塩基配列内の配列番号２の塩基配列を含み、両側に連続する３３個〜８０個のヌクレオチドである、インスリン受容体アプタマーであるか、ＩＲ−Ａ６２と命名された配列番号６の塩基配列内の配列番号７の塩基配列を必須として含み、配列番号７の塩基配列の両側に連続する２７個〜７９個または２７個〜８０個のヌクレオチドを追加的に含む、インスリン受容体アプタマーであってもよい。

さらに好ましくは、前記アプタマーは、配列番号１の塩基配列内の配列番号２の塩基配列を含み、両側に連続する３３個〜８０個の塩基配列からなるインスリン受容体アプタマー、または配列番号６の塩基配列内の配列番号７の塩基配列を必須として含む２７個〜７９個、または２７個〜８０個の塩基配列からなるインスリン受容体アプタマーであってもよい。

前記塩基配列は、アプタマーの結合力と特異性を高めるために、前記アプタマーに含まれているヌクレオチドの塩基の５’−位置が疎水性官能基で置換されたものであってもよい。例えば、可変領域のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）塩基の５’−位置が疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシル、例えば、５−［Ｎ−（１−ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ］−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（Ｎａｐ−ｄＵ）を可変領域に８個含む。前記疎水性官能基は、ナフチル基、ベンジル基、ピロールベンジル基、またはトリプトファンを含むことができ、さらに好ましくは、前記疎水性官能基は、ナフチル基である。

好ましくは、前記インスリン受容体アプタマーは、内部のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造を形成することができる。さらに好ましくは、前記ステム−ループ構造は、２７個または３３個のヌクレオチドから構成されたものであってもよい。

具体的には、前記３３個のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造は、ＩＲ−Ａ４８Ｆと命名された配列番号１の塩基配列のうち１５〜４７番目の塩基によって形成され、前記１５番目〜４７番目のヌクレオチドからなる塩基配列は、配列番号２であってもよい。また、前記２７個のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造は、ＩＲ−Ａ６２Ｆと命名された配列番号６の塩基配列のうち２６〜４５番目の塩基によって形成され、前記２６番目〜４５番目の塩基から構成されたステム−ループ構造の両端に追加のヌクレオチドを含む塩基配列は、配列番号１の２２番目〜４８番目の塩基を含む配列番号７であってもよい。

本発明者らは、前記インスリン受容体アプタマーがインスリン受容体と非常に類似の構造を有するＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）受容体には結合せず、インスリン受容体に特異的に結合することを確認した。具体的には、本発明のＩＲ−Ａ４８と命名されたインスリン受容体アプタマーは、インスリンと相異なる位置で非競争的に結合可能であり、インスリン受容体と結合時の解離定数（Ｋｄ）が１ｎｍ〜２０ｎＭであり、好ましくは約３．５〜６．９ｎＭである。ＩＲ−Ａ６２と命名されたインスリン受容体アプタマーは、インスリンと促進的相互作用（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ）によりインスリンの結合を増加させることができ、インスリン受容体と結合時の解離定数（Ｋｄ）が０．５ｎＭ〜４０ｎＭであり、好ましくは約２．４〜２６．９ｎＭである。

本発明者らは、ＳＥＬＥＸ方法を利用してインスリン受容体に結合するアプタマーを発掘し、発掘されたアプタマーがインスリン受容体と結合してインスリン受容体をリン酸化したことを確認した。

インスリンが受容体と結合すると受容体チロシン残基がリン酸化されるが、インスリン受容体のリン酸化は、信号伝達により脂肪細胞と筋肉でグルコース輸送担体４型（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ４；ＧＬＵＴ４）の移動を調節してブドウ糖吸収を増加させる。このようなインスリン受容体による代謝機能は主にＩＲＳ−ＡＫＴ経路によって調節され、また、インスリンの信号伝達過程で、ＰＩ３ＫはＡＫＴのリン酸化に重要な役割を果たす。公知のＰＩ３Ｋ阻害物質のＬＹ２９４００は、ＡＫＴのリン酸化だけでなく、ブドウ糖吸収のようにＡＫＴによって誘導される細胞機能を完全に遮断する。

本発明によるインスリン受容体アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を促進し、具体的には、インスリン受容体のＹ１１５０を優先的にリン酸化し、その後、ＡＫＴ Ｓ４７３のリン酸化を促進させてインスリンレベルにブドウ糖を吸収することができる。本発明者らは、前記リン酸化およびブドウ糖吸収がＰＩ３Ｋを介して誘導されることを確認した。

ＭＡＰＫ経路は、インスリン受容体を介して誘導される代表的な信号伝達経路であり、細胞分裂に重要な役割を果たし、インスリンもいくつかの癌細胞株で細胞分裂を誘導することがよく知られている。本発明者らは、前記インスリン受容体アプタマーは、インスリンの作用剤としてブドウ糖吸収（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ）を行えるものの、しかし、インスリンとは異なって細胞分裂に影響を及ぼさないことを確認した。したがって、本発明によるインスリン受容体アプタマーは、インスリンとは異なってＭＡＰＫ経路を活性化させず、好ましくは、ＭＡＰＫ経路の活性化によるインスリン疾患に影響を及ぼさず、さらに好ましくは、癌細胞の成長による癌発生率の増加と血管平滑筋細胞の成長による粥状動脈硬化に影響を及ぼすことなく、血糖調節をするのに有用に使用できる。

また、前記アプタマーは、血清内の安定性を増進させたり腎クリアランス（ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を調節するために、５’末端、３’末端、中間または両末端に位置する塩基を少なくとも１つ以上修飾することができる。前記修飾は、５’末端、３’末端、中間または両末端に、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ビオチン、ｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、２’−メトキシヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシド、２’Ｆ−ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、およびコレステロールなどからなる群より選択された１種以上が結合して修飾されたものであってもよい。２’−メトキシヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシドまたは２’Ｆ−ヌクレオシドは、アプタマーに含まれている塩基に結合して修飾された塩基を提供することによって、ヌクレアーゼ抵抗性（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を付与する。

好ましくは、前記アプタマーは、ヌクレアーゼ抵抗性を確保して最適化されたｉｎ ｖｉｖｏ投与のために修飾された塩基を含むことができ、さらに好ましくは、前記修飾は、２’−ＯＭｅ（メトキシ）または２’−Ｆ（フッ素）であってもよい。

