WO2012176952A1 - Erbb2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

Erbb2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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김윤동
강현구
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김종인
김기석
장승기
오일웅
최민정
강원준
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Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer that specifically binds to a breast cancer related Her2 (ERBB2) receptor, a composition for inhibiting cancer metastasis and a composition for diagnosing cancer containing the same as an active ingredient.
  • ERBB2 breast cancer related Her2
  • Breast cancer is the most common cancer among women in developed countries such as the United States and Europe. It is the leading cause of death among American women aged 40 to 55 years. During one lifetime, 1 out of 9 women develop breast cancer and the number of breast cancer patients is also increasing by about 15% annually. In Korea, breast cancer accounted for about 11.9% of female cancer patients in 1995, becoming the third most common cancer after cervical and stomach cancers, and the fifth most common cancer after stomach cancer, liver cancer, uterine cancer, and lung cancer. Is on the rise every year.
  • Herceptin (Herceptin, Trastuzumab, Genentech) is a humanized monoclonal antibody that binds to the HER-2 receptor.Herceptin blocks the signal of the Her-2 receptor by blocking the dimerization of the Her-2 receptor, thereby blocking breast cancer cells. Specific attacks of the bay significantly improve the survival of breast cancer patients. Therefore, Herceptin, which targets Her-2, is in the spotlight as a blockbuster, whose sales volume creases annually.
  • Herceptin binds to other sites of Her-2 and not to sites that block dimerization of Her-2 receptors.
  • Pertuzumab which can replace Herceptin. I'm concentrating.
  • aptamers that can be used for the treatment and diagnosis of breast cancer as well as different binding mechanisms from the existing antibodies are expected to be able to remove breast cancer cells more effectively by combining with Herceptin.
  • an example of the present invention includes a modified base that specifically binds to ERBB2 and wherein the 5 'position of dUTP (deoxyuracil) is substituted with a hydrophobic functional group such as a naphthyl group, benzyl group, pilbenzyl group, tryptophan, etc.
  • a hydrophobic functional group such as a naphthyl group, benzyl group, pilbenzyl group, tryptophan, etc.
  • composition for treating cancer comprising the ERBB2 aptamer as an active ingredient.
  • Another example provides a method of treating cancer comprising administering the ERBB2 aptamer to a patient in need thereof.
  • Another example provides the use of the ERBB2 aptamer for the treatment of cancer
  • Another example provides a cancer diagnostic composition comprising the ERBB2 aptamer as an active ingredient.
  • Another example provides a cancer diagnostic method using the ERBB2 aptamer.
  • Another example provides the use of the ERBB2 aptamer for the diagnosis of cancer
  • An object of the present invention is to provide a ERBB2 aptamer capable of inhibiting or detecting cancer or cancer metastasis and cancer metastasis inhibitors having the same as an active ingredient by binding specifically to the Her2 protein involved in cancer development and metastasis. It is.
  • ERBB2 epidermal Growth Factor Receptor
  • ERBB2-ERBB3 mediated by EGF (Epidermal Growth Factor) or HRG (heregulin).
  • ERBB2 aptamers that block downstream signaling pathways, such as AT (RAC-alpha serin / threonine-protein kinase) and ERK (Extracellular signal-regulated kinase), which are associated with survival Cancer or cancer inhibitors and cancer or cancer diagnostic composition comprising as a component, and methods for inhibiting (treating) cancer or cancer metastasis and cancer diagnostic methods using the same are provided.
  • the ERBB2 may be derived from a mammal, preferably a human, and may be, for example, registration number P04626, P70424, P06494, 018735, or Q60553, and the like, for example, P04626 (ERBB2—human).
  • the ERBB2 aptamer may comprise a modified base, consisting of 20 to 100, preferably 25 to 100, such as 40 to 100, or 40 to 80 bases, including the modified base, It is characterized by binding specifically to ERBB2.
  • Bases used in the ERBB2 aptamer of the present invention other than the modified bases are selected from the group consisting of A, G, C, T, and their deoxy bases, unless otherwise specified.
  • the modified base refers to a modified form in which the 5 'position of dUTP (deoxyuracil) is substituted with a hydrophobic functional group.
  • the hydrophobic functional group may be at least one selected from the group consisting of benzyl group, naphthyl group, pyrrolebenzyl group, tryptophan and the like.
  • affinity with ERBB2 is significantly increased as compared with the case where the dUTP base is not modified.
  • the number of modified bases in the ERBB2 aptamer may be 5-15, preferably 7-13.
  • the ERBB2 aptamer may be composed of 40 to 100, preferably 40 to 80 bases including one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 35.
  • the ERBB2 aptamer consists of only one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 35, or the 5 'terminal, 3' terminal, or both ends of the base sequence It may further include a base sequence consisting of 15 to 30 bases.
  • the ERBB2 aptamer has GGCTGGTGGTGTGGCTG (SEQ ID NO: 40) or GAGTGACCGTCTGCCTGA (SEQ ID NO: 39) at the 5 'end of one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 35 CAGGCAGACGGTCACTC (SEQ ID NO: 41) or CAGCCACACCACCAGCC at 3 'end (SEQ ID NO: 42), but is not limited thereto.
  • the ERBB2 aptamer may be a 5 'end, 3' end, or both ends are modified to improve the stability in the serum to enhance the stability in the serum (see Examples 3 and 4).
  • the modifications include PEG (polyethylene glycol), inverted deoxythymidine (IDT), Locked Nucleic Acid (LNA), 2'-methoxy nucleoside, and 2'-amino nucleoside at the 5 'end, 3' end, or both ends.
  • 2'F-nucleoside, an amine linker, a thier linker, cholester and the like may be modified by one or more selected from the group consisting of.
  • the ERBB2 aptamer has a PEG (polyethylene glycol; for example molecular weight 500-50,000 Da) attached to the 5 'end, an inverted deoxythymidine (IDT) attached to the 3' end, or PEG at the 5 'end (Eg, molecular weight 500-50,000 Da) may be attached, and inverted deoxythymidine (idT) may be attached to the 3 ′ end.
  • PEG polyethylene glycol; for example molecular weight 500-50,000 Da
  • IDT inverted deoxythymidine
  • IdT inverted deoxythymidine
  • nucleic acid unit is the 3'-OH of the previous unit and the following It forms a chain by combining with 5'-0H of the unit, but idT combines 3'-OH of the next unit with 3'-OH of the previous unit to artificially change 5'-OH, not 3'-OH. It is a molecule that produces an effect of inhibiting degradation by 3 'exonuclease, which is a kind of nuclease.
  • the EGFR family consists of four types of isotypes (EGFRl, ERBB2, ERBB3, and ERBB4).
  • ERBB2 is composed of a structure that is always active without ligand-binding domains such as EGF, NRG, TGF-alpha, etc. have.
  • EGF binds to EGFR1
  • ERBB2 receptors when ERBB2 receptors are activated in certain cancer cells such as breast cancer and colon cancer, tyrosine kinase activity of ERBB2 receptors is formed by forming homo-dimer forms of ERBB2 receptors, which are always activated forms that ligands cannot bind without passing through other receptors such as EGFR1 and ERBB3. This increase causes cancer cell growth and cancer metastasis.
  • the ERBB2 aptamer blocks dimerization of ERBB2 and has a tumor suppressor effect in vivo (see Examples 2 and 4).
  • the ERBB2 aptamer according to the present invention may be one that binds to the extracellular domain of ERBB2.
  • the EGFR family consists of four types of isotypes (EGFRl, ERBB2, ERBB3, and ERBB4).
  • ERBB2 is composed of a structure that is always active without ligand-binding domains such as EGF, NRG, TGF-alpha, etc. have.
  • EGF binds to EGFR1, changes the structure of EGFR1, and forms a heterodimer through binding to ERBB2, thereby activating the tyrosine kinase activity of the receptor and transmitting a signal into the cell.
  • ERBB2 receptors are activated in certain cancer cells such as breast cancer and colon cancer
  • tyrosine kinase activity of ERBB2 receptors is formed by forming homodimers between ERBB2 receptors, which are always activated forms that ligands cannot bind without passing through other receptors such as EGFR1 and ERBB3. Increase, causing cancer cell growth.
  • the present inventors have discovered aptamers that bind to ERBB2, which is important for the formation and metastasis of cancer, and established the following screening method to discover aptamers that inhibit the activity of ERBB2 among these binding aptamers. .
  • the A431 skin carcinoma cell line expresses a large amount of EGFR by comparing the expression levels of EGFR in various cancer cell lines.
  • the EGF concentration was increased to 16nM or more EGFR activity was confirmed that the highest activity was shown after 5 minutes treatment.
  • the safety evaluation in vivo confirmed that the ERBB2 aptamer is a safe substance that is not toxic to the living body and does not exhibit abnormal findings (see Example 5). More specifically, in a single intravenous administration of male and female mice of the ICR line, the approximate lethal dose (ALD) of the ERBB2 aptamer according to the present invention in females was determined to exceed 1,000 mg / kg. The half lethal dose (LD 50 ) in males was calculated as 1215.8 mg / kg. In addition, no abnormal findings were observed when rough toxicity was confirmed by repeated intravenous administration to male and female mice of ICR line for 2 weeks. Therefore, ERBB2 aptamer according to the present invention can be usefully used to inhibit the growth of cancer cells.
  • another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or inhibiting cancer metastasis of cancer containing ERBB2 aptamer as an active ingredient as described above.
  • the pharmaceutical compositions may be formulated in various oral or parenteral dosage forms.
  • oral dosage forms may include, for example, a diluent such as lactose, textose, sucrose, manny, sorbobi, salrose and / or glycine, silica, in addition to the active ingredient according to the conventional composition of each formulation.
  • Pharmaceutically acceptable carriers such as talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or glidants such as polyethylene glycol.
  • the oral dosage form when it is a tablet, it may include a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylsalose, sodium carboxymethylcellose and / or polyvinylpyridine. And, optionally, disintegrants such as starch, agar, alginic acid or sodium salts thereof, or boiling mixtures and / or absorbents, colorants, flavors or sweeteners.
  • a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylsalose, sodium carboxymethylcellose and / or polyvinylpyridine.
  • disintegrants such as starch, agar, alginic acid or sodium salts thereof, or boiling mixtures and / or absorbents, colorants, flavors or sweeteners.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in a parenteral dosage form, in which case it is administered by a parenteral route of administration such as subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • a parenteral route of administration such as subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the pharmaceutical composition is an active ingredient, i.e., a derivative of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is mixed in water with a stabilizer or a laxative to form a solution or suspension.
  • solutions or suspensions may be prepared in unit dosage forms of ampoules or vials.
  • the pharmaceutical composition may be sterile, or may further include adjuvants such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifiers, salts and / or buffers for controlling osmotic pressure, and may further include other therapeutically useful substances. May be formulated according to conventional methods of mixing, granulating or coating.
  • the active ingredient ie, ERBB2 aptamer
  • the pharmaceutical composition may be included in the pharmaceutical composition in an effective amount of ⁇ to 500 mg / kg (body weight), preferably 0.5 to 100 mg / kg (body weight) per day, and the pharmaceutical composition may be It may be divided once or twice a day and administered via the oral or parenteral route.
  • Cancer that can be treated or inhibited metastasis by the pharmaceutical composition of the present invention may be any type of cancer associated with ERBB2, for example, breast cancer, colon cancer, lung cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, and the like. have.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be a mammal, including a human, preferably a rodent or a human.
  • Another example is treating the cancer with a therapeutically effective amount of the ERBB2 aptamer. It provides a method of cancer treatment or cancer metastasis comprising administering to a patient in need thereof. The method may further comprise identifying a patient in need of cancer treatment prior to the step of administering the ERBB2 aptamer.
  • the therapeutically effective amount means a dosage that can exert a therapeutic effect in the patient to be administered, and can be appropriately adjusted according to the patient's condition, condition, and the like, for example, 0.1 to 500 mg / kg (weight per day). ), Preferably 0.5 to 100 rag / kg (body weight), the effective amount may be administered once or twice a day or more.
  • Another example provides the use of the ERBB2 aptamer for the treatment of cancer or inhibition of cancer metastasis, or for use in the manufacture of a cancer treatment or cancer metastasis suppression agent.
  • Another example provides the use of the ERBB2 aptamer for the diagnosis of cancer.
  • the ERBB2 aptamer can be used as a cancer diagnostic composition.
  • the present invention provides a method for providing information for cancer diagnosis using the ERBB2 aptamer.
  • the method may further comprise measuring the degree of binding of the ERBB2 aptamer in the normal sample.
  • the patient may be a mammal including a human, and preferably, as a rodent or a human, a subject to determine whether the cancer has developed or has metastasized.
  • the type of cancer that can provide information for diagnosis by the above method may be any type of cancer associated with ERBB2, and may be, for example, one or more types selected from the group consisting of breast cancer, colon cancer, lung cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, and stomach cancer. .
  • the normal sample may be a mammal including a human, Preferably from rodents or humans, cancer of the subject to provide information for diagnosis, such as, for example, breast cancer, colorectal cancer, lung cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, the occurrence of cancer selected from the group and metastasis of the cancer Means a biological sample obtained from an individual without.
  • the biological sample may be cells, tissues, blood, body fluids, saliva, etc. isolated from mammalian living bodies other than humans and mammals including humans.
  • Measuring the degree of binding of the ERBB2 aptamer in the biological sample may be performed using a DNA aptamer binding measuring technique commonly used in the art, for example, the fluorescent or radioactive material label at the end of the ERBB2 aptamer To measure the fluorescence or radioactive intensity, or to image and observe, but is not limited thereto.
  • a pair of aptamers selected from the ERBB2 aptamers different from each other and do not interfere with each other one is fixed to the substrate (capture aptamer), the other (detection aptamer) is terminal
  • the presence of ERBB2 in the sample by labeling the fluorescent material or radioactive material (or combining the fluorescent material or radioactive material with reactable material) and measuring its intensity
  • ERBB2 overexpression can be determined (see FIG. 2A).
  • the present invention provides an aptamer capable of effectively inhibiting ERBB2, which can be usefully used for the diagnosis, treatment and / or inhibition of metastasis of all types of cancers associated with ERBB2.
  • FIG. 1 schematically shows a process of synthesizing a modified base-containing antisense library using a modified base (dUTP).
  • FIG. 2A schematically shows a sandwich-type assay process using ERBB2 aptamer
  • FIG. 2B shows a comparison of assay results by ELISA and assay using ERBB2 aptamer of the present invention.
  • 3A shows the tyrosine (Tyr845) phosphorylation changes of EGFR (ERBB1) with EGF concentration
  • 3B shows tyrosine (Tyr8 4 5) of EGFR (ERBBl) over time. Show phosphorylation changes.
