KR102062115B1 - 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법 - Google Patents

압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102062115B1
KR102062115B1 KR1020180046550A KR20180046550A KR102062115B1 KR 102062115 B1 KR102062115 B1 KR 102062115B1 KR 1020180046550 A KR1020180046550 A KR 1020180046550A KR 20180046550 A KR20180046550 A KR 20180046550A KR 102062115 B1 KR102062115 B1 KR 102062115B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
aptamer
odn
erbb2
codn
seq
Prior art date
Application number
KR1020180046550A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180120092A (ko
Inventor
이중환
김종인
임종훈
이종욱
김진우
Original Assignee
인터올리고 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인터올리고 주식회사 filed Critical 인터올리고 주식회사
Priority to EP18791814.9A priority Critical patent/EP3636287A4/en
Priority to PCT/KR2018/004770 priority patent/WO2018199607A1/ko
Priority to JP2019557747A priority patent/JP7016544B2/ja
Priority to US16/608,645 priority patent/US11499156B2/en
Priority to CN201880027916.2A priority patent/CN110621351B/zh
Publication of KR20180120092A publication Critical patent/KR20180120092A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102062115B1 publication Critical patent/KR102062115B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0491—Sugars, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, e.g. DNA, RNA, nucleic acid aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0404—Lipids, e.g. triglycerides; Polycationic carriers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

형광 또는 방사성 동위원소로 표지된 ERBB2 압타머를 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물에 관한 것으로, 방사성 동위원소 또는 형광염료로 표지된 ERBB2 압타머를 이용하여 생체 내 종양성 질환 부위를 영상화하는 것을 특징으로 한다.

Description

압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법{PET IMAGING OF HER2 EXPRESSION WITH AN RADIO-LABELED APTAMER}
본 발명은 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법에 관한 것으로, 상세하게는 동위원소로 표지된 압타머를 이용하여 성장인자 수용체2(HER2) 발현 세포주에 결합시켜 영상을 얻는 방법에 관한 것이다.
압타머의 어원은 "꼭 들어맞다"라는 의미의 라틴어인 "aptus", "부분"이라는 의미의 그리스어인 "meros"에서 유래가 되었다. 이러한 압타머는 단일가닥 핵산으로 길이가 20에서 90개 정도의 염기 서열로 이루어져 있다. 보통 압타머 발굴 기술인 시험관 내 인공진화법(SELEX)을 통하여 표적분자에 매우 특이적이고 친화도가 높은 압타머를 선별한다. 따라서 압타머는 그들이 표적으로 하는 특정 분자의 발현도를 측정하거나 찾아내는데 아주 좋은 시약으로 간주되고 있다. 압타머는 생산비용에서의 저렴함, 합성이 용이한점, 낮은 독성, 면역반응을 불러 일으키지 않는 점 그리고 항체와 같이 동물 시스템에서 만들지 않는 등의 몇 가지 측면에서 항체와 비교하여 장점을 가지고 있다. 그리고 이것은 진단분야에서 비교적 새롭게 개발된 시약이다. 여러 가지 표적들, thrombin, nucleolin, PSMA, TNC 그리고 바이러스에 기원된 단백질과 같이 매우 다양한 표적에 대한 압타머들이 개발이 되고 있다. 치료분야에서는 2004년 최초로 노인 황반변성 치료제로 FDA에 승인된 VEFG 표적 압타머가 개발이 되었다. 현재에서는 매우 많은 종류의 압타머들이 전임상과 임상단계에서 개발중에 있고 더 많은 시험들이 진단 및 치료에 관련해서 진행중에 있다.
HER2는 매우 잘 알려진 암유전자로 대략 유방암의 15~30% 정도로 증가되거나 과발현되어 있다. 그리고 여러 암에서 높은 비율의 재발률과 예후가 매우 안 좋은 것과 관련된 인자이다. HER2에 의해 활성화되는 두 가지의 신호전달 체계는 세포증식을 촉진시키는 MAPK 경로와 암세포의 생존을 증진시키는 PI3K-AKT 경로가 존재한다. 따라서 암치료에 적용하는데 매우 적합한 표적으로 간주된다. 여기에 현재 상용된 잘 알려진 치료 단일 항체로 HER2를 표적화하는 트랜스투주맙(transtuzumab)과 퍼투주맙(pertuzummab)이 존재하는데 임상에서 효과적이라고 판명되었다. 이전에 HER2를 표적으로 하는 몇 가지의 DNA/RNA 압타머가 전통적인 방법의 SELEX와 세포를 기반으로 하는 SELEX를 통하여 발굴이 되었다. 그리고 그러한 HER2 압타머의 암을 저해하는 특성을 약학적으로 활용하는 예가 최근에 보고되었다.
한편, 분자 영상은 비침습적 방법으로 살아있는 세포나 조직 또는 손상을 가하지 않는 물체를 세포적 분자적 수준에서 생화학적 사건을 실시간으로 시각화할 수 있다. 자성 나노물질이나 형광소재로 변형된 압타머는 표적화 형광 영상화나 magnetic resonance imaging (MRI)에서 좋은 소재로 제공될 수 있다. 몇 생체 내 MRI 연구들에서 암이 있는 마우스에서 암을 효과적으로 표적화하는 것이 관찰되었다. 그러나 대사변화가 보통 해부학적 변화 전에 발생하기 때문에 PET은 분명하게 computed tomography (CT) 와 MRI 같은 해부학적 기술보다 진단에서 유리한 점이 있다. 임상활용에서 PET는 기초 연구와 전임상 분야에서 광범위한 응용이 되고 있다. 예를 들면 PET는 새로운 방사선치료제 분석, 새로운 치료제의 효능 그리고 약제의 상체분포를 검증하는데 사용될 수 있다. PET이 가지고 있는 강점으로 탐침 깊이, 탁월한 민감도, 정량적 자료 그리고 전임상에서 임상까지의 전환성에 있다. 즉, PET은 대표적인 분자영상기기로 방사선 의약품을 이용하여 살아있는 생체의 분자표적 수준에서의 생화학적 변화를 감지할 수 있고 굉장히 민감도가 높아 기초과학이나 전임상 영역을 비롯한 광범위한 분야에서 이용되고 있다. 압타머를 이용한 암 표적화는 최근에 생겨난 분자 영상기술로 Hicke을 비롯한 여러 연구자들에 의해 분자 영상에서 압타머가 사용된 사례가 있다. 그들은 세포외질 단백질인 tenascin-C에 결합하는 TTA1이라는 압타머에 99mTC를 공유결합하여 생체 내에서 gamma-camera를 이용하여 암을 영상화하였다. 차후에 PET을 이용한 영상화도 다른 팀에 의해 구현되었다.