本発明による２以上のアプタマーが連結されて二量体（ｄｉｍｅｒ）あるいは多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）として存在し得る。

本願で使用されるもので、用語「インスリン受容体の作用剤」は、インスリン受容体に選択的に結合する薬学的に許容可能な製剤を示す。通常、インスリン受容体の作用剤は、効果的に血糖を調節するために開発された新たな種類の糖尿病治療剤を示す。本発明のインスリン受容体の作用剤は、インスリン受容体に特異的に結合するだけでなく、癌発生の副作用がない特徴がある。

したがって、前記インスリン受容体の作用剤は、インスリンに関連する多様な疾病の診断または治療用途に使用できる。

そこで、本発明の他の例は、前記アプタマーをインスリン受容体の作用剤として含むインスリンと関連疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。さらに他の例は、前記アプタマーをインスリン受容体の作用剤として含むインスリンと関連疾患の診断用組成物に関する。前記組成物は、インスリンを追加的に含んでもよい。前記インスリン関連疾患は、糖尿病、糖尿合併症、代謝性症候群、肥満、心血管疾患などを含むことができる。

前記薬学組成物は、多様な経口投与形態または非経口投与形態に剤形化される。例えば、錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）などの任意の経口投与用剤形になってもよい。このような経口投与用剤形は、各剤形の通常の構成により、前記有効成分のほか、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンなどの希釈剤や、シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどの滑沢剤などの製薬上許容可能な担体を含むことができる。

また、前記経口投与用剤形が錠剤の場合、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリジンなどの結合剤を含むことができ、場合によって、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤や、沸騰混合物および／または吸収剤、着色剤、香味剤または甘味剤などを含んでもよい。

そして、前記薬学組成物は、非経口投与形態に剤形化されてもよいが、この場合、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射などの非経口投与方法によって投与される。この時、前記非経口投与用剤形に製剤化するために、前記薬学組成物は、有効成分、つまり、化学式Ｉの誘導体またはその薬学的に許容可能な塩が安定剤または緩衝剤と共に水で混合されて溶液または懸濁液に製造され、このような溶液または懸濁液がアンプルまたはバイアルの単位投与型に製造される。

また、前記薬学組成物は、滅菌されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤をさらに含んでもよく、その他治療的に有用な物質をさらに含んでもよいし、混合、顆粒化またはコーティングの通常の方法により製剤化される。

本発明の薬学組成物の投与対象は、ヒトを含む哺乳類であってもよいし、好ましくは、げっ歯類、またはヒトであってもよい。

他の側面から、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを用いて糖尿病の診断に情報を提供する方法を提供する。

前記糖尿病の診断に情報を提供する方法は、
分離された生物学的試料を準備する段階と、
前記生物学的試料に、本発明によるインスリン受容体アプタマーを反応させる段階と、
前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階とを含み、
生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度が正常な試料より高い場合、糖尿病であると診断することを特徴とするものであってもよい。

前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階は、関連技術分野で通常使用されるＤＮＡアプタマー結合測定技術を利用して行われ、例えば、インスリン受容体アプタマーの末端に蛍光または放射性物質を標識して蛍光または放射性強度を測定したり、イメージ化して観察する方法などを利用することができるが、これらに制限されるわけではない。

本発明のインスリン受容体アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を促進させてブドウ糖吸収を増加させながらも、インスリン受容体の代謝機能のみを選択的に誘導するバイアスアゴニスト（Ｂｉａｓｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ）として機能することができる。それだけでなく、癌発病率の増加などのようなＭＡＰＫ経路の活性化による各種インスリンによる疾患を起こすことなく、インスリン受容体を介して血糖を調節することができる。