  • 4A schematically illustrates the process of screening for inhibition of ERBB2 activity using ERBB2 aptamer (1: £ 01, 2 ⁇ 1682 aptamer).
  • 4B representatively shows the result of AP001-24 (SEQ ID NO: 11) among the results obtained by such screening.
  • FIG. 5A schematically shows how ERBB2 aptamer (green) blocks EGF mediated dimerization and inhibits ERBB2 activity (Tyr877 phosphorylation), and FIG. 5B shows that ERBB2 aptamer (green) blocks HRG mediated dimerization To inhibit ERBB2 activity (Tyr877 phosphorylation).
  • FIG. 5C shows that ERBB2 aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11) blocks EGF-mediated dimerization and HRG-mediated dimerization to activate ERBB2. Tyr877 phosphorylation) (NT: No Treatment, Control aptamer: reverse complement sequence of Ap001-24).
  • Figure 6 shows the results of inhibition of AKt and ERK activity by ERBB2 aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11).
  • FIG. 7A shows the result of binding analysis of ERBB2 aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11) with EGFR and ERBB2 (X axis: concentration of target protein (nM), y axis: cpm), 7B at MCF7.
  • the binding of ERBB2 aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11) to ERBB2 is shown by Cytochemistry method, and 7C shows the result confirmed by FACS assay method (control aptamer: reverse complement of Ap001-24) sequence).
  • Figure 8 shows the result of comparing the serum half-life of PEG-ERBB2 aptamer -idT (E2) and Control T40mer aptamer (Tl) in the ERBB2 aptamer preparation prepared in Example 3.
  • Figure 9 shows the results of measuring the size change of mouse breast cancer tissue after ERBB2 aptamer administration.
  • FIG. 10 shows macroscopic findings (top) and FDGPET imaging results (bottom) before (Day 0) and after (Day 6) treatment with ERBB2 aptamer preparation.
  • the SELEX technique was used to select DNA aptamers that bind to ERBB2 (R & D systems, 1 129-ER-050).
  • Binding with ERBB2 First, the synthesized Library lnmole was added to a selection buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KC1, 25mM MgCl 2 ) and reacted at 95 ° C, 70 ° C, 48 ° C, and 37 ° C for 5 minutes each. After application, 10X protein competition buffer (10 M prothrombin, ⁇ casein, 0.1% (w / v) HSA (human serum albumin, SIGMA) H ⁇ L was mixed for negative selection, and then the supernatant was removed. Was added to Talon bead (50% (w / v) slurry, lOmg / ml Invitrogen) to which it was reacted at 37 ° C for 10 minutes.
  • a selection buffer 200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KC1, 25mM MgCl 2
  • 10X protein competition buffer (10 M prothrombin, ⁇ case
  • the reaction was performed at 37 ° C for 1 hour on Talon beads combined with ERBB2.
  • the Talon bead bound to the DNA and ERBB2 complexes was washed five times with the selection buffer (200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM KC1, 25 mM MgCl 2 ). At the fifth wash, they were transferred to a new plate for washing.
  • a library bound to the target was added by adding 2 mM NaOH solution 85 and neutralized with 20 ⁇ ⁇ of 8 mM HC1 solution.
  • Amplification Library DNA binding to the target was amplified using QPCR (quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad). 5 'primers (GAGTGACCGTCTGCCTG (SEQ ID NO: 39) and 3' primers (Biotin-GGCTGGTGGTGTGGCTG, Biotin- (SEQ ID NO: 40)), respectively, used in the previous ibrary production, 5uM (5 X QPCR master Mix, Novagen), 0.075 U / ul KOD (Novagen), ImM dNTP (Roche Applied science), 25mM MgCl 2 , 5XSYBR green I (Invitrogen) were mixed to give a total volume of 125, 96 ° C 15 seconds, 55 ° C 10 seconds The double strand library was prepared by repeating 1 cycle at 68 ° C.
  • eDNA was prepared from DNA template and polymerase using enzymatic DNA.
  • the DNA library produced by QPCR was mixed and fixed in 25 L Myone SA bead (Invitrogen) for 10 minutes at room temperature, and the amount of the DNA was 60ul as the QPCR product. NaOH solution was added to make single strand DNA, and the same method as in Library Preparation of Example 1.1.
  • DNA containing the modified nucleic acid was synthesized and used for the next round: SELEX rounds were performed a total of eight times, and DNA and protein (ERBB2) from 4 to 6 and 7 to 8, respectively, for more selective binding.
  • the DNA aptamer was selected by diluting the complex to 1/200 and 1/400 in 10 mM DxS0 4 (sigma) solution.
  • a filter binding assay was performed to determine the binding force between the ERBB2 and the SELEX round DNA po. The first 6 and 8 rounds of po were carried out at the ends of aP 32 ATP (Perkin Elmer) and TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB). Repeated reaction at 37 ° C for 30 minutes with library DNA ⁇ , 0.25 ⁇ ⁇ - ⁇ 32 ⁇ (5 ⁇ , perkinelmer), 0.25 ⁇ TdT, and 10XNEB buffer4 (NEB) ⁇ reaction volume obtained through the SELEX process, 70 Incubation for 10 minutes at ° C, TdT was inactivated. Labeled DNA po was purified using a Micro spin G-50 column (GE healthcare). Labeled DNA pool 20,000cpm ⁇ lxSB buffer (200mM HEPES,
  • 510m NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl 2 was slowly cooled from 95 ° C to 37 ° C by 0.1 ° C in 1 second. Then, serial dilution of ERBB2 protein (R & D systems, 1 129-ER-050) from 100 nM to 12 points using a buffer (200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM KCl, 25 mM MgC1 ⁇ 2). 30 ⁇ of cooled DNA pools were added and reacted for 30 minutes at 37 ° C.
  • the binding affinity between the obtained ERBB2 and the DNA po undergoing SELEX round is shown in Table 1 below.
  • the binding affinity was obtained using the SigmaPlot ll (Systat Software Inc.) obtained through the filter binding assay, BMax in Table 1 represents the ratio of the aptamer bound to the input, Kd (dissociation constant) is the affinity Indicates.
  • the library is a DNA having a random base sequence of three types of modified nucleic acid of benzyl, tryptophan, and naphthyl groups, and each group is a ssDNA Po obtained after a specific round of the previously described SELEX step using a specific library. Meaning is as follows.
  • Groupl means Nap Library 6R pool, Group2 ⁇ Bz library 6R Pool, Group3 ⁇ Nap library 8R pool, Group4 ⁇ -Trp library 8R pool, and Group5 means 8R po of Bz library.
  • ERBB2 aptamer sequencing Group 1, which had six SELEX rounds, had the highest binding affinity, which was amplified by double strand DNA using the QPCR method mentioned above and cloned using TA cloning kit (SolGent). And sequencing with the Ml 3 primer (CAGGAAACAGCTATGAC) present on the vector obtained the following sequence.
  • T 2'-deoxyThymidine (Thymidine)
  • ERBB2 aptamers identified above were classified into similar families as follows (sequence homology based on 85% homology of base sequences):
  • Clone binding assay To determine the binding affinity of clones with repeated nucleotide sequences, a filter binding assay was performed in the same manner as the pool binding assay above. The binding affinity was obtained using SigmaPlot ll (Systat Software Inc.) all the values obtained through the filter binding assay, the results are shown in Table 4 below. In Table 4, BMax represents the amount of aptamer bound to the input, which means close to 1, which means better performance, and Kd (dissociation constant) is a numerical value representing affinity.
  • DNA aptamers cloned through the SELEX process have a length of about 80mer.
  • the length of the DNA aptamer was selected to be within a suitable dissociation constant () with the target protein.
  • ERBB2 aptamer synthesis The aptamer was synthesized by Solid Phase Oligo Synthesis using a Mermade 12 synthesizer manufactured by Bioautomation.
  • ERBB2 aptamer isolation / purification and QC modified aptamers discovered through synthesis, purification and identification of aptamers with the modified nucleic acid were modified from modified-dU-phosphoramidite using an oligonucleotide synthesizer (Mermadel 2 from Bioautomation). After synthesis, the resin (200nmole-dA (Bz) synthesis column, 1000A (MM1-1000-2)) was added to t-butylamine: methanol: water (l: 1: 1 volume ratio) at 70 ° C.
  • Synthetic ERBB2 Aptamer Molecular Weight Measurement Using a LC-ESI MS spectrometer, accurate molecular weights of aptamer and aptamer formulations having a molecular weight of 10,000 g / mole or more were measured within an error range of 0.02%.
  • ERBB2 Aptamers To explore the possibility of assay development using the above-discovered ERBB2 aptamers to accurately measure the concentration of ERBB2 in a sample, binding to ERBB2 but without interfering with each other Two types of aptamers AP001-24 (SEQ ID NO: 11) and AP001-25 (SEQ ID NO: 7) that combine at the same time were subjected to ELISA assay in the presence of 5% serum (sigma). The detection capacity of purified ERBB2 was confirmed. For this purpose, AP001-25 was fixed to the bottom of the aptamer, and biotin was conjugated at the AP001-24 terminal to confirm the color reaction using Streptavidin-HRP (see FIG. 2A) . The ERBB2 ELISA Kit of RnD Systems for comparison with the antibody was compared. The assay was carried out using.
  • Fig. 2B The result thus obtained is shown in Fig. 2B.
  • 50 pg / purified purified ERBB2 (R & D systems, 1129-ER-050) was added in complex sample conditions in which 5% serum was present. It was confirmed that it can be measured with excellent sensitivity of ml.
  • the EGFR family consists of four types of isotypes (EGFRl, ERBB2, ERBB3, and ERBB4).
  • ERBB2 has no domain to which ligands such as EGF, NRG and TGF-alpha bind to the outside of the cell membrane and is always activated. It is made of a structure.
  • EGF binds to EGFR1, changes the structure of EGFR1, and becomes hetero-dimer by binding to ERBB2.
  • the tyrosine kinase activity of the receptor is activated to transmit a signal into the cell.
  • ERBB2 receptors when ERBB2 receptors are activated in certain cancer cells such as breast cancer and colorectal cancer, ERBB2 receptors, which are always active forms that cannot be bound to ligands without passing through other receptors such as EGFR1 and ERBB3, form homo-dimer forms. The tyrosine kinase activity of the receptor is increased, causing cancer cell growth.
  • aptamers that bind to ERBB2 which are important for the formation and metastasis of such cancers, were identified, and the screening method described below was used to discover aptamers that inhibit the activity of ERBB2 among such binding aptamers. was established.
  • EGF P01133, Sigma
  • Fig. 3A cell lines
  • Fig. 3B ⁇ EGF was After treatment for a period of time (Fig. 3B), lysed for 1 hour on ice in Lysis buffer (l% Triton X-100, Tris buffered saline), followed by electrophoresis and transfer to Nitro cellulose paper, followed by phospho-EGFR antibody ( Western blot was performed using Cell Signal) to confirm EGFR phosphorylation according to EGFR activation.
  • the activity of EGFR increased until the EGF concentration increased to 16nM or more, it was confirmed that the highest activity at 5 minutes treatment.
  • the researchers treated EGF ⁇ for 5 minutes under the conditions of screening about 50 ERBB2 binding aptamers, and simultaneously measured the tyrosine phosphorylation of ERBB2 receptors by EGF by adding aptamers at the same time.
  • A431 cells (ATCC) were fixed on a 6-well plate and starvated with DMEM (HyClone) without serum for 24 hours, followed by DMEM with each aptamer together with ⁇ EGF (P01 133, Sigma). The media were exchanged and incubated for 5 minutes. After removing the media, treat 300ul of lysis bufferil% Triton X-100, Tris buffered saline), collect the cells using a scraper, incubate for 1 hour in ice, dissolve the cells, and then use centrifiige. Centrifuge at 1000 g of 4C for 10 minutes.
  • ERBB2 aptamers block downstream signaling pathways such as AKT and ERK, which block EGF, HRG mediated EGFR-ERBB2 or ERBB2-ERBB3 hetero-dimerization and are involved in cancer survival. Blocking was observed.
  • 5A and 5B show EER-mediated dimerization of ERBB2 aptamer (green), respectively
  • Blocking HRG-mediated dimerization shows the process of inhibiting ERBB2 activity (Tyr877 phosphorylation).
  • ERBB2 aptamer AP001-24 SEQ ID NO: 11
  • EGF or HRG EGF or HRG
  • EGF P01 133, Sigma
  • HRG Q02297, Sigma
  • ERBB2 receptor activation by AP001-24 aptamer also plays an important role in ERBB2 downstream, which is known to play an important role in cancer cell growth.
  • Akt and ERK protein activation was also inhibited.
  • A431 cell line (ATCC) on a 6well plate and replace it with DMEM medium without growth factor (HyClone) when it becomes 50% -70% confluent, and perform serum starvation for 24 hours.
  • Incubation was performed by adding the final concentration of 20 nM of aptamer AP001-24 for 15 minutes, followed by incubation for 5 minutes by adding EGF (P01 133, Sigma) or 2 nM HRG (Q02297, Sigma). After that, the supernatant was removed, 300ul of lysis buffer (l% Triton X-l 00, Tris buffered saline) was added, collected, and incubated on ice for 1 hour to make cell lysate.
  • lysis buffer l% Triton X-l 00, Tris buffered saline
  • aP 32 ATP Perkin Elmer
  • TdT Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB
  • Labeled DNA po was purified using a Micro spin G-50 column (GE healthcare).
  • the labeled DNA pool 20,000cpm was added to ⁇ ⁇ lxSB buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25m MgCl 2 ) and slowly cooled from 95 ° C to 37 ° C by 0.1 ° C per second. Then, serial dilution of ERBB2 protein (R & D systems, 1 129-ER-050) from 100 nM to 12 points using a buffer (200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM KCl, 25 mM MgCl 2 ). 30 ⁇ of DNA pools were added and reacted for 30 minutes at 37 ° C.
  • MCF7 cells For cytochemistry, put MCF7 cells (ATCC) on a 24well plate and grow them with a cover glass. After 30-50% confluent, fix the cells with PBS containing l% (w / v) paraformaldehyde. Blocking with Tris buffered saline containing% BSA. In the case of antibodies, ErBB2 specific antibody (Cell Signaling) is treated by dilution with PBS added with l% (w / v) BSA (RnD systems) at a ratio of l: 1000 (v / v) and aptamers.
  • Cell Signaling is treated by dilution with PBS added with l% (w / v) BSA (RnD systems) at a ratio of l: 1000 (v / v) and aptamers.
  • MCF7 cells (ATCC) were placed on 5 cm 10 4 to 10 cm plates.
  • aptamer was added to the aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11) of lOOpmole reacted at 4 ° C for 1 hour, and prepared by washing with PBS cooled to 4 ° C.