그러나 HER2 특이 ERBB2 압타머를 이용한 PET 영상화에 대한 구현은 아직까지 알려진 바가 없다.
한국특허등록 10-1405440호 한국 특허공개 10-2015-0045592호
Lupold SE, Hicke BJ, Lin Y, Coffey DS. Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer research. 2002;62:4029-33. Daniels DA, Chen H, Hicke BJ, Swiderek KM, Gold L. A tenascin-C 압타머 identified by tumor cell SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100:15416-21. Hicke BJ, Stephens AW, Gould T, Chang YF, Lynott CK, Heil J et al. Tumor targeting by an 압타머. Journal of nuclear medicine: official publication, Society of Nuclear Medicine. 2006;47:668-78.
압타머는 핵산류의 일종으로 표적분자에 높은 특이성과 친화도를 갖는 물질이다. 본 발명은 방사성 동위원소나 형광염료로 표지된 압타머를 이용하여 생체내의 분자적 영상을 얻는 것을 목적으로 한다.
도 1에는 방사성 동위원소 또는 형광표지 ERBB2 압타머의 메카니즘 모식도를 나타내었다.
본 발명에서는 방사성 동위원소나 형광염료로 표지된 HER2 압타머를 이용하여 생체 내 영상화를 위해 활용하였다.
유동세포계수법을 통한 분석에서 ERBB2 압타머는 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB231세포주에는 거의 결합하지 않는 반면 HER2 발현 세포주인 BT474에는 매우 높은 친화력을 갖는 것으로 보여진다. 마찬가지로 공초점 현미경으로부터 얻어진 영상에서도 이 압타머는 HER2가 발현된 유방암 세포주에서 결합하는 것으로 관찰이 되고 HER2 미발현 세포에서는 최소한의 결합만 하는 것으로 확인되었다. 생체 내 BT474 암 세포주가 이식된 마우스에 대한 양전자 단층촬영 분자 영상에서 암세포로의 18F 이 표지된 HER2 특이 ERBB2 압타머의 섭취가 상당히 증가되었다. ERBB2 압타머는 시험관 및 생체 내 두 가지에서 모두 HER2가 발현된 유방암 세포주에 우선적으로 결합할 수 있고 이것은 세포 표면에 HER2 구조체를 인지함이 가능하기 때문이다.
18F 등 방사성 동위원소나 형광염료가 표지된 ERBB2 압타머는 인간 유방암 세포에서의 HER2 발현을 인지하여 적절한 시각화를 가능하게 할 수 있다. 이러한 결과들은 동위원소나 형광염료 표지 ERBB2 압타머가 HER2 양성 유방암 세포에 대한 표적 치료 적용이나 어떻게 치료할 것인가에 대한 잠재적 응용법을 제시한다.
도 1은 방사선 또는 형광표지 ERBB2 압타머의 메카니즘 모식도
도 2는 R-[ERBB2 압타머]-ODN-X (R = H, 콜레스테롤, 또는 PEG, X = H, 또는 idT)와 cODN-Cy5의 혼성화(hybridization) 결과물인 R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-Cy5를 Typhoon FLA7000 3% 아가로오스 겔로 분석한 것이다.
도 3은 50도, 55도, 60도 온도에 따른 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT, 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN 압타머와 형광 표지 cODN(cODN-Cy5) 사이의 상보적 염기 쌍합을 3% 아가로오스 겔로 확인한 결과 (검은색: 압타머, 붉은색: cODN-Cy5)
도 4는 95도 가열한 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT, 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN, PEGylated-[AP001-25]-ODN-idT, PEGylated-[AP001-25]-ODN 압타머와 형광 표지 cODN(cODN-Cy5) 사이의 상보적 염기 쌍합을 아가로오스 겔로 확인한 결과
도 5는 R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-Cy5를 KPL4, N87, 및 SK-BR 세포주에 대한 confocal image 결과이다. HER2 양성 세포주에서의 [AP001-24]-hy(bp)-Cy5와 [AP001-25]-hy(bp)-Cy5 압타머의 공초점 현미경 영상.(a) KPL4, HER2 양성 유방암 세포주에서 Cy5 표지 압타머로 변환 (b) N87 암세포주에서 같은 압타머의 처리 (c) SK-BR-3 암세포주에서 같은 압타머의 처리 (표지 DAPI:파란색, Cy5-압타머:붉은색)
도 6은 R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-Cy5를 KPL4, N87, 및 SK-BR 세포주에 대한 FACS analysis 결과이다.
표 3은 R-[ERBB2 압타머]-ODN-X (R = H, 콜레스테롤, 또는 PEG, X = H, 또는 idT)와 cODN-L-F18(L = linker)의 hybridization 구조를 R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-L-F18로 나타내었다.
도 7은 [AP001-24]-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 8는 [AP001-24]-idT-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 9는 콜레스테릴-[AP001-24]-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 10은 콜레스테릴-[AP001-24]-idT-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 11는 PEGylated-[AP001-24]-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 12는 PEGylated-[AP001-24]-idT-hy(bp)-L-F18의 microPET 이미지 결과이다.