図１Ａは、ＩＲ−Ａ４８ＦおよびＩＲ−Ａ４８アプタマーの配列を示すものである。 図１Ｂは、実施例１．６のＭｆｏｌｄプログラムによって予測されたアプタマーの２次構造であって、ＩＲ−Ａ４８のヌクレオチドがステム−構造を形成することを示すものである。 図１Ｃは、実施例２．３のＩＲ−Ａ４８ＦまたはＩＲ−Ａ４８がインスリン受容体またはＩＧＦ−１受容体に結合するか否かを測定した結果である。 図１Ｄは、ＩＲ−Ａ６２ＦおよびＩＲ−Ａ６２アプタマーの配列を示すものである。 図１Ｅは、実施例１．６のＭｆｏｌｄプログラムによって予測されたアプタマーの２次構造であって、ＩＲ−Ａ６２のヌクレオチドがステム−構造を形成することを示すものである。 図１Ｆは、実施例２．３のＩＲ−Ａ６２ＦまたはＩＲ−Ａ６２がインスリン受容体またはＩＧＦ−１受容体に結合するか否かを測定した結果である。 図２Ａは、インスリン受容体を過発現させているＲａｔ−１ 線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（Ｒａｔ−１／ｈＩＲ）に、ＦＩＴＣ−インスリン（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）とＩＲ−Ａ４８を０．１、０．２５、および１μｍの濃度で処理して、ＦＩＴＣ蛍光変化を特定した実施例２．２の実験結果を示すものである。 図２Ｂは、実施例３．２のＲａｔ−１／ｈＩＲ細胞においてインスリンおよびＩＲ−Ａ４８によるＩＲＳ、ＡＫＴ、ＥＲＫのリン酸化の有無を確認した結果を示すものである。 図２Ｃは、インスリン受容体を過発現させているＲａｔ−１ 線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（Ｒａｔ−１／ｈＩＲ）に、ＦＩＴＣ−インスリン（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）とＩＲ−Ａ６２を０．０２、０．１、０．２５、０．５および１マイクロメートルの濃度で処理して、ＦＩＴＣ蛍光変化を特定した実施例２．２の実験結果を示すものである。 図２Ｄは、実施例３．２のＲａｔ−１／ｈＩＲ細胞においてインスリンおよびＩＲ−Ａ６２によるＩＲＳ、ＡＫＴ、ＥＲＫのリン酸化の有無を確認した結果を示すものである。 図３Ａは、実施例３．３のインスリン、ＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２によるインスリン受容体内のＹ９６０、Ｙ１１４６、Ｙ１１５０、Ｙ１１５１、Ｙ１３１６およびＹ１３２２のリン酸化の有無を確認した結果を示すものである。 図３Ｂは、実施例３．３のインスリン受容体に対する抗体である１０Ｃ３とｐＡｂのＹ１１５０、Ｙ１１５１およびＹ１１５０／Ｙ１１５１のリン酸化に対する結合特異性を測定した結果である。 図３Ｃは、ＨｅＬａ細胞においてＩＧＦ−１受容体のリン酸化を観察した結果である。 図４Ａは、実施例３．４のインスリン（５０ｎｍｏｌ／Ｌ）が処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてインスリン受容体蛋白質のリン酸化の有無を確認した結果を示すものである。 図４Ｂは、インスリンおよびＩＲ−Ａ４８によってＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化の有無を定量化した実施例３．４の実験の結果である。 図４Ｃは、インスリンおよびＩＲ−Ａ４８によってＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化の有無を定量化した実施例３．４の実験の結果である。 図４Ｄは、インスリンおよびＩＲ−Ａ４８によってＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のリン酸化の有無を定量化した実施例３．４の実験の結果である。 図５Ａは、実施例５のＭＣＦ−７細胞にインスリンおよびＩＲ−Ａ４８をそれぞれ処理して、細胞成長に及ぼす影響を確認した結果である。 図５Ｂは、ＭＣＦ−７細胞にインスリンおよびインスリンとＩＲ−Ａ４８との混合物をそれぞれ処理して、ＩＲ Ａ４８がインスリンによる細胞成長に及ぼす影響を確認した結果である。 図５Ｃは、ＭＣＦ−７細胞においてインスリンおよびＩＲ−Ａ４８がインスリン受容体のＹ１１５０およびＡＫＴ Ｓ４７３をリン酸化させるか否かを確認した結果を示すものである。 図６Ａは、実施例４．１の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にインスリン、ＩＲ−Ａ４８およびインスリンとＩＲ−Ａ４８との混合物を処理し、時間に応じたブドウ糖吸収を示すグラフである。 図６Ｂは、インスリンとＩＲ−Ａ４８の濃度に応じた活性を測定するために、それぞれ３０分および４時間処理した後、ブドウ糖吸収を観察した実施例４．１の結果である。 図６Ｃは、実施例４．２のＩＲ−Ａ４８の活性がＰＩ３Ｋを介して伝達されるかを確認するために、３Ｔ３−Ｌ１でＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）を１時間前処理した後、ＩＲ−Ａ４８（２時間処理）およびインスリン（３０分処理）によるブドウ糖吸収の増加を比較調査した結果である。 図６Ｄは、ＩＲ−Ａ４８の活性がＰＩ３Ｋを介して伝達されるかを確認するために、３Ｔ３−Ｌ１でＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）を１時間前処理した後、ＩＲ−Ａ４８（２時間処理）およびインスリン（３０分処理）によるＡＫＴのリン酸化を比較調査した結果である。 図７は、実施例６の０．６Ｕ／ｋｇのインスリンおよび２．５、５、１０ｍｇ／ｋｇのＩＲ−Ａ４８をマウスに投与した後、１２０分間血糖変化を観察した結果である。

以下、実施例を挙げて本発明の構成および効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実施例は本発明に対する理解のために例示の目的として提供されたものに過ぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるわけではない。

抗体および試薬の準備
ヒトインスリン受容体蛋白質は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｅ、ＭＮ）から購入して使用した。使用されたアプタマーは、Ａｐｔａｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｈａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）とＳＴ Ｐｈａｒｍ（Ｓｉｈｅｕｎｇ、Ｋｏｒｅａ）により合成された。ウェスタンブロットの際に使用した抗体は、次の通りである：Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、Ａｎｔｉ−ＡＫＴ、Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）、Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦｏｘＯ１／３ａ（Ｔ２４／Ｔ３２）、およびａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＳ１６０（Ｔ６４２）（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。Ａｎｔｉ−ＩＲ β−ｓｕｂｕｎｉｔ（Ｃ−１９）、ａｎｔｉ−ＩＧＦ−１Ｒ β−ｓｕｂｕｎｉｔ（Ｃ−２０）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（１０Ｃ３、Ｙ１１５０／Ｙ１１５１）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲＳ１（Ｙ６３２）、およびａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｈｃ（Ｙ２３９／Ｙ２４０）抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌｏｇｙ、Ｓｎａｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入する。Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ（４Ｇ１０）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲＳ１（Ｙ６１２）ｈｕｍａｎ／（Ｙ６０８）ｍｏｕｓｅ、およびａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（Ｙ１１４６）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（Ｙ９６０）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（ｐＡｂ、Ｙ１１５０／Ｙ１１５１）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（Ｙ１３１６）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（Ｙ１３２２）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＲ（Ｙ１１４６／Ｙ１１５０／Ｙ１１５１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。

細胞培養および分化
ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株、ヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ２９３、マウス脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。インスリン受容体が過発現したＲａｔ−１線維細胞（Ｒａｔ−１／ｈＩＲ）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＮｉｃｈｏｌａｓ Ｊ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ博士から提供された。ＭＣＦ７、ＨＥＫ２９３、Ｒａｔ−１／ｈＩＲは、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、およびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）にて、３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で培養した。３Ｔ３−Ｌ１は、０％Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、およびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）にて、３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞分化のために飽和状態に成長した細胞を２日間さらに培養した後、１μＭ デキサメタゾン、５００ｎＭ ＩＢＭＸ、８５０ｎＭインスリンと１０％ＦＢＳが含まれているＤＭＥＭを２日間処理した。その後、８５０ｎＭインスリンと１０％ＦＢＳが含まれているＤＭＥＭを２日間処理し、１０％ＦＢＳのみが含まれているＤＭＥＭを脂肪細胞への分化が完了するまで５〜６日間処理した。

実施例１：インスリン受容体アプタマーの発掘
ＳＥＬＥＸを用いてインスリン受容体の細胞外領域に結合するアプタマーを発掘した。４０ｍｅｒの可変配列と両側に２０ｍｅｒずつ存在する不可変配列とから構成された単鎖ＤＮＡライブラリー（配列番号３）を用いてＳＥＬＥＸを進行させた。