  • Antibodies and aptamer-treated cells were fixed at 4 ° C. by adding i.5 ml of l% (w / v) paraformaldehyde solution and measured using a FACs instrument (FACSCalibur flow cytochemistry, BD bioscience).
  • ERBB2 aptamer AP001-24 SEQ ID NO: 11
  • control aptamer reverse complement sequence of Ap001-24
  • ERBB2 aptamers Four types of ERBB2 aptamers were synthesized from Truncated aptamer AP001-24 (SEQ ID NO: 11) as follows.
  • E2 PEG-ERBB2 aptamer -idT [Cy3-T-PEG 784 -O- (AP001 -24) -idT]
  • E3 ERBB2 aptamer -idT [Cy3-O- (AP001-24) -idT]
  • E4 ERBB2 aptamer [Cy3-O- (AP001 -24) -OH]
  • each aptamer was prepared to have a concentration of 0.1 mM.
  • Serum half-life was measured to determine the stability of serum of the ERBB2-aptamer preparation. Specifically, the prepared aptamer was left at 94 ° C for 4 minutes, and slowly lowered the temperature for 1 hour to room temperature so that the aptamer well formed a secondary structure. 40uL (4 nmoles) of each aptamer solution was added to 200uL of Human Serum (Human male AB plasma / sigma H4522), vortexed, and then dispensed into 10 E-tubes by 20uL and left in a 37 ° C thermostat.
  • Human Serum Human male AB plasma / sigma H4522
  • Each sample was stored in cryogenic blast furnaces in order of l Omin, 30min, lh, 2h, 4h, 8h, 21h, 24h, 30h, 48h, 72h in sequence, 20uL of distilled water was added before analysis, and then lOuL was taken.
  • the stability of ERBB2 aptamer was measured by analyzing the result of quantification using (Column: GE Healthcare, 1 1 ′: 6) _ and graphing the residual amount in serum.
  • Anion exchange Resource-Q column was used for HPLC, A buffer was used for 25 mM Tris-HCl pH8.5, B buffer was used for 1M Nad 25 mM Tris-HCl pH 8.5, and the B buffer ratio was 10% (v / v) to 100% (v / v) was slowly masked and 566 nm of fluorescence was measured by irradiating the wavelength of 551nm.
  • Table 6 The results obtained from the above analysis are shown in Table 6 below. Table 6
  • Tumors in vivo were modeled using 6-week-old Balb / c nude female mice. The average weight of the mice used in the experiment was 20g on average. An estradiol pellet was implanted into the dorsal subcutaneous tissue of the mouse.
  • BT-474 cells a human-derived breast cancer cell line, were purchased from ATCC and grown. Pellet Injection After this, the propagated BT-474 cells were injected subcutaneously into the thighs of mice in the amount of 5 ⁇ 10 7 cells to form tumors. The tumor growth was visually observed for 2-3 weeks after the injection, and the tumor size was measured using a caliper. Acquisition of FDG PET images: FDG PET imaging was performed to confirm tumor formation.
  • F-18 FDG F-18 fluorodioxyglucose, Severance Hospital Nuclear Medicine and Cyclotron Center 220-230 was injected into the mouse intraperitoneally, followed by 1 hour using Siemens Inveon animal Positron emission tomography (PET). Won the award. After treatment, FDG PET images were obtained again using the same protocol.
  • ERBB2 aptamer AP001-24, SEQ ID No: 11
  • E2 preparation PEG-ERBB2 aptamer-idT, AP001-24, SEQ ID No: 11
  • Injections were made daily intraperitoneally for 5 days in amounts of 5 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • 200 ul of PBS was injected intraperitoneally.
  • Tumor size was measured using a caliper at intervals of 2-3 days, and FDG PET images were obtained on day 6 and compared. result
  • Tumor size change The tumor size change was measured when ERBB2 aptamer preparations (PEG-ERBB2, E2) were administered and compared with the case where PBS was administered, and the results are shown in FIG. 9. As confirmed in Figure 9, ERBB2 aptamer formulation (PEG-ERBB2, E2) showed significant tumor size changes in 5mg, 20mg, ERBB2 20mg. Tumor size inhibitory effects persisted for more than two weeks after 7 days of treatment.
  • FDG PET image results The results of evaluating the metabolic activity of the tumor through the FDG PET image is shown in FIG. As shown in FIG. 10, the glucose metabolism level observed at the tumor site before treatment was continuously measured at 6 days after 5 days of intraperitoneal treatment with ERBB2 aptamer preparation (PEG-ERBB2, E2) 5 mg / kg. It can be confirmed that glucose metabolism of tumor is inhibited by ERBB2 aptamer preparation. It can also be seen that the size of the tumor site (arrow) is reduced. Tumor mouse model experiments using the ERBB2 aptamer preparation as described above were able to confirm a significant decrease in tumor size compared to the control group. FDG PET was also used to confirm the glucose metabolism in tumors. After ERBB2 aptamer preparation, significant decrease in glucose metabolism was observed. Changes in tumor size and glucose metabolism Evaluation of the anticancer effect of the ERBB2 aptamer formulation on the BT-474 breast cancer cell line.
  • ERBB2 aptamer preparation PEG-ERBB2, E2
  • PEG-ERBB2 aptamer-idT an aptamer preparation prepared using 40 kDa PEG, was used as a test material.
  • Excipients were dosed at doses of 0 (vehicle control), 10, 100 and 1,000 mg / kg, with a single dose of 10 animals per group (5 male and female) and observed for mortality, general symptoms, weight and autopsy findings. Compared with. Materials and methods
  • the test material used 40kDa PEG-ERBB2 aptamer-idT (E2) made from ERBB2 aptamer (AP001-24) in Example 3.
  • Excipients were IX D-PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, GIBCO). The excipients were chosen because they are well soluble in test materials and are commonly used in toxicity tests for intravenous administration.
  • the animals used in the test group were SPF-free mice, HsdKoat: ICR (CD-l ® Coatec), 7 weeks of age and 24 males and 24 females, respectively. 13-32.97 g, female 23.81-26.36 g, 8 weeks of age, 20 male and female, and 31.33-34.70 g male and 24.87-27.40 g female.
  • Breeding environment was tested at a temperature of 23 ⁇ 3 ° C, a relative humidity of 55 55%, ventilation times 10-20 times / hr, lighting for 12 hours (light at 8 am-light off at 8 pm) and illuminance 150-300 Lux. It was performed in Room 2 of Animal Preservation Zone 2, which is maintained by Chem. All investigators carried out the experiments in working clothes and protective equipment under autoclave (121 V, 20 minutes). During the experiment, the temperature and relative humidity ranges of the animal room were 22.5-22.8 ° C and 63.7-69.2%, respectively. Recorded using. The number of ventilations and illuminance were measured regularly according to the Standard Operation Procedures (SOPs) of the Rat Camon Preclinical Research Center.
  • SOPs Standard Operation Procedures
  • test group consists of:
  • the dose was set at a high dose of 1,000 mg / kg, two groups were set at azeotropic 10 below, and an excipient control group was administered that only 1XD-PBS was administered.
  • Group separation of animals was performed as follows. First, the weights of the animals determined to be healthy during the acclimation period were measured, and 20 animals were selected, each of which was close to the mean weight. The selected animals were randomly distributed in order to distribute the average weight of each group as evenly as possible according to the ranked weight, so that the number specified in the 'test group composition' table. After group separation, the remaining animals were used as exercise animals.
  • Test substance was used for preparation without correction of purity and was prepared immediately before administration.
  • the high dose group was prepared by weighing the test substance and dissolving it in excipients at a concentration of 100 mg / mL.
  • Medium and low dose groups were prepared by diluting the high dose group with the same excipients.
  • the pH of the high dose group was measured using pH Test Strips (P-4536, SIGMA).
  • Intravenous administration was selected as a planned clinical route for humans. Animals to be administered were placed in a calibrator, the tails were disinfected with 70% cotton and cotton, alcohol was removed using gauze, and intravenously administered at a rate of about 1 mL / min using a 26 G needle. The dose amount was calculated as 10 mlJkg based on the weight at the time of fasting measured on the day of administration. Once / day, a single dose was administered and the administration was completed before 11:30. Dosing date was set to day 0. Observation and Inspection Items
  • Body weights were weighed immediately upon discovery for dead animals prior to dosing, on days 1, 3, 7 and 14 post-dose.
  • the autopsy was performed by anesthesia using a surviving animal C0 2 on the 14th day after administration, and after the abdominal vein and abdominal aorta were cut and bleeding, and the visual examination of the body surface and organs was observed.
  • the weight and weight gain were assessed by the one-way ANOVA test, and it was considered statistically significant when P ⁇ 0.05. Assuming normality, the test of equal dispersion using the Levene test, Duncan's multiple range test was performed because of equal dispersion. The half lethal dose (LD 50 ) for dead animals was calculated according to the Probit method, and the SPSS HH K was used as a computer program for statistics. result
  • the mortality rate in the 1,000 mg / kg-administered group was 1 male at 7 days post-dose, and the semi-numerical dose of this test substance in the male was 1215.8 mg / kg (the confidence interval was not calculated. ), And no abnormality was observed in all living and dead animals.
  • Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0.
  • Numbers in parenthesis represent the number of survived animals.
  • Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0.
  • Body weight at the time of death are body weight difference between day 14 and the day 0.
  • Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0. As shown in Tables 12 to 14, the weight change was significant in the mean body weight of the 1,000 mg / kg group compared to the control group at 3 days after administration. Although it was low ( ⁇ ⁇ 0 ⁇ 01), it was observed similarly to the excipient control group from 7 days after administration. The animals that died after administration had continued to lose weight until death.
  • test was performed to determine the approximate toxicity of test substance Aptopmer Formulation E2 when administered intravenously in single ICR mice. Was carried out.
  • the death observed in 1 male of 1,000 mg / kg group was judged to be a change by the administration of test substance in combination with the weight loss observed in the same group.
  • the body weight of the dead animals was reduced by 14% compared to the body weight on the day of administration.
  • the weight loss observed in the 1,000 mg / kg-treated males was considered to be a temporary change from the 7th day after the administration, as the average body weight was similar to that of the control group.
  • test group SPF mice, HsdKoat: ICR (CD-l®, 6 weeks old dosing administration was started, and the administration substance was aptamer preparation E2, and the composition of the test group was as follows.
  • Float Vessel (1X D-PBS) The frequency and duration of administration were 1 / day, 7 days / week, intravenously administered for 2 weeks. Observation and examination items were mortality, general symptoms, weight change, feed and water intake, urinalysis, eye examination, hematology and blood. Biochemical tests, autopsy findings, and organ weights were performed. result
  • Na + and Chloride ion tended to be higher in the male and female groups than the control group, and statistically significant Na + was more than 20 mg / kg / day in males.
  • C1 " was identified in males of 40 mg / kg / day and females of 20 mg / kg / day or more (CP ⁇ ao5, p ⁇ o.oi).
  • IP Inorganic phosphorus
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Abstract

본 발명은 유방암 관련 Her2 (ERBB2) 수용체에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 조성물 및 암진단용 조성물에 관한 것으로, 상기 압타머는 기존의 항체와는 다른 결합 기작을 가짐으로써 보다 효과적으로 암 전이를 억제하고 암을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
E R B B2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 【기술분야】
유방암 관련 Her2 (ERBB2) 수용체에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머， 이를 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 조성물 및 암진단용 조성물에 관한 것이다. 【배경기술】
유방암은 미국이나 유럽 등 선진 국가에서의 여성암 중에서 가장 흔한 암으로， 40세에서 55세 사이의 미국 여성의 제 1의 사망원인이 되고 있다. 평생 동안 9명의 여성 중 1명에서 유방암이 발생하고 유방암 환자 수 역시 매년 약 15%씩 증가하는 추세이다. 우리나라에서는 1995년 여성 암 환자 중 약 11.9%를 유방암이 차지하고 있으며 자궁경부암과 위암에 이어 세 번째로 흔한 암이 되었고， 위암， 간암, 자궁암， 폐암에 이어 다섯 번째로 사망률이 높은 암으로, 그 빈도가 매년 증가하는 추세에 있다.
전체 유방암 환자의 약 20~25%에서 HER-2 단백질 (ERBB2)의 과발현이 관찰되는데， HER-2 과발현이 관찰되는 유방암은 그렇지 않은 유방암에 비해 진행이 빠르고 공격적이며， 타목시펜이나 특정한 항암화학요법에 반웅이 낮은 것으로 알려져 왔다. 허셉틴 (Herceptin, Trastuzumab, Genentech)은 HER-2 수용체에 결합하는 인체형 단클론성 항체 (Humanized Monoclonal Antibody)로서 허셉틴은 Her-2 수용체의 다이머화를 차단함으로써 Her-2 수용체의 신호를 차단하여 유방암 세포만을 특이적으로 공격하여 유방암 환자의 생존기간을 의미 있게 향상시킨다. 따라서 Her-2를 표적으로 하는 허셉틴은 판매량이 매년 급증하는 blockbuster로써 각광받고 있다.
하지만 허셉틴 단독투여 시 반웅률은 약 20%에 불과하며， 1년 치료 비용부담이 매우 높고, 심장독성이 일부 발생할 수 있으며 대부분의 환자에서 1년 후 허셉틴에 대한 치료 효과가 사라지는 허셉틴 내성이 발생하고 있다. 이는 허셉틴이 Her-2 수용체의 다이머화를 차단하는 부위가 아닌 Her-2의 다른 부위에 결합하며 그 결합력이 약함으로 인하여 기인된다고 알려져 있다. 따라서 많은 제약회사들은 이러한 허셉틴을 대체 할 수 있는 Pertuzumab과 같은 많은 치료제를 개발하기 위한 연구를 집중하고 있다.
본 발명에서는 허셉틴의 단점을 보완할 수 있는 Her-2 수용체에 특이적으로 결합 하는 압타머를 개발하고자 하였다. 이를 통하여 유방암 치료 및 진단에 사용될 수 있을 뿐 만 아니라 기존 항체와는 다른 결합 메커니즘을 갖는 압타머는 허셉틴과 병용함으로써 유방암 세포를 보다 효과적으로 제거 할 수 있을 것으로 기대된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에, 본 발명의 일례는 ERBB2에 특이적으로 결합하고， dUTP(deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기， 피를벤질기， 트립토판 등과 같은 소수성 작용기로 치환된 변형된 염기를 포함하는， ERBB2 압타머를 제공한다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머의 암 치료를 위한 용도를 제공한다
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머를 이용하는 암 진단 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머의 암 진단을 위한 용도를 제공한다
【기술적 해결방법】
본 발명의 목적은, 암의 발생 및 전이에 관여하는 Her2 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 암 또는 암 전이를 억제하거나 암의 검출이 가능한 ERBB2 압타머 및 이를 유효 성분으로하는 암전이 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 EGF(Epidermal Growth Factor) 또는 HRG(heregulin)에 의하여 매개되는 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)-ERBB2 또는 ERBB2-ERBB3의 hetero-dimerization을 차단 (block)하며 암생존 (cancer survival)과 관련이 있는 A T(RAC-alpha serin/threonine-protein kinase) 및 ERK(Extracellular signal-regulated kinase)와 같은 다운스트림 신호전달 (Downstream signaling pathway)을 차단 (block)하는 ERBB2 압타머，이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 암 억제제 및 암 또는 암 진단용 조성물， 및 이를 이용한 암 또는 암 전이 억제 (치료) 방법 및 암 진단 방법이 제공된다.