도 13은 KPL4 암을 품은 마우스에서 [AP001-24]-hy(bp)-L-F18, [AP001-24]-idT-hy(bp)-L-F18, 콜레스테릴-[AP001-24]-hy(bp)-L-F18, 콜레스테릴-[AP001-24]-idT-hy(bp)-L-F18 의 비교영상
도 14는 인간 유방암 세포주에서 웨스턴 블롯에 의한 HER2 발현도 결정.
도 15는 HER2 항체와 ERBB2 압타머(AP001-25)를 이용하여 유방암 세포주의 유동 세포 계속법 분석 (a) 점도표는 항체로부터의 BT474와 (HER2 양성 세포주), MDA-MB231(HER2 음성 세포주)에 대한 형광 신호를 나타낸다. ERBB2 압타머(AP001-25) (빨강색) 또는 대조군 염기서열 (파란색) (b) 항체와 ERBB2 압타머(AP001-25) 그리고 음성 대조군을 이용한 두 세포주에서 유동 세포 분석 그래프
도 16은 HER2 양성 세포주에서의 선별된 ERBB2 압타머(AP001-25)의 공초점 현미경 영상 (a) BT474, HER2 양성 유방암 세포주에서 FITC 표지 압타머로 변환 (b) MDA-MB231 암세포주에서 같은 ERBB2 압타머(AP001-25)의 처리(표지 DAPI:파란색, FITC-ERbB2 압타머:녹색)
도 17는 BT474 암을 품은 마우스에서 18F 표지 ERBB2 압타머{[AP001-25]-hy(bp)-L-F18} 나타내는 PET 생체내의 영상. Hy(bp)는 hybridization(base pairing)으로 ODN/cODN hybridization을 나타냄
도 18은 암이 있는 마우스에서 18F 표지 ERBB2 압타머{[AP001-25]-hy(bp)-L-F18}의 생체분포 연구. 자료는 조직의 그람 당 주입된 활성화를 백분율로 나타낸 것이다(%ID/g). Error bars, SD (N=4).
도 19은 HER2 양성 및 음성 암이 있는 마우스에서 18F 표지 ERBB2 압타머{[AP001-25]-hy(bp)-L-F18} 나타내는 PET 생체 내의 영상들. (a) HER2 과발현 BT474 암(왼쪽 겨드랑이)은 (b) HER2 음성 MDA-MB231 암(오른쪽 겨드랑이)과 비교할 때 좀 더 증가된 섭취를 나타낸다. (c) 분당 숫자(CPM)와 암 조직에 그람당 주입된 양(%ID/g)을 18F 표지 ERBB2 압타머로 계산하였다.
도 20은 HER2에 대한 H&E 및 IHC 염색 결과를 나타낸다(원본 배율 400X)
본 발명에 사용된 유방암 관련 Her2 수용체에 특이적으로 결합하는 ERBB2 압타머는 5'-TCAGCCGCCAGCCAGTTC-[Core sequence]-GACCAGAGCACCACAGAG-3'의 염기서열을 가지며 Core Sequence에서 숫자 6이나 첨부하는 염기서열 목록에서 n은 NaptyldU를 나타낸다.
Description
(클론 번호)		 Core sequence
1 9-ER-N-A01_A05 A6G66AGAG666GCC6GAG6GCC6CG6AAGGGCG6AACAA (SEQ ID NO: 1)
2 9-ER-N-A02_B05 6AC6GGGCCCG66AGCC6C6GGCGC6CC66CGC66G6GCC (SEQ ID NO: 2)
3 9-ER-N-A03_C05 66A6CAACGCAC6GAGGGCG6CAGC66C66666AGG (SEQ ID NO: 3)
4 9-ER-N-A04_D05 A6G6AGAG666GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 4)
5 9-ER-N-A06_E05 6CC6G6CCCGG666ACACAAG66AAGGCAGCCGC6GGA6A (SEQ ID NO: 5)
6 9-ER-N-B02_F05 G6C6GAACACCGAGA66AGC6GAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 6)
7 9-ER-N-B03_G05 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
8 9-ER-N-B04_H05 CGCGA66AGA6GAACGCACAA6ACCCG66C6GAG6AAAG6 (SEQ ID NO: 8)
9 9-ER-N-B08_A06 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
10 9-ER-N-B09_B06 G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)
11 9-ER-N-B12_C06 A6G66AGAG666GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAA (SEQ ID NO: 11)
12 9-ER-N-C02_D06 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
13 9-ER-N-C03_E06 G6C6GAGCA6CGCG666AGCCGAACGC6CGG6GAGG6AGA6(SEQ ID NO: 12)
14 9-ER-N-C05_F06 6CA6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 13)
15 9-ER-N-C06_G06 C6ACACGAA6CAAC6CCCC6CCGCA6AC6GAACA6CACAA (SEQ ID NO: 14)
16 9-ER-N-C08_H06 66AGCAAAA6GCCA6G6GCG6CC6G6CCCGG666ACAGC (SEQ ID NO: 15)
17 9-ER-N-C10_A07 6GA6G6CCCCAAC6CAGC6G6GAA6C6A6GCCCCCGCCCA (SEQ ID NO: 16)
18 9-ER-N-D01_B07 C6GAGCGG66AC6ACACCACCG6GAGACC66AG66ACAAA (SEQ ID NO: 17)
19 9-ER-N-D02_C07 A66AGA6GAAAGCGCA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 18)
20 9-ER-N-D03_D07 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
21 9-ER-N-D04_E07 666GGAG6G6C66ACGG66GGAG6AA6CGAGGA6GGA6GA (SEQ ID NO: 19)
22 9-ER-N-D05_F07 CCG66ACC6ACC6CC6CGACCG6GGG6GCCC66AG6CCCA (SEQ ID NO: 20)
23 9-ER-N-D06_G07 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCAGA (SEQ ID NO: 21)
24 9-ER-N-D07_H07 CCG66ACC6ACC6CC6CGACCG6GGG6GCC666AG6CCCA (SEQ ID NO: 22)
25 9-ER-N-D09_A08 A6G66AGAG666GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAA (SEQ ID NO: 23)
26 9-ER-N-D11_B08 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAG6 (SEQ ID NO: 24)
27 9-ER-N-E02_C08 CCG66ACC6ACC6CC6CGACCG6GGG6GCCC66AG6CCCA (SEQ ID NO: 20)
28 9-ER-N-E04_D08 A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 25)
29 9-ER-N-E09_E08 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
30 9-ER-N-E11_F08 A6G66AGAG666GCC6GAG6GCG6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 26)