１．１．修飾された核酸ライブラリーの合成
ＳＥＬＥＸに必要な単鎖修飾ＤＮＡライブラリーを製造するために、５’にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）の結合したアンチセンスライブラリー（配列番号３）を合成した。アンチセンスライブラリーを、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、Ｂｚ−ｄＵ）、０．２５Ｕ／ｕｌのＫＯＤ ＸＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０Ｘ伸長緩衝液（１．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、７０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）上で、７０℃１時間、５０ｕＭの逆方向プライマー（配列番号４）と反応させて、二重螺旋ＤＮＡを製造した。これに、２０ｍＭ ＮａＯＨを用いて単鎖修飾ＤＮＡライブラリーを溶出した後、ＨＣＬ溶液で中和した。製造されたＤＮＡライブラリーは、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した後、ＵＶ分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で定量した。

１．２．インスリン受容体との結合
前記合成されたライブラリー１ｎｍｏｌｅを選択緩衝液（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に入れて、９５℃、７０℃、４８℃、３７℃でそれぞれ５分間反応させた後、陰性選択（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のために、１０Ｘ蛋白質競争緩衝液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１０μＭ プロトロンビン、１０μＭ カゼイン、０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、ＳＩＧＭＡ）１０μＬを混合した後、上澄液の除去されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅ^Ｔｍ ストレプトアビジン Ｃ１（ＳＡビーズ）（５０％（ｖ／ｖ）スラリー、１０ｍｇ／ｍｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加して、３７℃で１０分間反応させた。

陰性選択反応後、上澄液のみを取って新しいチューブに移した後、Ｈｉｓ ｔａｇの結合したインスリン受容体蛋白質と結合させたＤｙｎａｂｅａｄ ＴＡＬＯＮに、３７℃で１時間反応させた。１００μＬで選択緩衝液（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）ＤＮＡとインスリン受容体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ ＴＡＬＯＮを５回洗浄した。５回洗浄時には新しいプレートに移して洗浄した。２ｍＭ ＮａＯＨ溶液８５μＬを添加して標的に結合するライブラリーを溶出した後、８ｍＭ ＨＣｌ溶液２０μＬで中和した。

１．３．増幅
標的に結合するライブラリーＤＮＡをＱＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ＩＱ５ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて増幅した。先にライブラリーの製造に使用された逆方向プライマー（配列番号４）とアンチセンスライブラリー（配列番号３）を、それぞれ５ｕＭ（５Ｘ ＱＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｎｏｖａｇｅｎ）、０．０７５Ｕ／ｕｌ ＫＯＤ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ＸＳＹＢＲｇｒｅｅｎＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の総体積が１２５μＬとなるように混合して、９６℃１５秒、５５℃１０秒、６８℃３０分の条件で１回、そして、９６℃１５秒、７２℃１分の条件で３０回繰り返して、二重鎖ライブラリーを製造した。

１．４．ｅＤＮＡの製造
ｅＤＮＡは、酵素ＤＮＡでＤＮＡ鋳型とポリメラーゼを用いて生産したアプタマーを意味する。前記ＱＰＣＲにより作られたＤＮＡライブラリーを、２５μＬ Ｍｙｏｎｅ ＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に常温で１０分間混合して固定した。この時、混合されたＤＮＡの量は、ＱＰＣＲ産物で６０ｕｌとした。２０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を添加して、単鎖ＤＮＡとして作った。そして、実施例１．１のライブラリーの製造と同様の方法で修飾された核酸を含むＤＮＡを合成して次回に使用した。ＳＥＬＥＸの一通りの手順を計８回行い、より選択的な結合のために、４回から６回まで、そして、７回から８回まで、それぞれＤＮＡと蛋白質（インテグリンαＶβ３）の複合体を１０ｍＭ ＤｘＳＯ４（ｓｉｇｍａ）溶液に１／２００、１／４００に希釈して、ＤＮＡアプタマーを選別した。

１．５．アプタマー塩基配列の分析
ＳＥＬＥＸの一通りの手順を８回経た後、その結果物をＱＰＣＲ方法で二重鎖ＤＮＡに増幅した後、ＴＡクローニングキット（ＳｏｌＧｅｎｔ）を用いてクローニングした。そして、ベクター上に存在するＭ１３プライマー（配列番号５）をもってシーケンシングして、アプタマーの配列を得た。

１．６．最適なアプタマー配列の決定
アプタマーを探すために、発掘されたアプタマー（１ｕＭ）をインスリン受容体が過発現しているＨＥＫ２９３細胞に処理して、ＡＫＴ Ｓ４７３のリン酸化が増加するかを分析した。ほとんどのアプタマーは効果がなかったが、発掘されたＩＲ−Ａ４８ＦおよびＩＲ−Ａ６２Ｆアプタマーは、ＡＫＴのリン酸化を大きく増加させた。ＩＲ−Ａ４８ＦおよびＩＲ−Ａ６２Ｆの配列は、可変領域に８個のＮａｐ−ｄＵを含む８０ｍｅｒで構成されているが（図１Ａ、図１Ｄ）、標的との結合に必要なアプタマーの最小配列を探すために、アプタマーの２次構造に基づいてアプタマー配列の最小化を行った。

Ｍｆｏｌｄプログラムによって予測されたＩＲ−Ａ４８Ｆアプタマーの２次構造は図１Ｂに示し、６個のＮａｐ−ｄＵを含むアプタマー内部の３３個のヌクレオチドが安定したステム−ループ構造を形成する。Ｍｆｏｌｄプログラムによって予測されたＩＲ−Ａ６２Ｆアプタマーの２次構造は図１Ｅに示し、６個のＮａｐ−ｄＵを含むアプタマー内部の２７個のヌクレオチドが安定したステム−ループ構造を形成する。

前記実験の結果、標的に対する結合分析により、この内部のステム−ループ配列（ＩＲ−Ａ４８）（３．５ｎＭ Ｋｄ）がＩＲ−Ａ４８Ｆ（６．９ｎＭ Ｋｄ）と似たレベルでインスリン受容体に結合することを確認した。また、ＩＲ−Ａ４８は、インスリン受容体と非常に類似の構造を有するインスリン類似成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１、ＩＧＦ−１）受容体は結合しないことから、インスリン受容体に対して非常に高い特異性を有することを確認した。同様に、１０Ｃ３抗体を用いてＩＲ−Ａ４８がＩＧＦ−１受容体のリン酸化に及ぼす影響を調べた結果、結合特異性と一致して、ＩＲ−Ａ４８は、インスリンとは異なってＩＧＦ−１受容体のリン酸化に何ら影響を及ぼさなかった。前記結果を図１Ｃおよび図３Ｃに示した。