상기 ERBB2는 포유류, 바람직하게는 인간에서 유래하는 것일 수 있으며， 예컨대, 등재번호 P04626, P70424, P06494, 018735, 또는 Q60553 등일 수 있으며， 예컨대 P04626(ERBB2— human)일 수 있다.
상기 ERBB2 압타머는 변형된 염기를 포함할 수 있으며， 상기 변형된 염기를 포함하여 20 내지 100개， 바람직하게는， 25 내지 100개, 예컨대 40 내지 100개, 또는 40 내지 80개의 염기로 이루어지고， ERBB2에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 변형된 염기 이외의 본 발명의 ERBB2 압타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한， A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 변형된 염기는 dUTP(deoxyuracil)의 5' 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태를 의미한다. 상기 소수성 작용기는 벤질기， 나프틸기， 피롤벤질기， 트립토판 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같이 dUTP 염기의 5' 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 ERBB2와의 친화력 (affinity)이 현저하게 높아지는 이점이 있다.
ERBB2 압타머 내의 상기 변형된 염기 개수는 5 내지 15개， 바람직하게는 7 내지 13개일 수 있다.
상기 ERBB2 압타머는 SEQ IDNO: 1 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하는 40 내지 100개， 바람직하게는 40 내지 80개의 염기로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서， ERBB2 압타머는 SEQ ID NO: 1내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로만 이루어지거나, 상기 염기서열 5' 말단， 3' 말단， 또는 양 말단에 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, ERBB2 압타머는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열의 5' 말단에 GGCTGGTGGTGTGGCTG (SEQ ID NO: 40) 또는 GAGTGACCGTCTGCCTGA (SEQ ID NO: 39)를 갖고, 3' 말단에 CAGGCAGACGGTCACTC (SEQ ID NO: 41) 또는 CAGCCACACCACCAGCC (SEQ ID NO: 42)를 갖는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 ERBB2 압타머는， 혈청 내 안정성 증진을 위하여， 5' 말단, 3' 말단， 또는 양 말단 모두가 변형되어 혈청 내 안정성이 증진된 것일 수 있다 (실시예 3 및 4 참조). 상기 변형은 5' 말단， 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드， 2'-아미노 뉴클레오사이드， 2'F-뉴클레오사이드， 아민 링커, 티을 링커， 및 콜레스테를 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 ERBB2 압타머는 5' 말단에 PEG(polyethylene glycol; 예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되어 있거나， 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착되어 있거나， 5' 말단에 PEG (예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되고 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착된 것일 수 있다.
상기 'idT(inverted deoxythymidine)'는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서， 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-0H와 결합하여 사슬을 이루지만 idT는 앞 단위체의 3'-OH에 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제 (3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
EGFR family는 전체 4종류의 isotype(EGFRl, ERBB2, ERBB3, ERBB4)로 이루어져 있으며, 이들 중 ERBB2는 세포막 바깥쪽에 EGF, NRG, TGF-alpha 등 리간드가 결합하는 도메인이 없으며 항상 활성화 되어있는 구조로 이루어져 있다. 실제 정상 세포내에서 EGF는 EGFR1에 결합하여 EGFR1의 구조를 변화시키고 ERBB2와 결합을 통하여 hetero-dimer형태가 되며, 이에 따라 수용체의 tyrosine kinase activity가 활성화되어 세포내로 신호를 전달하게 된다. 하지만 유방암， 대장암 등의 특정 암세포에서 ERBB2 수용체가 활성화 되면 EGFR1, ERBB3 등 다른 수용체를 거치지 않고 리간드가 결합할 수 없는 항상 활성화 형태인 ERBB2 수용체끼리 homo-dimer 형태를 형성함으로써 ERBB2 수용체의 tyrosine kinase활성이 증가되어 암세포의 성장과 암전이를 유발하게 된다.
본 발명자들은 상기 ERBB2 압타머가 ERBB2의 이합체화를 차단하고 생체내에서 종양 억제 효과를 갖는 것을 확인하였다 (실시예 2 및 실시예 4 참조). 예컨대, 본 발명에 따른 ERBB2 압타머는 ERBB2의 세포외 도메인 (extracellular domain)에 결합하는 것일 수 있다. EGFR family는 전체 4종류의 isotype(EGFRl, ERBB2, ERBB3, ERBB4)로 이루어져 있으며, 이들 중 ERBB2는 세포막 바깥쪽에 EGF, NRG, TGF-alpha 등 리간드가 결합하는 도메인이 없으며 항상 활성화 되어있는 구조로 이루어져 있다. 실제 정상 세포내에서 EGF는 EGFR1에 결합하여 EGFR1의 구조를 변화시키고 ERBB2와 결합을 통하여 헤테로 다이머 형태가 되며， 이에 따라 수용체의 티로신 카이네이즈 활성이 활성화되어 세포내로 신호를 전달하게 된다. 하지만 유방암， 대장암 등의 특정 암세포에서 ERBB2 수용체가 활성화 되면 EGFR1, ERBB3 등 다른 수용체를 거치지 않고 리간드가 결합할 수 없는 항상 활성화 형태인 ERBB2 수용체끼리 호모 다이머 형태를 형성함으로써 ERBB2 수용체의 티로신 카이네이즈 활성이 증가되어 암세포의 성장을 유발하게 된다.
본 발명자들은 이러한 암의 형성 및 전이 과정에 중요한 ERBB2에 대하여 결합하는 압타머를 발굴하였고 이와 같은 결합 압타머 중 ERBB2의 활성을 저해하는 역할을 하는 압타머를 발굴하기 위하여 아래와 같은 스크리닝 방법을 수립하였다. 우선 스크리닝할 세포주를 선택하기 위하여 여러 암세포들 주에 EGFR의 발현량을 비교하여 A431 skin carcinoma 세포주가 많은 양의 EGFR를 발현하고 있음을 확인하였다. 또한 EGF농도가 16nM 이상까지 EGFR의 활성이 증가하며 5분 처리 시 가장 높은 활성도를 나타냄을 확인하였다.
또한, 생체내 안전성 평가를 통하여 상기 ERBB2 압타머가 생체에 독성이 없고 이상 소견을 나타내지 않는 안전한 물질임을 확인하였다 (실시예 5 참조). 보다 구체적으로， ICR 계통의 암수 마우스에 대한 단회 정맥내투여 실험에서 암컷에서의 본 발명에 따른 ERBB2 압타머의 개략의 치사량 (approximate lethal dose; ALD)은 1,000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단되었고， 수컷에서의 반수치사량 (LD50)은 1215.8 mg/kg으로 산출되었다. 또한 ICR 계통의 암수 마우스에 2주간 반복 정맥내투여 하여 개략적인 독성을 확인하였을 때， 이상 소견이 관찰되지 않았다. 따라서， 본 발명에 따른 ERBB2 압타머는 암세포의 성장을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 또 다른 측면은 상기한 바와 같은 ERBB2 압타머를 유효성분으로 함유하는 암의 치료 또는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제， 경,연질 갑셀제， 액제， 현탁제， 유화제, 시럽제, 과립제， 엘릭서제 (elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어， 락토즈， 텍스트로즈， 수크로즈， 만니를， 솔비를， 샐를로즈 및 /또는 글리신 등의 회석제나， 실리카, 탈크， 스테아르산 및 그의 마그네슴 또는 칼슘염 및 /또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한， 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트， 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스， 메틸샐를로즈, 나트륨 카복시메틸셀를로즈 및 /또는 폴리비닐피를리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분， 한천， 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제나， 비등 흔합물 및 /또는 흡수제, 착색제， 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
그리고， 상기 약학 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사， 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구 투여 경로에 의해 투여된다. 이 때， 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여， 상기 약학 조성물은 유효 성분， 즉, 화학식 I의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 안정제 또는 완층제와 함께 물에서 흔합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한， 상기 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제， 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 /또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고， 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며， 흔합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
그리고, 상기 유효 성분, 즉， ERBB2 압타머는 하루에 αΐ 내지 500 mg/kg (체중)， 바람직하게는 0.5 내지 100 mg/kg (체중)의 유효량으로 상기 약학 조성물에 포함될 수 있고, 이러한 약학 조성물이 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 의하여 치료 또는 전이 억제가 가능한 암은 ERBB2와 관련된 모든 종류의 암일 수 있으며, 예컨대， 유방암, 대장암， 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 대상은 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며， 바람직하게는 설치류， 또는 인간일 수 있다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머의 치료적 유효량을 암 치료를 필요로 하는 환자에 게 투여하는 단계를 포함하는 암 치 료 또는 암전이 억 제 방법을 제공한다. 상기 방법은 ERBB2 압타머 투여 단계 이 전에 암 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 치료적 유효량은 투여 대상 환자에서 치료 효과를 발휘 할 수 있는 투여량을 의 미하는 것으로， 환자의 상태, 병 세 등에 따라서 적 절히 조절될 수 있으며 , 예컨대 하루에 0.1 내지 500 mg/kg (체중)， 바람직하게는 0.5 내지 100 rag/kg (체중) 정도일 수 있으며 , 상기 유효량이 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분량되 어 투여 될 수 있다.
또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머 의 암 치료 또는 암 전이 억 제를 위한 용도, 또는 암 치료제 또는 암 전이 억 제제 제조에 사용되기 위한 용도를 제공한다. 또 다른 예는 상기 ERBB2 압타머 의 암 진단을 위 한 용도를 제공한다.
상기 방법 또는 용도에 있어서의 투여 경로, 환자 (투여 대상), 치료 가능한 암 종류는 상기한 바와 같다.
또한， ERBB2는 유방암과 대장암을 비롯하여 다양한 암에서 과발현이 관찰되므로， 상기 ERBB2 압타머는 암 진단용 조성물로서 사용 가능하다. 또 다른 측면에서， 본 발명은 상기 ERBB2 압타머를 이용하여 암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 암 진단에 정보를 제공하는 방법은
환자의 생물학적 시료를 준비하는 단계;
상기 생물학적 시료에 ERBB2 압타머를 반응시 키는 단계; 및
상기 생물학적 시료에서의 ERBB2 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
환자의 생물학적 시료에서의 ERBB2 압타머 의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우， 상기 환자를 암이 발생한 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있다. 따라서， 상기 방법은 정상 시료에서 의 ERBB2 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 환자는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며 , 바람직하게는 설치류, 또는 인간으로서， 암의 발생 또는 암의 전이 여부를 판단할 대상을 의 미 한다.
상기 방법으로 진단에 정보를 제공할 수 있는 암 종류는 ERBB2와 관련된 모든 종류의 암일 수 있으며， 예컨대, 유방암， 대장암, 폐암, 담낭암， 췌장암， 위 암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 정상 시료는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며， 바람직하게는 설치류， 또는 인간으로부터 얻어진 것으로， 진단에 정보를 제공할 대상 암, 예컨대， 예컨대, 유방암, 대장암， 폐암, 담낭암， 췌장암， 위암 등으로 이루어진 군에서 선택된 암의 발생 및 상기 암의 전이가 없는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 의미한다.
상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포， 조직， 혈액, 체액， 타액 등일 수 있다.
상기 생물학적 시료에서의 ERBB2 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며， 예컨대, ERBB2 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하여 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나， 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 ERBB2 압타머 중 ERBB2 결합부위가 상이하여 서로 결합에 방해하지 않는 한 쌍의 압타머를 선택하여， 하나는 기판에 고정시키고 (capture aptamer), 다른 하나 (detection aptamer)는 말단에 형광 물질 또는 방사성 물질 표지 (또는 형광 물질 또는 방사성 물질과 반웅 가능한 물질 결합)하여， 그 세기를 측정함으로써, 시료 내 ERBB2 존재 여부 또는
ERBB2 과발현 여부를 측정할 수 있다 (도 2A 참조).
이와 같이, 압타머를 사용하여 시료 내 ERBB2 존재 여부 또는 과발현 여부를 확인하는 경우, 기존의 항체를 이용한 검출보다 현저하게 우수한 민감도를 보이는 것으로 나타났다 (도 2B 참조)
【발명의 효과】
본 발명은 ERBB2를 효과적으로 억제할 수 있는 압타머를 제공하며， 상기 압타머는 ERBB2와 관련된 모든 종류의 암의 진단， 치료 및 /또는 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 변형 염기 (dUTP)을 사용하여 변형 염기 함유 안티센스 라이브러리를 합성하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
2A는 ERBB2 압타머를 이용한 샌드위치 방식 에세이 과정을 모식적으로 보여주는 것이고, 도 2B는 본 발명의 ERBB2 압타머를 이용한 assay와 ELISA에 의한 분석 결과를 비교하여 보여주는 것이다.
도 3A는 EGF 농도에 따른 EGFR (ERBB1)의 티로신 (Tyr845) 인산화 변화를 보여주는 것이고， 3B는 시간에 따른 EGFR (ERBBl)의 티로신 (Tyr845) 인산화 변화를 보여준다.
도 4A는 ERBB2 압타머를 이용하여 ERBB2 활성 저해를 스크리닝하는 과정을 모식적으로 보여주는 것이고(1:£01 ，2^1682 압타머). 4B는 이와 같은 스크리닝에 의하여 얻어진 결과 중 AP001-24(SEQ ID NO: 11)의 결과를 대표적으로 보여주는 것이다.
도 5A는 ERBB2 압타머 (녹색)가 EGF 매개 다이머화를 차단하여 ERBB2 활성 (Tyr877 인산화)을 저해하는 과정을 모식적으로 보여주는 것이고， 도 5B는 ERBB2 압타머 (녹색)가 HRG 매개 다이머화를 차단하여 ERBB2 활성 (Tyr877 인산화)을 저해하는 과정을 모식적으로 보여주는 것이고， 도 5C는 ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)가 EGF 매개 다이머화와 HRG 매개 다이머화를 차단하여 ERBB2 활성화 (Tyr877 인산화)를 저해하는 결과를 보여주는 것이다 (NT: No Treatment, Control aptamer: Ap001-24의 reverse complement sequence).