31 9-ER-N-E12_G08 6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 27)
32 9-ER-N-F01_H08 G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)
33 9-ER-N-F02_A09 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
34 9-ER-N-F03_B09 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
35 9-ER-N-F04_C09 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
36 9-ER-N-F05_D09 6CC6GG6A6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 28)
37 9-ER-N-F08_E09 6AGA6C6C6GA66AGG6AGAACGCCC6AC6C6AACGGCAG (SEQ ID NO: 29)
38 9-ER-N-F09_F09 6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 30)
39 9-ER-N-F11_G09 6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 31)
40 9-ER-N-G02_H09 A66AGA6GAAAGCGCA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 18)
41 9-ER-N-G03_A10 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
42 9-ER-N-G04_B10 CG6CC66GG6GAG666GGG6C6GAGCAGGAGCACG6GAG6 (SEQ ID NO: 32)
43 9-ER-N-G08_C10 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
44 9-ER-N-G09_D10 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
45 9-ER-N-H01_E10 A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 33)
46 9-ER-N-H02_F10 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
47 9-ER-N-H03_G10 A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 34)
48 9-ER-N-H04_H10 G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)
49 9-ER-N-H08_A11 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
50 9-ER-N-H09_B11 A6G66AGAG6C6GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 35)
6 = NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-[0070] 2'-deoxyuridine]
본 발명에서는 방사성 동위원소, 예를 18F, 32P, 123I, 89Zr, 67Ga, 201Tl, 111In-111나 형광염료, 예를 들어 시아닌 형광염료인 Cy3, Cy5, Cy7 등으로 표지된 HER2 압타머를 이용하여 생체 내 영상화를 위해 활용하였다.
본 발명의 실시 예에서는 동위원소나 형광염료로 표지된 ERBB2 압타머를 가지고 생체내의 분자적 영상을 위한 표적 특이성과 임상 적용가능성에 대한 평가를 진행하였다.
인간 상피 성장인자 수용체2 (HER2) 에 대한 ERBB2 압타머를 18F-fluoride 동위원소로 표지하였다. HER2가 발현된 암세포주로 압타머가 들어가는 것 확인하기 위하여 대조군 압타머와 같이 유동세포계수법과 공초점 현미경을 통하여 비교하였다. 18F이 표지된 HER2 특이 ERBB2 압타머를 양전자 단층 촬영하여 BT474 또는 KPL4 세포가 이식된 마우스에 대한 생체 분자 영상을 각각 시간별로 얻었다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
세포배양
HER2가 발현된 인간 유방암 세포주인 BT474, KPL4, N87, 및 SK-BR-3를 가지고 시험관 및 생체 내 시험을 위해 이용하였다. 그리고 대조군으로 다른 인간 유방암 세포주 MDA-MB231를 가지고 실험을 진행하였다. 모든 세포주는 ATCC로부터 구매하였고 10% FBS를 함유한 MEM 배지에 배양하여 유지하였다.
세포 용해, 웨스턴블롯
세포 내 단백질을 추출하기 위해 단백질 분해효소 방지제가 포함된 세포 용해액을 얼음 위에서 30분간 배양하였다. 이렇게 얻어진 세포 용해액을 4℃ 20분간 원심분리하여 정제하였다. 단백질 정량을 위하여 Bradford법을 이용하여 정량화하였고 각각의 샘플에서 30㎍의 단백질 추출물을 10% SDS-PAGE로 전기영동하여 분리하였다. 그리고 나서 니트로셀룰로오스막에 옮겨 HER2 항체와 대조군인 beta-action 항체를 프로브로 이용하여 ECL로 x-ray film에 감광하였다.
ERBB2 압타머 합성
Her2-(+) 표적 ERBB2 압타머의 염기서열은 아래 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112018039999181-pat00001
Figure 112018039999181-pat00002
Figure 112018039999181-pat00003
ERBB2 압타머인 AP001-24는 타겟에 대한 결합력(Kd)가 3.1nM이고 AP001-25는 0.9nM이다.
여기서 6은 다음 구조식의 NapdU [5-(N-나프틸카르복시아미드)-2'-데옥시우리딘]이고 A = 2'-데옥시아데노신, G = 2'-데옥시구아노신, C = 2'-데옥시시티딘이다.
Figure 112018039999181-pat00004
압타머 혼성(압타머 hybridization)을 위해서 ERBB2 압타머{[AP001-24] 및 [AP001-25]}의 3'에 fully matching sequence인 ODN(5'-CAGCCACACCACCAG-3')를 포함한 합성을 진행하였다.
[AP001-24]- ODN 합성
5'-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3' {[AP001-24]-ODN}를 다음과 같이 합성하였다.
압타머 합성과정은 phosphoramidite 커플링 반응을 이용한 고체상 합성 방법을 이용하여 합성했으며 합성 후 t-부틸아민:메탄올:물(1:1:2 v/v/v) 용액 70℃, 5시간동안 반응을 통하여 cleavage와 deprotection 과정을 거쳐서 온전한 압타머를 얻은 후 건조시겼다. 합성 압타머를 HPLC로 [C18 칼럼(Waters, Xbridge OST C18 10x50mm, 260nm] 분리후 ESI MS 질량분석기 (Qtrap2000, ABI)를 이용하여 분자량을 측정하였다.
상기 표 1의 11번째 압타머(SEQ ID NO: 11)가 AP001-24에 해당한다.
[AP001-25]- ODN 합성 :
5'-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{[AP001-25]-ODN}를 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN}합성방법으로 합성하였다.