また、標的に対する結合分析により、この内部のステム−ループ配列（ＩＲ−Ａ６２）（２．４ｎＭ Ｋｄ）がＩＲ−Ａ４８Ｆ（２６．９ｎＭ Ｋｄ）と似たレベルでインスリン受容体に結合することを確認した。さらに、ＩＲ−Ａ６２は、インスリン受容体と非常に類似の構造を有するインスリン類似成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１、ＩＧＦ−１）受容体は結合しないことから、インスリン受容体に対して非常に高い特異性を有することを確認した。同様に、１０Ｃ３抗体を用いてＩＲ−Ａ６２がＩＧＦ−１受容体のリン酸化に及ぼす影響を調べた結果、結合特異性と一致して、ＩＲ−Ａ６２は、インスリンとは異なってＩＧＦ−１受容体のリン酸化に何ら影響を及ぼさなかった。前記結果を図１Ｆおよび図３Ｃに示した。

以降のすべての実験は、最小化が進んだＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２を用いて行った。

１．７．アプタマーの合成および精製
アプタマーは、核酸専用の固相合成器であるＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社のＭｅｒｍａｄｅ１２合成器を用いて、オリゴ固相合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｌｉｇｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法で自体合成した。オリゴヌクレオチド合成器（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｍａｄｅ１２）を用いてβ−シアノエチル ホスホロアミダイト固相化学反応（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｂ−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で合成し、合成後、ＣＰＧ（２００ｎｍｏｌｅ 合成カラム、１０００Ａ（ＭＭ１−１０００−））を開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）溶液［ｔ−ブチルアミン：メタノール：水（体積比１：１：２）］に入れて、７０℃で５時間開裂／脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）後に真空乾燥させた後、ＨＰＬＣ（ＧＥ、ＡＫＴＡ ｂａｓｉｃ）を用いて分離／精製した。使用したカラムは、ＲＰ−Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ １０ｘ５０ｍｍ）であり、ＵＶ２５４ｎｍ／２９０ｎｍ、流速：５ｍｌ／分、温度：６５℃の条件で、０．１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル緩衝液を用いた。これらのアプタマーはいずれも、ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ分光計（Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗａｔｅｒｓ）＋Ｑｔｒａｐ２０００（ＡＢＩ））で０．０２％の誤差範囲内で正確な分子量を測定し、ＨＰＬＣを用いた純度測定から８０−９０％を得ることができた。

実施例２：インスリン受容体アプタマーの結合特性
２．１．細胞実験のための準備
アプタマーを処理する前、血清欠乏のために、細胞をＦＢＳのないＤＭＥＭに３時間処理した。以降、１時間、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝液［２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、および１．３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４］に細胞処理した。細胞処理のためのすべてのアプタマーは、同一のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝液に準備され、正確な２次構造形成のために、９５℃で５分間加熱して、常温でゆっくり冷やす過程を経た。

２．２．インスリン競合分析（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２のインスリン受容体に対する結合特性を調べるために、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてインスリン競合分析（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を進行させた。Ｒａｔ−１／ｈＩＲ細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡが含まれているＰＢＳを用いて細胞培養容器から引き離した。準備された細胞にブロッキング緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、および０．１％ＮａＮ３）を処理して、４℃で３０分間、２０ｒｐｍで回転して反応させた。以降、ＦＩＴＣの結合したインスリンを多様な濃度のＩＲ−Ａ４８と共に処理して、それぞれの結合が平衡状態に至るように、４℃で１時間反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗った後、４％パラホルムアルデヒドが含まれているＰＢＳで常温に３０分間固定させた。細胞に結合したインスリンの量をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ^ＴＭ ＩＩ）によりＦＩＴＣの蛍光を測定することによって観察した。

その結果、ＩＲ−Ａ４８は、アゴニストとして活性を有するにもかかわらず、インスリンの結合を妨げないことを確認した（図２Ａ）。これは、ＩＲ−Ａ４８がインスリンの結合するオルソステリックサイト（ｏｒｔｈｏｓｔｅｒｉｃ ｓｉｔｅ）でない、完全に異なるアロステリックサイト（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｓｉｔｅ）に結合するとの意味を有する。ＩＲ−Ａ６２は、アゴニストとして活性を有するにもかかわらず、インスリンの結合を増加させる促進的相互作用（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ）を有することを確認した（図２Ｃ）。

２．３．フィルタ結合分析（ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
選別されたアプタマーの結合力を調べるために、フィルタ結合分析法（ｆｉｌｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。まず、アプタマーの５’末端にＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＥＢ）でα−Ｐ３２ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を標識した。アプタマー１μＭ０．２５μＬ、α−Ｐ３２ＡＴＰ（５μＭ、ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）、０．２５μＬ、ＴｄＴおよび１０Ｘ ＮＥＢ緩衝液４ １０μＬ 反応体積で３７℃で３０分間反応させ、７０℃で１０分間インキュベーションして、ＴｄＴを不活性化させた。標識されたＤＮＡプールは、Ｍｉｃｒｏ ｓｐｉｎ Ｇ−５０ カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

標識されたアプタマー２０，０００ｃｐｍを１００μＬ １ｘＳＢ緩衝液（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に入れて、９５℃から１秒に０．１℃ずつ３７℃までゆっくり冷却させた。そして、緩衝液（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を用いて、インスリン受容体蛋白質を１００ｎＭから１２ｐｏｉｎｔで順次に希釈した後、前記加熱および冷却させたＤＮＡプール３０μＬをそれぞれ添加して、３７℃で３０分間反応させた。ナイロンメンブレン（Ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＤＮＡとインテグリンαＶβ３との混合物をそれぞれ２μＬずつスポッティングした後、ｚｏｒｂａｘ樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ）５．５μＬを添加した。そして、予め１Ｘ ＳＢ緩衝液（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）５０μＬに浸しておいたＤｕｒａｐｏｒｅフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れて、減圧をかけた。そして、メンブレンフィルタを１００μＬの１Ｘ選択緩衝液（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で洗った。フィルタプレートをイメージプレートに一晩露出させた後、ＦＬＡ−５１００（Ｆｕｊｉ）でイメージを定量化した。