도 6은 ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)에 의한 AKt 및 ERK의 활성도 저해 결과를 보여주는 것이다.
도 7A는 ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)의 EGFR 및 ERBB2와의 결합력올 분석한 결과이고 (X 축: 표적 단백질의 농도 (nM), y축: cpm), 7B는 MCF7에서의 ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)의 ERBB2와의 결합을 Cytochemistry 방법을 통하여 확인한 결과를 보여주는 것이고， 7C는 FACS assay 방법에 의하여 확인한 결과를 보여주는 것이다 (control aptamer: Ap001-24의 reverse complement sequence).
도 8은 실시예 3에서 제조된 ERBB2 압타머 제제 중 PEG-ERBB2 압타머 -idT(E2)와 Control T40mer aptamer(Tl)의 혈청 내 반감기를 비교한 결과를 보여주는 것이다.
도 9는 ERBB2 압타머 투여 후 마우스 유방암 조직의 크기 변화를 측정한 결과를 보여주는 것이다.
도 10은 ERBB2 압타머 제제를 사용한 치료 전 (Day 0)과 치료 후 (Day 6)의 육안소견 (위)과 FDGPET영상 결과 (아래)를 보여주는 것이다. 【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나， 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다. <실시예 1> ERBB2 압타머 발굴
1.1: 변형핵산 라이브러리 합성
SELEX에 필요한 single strand modified DN A library를 제조하기 위하여， 5' 말단에 Biotin이 결합된 antisense library [5'-Biotin-d(GGCTGGTGGTGTGGCTG-N40-CAGGCAGACGGTCACTC)-3'; (SEQ ID NO: 36)]를 합성하였다. 이 과정을 도 1에 모식 적으로 나타내었다.
이 와 같이 합성된 antisense를 가지 고 20μΜ 5' primer(GAGTGACCGTCTGCCTG; SEQ ID NO: 39)와， 0.5mM dNTP(ATP, GTP, CTP, NapdUTP), 0.25U/ul KOD XL( OD XL DNA polymerase, Novagen), 10X extension buffer(1.2M Tris-HCl pH7.8, lOOmM KC1, 60mM (NH4)2S04, 70mM MgS04, 1% Triton X-100, lmg/ml BSA) 상에서 70°C에서 1 시 간 동안 인큐베이 션하여 double strand DNA를 제조하였다.
여 기에 20mM NaOH 이 용하여 elution한 뒤， 80mM HC1용액으로 중화하여 single strand modified DNA library를 제조하였다. 제조된 DNA library는 Amicon ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축한 뒤 UV spectrophotometer로 정량하였다 .
1.2: SELEX 방법으로 ERBB2 단백질에 대한 압타머 발굴
ERBB2(R&D systems, 1 129-ER-050)에 결합하는 DNA aptamer를 선별하기 위하여 SELEX 기법을 이용하였다.
ERBB2와의 결합: 먼저 상기 합성된 Library lnmole을 selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KC1, 25mM MgCl2)에 넣고 95 °C , 70°C , 48 °C, 37 °C에서 각각 5분간 반응시 킨 후， Negative selection을 위하여 10X protein competition buffer(10 M prothrombin, ΙΟμΜ casein, 0.1%(w/v) HSA (human serum albumin, SIGMA) H^L를 흔합한 뒤， 상층액 이 제거된 Hexa-His가 결합되어 있는 Talon bead(50%(w/v) slurry, lOmg/ml Invitrogen)에 첨가하여 37 °C에서 10분간 반웅 시 켰다.
Negative selection반웅 후, 상층 액만을 취 하여 새로운 tube에 옮긴 후， ERBB2와 결합시 킨 Talon bead에 37 °C에서 1시 간 동안 반웅시켰다. Selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KC1, 25mM MgCl2) ΙΟΟμί로 DNA와 ERBB2 복합체와 결합한 Talon bead를 5번 세척 하였다. 5번째 세척 시 에는 새로운 plate에 옮겨 세척 하였다. 2mM NaOH 용액 85 를 첨가하여 표적에 결합하는 library를 elution한 뒤 8mM HC1 용액 20μΙ^로 neutralization하였다. 증폭: 표적에 결합하는 library DNA를 QPCR(quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다. 앞세 ibrary제조에 사용된 5' primer (GAGTGACCGTCTGCCTG (SEQ ID NO: 39)와 3' primer(Biotin-GGCTGGTGGTGTGGCTG, Biotin-(SEQ ID NO: 40)) 각각 5uM (5 X QPCR master Mix, Novagen), 0.075U/ul KOD(Novagen) (임종훈)， ImM dNTP(Roche Applied science), 25mM MgCl2, 5XSYBR green I (Invitrogen)를 총부피가 125 가 되도록 흔합하여 , 96 °C 15초， 55 °C 10초, 68 °C 30분 조건으로 1 cycle, 그리고 96 °C 15초， 72 °C 1분 조건으로 30 cycle을 반복하여 double strand library을 제조하였다. eDNA 제조: eDNA는 enzymatic DNA로 DNA template와 polymerase를 이용해 생산한 압타머를 의 미 한다. 상기 QPCR을 통하여 만들어진 DNA library를 25 L Myone SA bead(Invitrogen)에 상온에서 10분간 흔합하여 고정하였다. 이 때 흔합된 DNA 양은 QPCR product로 60ul로 하였다. 20mM NaOH 용액을 첨가하여 single strand DNA로 만들어주었다. 그리고 상기 실시 예 1.1의 Library 제조와 같은 방법으로 변형된 핵산을 포함하는 DNA를 합성하여 다음 round에 사용하였다. SELEX round는 총 8회 수행하였고 보다 선택적 인 결합을 위하여 4회부터 6회 까지 그리고 7회부터 8회까지 각각 DNA와 단백질 (ERBB2) 복합체를 10mM DxS04(sigma)용액에 1 /200， 1 /400로 희석하여 DNA aptamer를 선별하였다.
Pool binding assay: ERBB2와 SELEX round가 진행된 DNA po 의 결합력을 알아보기 위하여 filter binding assay을 수행하였다. 먼저 수행된 6 round와 8 round의 po 을 a-P32ATP(Perkin Elmer)와 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB)로 말단에 표지 하였다. 상기 SELEX 과정을 통하여 얻어진 library DNA Ι μΜ, 0.25μί α-Ρ32ΑΤΡ(5μΜ, perkinelmer), 0.25μί TdT, 및 10XNEB buffer4(NEB) ΙΟμί reaction volume으로 37 °C에서 30분간 반웅시 키 고, 70 °C에서 10분간 incubation 하여 , TdT를 불활성화시 켰다. 표지 된 DNA po 은 Micro spin G-50 column(GE healthcare)을 이용하여 정 제하였다. 표지 된 DNA pool 20,000cpm을 ΙΟΟμί lxSB buffer(200mM HEPES,
510m NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)에 넣고 95 °C에서부터 1초에 0.1 °C씩 37 °C까지 천천히 냉각시 켰다. 그리고， buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgC½)를 이 용하여 ERBB2 protein(R&D systems, 1 129-ER-050)을 100nM에서 12 point로 serial dilution한 뒤， 상기 가열 및 냉 각시 킨 DNA pool 30μί를 각각 첨 가하여 37 °C에 서 30분간 반웅시 켰다. Nylon membrane(GE healthcare)에 DNA와 ERBB2의 흔합물을 각각 2μί씩 spotting한 뒤 zorbax resin(Agilent) 5.5 L를 첨 가하였다. 그리 고 미 리 IX SB buffer(200mM HEPES, 510m NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) 50μί로 적셔놓은 Durapore filter(Millipore)에 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리 고 membrane filter를 ΙΟΟμί의 IX selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)로 씻어주었다. Filter plate를 image plate에 overnight expose한 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 image를 정량화 하였다.
상기 얻어진 ERBB2와 SELEX round를 거 친 DNA po 간의 결합 친화력을 다음의 표 1에 나타내었다. 상기 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 SigmaPlot l l(Systat Software Inc.)을 이용하여 구하였으며， 표 1 중 BMax는 input 대비 결합한 압타머 의 비율을 나타낸 것이고， Kd(dissociation constant)는 친화력을 나타낸다.
【표 1 ]
Figure imgf000014_0001
상기 표 중, library는 사용된 벤질기， 트립토판기， 나프틸기 3가지 종류의 변형 핵산 무작위 염 기서 열을 갖는 DNA이고 각 group은 특정 한 library를 이용한 앞서 기 재된 SELEX 단계 중 특정 Round 후 얻어지는 ssDNA Po 을 의 미하여 각각 다음과 같다. Groupl은 Nap Library 6R pool, Group2^ Bz library 6R Pool, Group3^ Nap library의 8R pool, Group4^- Trp library 8R pool, Group5는 Bz library의 8R po 을 의 미 한다.
ERBB2 압타머 염기서열 분석 : 6번의 SELEX round를 거 친 group 1의 경우 결합 친화력 이 가장 높아 위에 언급한 QPCR 방법으로 double strand DNA로 증폭한 뒤 TA cloning kit(SolGent)를 이용하여 cloning하였다. 그리고 vector상에 존재하는 Ml 3 primer(CAGGAAACAGCTATGAC)을 가지 고 sequencing하여 다음과 같은 sequence를 얻었다.
얻어진 ERBB2에 매우 특이 적으로 결합하는 DNA aptamer는
5'-GAGTGACCGTCTGCCTG-[Core
sequence]-CAGCCACACCACCAGCC-3'
의 염 기서 열을 가지며, 여 기서 Core Sequence는 아래의 표 2에 나타낸 바와 같고, 이 중에서 6은 Naphthyl-dU를 나타낸다.
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
A = 2'-deoxy Adenosine
G = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidine
T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine) 상기 발굴된 ERBB2 압타머들을 다음과 같이 유사 family로 분류하였다 (서열 상동성은 염기서열의 85% 상동성을 기준으로 함):
【표 3】 74.00% (37/50) Multi-Copy
Figure imgf000017_0002
#12 clone(9-ER-N-C02_D06)의 경우 50개의 sequence중 11번의 같은 염기서열이 반복되어 나타났다. 그리고 #33(9-ER-N-F02_A09)은 7번，
#1(9-ER-N-A01_A05)은 5번， #19(9-ER-N-D02— C07)은 5번， #10(9-ER-N-B09— B06)은 3번의 반복되는 염기서열이 나타났다. 상기 발굴된 ERBB2 압타머의 서열 상의 유사성을 clone들간의 염기서열 중 반복적으로 나타나는 부분과 빈도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과는 다음과 같다:
//: O K8soono2Ml>dAV
Figure imgf000019_0001
** * * * * ********** . [12】 9"HH 02J»6 Count: 11 66ACAGC Pattero_3 X 1 i imt s
Score: 12
[4】 »-ER- -A04J»5 >【： u 】 ι
ψ * + + + + ) + * i + ^ ψ + ÷ ,ι .: + 4
__AGAG66eQCC6GAGeQCC60G PatternJS X 4 times
JG(S66eQ00SGAGe00CW(XAAGBGCG6_^_ PetteriL.7 \ 3 tii s eQ00eGAG6G006OiCAA0GGfieAACAG Pattern^ X 2 tinu-
Score: 9
[42] -ER- -G0 10 Lou ： 1 0.02%
Figure imgf000020_0001
ψ φ ^ > - ) ' φ
_C0eeAGe PiUernj X 7 times
Score: 7
[22] 9~HHH 6LP07 Count: 3 0.06%
a'GeeAcceAccax'ajAc GeGc^e 'cceeAGe tcA
H( ) > > ♦ * *
C0eeAG6__ Pattera_4 X 7 t imes
Score: 7
[18] 9-EIHHX)U07 Count： 1 0.02* CC66AG6 Pattera_4 X 7 times
Score: 7
[13] -BR-»-C0aUOe Count： 1 0.02* eeAGOOGAAOG PitternJi X 7 tim s
Score: 7
[1] 9-E -N-AD 05 Count: 5 0.10*
A ; AGAG66eQCX iAGeQCCeO^
***** ^ * * + * Ψ ******** * *
AGAG66«3CO0GAGeQCCeOG Pattern^ X l imes
Score: 4
[5】 9~HHHtt)eLE05 Count： 1 0.02*
90CeGeCCCQG666ACA..W
e0C8Ge000Q0666ACA PatteroJB X time
Score: 2 10.00% (5/50) Orphans
【219-E -N-A02_B05 1 i. '
[15] 9-ER-N-C06.G06 1
[17] & -ER-N-C10JW7 1 Ο.ο^
6( \«16L·L'CCl'\t6C·Λ(λ¾i«,Λ\β 6.\t¾itC (I ： \
[21] 9"ΗΗΚ»^_Β07 1 0.03
[37] 9-ER-N-F08_E091 0.02^
H \iai5Ci¾:t¾1.\6HA(,(l6.(J.l (itlC6At6teA ;(,(J<.A(1
Clone binding assay: 반복적으로 관찰된 염기서열을 갖는 clone의 결합친화력을 알아보기 위하여 위의 pool binding assay와 같은 방법으로 filter binding assay를 수행하였다. 상기 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 SigmaPlot ll(Systat Software Inc.)올 이용하여 구하였으며， 그 결과를 아래의 표 4에 나타내었다. 표 4 중 BMax는 input 대비 결합한 압타머의 양을 나타낸 것으로, 1에 가까울수톡 좋은 성능을 의미하는 것이고， Kd(dissociation constant)는 친화력을 나타내는 수치로 수치가 낮을수록 결합력이 높음을 나타낸다.
【표 4】
Figure imgf000021_0001
총 5종류의 clone을 가지고 assay하였고 이들 중 #12 clone(9-ER-N-C02_D06)의 경우 ¾가 0.78nM로 표적 단백질에 높은 친화력을 나타내는 결과를 보였다. #11 clone(9-ER-N-B12_C06)의 경우 screening 결과 표적단백질에 대하여 좋은 억제력 (inhibition)을 보였다.