표 1의 12번째 압타머(SEQ ID NO: 7)가 AP001-25에 해당한다.
같은 방식으로 CAG-3'{표 1의 (SEQ ID NO: 1~35)의 각 압타머-ODN}를 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN}합성방법으로 합성하였다.
[AP001-24]- ODN - idT 합성
5'-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-idT-3'{[AP001-24]-ODN-idT}를 idT(invert dT) CPG(Glen, 20-0302-10)를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]- ODN } 합성방법으로 합성하였다.
[AP001-25]- ODN - idT 합성 :
5'-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-idT-3'{[AP001-25]-ODN-idT}를 idT CPG(Glen, 20-0302-10)를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
콜레스테릴 -[AP001-24]- ODN 합성
5'-콜레스테릴-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{콜레스테릴-[AP001-24]-ODN}를 콜레스테롤-PA(Glen, 10-1976-90) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
콜레스테릴 -[AP001-25]- ODN 합성 :
5'-콜레스테릴-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{콜레스테릴-[AP001-25]-ODN}를 콜레스테롤-PA(Glen, 10-1976-90) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
콜레스테릴 -[AP001-24]- ODN - idT 합성
5'-콜레스테릴-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-idT-3'{콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT}를 idT CPG(Glen, 20-0302-10) 및 콜레스테롤-PA(Glen, 10-1976-90)를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
콜레스테릴 -[AP001-25]- ODN - idT 합성 :
5'-콜레스테릴-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-idT-3'{콜레스테릴-[AP001-25]-ODN-idT}를 idT CPG(Glen, 20-0302-10) 및 콜레스테롤-PA(Glen, 10-1976-90) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
PEGylated -[AP001-24]- ODN 합성
5'-PEGylated-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{PEGylated-[AP001-24]-ODN}를 Polyethyleneglycol 2000 CED PA(ChemGenes, CLP-2119) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
PEGylated -[AP001-25]- ODN 합성 :
5'-PEGylated-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{PEGylated-[AP001-25]-ODN}를 Polyethyleneglycol 2000 CED PA(ChemGenes, CLP-2119) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
PEGylated -[AP001-24]- ODN - idT 합성
5'-PEGylated-[6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A]-CAG CCA CAC CAC CAG-idT-3'{PEGylated-[AP001-24]-ODN-idT}를 idT CPG(Glen, 20-0302-10) 및 Polyethyleneglycol 2000 CED PA(ChemGenes, CLP-2119) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
PEGylated -[AP001-25]- ODN - idT 합성 :
5'-PEGylated-[A6G 66A GAG 666 GCC 6GA G6G CC6 CGC AAG GGC G6A ACA A]-CAG CCA CAC CAC CAG-3'{PEGylated-[AP001-25]-ODN-idT}를 idT CPG(Glen, 20-0302-10) 및 Polyethyleneglycol 2000 CED PA(ChemGenes, CLP-2119) 를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
Cy5 conjugated된 cODN (Complementary Oligonucleotide) [ cODN - Cy5 ] 합성 :
아래 그림은 cODN-Cy5 및 cODN-L-F18 (L = linker)구조 및 합성을 나타낸다.
Figure 112018039999181-pat00005
5'-Cy5-[CTGGTGGTGTGGCTG]-3'[cODN-Cy5]를 Cy5-PA(Glen,10-5915-10)를 사용하여 앞에서 기술한 {[AP001-24]-ODN} 합성방법으로 합성하였다.
Cy5 -표지 ERBB2 압타머 형성
아래 표 3에는 R-[ERBB2 압타머]-ODN-X (R = H, 콜레스테롤, 또는 PEG, X = H, 또는 idT)와 cODN-Cy5의 hybridization 구조를 R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-Cy5로 나타내었다.
[표 3]
Figure 112018039999181-pat00006
Cy5-표지 ERBB2 압타머, {R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-Cy5}를 다음과 같은 방식으로 만들었다.
먼저, 같은 몰수의 cODN-Cy5와 [ERBB2 압타머]-ODN을 annealing buffer(PBS)에 넣는다. 이때 MgCl2 의 농도가 최종 10mM 이 되도록 맞춘다. 위 반응물을 95℃에서 5분간 두었다가 상온에서 천천히 식힌다. cODN-Cy5 와 [ERBB2 압타머]-ODN의 Hybridization efficiency 는 전기영동(Typhoon FLA7000 3% 아가로오스 겔 analysis) 및 HPLC를 이용하여 분석하였다.(XBridge OST analytical column (2.5㎛, 4.6 × 50mm, Waters, 254 nm.0.1M TEAA/아세토니트릴) 도 2에 R-[ERBB2 aptamer]-ODN-X (R = H, 콜레스테롤, 또는 PEG, X = OH, 또는 idT)와 cODN-Cy5의 hybridization 결과물인 R-[ERBB2 aptamer]-X-hy(bp)-Cy5를 Typhoon FLA7000 3% 아가로오스 겔로 분석한 결과를 나타내었다.
형광물질 Cy5가 표지된 합성 올리고뉴클레오타이드(cODN-Cy5)와 [ERBB2 압타머]-ODN의 상보적 염기 쌍합을 확인하였다. 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT, 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN와 cODN-Cy5을 1:1 비율로 섞어준 다음 55℃, 60℃, 65℃에서 서로 결합하도록 온도를 유지하였다. 결합을 확인하기 위하여 3% 아가로오스 겔로 전기 영동을 한 뒤 Cy5는 FLA5000을 이용하여 형광을 영상화하였고 전체적인 압타머는 EtBr로 염색하여 UV로 영상화하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT, 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN, PEGylated-[AP001-25]-ODN-idT, PEGylated-[AP001-25]-ODN와의 cODN-Cy5의 상보적 염기 쌍합을 비교하기 위하여 1:1로 섞어주고 95도에서 5분간 열을 가하여 결합한 뒤 위와 같은 방법으로 확인하였다. 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN-idT, 콜레스테릴-[AP001-24]-ODN, PEGylated-[AP001-25]-ODN-idT, PEGylated-[AP001-25]-ODN와 형광 표지 ODN(cODN-Cy5) 사이의 상보적 염기 쌍합을 95도 가열과 가열하지 않은 것의 확인하여 비교하였다. 비교 결과는 도 4에 나타내었다.