その結果、ＩＲ−Ａ４８およびＩＲ Ａ４８ＦのＫｄはそれぞれ３．５ｎＭおよび６．９ｎＭであり、ＩＲ−Ａ４８はインスリン受容体には結合したが、ＩＧＦ−１受容体には結合しないことを確認することができた。前記結果を図１Ｃに示した。

また、その結果、ＩＲ−Ａ６２およびＩＲ−Ａ６２ＦのＫｄはそれぞれ２．４ｎＭおよび２６．９ｎＭであり、ＩＲ−Ａ６２はインスリン受容体には結合したが、ＩＧＦ−１受容体には結合しないことを確認することができた。前記結果を図１Ｆに示した。

実施例３：インスリン受容体アプタマーのリン酸化
３．１．ウェスタン ブロッティング
インスリン受容体および信号伝達蛋白質のリン酸化を観察するために、溶解緩衝溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ β−グリセロリン酸、２ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル］に細胞を溶解させた。細胞溶解物は、９５℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して蛋白質を分離した。準備された細胞溶解物は６％〜１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移された。膜に１次抗体を４℃で１２時間反応させた後、ＨＰＲ（ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））あるいはＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ）の結合した２次抗体を常温で１時間反応させた。蛋白質の存在およびリン酸化の程度は、ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）を介したＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅあるいはＩｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｄｙｓｓｅｙ、ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて測定された。

３．２．インスリン受容体のリン酸化
実施例１のＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２アプタマーがインスリンの結合に及ぼす影響を調べるために、ＩＲ−Ａ４８、ＩＲ−Ａ６２およびインスリンを処理する場合、インスリン受容体のリン酸化の程度を前記記載のウェスタンブロッティング法により観察し、その結果を図２Ｂおよび図２Ｄに示した。

Ｒａｔ−１／ｈＩＲ細胞においてインスリンによるＩＲＳ、ＡＫＴ、ＥＲＫのリン酸化は、ＩＲ−Ａ４８またはＩＲ−Ａ６２と共に処理したにもかかわらず、何ら影響を受けなかった。しかし、ＩＲ−Ａ４８またはＩＲ−Ａ６２によるインスリン受容体のリン酸化はインスリンとは異なった。インスリン受容体キナーゼ領域のＹ１１５０／Ｙ１１５１のリン酸化は、インスリンとＩＲ−Ａ４８またはＩＲ−Ａ６２ともによって増加した。ＩＲ−Ａ４８とインスリンが共に処理された時、Ｙ１１５０／Ｙ１１５１のリン酸化は協力的に増加し、ＩＲ−Ａ４８とインスリンが共に処理された時、Ｙ１１５０／Ｙ１１５１のリン酸化は大きく増幅された。全体チロシンのリン酸化はインスリンによってのみ大きく増加し、ＩＲ−Ａ４８とＩＲ−Ａ６２の影響はわずかであった。まとめてみれば、これらの結果は、ＩＲ−Ａ４８であるインスリンと独立して作用し、ＩＲ−Ａ６２はインスリンの活性を増幅させるが、その活性はキナーゼ領域の特定チロシン（Ｙ１１５０／Ｙ１１５１）に偏っていることを示す。

３．３．ＥＬＩＳＡ−細胞内チロシンのリン酸化
実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２アプタマーのリン酸化効果を調べるために、６種類の抗体を使用した。インスリンが受容体に結合する時、細胞内領域の７つのチロシン（Ｙ９５３、Ｙ９６０、Ｙ１１４６、Ｙ１１５０、Ｙ１１５１、Ｙ１３１６およびＹ１３２２）がリン酸化されるが、このうち、Ｙ９５３に対する抗体は開発されず、計６つのチロシンに対して実験した。

抗体の抗原特異性を観察するためにＥＬＩＳＡを行ったが、まず、抗原として用いられる３種類のペプチド（ＭＴＲＤＩＹＥＴＤ−ｐＹ−ｐＹ−ＲＫＧＧＫＧＬＬ、ＭＴＲＤＩＹＥＴＤ−ｐＹ−ＹＲＫＧＧＫＧＬＬ、ＭＴＲＤＩＹＥＴＤＹ−ｐＹ−ＲＫＧＧＫＧＬＬ）は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）で合成された。ＰＢＳに溶かした２０ｐｍｏｌ／１００μｌのペプチドをＮ−オキシスクシンイミドエステル基でコーディングされた９６プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ）に４℃で１２時間反応させて共有結合で連結させた。１％ＢＳＡが含まれているＰＢＳで１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇ後、ＴＴＢＳ緩衝溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０］で１回洗った。抗体をＴＴＢＳ緩衝溶液に１：１０００で稀釈させた後、常温で１時間、９６プレートに結合した抗原と結合させた。ＴＴＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、ＡＰ（アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））の結合した２次抗体１：２０００で希釈して、１時間常温で結合させた。ＴＴＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、１００ｕｌのＣＳＰＤを添加して常温で３０分間反応させた後、光度計（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ）を用いて化学発光を測定した。

Ｙ１１５０／Ｙ１１５１に偏ったリン酸化を明確に検証するために、２つの異なる種類のｐＹ１１５０／ｐＹ１１５１抗体を使用した：１０Ｃ３（ｓｃ−８１５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）ｐＡｂ（４４８０４Ｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。また、Ｙ１１５０とＹ１１５１は独立してリン酸化されるため、２つの抗体がそれぞれｐＹ１１５０、ｐＹ１１５１、ｐＹ１１５０／ｐＹ１１５１に互いに異なる特異性を有していると仮定し、これを検証するために、ｐＹ１１５０、ｐＹ１１５１、ｐＹ１１５０／ｐＹ１１５１に対応する合成ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を準備しながら、ＥＬＩＳＡにより抗体の特異性を確認した。

その結果を図３Ａに示し、インスリンはＹ９６０、Ｙ１１４６、Ｙ１１５０、Ｙ１１５１、Ｙ１３１６、Ｙ１３２２のすべてのリン酸化を増加させたが、ＩＲ−Ａ４８およびＩＲ−Ａ６２は単にキナーゼ領域のＹ１１５０／Ｙ１１５１のリン酸化だけを増加させたことが分かる。