Full length 압타머로부터 truncation을통한 최적의 압타머 서열 결정:
SELEX 과정을 통하여 cloning된 DNA 압타머는 sequence가 80mer 전후의 길이를 가지는데， 이 정도의 길이가 타겟 단백질과의 해리상수 ( )가 적합한 범위인 것으로 선별되었다. 이 중 가장 좋게 평가되는 두 가지 클론인 #11 Clone(1194-2로 표시， SEQ ID NO: 37) 및 #12 clone(1194-l로 표시, SEQ ID NO: 38)을 가지고 전체 sequence 길이를 가지는 74mer와 프라이머 영역을 제외한 랜덤영역 40mer인 압타머 1194-35 (AP001-25， SEQ ID NO: 7) 및 압타머 1194_34(AP001-24, SEQIDNO: 11)를 각각 합성하였다 (표 5 참조). ERBB2 압타머 합성 : 압타머는 핵산전용 고정 상합성 기 인 Bioautomation사의 Mermade 12 합성 기를 사용하여 Solid Phase Oligo Synthesis 방법으로 자체 합성하였다. ERBB2 압타머 분리 /정제 및 QC: 상기 변형 핵산체를 가지는 압타머 의 합성， 정 제 및 동정을 통하여 발굴된 변형 압타머들을 modified-dU-phosphoramidite로부터 Oligonucleotide 합성 기 (Bioautomation사의 Mermadel 2)를 이용한 phosphoramidite coupling 반웅으로 합성하였으며， 합성 후 resin(200nmole-dA(Bz) synthesis column, 1000A(MM1 - 1000-2))을 t-butylamine:methanol:water(l： 1 :2 부피 비)에 넣고 70°C에서 5시 간 동안 deprotection후 진공 건조를 시킨 다음， C18 column (Waters, Xbridge OST C18 10x50mm)를 사용하여 5ml/min의 속도로 651：에서 Acetonitrile의 농도를 높여가면서 HPLC의 방법으로 분리 /정 제하였다.
HPLC에서 UV 254 nm 및 290nm를 chromatogram을 분석 한 결과 70 ~ 90%의 순도를 보이는 변형 압타머들을 성공적으로 합성하였다. 이들 압타머들은 모두 LC-ESI MS spectrometer(Waters HPLC systems(Waters) + Qtrap2000(ABI))로 정확한 분자량을 측정하여 표 5에 나타내었다.
【표 5】 ERBB2 압타머 서 열 (ERBB2 압타머 = NapdU-modified DNA aptamer, 6 = NapdU)
Figure imgf000022_0001
#12 (1194-1): 9-ER-N-C02— D06
6 = NapdU [5-(N-Napthylcarboxyamide)-2!-deoxyuridine]
A = 2*-deoxyAdenosine
G = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidine
T = 2f-deoxyThymidine(Thymidine) 상기 Na dU는 다음의 구조를 갖는다:
Figure imgf000023_0001
합성 ERBB2 압타머 분자량 측정 : LC-ESI MS spectrometer를 이용하여 10,000g/mole 이상의 분자량을 가진 압타머 및 압타머 제제를 0.02% 오차범위 내에서 정확한 분자량을 측정하였다.
ERBB2 압타머의 샌드위치 방식의 어세이 적용: 상기 발굴된 ERBB2 압타머를 이용하여 샘플에 있는 ERBB2의 농도를 정 확히 측정하는 어세이 개발 가능성을 살펴보기 위하여， ERBB2에 결합하지 만 서로 방해하지 않으면서 동시에 결합하는 2종류의 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 1 1)와 AP001-25(SEQ ID NO: 7)를 이용하여 ELISA 방식 의 어세이를 진행하여 5%의 serum(sigma)존재 하에서 정 제된 ERBB2의 검출 능력을 확인하였다. 이를 위하여 압타머에 대해서는 AP001-25를 바닥에 고정하고 AP001-24말단에 biotin을 conjugation하여 Streptavidin-HRP를 이용한 발색반웅으로 확인하였고 (도 2A 참조)， 항체와 비교를 위하여 RnD systems 사의 ERBB2 ELISA Kit를 사용하여 어 세이를 진행하였다.
이와 같이 얻어진 결과를 도 2B에 나타내었다. 도 2B에서 알 수 있는 바와 같이， 본 발명에 따른 ERBB2 압타머를 사용하는 경우 5% serum이 존재하는 복잡한 샘플 조건에서 추가로 넣어준 정제된 ERBB2(R&D systems, 1129-ER-050)를 50pg/ml의 뛰 어난 민감도로 측정 가능함을 확인하였다.
<실시 예 2> ERBB2 압타머의 생체외 (in vitro) 효능 실험
2.1: ERBB2 signaling blocking을 위한 발굴 압타머 스크리닝
EGFR family는 전체 4종류의 isotype(EGFRl , ERBB2, ERBB3, ERBB4)로 이루어 져 있으며 , 이들 중 ERBB2는 세포막 바깥쪽에 EGF, NRG, TGF-alpha 등 리 간드가 결합하는 도메 인이 없으며 항상 활성화 되 어 있는 구조로 이루어 져 있다. 실제 정상 세포내에서 EGF는 EGFR1에 결합하여 EGFR1의 구조를 변화시 키 고 ERBB2와 결합을 통하여 hetero-dimer형 태가 되며， 이에 따라 수용체의 tyrosine kinase activity가 활성 화되어 세포내로 신호를 전달하게 된다. 하지 만 유방암， 대 장암 등의 특정 암세포에서 ERBB2 수용체가 활성화 되면 EGFR1, ERBB3 등 다른 수용체를 거 치지 않고 리 간드가 결합할 수 없는 항상 활성화 형 태인 ERBB2 수용체끼 리 homo-dimer 형 태를 형성 함으로써 ERBB2 수용체의 tyrosine kinase활성 이 증가되어 암세포의 성 장을 유발하게 된다.
본 발명에서는 이 러 한 암의 형성 및 전이 과정에 중요한 ERBB2에 대하여 결합하는 aptamer를 발굴하였고, 이 와 같은 결합 압타머 중 ERBB2의 활성을 저해하는 역할을 하는 압타머를 발굴하기 위하여 아래와 같은 screening 방법을 수립하였다.
EGF 농도 및 시간에 따른 EGFR의 티로신 (Tyr845) 인산화 변화를 측정하기 위하여 세포주 (A431, ATCC)에 EGF(P01133, Sigma)를 5분간 다양한 농도로 처 리하거나 (도 3A), ΙΟηΜ의 EGF를 다양한 시 간동안 처 리 한 후 (도 3B) Lysis buffer(l% Triton X-100, Tris buffered saline)에서 ice에서 1시간동안 lysis시 킨 후, 전기 영동 및 Nitro cellulose paper에 transfer 후 phospho-EGFR antibody(Cell Signal)를 이용하여 western blot을 수행함으로써 EGFR의 활성화에 따른 EGFR 인산화를 확인하였다.
도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이 , EGF농도가 16nM 이상으로 증가할 때까지 EGFR의 활성 이 증가하며， 5분 처 리 시 가장 높은 활성도를 나타냄을 확인하였다.
이에 따라 본 연구진은 약 50여 개의 ERBB2 결합 압타머를 스크리 닝할 조건으로 EGF ΙΟηΜ을 5분간 처리하고 이 때 압타머를 동시에 넣음으로써 EGF에 의 한 ERBB2 수용체의 티로신 인산화 정도를 측정 함으로써 ERBB2의 활성도를 스크리 닝 하였다.
A431 세포 (ATCC)를 6well plate에 고정하여 24시 간 serum을 첨가하지 않은 DMEM(HyClone)으로 starvation을 진행 한 후, ΙΟηΜ의 EGF(P01 133, Sigma)와 함께 각각의 압타머를 첨가한 DMEM으로 미 디 어를 교환하여 5분간 incubation하였다. 그 후， media를 제거 한 뒤 300ul의 lysis bufferil %Triton X-100, Tris buffered saline)를 처 리하여 scrapper를 이용해 세포를 모은 뒤 ice에서 1시간 동안 incubation하여 세포를 용해시 킨 후, centrifiige를 이 용하여 10분간 4C 1000g에서 원심분리하였다. 펠렛으로 나오는 핵을 제거하고 상층액만을 모은 후， 이 렇게 얻은 세포 용해물을 전기 영동 및 nitro cellulose paper에 transfer한 뒤 anti-human phospho ERBB2 antibody(Cell Signal)를 이용하여 western blotting을 하여 ERBB2의 인산화 여 부를 확인하였다. 이 와 같은 스크리 닝 방법을 대략적으로 도 4A에 나타내었다. 이 는 ERBB2 압타머를 이 용하여 EGFR과 ERBB2의 헤 테로 다이 머 형 성 저해를 확인하기 위하여 설 계되 었다.
표 2에 기 재된 50개 압타머 에 대한 p-ERBB2 저해율을 압타머 농도별 (0.63， 2， 6.3, 20 nM)측정하였으며， 그 결과 AP001-24(SEQ ID NO: 1 1 )가 가장 효과적으로 EGF에 의 한 ERBB2의 활성 (인산화)을 저해함을 확인하여 그 결과를 도 4B에 나타내었다. AP001-24는 IC50 값이 약 InM인 정도로 ERBB2의 활성올 저해함을 알 수 있다. 2.2: ERBB2 압타머의 암억제 효과
ERBB2 압타머 가 EGF, HRG mediated EGFR-ERBB2 또는 ERBB2-ERBB3 hetero-dimerization을 차단 (block)하며 암생존 (cancer survival)과 관련이 있는 AKT 및 ERK와 같은 다운스트림 신호전달 (Down stream signaling pathway)를 차단 (block)하는 것을 관찰하였다.
도 5A와 5B는 각각 ERBB2 압타머 (녹색)가 EGF 매개 다이 머화와
HRG 매개 다이 머화를 차단하여 ERBB2 활성 (Tyr877 인산화)을 저해하는 과정을 모식 적으로 보여준다.
ERBB2 압타머 AP001 -24(SEQ ID NO: 1 1)를 EGF 또는 HRG와 함께 첨가하였을 때， EGF 또는 HRG만 첨가한 경우보다 ERBB2 활성화 (Tyr877 인산화)가 저해됨을 확인하였다. 이를 위하여 A431 cell line(ATCC)을 6well plate에 고정하여 50%-70% confluent가 될 때 성장인자가 없는 DMEM 배지 (HyClone)로 교체 후, 24시 간 동안 serum starvation을 진행하고， 세포가 있는 배지 에 최종 농도 20nM의 압타머를 15분간 첨가하여 incubation하였다. 그 후， 다시 최종농도 10nM 의 EGF(P01 133, Sigma), 또는 2nM의 HRG(Q02297, Sigma)를 첨가하여 5분간 incubation 하였다. 그 후， 상층액을 제거 하고， 300ul의 lysis bufFer(l%Triton X-100, Tris buffered saline)을 첨가하여 모은 뒤， ice에서 1시간동안 incubation을 하여 cell lysate를 만들었다. 만들어진 lysate를 5분간 4C 15000 rpm의 원심분리를 하여 (table top centrifiige, Eppendorf), 상층액만을 모아 세포 핵을 제거 한 뒤 , 전기 영동 및 Nitro cellulose paper에 transfer하여 phospho-ERBB2 specific antibody(Cell Signal)를 이 용하여 Western blot을 수행하였다. (도 5C 참조， NT: No Treatment, Control aptamer: Ap001 -24의 reverse complement sequence).
또한 이 러 한 AP001 -24 aptamer에 의 한 ERBB2 수용체의 활성화 저 해는 암세포의 성장에 중요한 역할을 한다고 알려 진 ERBB2 down stream의 Akt, ERK단백 질의 활성 화 또한 저해함을 확인하였다.
이를 위 하여 A431 cell line(ATCC)을 6well plate에 고정 하여 50%-70% confluent가 될 때 성 장인자가 없는 DMEM 배지 (HyClone)로 교체 후 24시 간 동안 serum starvation을 진행 한 후, 세포가 있는 배지 에 최종 농도 20nM의 압타머 AP001-24를 15분간 첨가하여 incubation 후 다시 최종농도 Ι ΟηΜ 의 EGF(P01 133, Sigma), 또는 2nM의 HRG(Q02297, Sigma)를 첨가하여 5분간 incubation하였다. 그 후, 상층액을 제거 하고 300ul의 lysis buffer(l %Triton X-l 00， Tris buffered saline)을 첨 가하여 모은 뒤 ice에서 1시 간동안 incubation을 하여 cell lysate를 만들었다. 만들어진 lysate를 5분간 4C 15000 rpm의 원심분리를 하여 (table top centrifuge, Eppendorf), 상층액만을 모아 세포 핵을 제거 한 뒤， 전기 영동 및 Nitro cellulose paper에 transfer하여 phospho-Akt specific antibody(Cell Signal) 및， phospho-ERK specific antibody(Cell Signal)를 이용하여 Western blot을 수행하였다 (도 6 참조). 2.3: ERBB2 압타머의 선택성 (Specificity) 확인
본 발명에서 발굴된 ERBB2 압타머가 ERBB2만을 특이 적으로 결합하는지를 확인하기 위하여 , ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 1 1)의 ERBB2와 아미노산 서 열이 비슷한 EGFR(Acc# P04412)와의 결합력을 비교해 보았다.
결합력을 측정하기 위하여 a-P32ATP(Perkin Elmer)와 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB)로 말단에 표지 하였다. 상기 SELEX 과정을 통하여 얻어진 library DNA Ι μΜ, 0.25μΙ α-Ρ32ΑΤΡ(5μΜ, perkinelmer), 0.25μί TdT, 및 10XNEB buffer4(NEB) ΙΟμί reaction volume으로 37 °C에서 30분간 반응시 키고, 70°C에서 10분간 incubation 하여， TdT를 불활성화시 켰다. 표지 된 DNA po 은 Micro spin G-50 column(GE healthcare)을 이 용하여 정 제하였다. 표지 된 DNA pool 20,000cpm을 ΙΟΟμΙ^ lxSB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25m MgCl2)에 넣고 95 °C에서부터 1초에 0.1 °C씩 37 °C까지 천천히 냉각시 켰다. 그리고， buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)를 이용하여 ERBB2 protein(R&D systems, 1 129-ER-050)을 100nM에서 12 point로 serial dilution한 뒤， 상기 가열 및 넁각시 킨 DNA pool 30μί를 각각 첨 가하여 37 °C에서 30분간 반웅시 켰다. Nylon membrane(GE healthcare)에 DNA와 ERBB2의 흔합물을 각각 2μί씩 spotting한 뒤 zorbax resin( Agilent) 5.5μί를 첨가하였다. 그리 고 미 리 IX SB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) 50| 로 적셔놓은 Durapore filter(Millipore)에 넣고 vacuum을 걸어주었다 · 그리고 membrane filter를 ΙΟΟμΙ^의 IX selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)로 씻어주었다. Filter plate를 image plate에 overnight expose한 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 image를 정량화 한 후 그 결과를 도 7A에 나타내었다. 도 7A에 나타난 바와 같이， ERBB2 결합 압타머는 ERBB2에 대한 결합력이 EGFR수용체보다 1,000배 이상의 높은 것으로 확인되었다.
또한, 상기 ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)에 Cy3 fluorescent(BioGenex)를 conjugation한 뒤， 이를 이용하여 유방암 세포주인 MCF7(ATCC)에서의 ERBB2와의 결합을 Cytochemistry (도 7B), 및 FACS assay 방법 (도 7C)을 통하여 확인하였다.