F 18 방사성 동위원소 표지 cODN (Complementary Oligonucleotide) [ cODN -L-F 18 ]
18F-labeled cODN 합성은 이미 보고된 과정(참고문헌 24)을 중심으로 하였다. No-carrier-added 18F-fluoride ion을 합성기(Tracerlab FXFN, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)를 이용하여 생성 후 메실레이트(mesylate)와 반응(100℃에서 10분) 후 18F-fluoro-PEG-azide (18F-FPA)를 HPLC를 이용하여 정제하였다. 5'-hexynyl complementary oligonucleotide(5'-hex-cODN 200mg)에 아세토니트릴(10 mL) 중의 1M N,N-디이소프로필에틸아민, 아세토니트릴(20 mL) 중의 100 mM 요도드화 구리(I)를 넣고 18F-FPA (750e1100 MBq)를 넣어 click chemistry 반응을 진행하였다.(70℃, 20분간) 합성된 18F-labeled cODN(cODN-L-F18)은 HPLC H(Xbridge OST C18 10Х50mm, 용리액 아세토니트릴/0.1M TEAA 5:95-95:5 20분에 걸쳐, 유속: 5 mL/min, UV (254 nm)를 이용하여 정제하였다.
F 18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머 [R-[ ERBB2 압타머 ]-X- hy (bp)-L-F 18 ] 형성
아래 표 4에 R-[ERBB2 aptamer]-ODN-X (R = H, 콜레스테롤, 또는 PEG, X = OH, 또는 idT)와 cODN-L-F18(L = linker)의 hybridization 구조를 R-[ERBB2 aptamer]-X-hy(bp)-L-F18로 나타내었다.
[표 4]
Figure 112018039999181-pat00007
F18 방사성 동위원소표지 ERBB2 압타머, {R-[ERBB2 압타머]-X-hy(bp)-L-F18}를 다음과 같은 방식으로 만들었다.
먼저, 같은 몰수의 cODN-L-F18 와 [ERBB2 압타머]-ODN을 annealing buffer(PBS)에 넣는다. 이때 MgCl2 의 농도가 최종 10mM 이 되도록 맞춘다. 위 반응물을 95℃에서 5분간 두었다가 상온에서 천천히 식힌다. cODN-L-F18와 [ERBB2 압타머]-ODN의 Hybridization efficiency 는 HPLC를 이용하여 분석하였다(XBridge OST analytical column (2.5 ㎛, 4.6 × 50mm, Waters, 254 nm.0.1M TEAA/아세토니트릴). 98% 이상의 혼성화율로 결합하였다.
공초점 현미경
BT474, KPL4, N87, SK-BR-3, 및 MDA-MB231 세포주를 coverslip에 분주하여 밤새 배양하였다. 약 80%정도가 자랐을 때 주의 깊게 씻어주고 형광이 표지된 ERBB2 압타머 {R-[ERBb2 압타머]-hy(bp)-Cy5}를 250nM의 농도로 처리하여 배양하였다. 배양 후에 조심스럽게 씻어주고 DAPI를 함유한 배양액을 슬라이드에 장착하였다. LSM700 공초점 현미경으로 형광을 관찰하였다. 현미경 셋팅은 FITC 관찰에는 488nm 레이저로 여기(excitation), 방출(emission)은 BP490-555 그리고 Texas red에서는 639nm 레이저로 방출은 LP640 필터를 이용하였다.
앞선 실험과 같은 방법으로 ERBB2 과발현 유방암 세포주인 KPL4, N87 와 SK-BR-3를 coverslip에 분주하여 밤새 배양하였다. 약 80%정도가 자랐을 때 주의 깊게 씻어주고 Cy5형광이 표지된 ODN을 상보 염기 쌍합을 이용하여 ERBb2 압타머에 결합한 시료를 처리하여 배양하였다. 배양 후에 조심스럽게 씻어주고 DAPI를 함유한 배양액을 슬라이드에 장착하였다. LSM700 공초점 현미경으로 형광을 관찰하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
유동세포계수법
ERBB2 압타머의 특이도를 유동세포 계수시스템(BD Biosciences)을 이용하여 형광 활성 세포 분리법으로 검증하였다. BT474, KPL4, N87, SK-BR-3, 또는 MDA-MB231 암 세포주를 페트리디쉬에 적정 수를 계대 배양하여 80% 정도까지 자라도록 배양하였다. 세포에 트립신을 처리하고 PBS로 씻어준 다음 형광이 표지된 ODN을 온도에 의한 상보적 염기로 ERBB2 압타머에 결합하였다. 결합이 완료된 시료를 세포에 처리하였다. ERBB2 압타머 {R-[ERBb2 압타머]-hy(bp)-Cy5}와 대조군으로 1%FBS를 함유한 항체를 각각 4℃에서 30분간 처리하였다. 처리가 완료된 시료를 씻어준 다음 결합된 ERBB2 압타머를 측정하고 형광활성 세포 분리법을 통해 분석하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
생체 내 실험
4주령 Balb/c 누드 마우스 피하에 17ββ-estradiol 펠렛을 목 측면 부위에 에스트로겐이 암이 발생 가능할 정도의 양이 방출하도록 이식하였다. 몇일 후 마우스당 7X106 정도의 수로 BT474 또는 KPL4 인간 유방암 세포주를 피하에 이식하였다. 암이 3주간 발생되도록 한 후 암의 성장을 caliper로 측정하였다.
Balb/C 누드 마우스에 인간 유방암 세포주인 KPL4세포를 1X105개를 오른쪽 어깨에 피하 이식하였다. 이후 암이 발생되도록 유도하였다.