図３Ｂから分かるように、１０Ｃ３抗体はｐＹ１１５０／ｐＹ１１５１とｐＹ１１５０のすべてに似た程度に結合したが、ｐＡｂ抗体は単にｐＹ１１５０／ｐＹ１１５１にだけ強く結合した。この結果により、ＩＲ−Ａ４８がインスリン受容体キナーゼ領域のＹ１１５０のみを優先的にリン酸化させるバイアスアゴニスト（ｂｉａｓｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）であることが裏付けられた。

３．４．信号伝達蛋白質のリン酸化
実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８によるＹ１１５０のリン酸化がインスリンの信号伝達にどのような異なる影響を及ぼすかをインスリンと比較した。

前記実験の結果、ＩＲ−Ａ４８は、インスリンに匹敵する程度の信号伝達を活性化させた。インスリン（５０ｎｍｏｌ／Ｌ）が処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてインスリン受容体とＩＲＳ、ＡＫＴ、ＥＲＫなどの蛋白質のリン酸化は５分間急速に増加し、時間の経過と共に次第に減少した。インスリンとは対照的に、ＩＲ−Ａ４８（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）は、ＲＳ（Ｙ６０８、Ｙ６３２）、ＡＫＴ（Ｔ３０８、Ｓ４７３）、ＡＳ１６０（Ｔ６４２）、ＧＳＫ３ α／β（Ｓ２１／Ｓ９）、ＦＯＸＯ１／３ａ（Ｔ２４／Ｔ３２）のリン酸化を２時間かけてゆっくり増加させ、リン酸化は４時間持続した。前記結果を図４Ａに示した。

インスリン受容体のリン酸化は信号伝達において２つの役割を果たすが、第一、キナーゼ領域のリン酸化（Ｙ１１４６、Ｙ１１５０、Ｙ１１５１）はキナーゼの活性を調節し、第二、Ｙ９６０とＹ１３２２のリン酸化がインスリン受容体に結合する信号伝達蛋白質の結合位置として使用される。このようなＹ１１５０に偏ったリン酸化を考慮する時、ＩＲ−Ａ４８は、他のチロシンの低いリン酸化によってインスリンの信号伝達を大きく高められないと考えられたにもかかわらず、ＩＲ−Ａ４８はインスリンレベルの信号伝達活性を示して予期せぬ効果を示したことを確認した。

何よりも、ＩＲ−Ａ４８は、特定インスリンの信号伝達に偏った活性を示した。ＩＲ−Ａ４８によって、ＡＫＴ Ｓ４８３のインスリンと比較して９８％程度の高いリン酸化程度を示したが、ＡＫＴ Ｔ３０８のリン酸化は単に３７％にとどまった（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）。また、ＩＲ−Ａ４８は、ＥＫＲのリン酸化にはほとんど影響を及ぼさなかった（図４Ａおよび４Ｄ）。このように、ＩＲ−Ａ４８はインスリン受容体の信号伝達を活性化させるが、インスリンによる信号伝達とは明確に異なる特性を有している。

実施例４：インスリン受容体アプタマーのブドウ糖吸収
４．１．３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるブドウ糖吸収
前記実施例１で発掘されたＩＲ−４８がＡＫＴ Ｓ４７３のリン酸化を増加させたため、ブドウ糖吸収に対するＩＲ−Ａ４８の活性を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で調べた。

完全に分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を血清欠乏のためにＦＢＳのないＤＭＥＭに３時間処理した後、１時間、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で処理した。インスリンあるいはアプタマーを当該時間の間処理した後、２−デオキシ［１４Ｃ］グルコース（０．１μＣｉ／ｍｌ）を１０分間処理した。２０ｍＭブドウ糖が添加されたＰＢＳで３回洗い、０．５Ｎ ＮａＯＨと１％ＳＤＳが含まれている溶液で細胞を溶かした。液体閃光計数器（Ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて細胞内に吸収した２−デオキシ−Ｄ−グルコースの量を観察した。

３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にインスリン（５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を処理した時、ブドウ糖吸収は、３０分から１時間程度で最も高く増加してからゆっくり減少して８時間後には半分以下に低下した。Ｙ１１５０に偏ったリン酸化にもかかわらず、ＩＲ−Ａ４８（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）は、インスリンと似た程度のレベルにブドウ糖吸収を増加させた。しかし、信号伝達蛋白質のリン酸化パターンと同様に、ブドウ糖吸収も４時間かけてゆっくり増加させ、８時間以上持続した。また、ＩＲ−Ａ４８とインスリンを共に処理した時は、ＩＲ−Ａ４８のアロステリック結合（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）のため、ブドウ糖吸収は協力的に増加した。前記結果を図６Ａに示した。

遅い増加速度にもかかわらず、ＩＲ−Ａ４８は、高濃度でブドウ糖吸収を十分に増加させた。インスリンとＩＲ−Ａ４８の濃度に応じた活性を測定するために、それぞれ最も高い反応を示した処理時間にブドウ糖吸収を観察した（インスリンは３０分、ＩＲ−Ａ４８は４時間）。最も高い濃度でインスリンとＩＲ−Ａ４８とも似た程度の飽和したブドウ糖吸収程度を示した。しかし、インスリンの場合、濃度に応じて徐々に増加するブドウ糖吸収を示したが（ヒル係数（Ｈｉｌｌ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）：０．７７）、ＩＲ−Ａ４８は、２０ｎｍｏｌ／Ｌと２００ｎｍｏｌ／Ｌとの間で急激に増加する様子を示した（ヒル係数：０．７７）。その結果、ＩＲ−Ａ４８（６６．２ｎｍｏｌ／Ｌ）のＥＣ５０はインスリン（８．９ｎｍｏｌ／Ｌ）より高かったが、ＩＲ−Ａ４８（２０２．４ｎｍｏｌ／Ｌ）のＥＣ９５はインスリン（２６１．９ｎｍｏｌ／Ｌ）より若干低かった。前記結果を図６Ｂに示した。

４．２．ＰＩ３Ｋによるブドウ糖吸収の誘導
前記実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８の活性がＰＩ３Ｋを介して伝達されるか否かを確認するために、３Ｔ３−Ｌ１でＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）を１時間処理した後、ＩＲ−Ａ４８によるＡＫＴのリン酸化とブドウ糖吸収の増加を調べた。その結果、ＩＲ−Ａ４８によるブドウ糖吸収だけでなく、ＡＫＴのリン酸化もＬＹ２９４００２によって阻害することを確認した。その結果を図６Ｃおよび図６Ｄに示し、これは、ＩＲ−Ａ４８によるＡＫＴのリン酸化とブドウ糖吸収の増加は、インスリンと同様に、ＰＩ３Ｋを介して誘導されることを示す。