Cytochemistry를 위하여 MCF7 세포 (ATCC)를 24well plate에 cover glass를 넣고 키운 후 30~50% confluent하게 되었을 때 l%(w/v) 파라포름 알데히드가 포함된 PBS로 세포를 고정시킨 뒤, 15분간 1%BSA가 포함된 Tris buffered saline으로 blocking 하였다. 그 후 항체의 경우 ErBB2 specific antibody(Cell Signaling)을 l:1000(v/v)의 비율로 l%(w/v)의 BSA(RnD systems)가 첨가된 PBS로 회석하여 처리하고 압타머의 경우 lOpmole의 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)를 37°C에서 30분간 처리한 뒤, cover glass를 PBS로 3회 세척한 뒤 dehydration 및 건조시킨 후, slide glass에 permount 시킨 뒤 Microscope를 이용하여 관찰하였다.
FACs assay를 위하여 MCF7 세포 (ATCC)를 10cm plate에 5x104 내지
2x105 세포수만큼 배양한 뒤， 2mMEDTA를 첨가하여 세포를 떼어낸 뒤, 4°C로 넁각된 PBS로 세척하였다. 그 후， 항체의 경우 ErBB2 specific antibody(Santacruze)를 l:1000(v/v)의 비율로 l%(w/v)의 BSA(RnD systems)가 첨가된 PBS로 희석하여 4°C 에서 60분간 처리하고 PBC로 3회 세척 뒤, FITC conjugated secondary antibody(Santacruze)를 RT에서 30분간 처리하였다. 압타머의 경우 lOOpmole의 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)를 넣어 4°C에서 1시간 반웅시키고， 4°C로 냉각된 PBS로 세척하여 준비하였다. 항체 및 압타머를 처리한 세포들은 l%(w/v) 파라포름알데히드 용액을 i.5ml씩 첨가하여 4°C에서 고정시킨 후 FACs 기기 (FACSCalibur flow cytochemistry, BD bioscience)를 이용하여 측정하였다.
도 7B 및 7C에 나타낸 바와 같이, ERBB2 압타머 AP001-24(SEQ ID NO: 11)는 ERBB2에만 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다 (control aptamer: Ap001-24의 reverse complement sequence). <실시 예 3> ERBB2 압타머 제제 (formulation)의 제조
Truncated aptamer AP001 -24(SEQ ID NO: 1 1 )로부터 4종류의 ERBB2 압타머 제 제를 다음과 같이 합성하였다.
E l : (2'-OMeU)2-ERBB2 압타머 -(2'-OMeU)2 [(2'-OMeU)2-Cy3-O-(AP001-24)-O-(2'-OMeU)2-T]
E2: PEG-ERBB2 압타머 -idT [Cy3-T-PEG784-O-(AP001 -24)-idT]
E3: ERBB2 압타머 -idT [Cy3-O-(AP001-24)-idT]
E4: ERBB2 압타머 [Cy3-O-(AP001 -24)-OH]
(T: 2'-deoxyThymidine(Thymidine), idT: inverted deoxythymidine)
(PEG 분자량 : 784 Da)
정 제 후 2차 증류수에 녹여 압타머 의 농도를 측정한 후 각각의 압타머가 0.1 mM 농도가 되도록 준비 하였다.
ERBB2-aptamer 제제의 혈청 내 안정성올 확인하기 위하여 혈청 내 반감기 측정하였다. 구체적으로, 상기 준비된 압타머를 94°C에서 4분간 방치 후， 상온까지 1시간 동안 천천히 온도를 낮추어서 압타머가 2차 구조를 잘 형성하도록 하였다. 각각의 압타머 용액 40uL(4 nmoles)를 200uL의 Human Serum (Human male AB plasma/sigma H4522)에 첨 가하여 vortex한 후, 20uL씩 열개의 E-tube에 분주하여 37 °C 항온기에 방치하였다. 각 샘플을 l Omin, 30min, lh, 2h, 4h, 8h, 21h, 24h, 30h, 48h, 72h 마다 순서 대로 극저온 넁동고에 보관하고 분석 전에 20uL의 증류수를 첨가한 후 lOuL씩 취 하여 Anion Exchange HPLC(Column: GE Healthcare, 1 1乂:\\ 6 )_를 이용하여 정량하고 혈청 내의 잔존 양을 graph로 나타낸 결과를 분석하여 ERBB2 압타머의 혈청 내 안정성을 측정하였다.
HPLC 조건은 Anion exchange Resource-Q column을 사용하였으며， A buffer는 25mM Tris-HCl pH8.5, B buffer는 1M Nad 25mM Tris-HCl pH 8.5를 사용하고 25분간 B buffer의 비율을 10%(v/v)에서 100%(v/v)까지 서서히 을려주었으며 551nm의 파장을 조사해 566mn의 형 광을 측정하였다. 위 분석으로 얻어진 결과를 아래의 표 6에 나타내었다. 【표 6】
Figure imgf000029_0001
위 결과로부터， 4종의 ERBB2 압타머에 대한 혈청에서의 안정성 실험 결과 3종류의 압타머제제 모두 반감기가 72시간 이상 안정함을 확인하였다 (t1/2 in serum > 72 hr). 특히 압타머의 5' 및 3' 말단이 변형된 경우 전체적으로 안정성이 현저하게 증대되는 것으로 나타났다.
위 결과 나타난 압타머 제제의 안정성 순서는 다음과 같다:
PEG-ERBB2 압타머 -idT(E2) = (2'-OMeU)2-ERBB2 압타머 -(2'-OMeU)2(El) >ERBB2 압타머 -idT(E3)>ERBB2 압타머 (E4)
상기 가장 안정한 것으로 나타난 PEG-ERBB2 압타머 -i(iT(E2)의 반감기를 Control T40 mer aptamer(Tl, T가 40번 반복된 구조)와 비교하였다. 상기와 같은 방법으로 혈청 내 반감기를 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 8에서와 같이 ,ΤΙ은 반감기가 3시간(11/2 ^ 861 1 = 3111")인 반면, PEG-ERBB2 압타머 -idT(E2)은 반감기가 170 시간 (t1/2inserum= 170hr)인 것으로 나타나, 본 발명의 ERBB2 압타머 변형체가 혈청 내에서 매우 안정 함을 확인하였다.
<실시예 4> ERBB2 압타머 제제 (PE&ERBB2 압타머 -idT)의 in vivo 효능
실험 방법
동물 모델의 제작 :6주령 Balb/c nude female 마우스를 이용하여 종양 in vivo 모델을 만들었다. 실험에 사용된 마우스의 평균 무게는 평균 20g 이었다. 마우스의 등 피하 조직에 estradiol pellet을 이식하였다. 사람에서 유래된 유방암 세포주인 BT-474세포를 ATCC사에서 구매하여 증식시켰다. Pellet주입 이를 후에 증식된 BT-474세포를 5X107 세포수만큼의 양으로 마우스의 허벅지에 피하 주사하여 종양을 형성하도록 하였다. 주사 후 2-3주간 매일 관찰하여 종양의 성장을 육안으로 확인하고 caliper를 사용하여 종양의 크기를 측정하였다. FDG PET영상 획득: 종양의 형 성을 확인하기 위 하여 FDG PET영 상을 시 행하였다. 검사 24시 간 전부터 물 이외에 금식을 시 켰다. F-18 FDG (F-18플루오로디옥시 글루코스, 세브란스병 원 핵의학과 사이 클로트론 센터 ) 220-230 를 마우스 복강내로 주사하고， 1 시 간 후에 Siemens Inveon animal PET(Positron emission tomography)을 이 용하여 영 상을 얻었다. 치료 후 효과 판정을 위하여 같은 프로토콜을 사용하여 다시 FDG PET영상을 얻었다.
ERBB2 압타머를 이용한 치료: ERBB2 압타머 (AP001-24, SEQ ID No: 11)와 ERBB2 압타머 제제 (E2 제 제, PEG-ERBB2 압타머 -idT, AP001-24, SEQ ID No: 11)를 각각 5mg/kg 및 20mg/kg의 양으로 복강 내로 5일간 매일 주사하였다. 대조군에서는 PBS 200ul을 복강 내로 주사하였다. 2-3일 간격으로 종양의 크기를 caliper를 이용하여 측정하고, 6일째에 FDG PET영상을 얻어 비교하였다. 결과
종양의 크기 변화: ERBB2 압타머 제제 (PEG-ERBB2, E2)를 투여 한 경우의 종양 크기 변화를 측정하여 PBS 을 투여 한 경우와 비교하여， 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 확인되는 바와 같이， ERBB2 압타머 제제 (PEG-ERBB2, E2) 5mg, 20mg, ERBB2 20mg 에서 유의 한 종양의 크기 변화를 보였다. 종양 크기 억 제 효과는 치료가 종결된 7일 이후에도 지속되어 2주 이상 지속되 었다.
FDG PET영상 결과: 상기 FDG PET영상을 통하여 종양의 대사 활성 정도를 평가한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이 , 치료 전 종양 부위에서 높게 관찰되던 포도당 대사 정도는 ERBB2 압타머 제제 (PEG-ERBB2, E2) 5mg/kg를 복강내로 5일간 치료 후 6일 째 영상에서 지속적으로 낮게 측정되어 ERBB2압타머 제제에 의 하여 종양의 포도당 대사가 억 제되고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 종양부위 (화살표)의 크기가 감소하는 것도 확인할 수 있다. 위와 같은 ERBB2 압타머 제제를 이용한 종양 마우스 모델 실험올 통하여 대조군과 비교하여 유의 미한 정도의 종양의 크기 감소 효과를 확인할 수 있었다. 또한 FDG PET을 이 용하여 종양의 포도당 대사 정도를 확인하였으며 , ERBB2압타머 제제 치료 후에 유의 한 포도당 대사 정도의 감소를 확인할 수 있었다. 이 와 같은 종양의 크기 변화와 포도당 대사에 대한 평 가를 통하여 ERBB2 압타머 제 제의 BT-474 유방암 세포주에 대한 항암효과를 확인할 수 있다.
<실시 예 5> 압타머 제제의 생체내 안전성평가
5.1. 압타머제제 (Aptamer Formulation)의 ICR 마우스를 이용한 단회 정맥내투여 독성 시험
본 시험은 시험 물질 압타머 제제 (Aptamer Formulation)를 ICR 계통의 마우스에 단회 정맥내투여 하였을 때 나타나는 개략적 인 독성을 알아보기 위하여 실시하였다. 시험물질로 40kDa PEG를 사용하여 제조된 압타머 제제인 PEG-ERBB2 압타머 -idT를 사용하였다.
시험물질을 0 (vehicle control), 10, 100 및 1,000 mg/kg의 용량으로， 군당 10 마리 (암수 각 5 마리 )에 단회 투여한 후 사망률， 일반증상， 체중 및 부검소견을 관찰하여 부형 제 대조군과 비교하였다. 재료 및 방법
시험물질은 상기 실시 예 3에서 ERBB2 압타머 (AP001 -24)로부터 만든 40kDa PEG-ERBB2 압타머 -idT (E2)를 사용하였다. 부형제는 IX D-PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, GIBCO)를 사용하였다. 상기 부형 제는 시험물질이 잘 용해되고， 정맥내 투여 시 독성시험에서 일반적으로 사용하는 물질이 기 때문에 선택하였다. 시 험군으로 사용한 동물은 특정 병원균 부재 (SPF) 마우스， HsdKoat:ICR(CD-l ® 코아텍)으로， 입수시 7 주령 이 고 성 별은 암수 각각 24마리 이 며， 입수시 체중은 수컷 3().13-32.97 g, 암컷 23.81-26.36 g이 었으며 , 투여시에는 8 주령， 암수 각 20 마리 및 투여시 체중은 수컷 31.33-34.70 g, 암컷 24.87-27.40 g 이 었다.
동물 공급처에서 제공한 시험군의 병원체 검사 성 적서를 참고 하여 입수동물의 검수검 역을 실시하였다. 동물은 입수 후 5 일간 시험을 실시하는 동물실내에서 순화시켰고， 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 제공하였다.
사육환경은 본 실험을 온도 23±3 °C, 상대습도 55士15 %, 환기 횟수 10-20 회 /hr, 조명 12 시간 (오전 8 시 점등 -오후 8 시 소등) 및 조도 150-300 Lux로 유지 되는 (주)켐온 전임상연구센터 제 2동물사육구역 3 호실에서 수행하였다. 모든 시험자들은 고압증기멸균 (121 V, 20 분)한 작업복과 보호장구를 착용하고 실험을 수행하였다. 실험 기 간 동안 동물실의 온도와 상대습도 범위는 각각 22.5-22.8 °C 및 63.7-69.2 % 였고, 자동제어시스템을 이용하여 기록하였다. 환기횟수， 조도 등은 (쥐캠온 전임상연구센터의 표준작업수순서 (SOPs)에 따라 정기적으로 측정하였다. 그 결과， 시험 결과에 영향을 미치는 이탈은 관찰되지 않았다. 동물은 스테인레스제 망 사육상자 (W 165 X L 240 X H 145 mm)에서 수컷은 모든 실험기간 동안 1 마리 /사육상자로， 암컷은 검역 및 순화기간에는 5 마리 /사육상자 이하, 투여 및 관찰기간에는 3 마리 /사육상자 이하로 사육하였다. 실험에 공급된 사료는 방사선조사로 멸균된 실험동물용 고형사료 (TEKLAD CERTIFIED IRRADIATED GLOBAL 18 % PROTEIN RODENT DIET, 2918C, Harlan Co. Ltd., USA)를 코아텍으로부터 공급받아 자유롭게 섭취하도록 하였다. 사료의 성분분석성적서를 검토한 결과， 시험 결과에 영향을 줄만한요인은 없었다. 물은 지하수를 자외선 살균기와 미세여과장치를 거친 후, 물병을 이용하여 자유롭게 섭취하도록 하였다. 수질검사는 경기도보건환경연구원 (경기도 수원시 장안구 파장동 324-1) 에서 수행하였고， 먹는 물 수질 기준에 적합하였다.
본 시험은 동물보호법 (제정 1991 년 05 월 31 일 법률제 4379 호， 일부개정 2008 년 02 월 29 일 법률제 8852 호)에 근거한 (주)켐온 전임상연구센터의 동물윤리위원회에 승인되었다. 시험군 구성 및 투여량 설정
시험군 구성은 다음과 같다:
【표 7】
Figure imgf000032_0001
a) 부형제대조군 (1XD-PBS)
투여량은 1,000 mg/kg올 고용량으로 두고， 그 아래로 공비 10으로 두 개군을 설정하였으며， 1XD-PBS만을 투여하는 부형제 대조군을 설정하였다. 동물의 군분리는 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 측정하고， 평균체증에 가까운 동물들을 암수 각각 20 마리씩 선택하였다. 선택한 동물들은 순위화한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 '시험군의 구성' 표에 지정된 수가 되도록 하였다. 군분리 후 잔여동물은 연습동물로 사용하였다.