F 18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머 PET 영상화
마우스에 F18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머 주사 후 60분 후부터 10분간의 정적 영상을 Inveon microPET (Siemens, Knoxville, TN, USA) 스캐너를 이용하여 획득하였다. F18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머 주사 시 2% Isoflurane으로 호흡 마취한 후 마우스의 꼬리 정맥에 7.4 MBq의 F18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머를 주사하였다. 획득된 리스트모드 (listmode) 데이터는 사이노그램으로 변환 후 3D Ordered Subset Expectation Maximization (OSEM) 알고리즘으로 재구성하여 ASIpro (Concorde Microsystems Inc, Knoxville, TN)를 이용하여 분석하였다.
F18 방사성 동위원소 표지 ERBB2 압타머를 인간 유방암 세포주입으로 종양을 키운 마우스에 정맥 주사한 후에 지멘스사의 inveopn PET를 이용하여 PET를 수행하였다. 주입한 양은 13.7 ± 1.1 MBq (370 ± 30 uCi)였고 역학 PET 연구는 10개 1분 영상과 4개 5분 영상 프로토콜에 따라 30분 동안 수행되었다. 두 정지 상태에서의 연구가 주입 후 10, 60, 90 그리고 120분간 수행되었다. PET 신호의 부분정량은 AMIDE 소프트웨어를 이용하여 수행되었다. 영상들은 양전자 표지 프로브의 조직 농도(%ID/g)에 비례하는 false-color scale를 이용하여 구현하였다. 빨강색은 가장 농도가 높은 것을 나타내어주고 노랑, 녹색, 파랑은 점차적으로 낮은 농도와 일치한다.
PET 이미지를 도 7 내지 도 13에 나타내었다.
결과
HER2 발현의 입증과 표적 암세포에 대한 압타머의 친화도
웨스턴블럿과 유동 세포 계수법이 유방암 세포주인 BT474의 발현을 조사하기 위해 수행되었다. 웨스턴블롯 분석은 유전자 증폭에 기인하여 HER2가 과발현한다고 알려진 SKBR3세포주 뿐만 아니라 BT474에서의 과발현을 확인하였다. 음성 대조군 세포주인 MDA-MB231에서는 해당하는 위치에서 신호가 보이지 않는 것을 확인하였다 (도 14).
도 15에서 보이는 바와 같이 HER2 항체는 유동 세포 계수법을 이용하여 HER2-양성 BT474세포주에 매우 특이적으로 결합하는 것으로 보여진다. 항체와 비교할 ? ERBB2 압타머는 MDA-MB231 세포주에서는 매우 약한 반면 BT474 세포주에서는 강하게 결합하는 것을 볼 수 있다. 게다가 무작위 핵산 올리고에서는 어떠한 세포주에서도 결합하는 것을 볼 수 없었다. 이러한 결과는 ERBB2 압타머가 HER2 양성 유방암 세포주에 우선적으로 결합한다는 것을 제시하고 이는 이러한 세포주 표면에 HER2 구조를 인지함으로 인하여 가능하다. 같은 방법으로 유방암 세포주인 KPL4와 SK-BR-3 세포주 형광 표지 압타머가 강하게 결합하는 것이 관찰되었다.
공초점 현미경분석
ERBB2 압타머의 세포 결합은 공초점 현미경으로 좀 더 평가되었다(도 16). BT474 HER2 양성 유방암 세포주에 압타머를 처리하였다. ERbB2 압타머는 형광으로 표지가 되어 세포 표면에서 형광이 관측이 되었고 이러한 세포의 표면에 HER2 구조체가 있는 것으로 확인되었다. 세포막을 따라 압타머가 나타내는 형광이 관측되었고 음성 대조군인 MDA-MB231 세포주에서는 아무런 형광신호도 관측되지 않았으므로 HER2가 존재하지 않는 것으로 보인다. 따라서 이 ERBB2 압타머는 HER2 양성 유방암 세포주에 결합할 수 있고 HER2 음성 세포에는 최소 결합하는 것으로 관찰되었다. 형광표지 ODN과 상보적 염기 쌍합을 이룬 ERBB2 압타머{[AP001-24] 및 [AP001-25번]}을 위에서 진행한 실험과 같은 방법으로 유방암 세포주인 KPL4, N87, SK-BR-3에 처리한 뒤 공초점 현미경으로 형광을 관찰하였다. 두 종의 ERBB2 압타머 모두 유방암 세포주에 잘 결합하는 것이 확인되었고 [AP001-24]는 세포막을 따라 세포 표면에 형광이 관측되었고 [AP001-25]는 세포 내부에서도 형광이 관측되었다.
생체 내 PET 영상, 생체분포, 면역조직화학
동물 micro PET을 이용하여 BT474 또는 KPL4암을 품은 마우스의 생체 내 분자 이미지가 시간별로 주어졌다. 도 17에 따르면 18F 표지 HER2 특이 ERBB2 압타머가 마우스의 왼쪽 겨드랑이에 존재하는 암 조직에 섭취가 매우 증가하는 것이 관찰되었다. 120분간 주어진 영상에서 암은 수평면과 관상면 영상에서 ERBB2 압타머에 의해 분명하게 표지되었다. 창자와 방광에서의 생리적인 섭취가 뚜렷하게 나타난 것으로 보아 방사선의약품의 두 가지 주요 배출 경로를 반영한다.
생체분포는 18F로 표지된 ERBB2 압타머의 주입 후 한 시간 후에 암을 품은 마우스에서 검증되었다. 동물을 희생시킨 후에 암을 포함한 각각의 조직에서의 방사능 수치를 감마 계측기를 이용하여 측정하여 %ID/g를 표현하였다(도 18). 아래 표에도 나타내었다.
Figure 112018039999181-pat00008
18F 표지 ERBB2 압타머의 암에서 섭취는 한 시간당 0.62±±0.04였다. 생체 분포도에 대한 연구는 18F 표지 ERBB2 압타머 두 가지 주요 배출 경로가 신장과 창자임을 보여준다.