実施例５：癌細胞成長の誘導
実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８が細胞分裂に及ぼす影響を調べるために、インスリンの細胞分裂誘導能力を実験するのに幅広く使用されるＭＣＦ−７癌細胞株を使用した。

ＭＣＦ７細胞を２４−ウェル プレートにウェルあたり１００００個培養した後、２４時間育てる。血清欠乏のために、０．５％ＦＢＳ ＤＭＥＭで追加的に２４時間さらに育てる。インスリンあるいはアプタマーを７２時間処理し、２４時間経過するたびに培地を新たに入れ替えた。処理が終わった後、細胞を４％パラホルムアルデヒドが含まれているＰＢＳで常温に３０分間固定させた。細胞が有するＤＮＡを１μＭ ＳＹＴＯ６０蛍光色素が含まれているＰＢＳで染色させた後、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナで蛍光を測定することにより、細胞の量を定量した。

ＭＣＦ−７にインスリンとＩＲ−Ａ４８をそれぞれ単独処理した結果、インスリンは細胞分裂を２．１倍増加させたが、ＩＲ−Ａ４８は何ら影響がなかった。また、ＩＲ−Ａ４８（１ｕｍｏｌ／Ｌ）をインスリンと共に混合して処理した時も、インスリンによる細胞分裂に何ら影響を及ぼさなかった。ＩＲ−Ａ４８がＭＣＦ−７細胞に存在するインスリン受容体を活性化させない可能性を排除するために、ＭＣＦ−７細胞においてＩＲ−Ａ４８によるインスリンの信号伝達を確認した。その結果、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞と同様に、ＭＣＦ−７細胞においてもインスリン受容体Ｙ１１５０とＡＫＴ Ｓ４７３をリン酸化させることを確認した。前記結果を図５Ａ〜図５Ｃに示し、その結果、ＩＲ−Ａ４８によって誘導される信号伝達は、インスリン受容体による細胞分裂の誘導と完全に分離された機能を有することが分かった。

実施例６：ｉｎ ｖｉｖｏ血糖実験
前記実施例３〜実施例６の結果をｉｎ ｖｉｖｏで証明するために、実施例１で発掘されたＩＲ−Ａ４８がマウスの血糖に及ぼす影響を測定した。

血液中でＩＲ−Ａ４８が３’エキソヌクレアーゼ（３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）によって急速に分解されるのを防止するために、ＩＲ−Ａ４８の３’末端に逆位デオキシチミジン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、ｉｄＴ）を追加した。８週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ実験マウスを１２時間絶食させた後、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＲ−Ａ４８をＰＢＳに溶かして、静脈注射により実験マウスに投与した。投与後、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分経過した時、尾から血液を採取して血糖測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ Ａｃｔｉｖｅ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により血糖の変化を観察した。投与３０分後、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＲ−Ａ４８が投与されたマウスの血糖（４１％減少）は、０．６ｕｎｉｔ／ｋｇのインスリン（５１％減少）と似た程度に減少した。しかし、３０分後に急速に血糖が回復するインスリンとは異なって、ＩＲ−Ａ４８が投与されたマウスは、１時間まで血糖が持続的に減少し、その後にゆっくり回復する様相を示した。前記結果を図７に示した。

これにより、ＩＲ−Ａ４８がｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても活性があることを確認し、これは、ＩＲ−Ａ４８がアロステリックの調節により、インスリンとは独立して血糖を調節できることを示す。

Claims (21)

1. インスリン受容体の細胞外領域に特異的に結合し、インスリン受容体のリン酸化を促進するアプタマーである、インスリン受容体アプタマー。
2. 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、ＩＧＦ−１受容体には結合しないことを特徴とする、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
3. 前記アプタマーは、５’−位置に疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシルを含むものである、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
4. 前記アプタマーは、インスリン受容体のＹ１１５０をリン酸化するか、またはＡＫＴ Ｓ４７３をリン酸化させるものである、請求項４に記載のインスリン受容体アプタマー。
5. 前記アプタマーは、ＭＡＰＫ経路と独立した経路で活性化させることを特徴とする、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
6. 前記アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を起こすが、細胞の成長または分裂を起こさないものである、請求項５に記載のインスリン受容体アプタマー。
7. 前記アプタマーは、配列番号２または配列番号７の塩基配列を含むものである、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
8. 前記アプタマーは、配列番号１の塩基配列内の配列番号２の塩基配列を必須として含み、前記配列番号２の塩基配列の少なくとも一末端に連続する３３個〜８０個のヌクレオチドからなるものである、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
9. 前記アプタマーは、配列番号６の塩基配列内の配列番号７の塩基配列を必須として含み、前記配列番号７の塩基配列の少なくとも一末端に連続する２７個〜８０個のヌクレオチドからなるものである、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
10. 前記アプタマーは、配列番号２または配列番号７の塩基配列がステム−ループ構造を形成するものである、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
11. 前記疎水性官能基は、ナフチル基、ベンジル基、ピロールベンジル基、およびトリプトファンからなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
12. 前記配列番号２の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数（Ｋｄ）が１〜２０ｎＭである、請求項８に記載のインスリン受容体アプタマー。
13. 前記配列番号２の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数（Ｋｄ）が０．５〜４０ｎＭである、請求項８に記載のインスリン受容体アプタマー。
14. 前記アプタマーに含まれている少なくとも１つの塩基は、ＰＥＧ、ビオチンｉｄＴ、ＬＮＡ、２’−メトキシヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシド、２’Ｆ−ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、およびコレステロールからなる群より選択された１種以上が結合して修飾されたことを特徴とする、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
15. 二量体または多量体として存在する、請求項１に記載のインスリン受容体アプタマー。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のインスリン受容体アプタマーを含む、インスリン受容体作用剤。
17. 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、ＩＧＦ−１受容体には結合しないことを特徴とする、請求項１６に記載の作用剤。
18. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、インスリン関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
19. 前記疾患は、糖尿病、糖尿合併症、代謝性症候群、肥満または心血管疾患である、請求項１８に記載の薬学組成物。
20. インスリンを追加的に含む、請求項１９に記載の薬学組成物。
21. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、糖尿病または糖尿合併症の診断用組成物。

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