개체식별은 순화기간에는 유성 매직을 이용한 미부표식법을 사용하였고, 투여 및 관찰기간에는 포화피크린산용액을 이용한 피모색소표식법을 사용하였다. 사육상자에는 용량별로 다른 색상의 개체식별카드를 부착하였으며， 사육상자대에는 고유번호를 부여하였다. 사육실 입구에는 시험번호， 동물실 사용기간, 시험책임자명， 시험담당자명， 비상연락처 등을 기재한 동물실사용기록지를 부착하였다.
시험물질은 순도에 대한 보정 없이 조제에 사용하였고， 투여직전에 조제하였다. 고용량군의 투여액은 시험물질을 칭량한 후 부형제에 용해시켜 100 mg/mL의 농도로 조제하였다. 중간 및 저 용량군의 투여액은 앞서 조제한 고용량군의 투여액을 동일한 부형제로 단계희석하여 조제하였다. 고용량군의 투여액에 한하여 pH Test Strips (P-4536, SIGMA)를 이용하여 pH를 측정한 결과 6.0-6.5 사이로 관찰되었다.
사람에 대한 임상예정경로인 정맥내투여를 선택하였다. 투여할 동물을 보정기에 넣은 후， 꼬리를 70 %, 알코을 솜으로 소독하고, 거즈를 이용하여 알코올 성분을 제거한 후， 26 G 주사침을 이용하여 약 1 mL/분의 속도로 정맥내투여하였다. 투여당일에 측정한 절식시의 체중을 기준으로 10 mlJkg으로 투여액량을 산출하였다. 1 회 /일， 단회투여 하였으며， 투여는 11:30 이전에 완료하였다. 투여일을 day 0으로 설정하였다. 관찰및 검사항목
일반증상은 투여 당일에는 투여 후 1 시간까지는 지속적으로, 투여 후 6 시간까지는 매시간마다 사망여부 및 증상을 관찰하였으며， 그 이후에는 매일 1 회 이상 투여 후 14 일까지 관찰하였다.
체중은 모든 동물에 대하여 투여 전, 투여 후 1， 3， 7 및 14 일째에, 사망동물에 대하여 발견 즉시 체중을 측정하였다.
부검은 투여 후 14 일째에 생존동물올 C02를 이용하여 흡입마취시켜 개복한 후， 후대정맥과 복대동맥을 절단하여 방혈치사 시킨 다음， 체표 및 장기에 대한 육안적인 부검소견을 관찰하였다.
통계는 체중 및 증체량은 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA test)으로 유의성을 평가하였고， P<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다. 정규성을 가정하고， Levene test로 등분산성을 검정한 결과， 등분산성이어서 Duncan's multiple range test를 수행하였다. 사망동물에 대한 반수치사량 (LD50)은 Probit 법에 따라 산출하였고, 통계를 위한 전산 프로그램으로는 SPSS HH K를 이용하였다. 결과
상기 얻어진 결과를 하기의 표 8 내지 표 17에 나타내었다:
【표 8】 압타머제제 (E2)를 ICR 마우스에 단회 정맥내투여시 독성시험
Figure imgf000034_0001
a) LD50: Lethal Dose 50
b) ALD: Approximate Lethal Dose
【표 9】 수컷 마우스에서의 임상적 증상
Figure imgf000035_0001
a) The day of administration was designated as day 0.
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
표 8 내지 표 11에 나타낸 바와 같이， 사망률 은 1,000 mg/kg 투여군에서 투여 후 7 일째에 수컷 1 마리 가 사망하여 수컷에서 본 시험물질의 반수치사량은 1215.8 mg/kg (신뢰구간은 산출되지 않았음)으로 산출되 었으며， 모든 생존동물 및 사망동물에서 이상증상은 관찰되지 않았다.
【표 12】 마우스의 체중 변화
Figure imgf000037_0002
a) Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0. b) Numbers in parenthesis represent the number of survived animals.
** A significant difference at <0.01 level compared with the vehicle control. 【표 13】 수컷 마우스의 체중 변화
Figure imgf000038_0001
a) Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0. b) Body weight at the time of death.
-: Not applicable (Death).
【표 14】 암컷 마우스에서 의 체중 변화
Figure imgf000039_0001
a) Weight gains are body weight difference between day 14 and the day 0. 표 12 내지 표 14에 나타난 바와 같이 , 체중변화는 1,000 mg/kg 투여군 수컷의 평균체중이 투여 후 3 일째에 부형 제대조군에 비하여 유의성 있게 낮았으나 (Ρ<0·01), 투여 후 7 일째부터는 부형 제대조군과 유사하게 관찰되 었다. 사망동물은 투여 후 사망 시까지 지속적 인 체증감소를 보였다.
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
s】51 【표 17】 암컷 마우스에서의 부검 소견
Figure imgf000041_0001
상기 표 15 내지 표 17에 나타난 바와 같이, 모든 생존동물에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았고， 사망동물은 사후변화로 인한 자가융해 (autolysis)가 진행된 상태였다. 고찰및 결론
시험은 시험물질 압탑머 제제 E2를 ICR 계통의 마우스에 단회 정맥내투여 하였올 때 나타나는 개략적인 독성을 알아보기 위하여 실시하였다.
실험 결과, 1 ,000 mg/kg 투여군 수컷 1 마리 에서 관찰된 사망은， 동일군에서 관찰된 체중감소와 결부하여 볼 때, 시험물질 투여에 의 한 변화로 판단하였다. 특히， 사망발견 시 사망동물의 체중은 투여당일의 체중에 비하여 약 14 % 감소하였다. 단， 1,000 mg/kg 투여군 수컷에서 관찰된 체중감소는, 투여 후 7 일째부터는 평균체중이 부형 제대조군과 유사하게 관찰된 것으로 보아， 한시 적 인 변화로 판단되 었다.
이상의 결과로 보아， 시험물질 Aptamer Formulation을 ICR 계통의 암수 마우스에 대한 단회 정맥내투여는 1,000 mg/kg 투여군 수컷에서 사망 및 한시 적 인 체중감소를 유발하였다.
또한, 암컷에서는 사망이 관찰되지 않아 암컷에서 본 시험물질의 개략의 치사량 (approximate lethal dose; ALD)은 1 ,000 mg/kg을 상회 하는 것으로 판단하였고, 수컷에서 본 시험물질의 반수치사량 (LD50)은 1215.8 mg/kg (신뢰구간은 산출되지 않았음)으로 산출되 었다.
부검소견 관찰결과， 모든 생존동물에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았다.
5.2. 압타머제제 (Aptamer Formulation)의 ICR 마우스를 이용한 2 주간 반복 정맥내투여 DRF 독성시험
식품의 약품안전청고시 제 2009- 1 16호 (2009 년 08 월 24 일) '의 약품등의 독성시험 기준' 및 식품의 약품안전청고시 제 2009-183호 (2009 년 12 월 22 일) '비 임상시험관리 기준'에 준하여 실시 하였다. 재료 및 방법
시험군으로는 특정 병원균부재 (SPF) 마우스, HsdKoat:ICR(CD-l ®， 6 주령 투여 개시 하였고, 투여 물질은 앱타머 제제 E2이고, 시험군의 구성은 다음과 같다.
【표 18]
Figure imgf000042_0001
a) 부형 제대조군 (1X D-PBS) 투여횟수 및 기간은 1 회 /일， 7 일 /주로 2 주간 정맥내 투여하였고, 관찰 및 검사 항목으로는 사망률， 일반증상， 체중변화， 사료 및 물 섭취량， 요검사， 안검사, 혈액학적 및 혈액생화학적 검사, 부검소견， 장기중량 등을 하였다. 결 과
실험기간 중 사망동물은 관찰되지 않았다. 일반증상 관찰결과， 모든 투여군에서 어떠한 이상증상도 관찰되지 않았다. 체중변화는 시험물질 투여군 암수 모두 부형제대조군과 유사하게 관찰되었다. 안검사 결과， 모든 동물에서 이상소견은 관찰되지 않았다. 요검사 결과， 시험물질 투여군 수컷에서 백혈구 (WBC)가 부형제대조군에 비하여 높은 경향을 보였고, 통계학적인 유의성은 5， 20 및 40 mg/kg/day 투여군에서 확인되었다 (PO.05, P< . 1). 그 밖의 항목과 시험물질 투여군 암컷에서 부형제대조군과의 차이는 관찰되지 않았다. 혈액학적검사 결과, 40 mg/kg/day 투여군 암컷에서 Hematocrit (HCT)가 부형제대조군에 비하여 유의성 있게 낮았고 (Ρ<0.05), 수컷에서는 부형제대조군과의 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. 혈액생화학적 검사 결과, 시험물질 투여군 암수에서 Sodium ion (Na+)과 Chloride ion (CI")이 부형제대조군에 비하여 높은 경향을 보였고, 통계학적인 유의성은 Na+은 20 mg/kg/day 이상의 투여군 수컷과 5, 20 및 40 mg/kg/day 투여군 암컷에서, C1"는 40 mg/kg/day 투여군 수컷과 20 mg/kg/day 이상의 투여군 암컷에서 확인되었다 CP<ao5,p<o.oi).
그 밖에 20 mg/kg/day 투여군 암컷에서 Inorganic phosphorus (IP)와 Calcium ion (Ca2+)이 부형제대조군에 비하여 유의성 있게 낮았으나 ( 0.01)， 용량상관성 없는 변화이었다. 장기중량은 시험물질 투여군 암수 모두에서 부형제대조군과의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다. 육안적 부검소견은 5 mg/kg/day투여군 암컷에서 자궁내 맑은액체저류 (retention of clear fluide)가 3 례 관찰되었으나, 이는 성주기에 따른 생리적인 변화이었고， 그 밖의 장기 및 수컷에서는 육안적 이상소견이 관찰되지 않았다. 고찰및 결론
본 시험은 압타머 제제 E2를 ICR 계통의 암수 마우스에 2 주간 반복 정맥내투여 하였을 때 나타나는 개략적인 독성을 확인하기 위하여 수행하였다.
20 mg/kg/day 이상의 투여군에서 관찰된 혈중 Na+및 C1의 증가 또는 증가경향은 암수 모두에서 관찰되었고， 어느 정도의 용량상관성을 보였으며, 전해질은 항상 좁은 범위 내에서 항상성을 유지하기에， 이는 시험물질 투여에 의한 영향으로 판단되었다. 단, 정상범위 이내의 수치이었고， 관련항목에서 유의한 변화를 동반하지 않았기에 독성학적인 의미는 미약한 것으로 사료되었다.
40 mg/kg/day 투여군 암컷에서 관찰된 혈중 HCT의 감소는 정상범위 이내의 수치이었다 (장승훈， 정기준: 압타머 (Aptamer) 개발의 최근 연구 동향, THE KOREAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY).
시험물질 투여군 수컷에서 관찰된 요 중 WBC의 증가는 trace (±)의 정도로 관찰되었는데, 이는 정상동물에서도 종종 관찰되는 변화이고, 관련 항목에서 유의성 있는 변화를 동반하지 않았기에 시험물질 투여에 의한 영향은 아닌 것으로 판단하였다. 상기와 같은 결과를 토대로, Aptamer Formulation을 ICR 마우스에 5, 10, 20 및 40 mg/kg/day 용량으로 2 주간 반복 정맥내 투여하였을 때, 20 mg/kg/day 이상의 용량에서 혈중 Na+ 및 가 증가하였고, 그 밖에 시험물질 투여에 따른 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다.

Claims

【청구의 범위】
1. ERBB2에 특이적으로 결합 하고, dUTP(deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기， 벤질기, 피를벤질기, 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 소수성 작용기로 치환되어 있는 변형된 염기를 5 내지 15개 포함하고， 총 20 내지 100개의 염기로 이루어진,
ERBB2 압타머 (aptamer).
2. 제 1항에 있어서,
상기 ERBB2 압타머는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는， 40 내지 100개의 염기로 이루어진 것인, ERBB2 압타머.
3. 제 2항에 있어서,
상기 ERBB2 압타머는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 11의 염기서열을 포함하는， 40 내지 100개의 염기로 이루어진 것인，
ERBB2 압타머.
4. 제 2항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 염기서열의 5' 말단， 3' 말단， 또는 양 말단에 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는,
ERBB2 압타머.
5. 제 2항에 있어서，
상기 ERBB2 압타머는 5' 말단， 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid),
2'-메톡시 뉴클레오사이드， 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드， 아민 링커， 티올 링커, 및 콜레스테를로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것을 특징으로 하는,
ERBB2 압타머.
6. 제 1항 내지 게 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머를 유효성분으로 함유하는， 약학 조성물.
7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머를 유효성분으로 함유하는，
암 치료용 약학 조성물.
8. 제 7항에 있어서，
상기 암은 유방암， 대장암， 유방암， 대장암， 폐암， 담낭암, 췌장암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
암 치료용 약학 조성물.
9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머를 유효성분으로 함유하는 암 진단용 조성물.
10. 제 1항에 따른 ERBB2 압타머를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
11. 제 10항에 있어서，
상기 ERBB2 압타머는 SEQ IDNO: 1 내지 SEQ IDNO: 35로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는， 40 내지 100개의 염기로 이루어진 것인, 암 치료 방법.
12. 제 11항에 있어서，
상기 ERBB2 압타머는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 11의 염기서열을 포함하는， 40 내지 100개의 염기로 이루어진 것인，
암 치료 방법.
13. 제 11항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 군에서 선택된 염기서열의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는,
암 치료 방법.
14. 제 11항에 있어서，
상기 ERBB2 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메록시 뉴클레오사이드， 2'-아미노 뉴클레오사이드， 2'F-뉴클레오사이드， 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테를로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것을 특징으로 하는,
암 치료 방법.
15. 제 10항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암， 유방암， 대장암， 폐암， 담낭암, 췌장암， 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인，
암 치료 방법.
16. 환자의 생물학적 시료를 준비하는 단계;
상기 생물학적 시료에 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머를 반옹시키는 단계; 및
상기 생물학적 시료에서의 ERBB2 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
환자의 생물학적 시료에서의 ERBB2 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우， 상기 환자를 암 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는， 암 진단에 정보를 제공하는 방법.
17. 암 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머.
18. 제 17항에 있어서,
상기 암은 유방암, 대장암， 유방암, 대장암, 폐암， 담낭암, 췌장암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
ERBB2 압타머.
19. 암 진단에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 ERBB2 압타머.
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