도 19는 HER2 양성과 음성 암을 품은 마우스에서 18F 표지 ERBb2 압타머를 나타내는 영상을 보여준다. HER2 과발현 BT474암은 HER2 음성 MSA-MB231 암과 비교할때 높은 동위원소 섭취를 보여준다. 반정량적 분석을 위해 각각 VOI(voxel- 또는 volume-of-interest)중의 전체 활성(nCi)이 계산되었다. BT474와 MDA-MB231 세포주 사이의 T/M (tumor/muscle) 섭취 비율의 비교는 BT474 암에 과발현 HER2에서 T/M 비율과 대조 이미지가 높은 것으로 보여진다(도 19). 면역조직화학으로 각각의 마우스 그룹으로부터 적출된 BT474암에서 HER2의 높은 발현과 MDA-MB231 세포에서의 HER2가 낮게 발현되는 것이 확인되었다(도 20). BT474 암세포(윗줄)는 MDA-MB231 세포주(아랫줄)와 비교할 때 HER2에 대해 더 강하게 세포막이 염색되는 것이 관찰된다.
본 발명에서, HER2 표적 ERBB2 압타머를 생체 내에서 성공적으로 PET 영상화하였다. 본 발명은 특이적인 ERBB2 압타머를 이용하여 HER2 표적 PET영상화한 첫 번째 사례이다. BT474 암이 있는 마우스에서 PET 영상들은 ERBB2 압타머가 생체 내에서 HER2를 인지하여 암을 비교적 선명하게 보여주는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 방사선 표지 ERBB2 압타머가 HER2 양성 유방암 세포주에 대한 표적 치료에 응용되거나 치료방법을 결정하는데 잠재적으로 적용될 수 있다.
상기 실시 예에서 확인한 바와 같이, R-[ERBB2 aptamer]-ODN-X 와 cODN-L-F18을 결합시켜 R-[ERBB2 aptamer]-ODN-X/cODN-L-F18[상기에서 R-[ERBB2 aptamer]-X-hy(bp)-L-F18로 표시]을 제조했을 때, R = H( No Protecting), X = H (No protecting)에서 R = 콜레스테롤, PEG(폴리에틸렌글리콜), X = idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2’-메톡시 뉴클레오타이드, 2’-아미노 뉴클레오타이드, 2’F-뉴클레오타이드 등으로 5’ 말단 위치나 3’ 말단 위치, 또는 양쪽 모두에서 화학적으로 변형된(protecting) 압타머인 경우 영상 이미지가 좋아진다.
이들 화합물에 의한 변형에 의해 t1/2 blood clearence를 높여주는 효과. 즉, 체내에서 혈중 내 반감기를 높여줌으로써 방사성 동위원소를 결합시킨 ERBB2 압타머가 종양에 더 많이 결합하여 영상효율을 높여주는 효과를 나타낸다[R = H, X = H 가 t1/2 = 10min인데 비하여 R과 X가 보호되어 변형된 경우 1시간 증가함으로써 영상 이미지가 좋아짐을 확인하였다.
참고문헌
1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990;249:505-10.
2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990;346:818-22.
3. Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. SELEX--a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular engineering. 2007;24:381-403.
4. Spiridonova VA, Kopylov AM. DNA aptamers as radically new recognition elements for biosensors. Biochemistry Biokhimiia. 2002;67:706-9.
5. Jayasena SD. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical chemistry. 1999;45:1628-50.
6. Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 1992;355(6360):564-6.
7. Bates PJ, Laber DA, Miller DM, Thomas SD, Trent JO. Discovery and development of the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment for cancer. Experimental and molecular pathology. 2009;86:151-64.
8. Lupold SE, Hicke BJ, Lin Y, Coffey DS. Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer research. 2002;62:4029-33.
9. Daniels DA, Chen H, Hicke BJ, Swiderek KM, Gold L. A tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100:15416-21.
10. James W. Aptamers in the virologists' toolkit. The Journal of general virology. 2007;88(Pt 2):351-64.
11. Doggrell SA. Pegaptanib: the first antiangiogenic agent approved for neovascular macular degeneration. Expert opinion on pharmacotherapy. 2005;6:1421-3.
12. Dausse E, Da Rocha Gomes S, Toulme JJ. aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline? Current opinion in pharmacology. 2009;9:602-7.
13. Mitri Z, Constantine T, O'Regan R. The HER2 Receptor in Breast Cancer: Pathophysiology, Clinical Use, and New Advances in Therapy. Chemotherapy research and practice. 2012;2012:743193.
14. Burstein HJ. The distinctive nature of HER2-positive breast cancers. The New England journal of medicine. 2005;353:1652-4.
15. Tan M, Yu D. Molecular mechanisms of erbB2-mediated breast cancer chemoresistance. Advances in experimental medicine and biology. 2007;608:119-29.
16. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nature reviews Cancer. 2009;9:463-75.
17. Dastjerdi K, Tabar GH, Dehghani H, Haghparast A. Generation of an enriched pool of DNA aptamers for an HER2-overexpressing cell line selected by Cell SELEX. Biotechnology and applied biochemistry. 2011;58:226-30.
18. Liu Z, Duan JH, Song YM, Ma J, Wang FD, Lu X et al. Novel HER2 aptamer selectively delivers cytotoxic drug to HER2-positive breast cancer cells in vitro. Journal of translational medicine. 2012;10:148.
19. Mahlknecht G, Maron R, Mancini M, Schechter B, Sela M, Yarden Y. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110:8170-5.
20. Mahlknecht G, Sela M, Yarden Y. Aptamer Targeting the ERBB2 Receptor Tyrosine Kinase for Applications in Tumor Therapy. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2015;1317:3-15.
21. Moosavian SA, Jaafari MR, Taghdisi SM, Mosaffa F, Badiee A, Abnous K. Development of RNA aptamers as molecular probes for HER2(+) breast cancer study using cell-SELEX. Iranian journal of basic medical sciences. 2015;18:576-86.
22. James ML, Gambhir SS. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological reviews. 2012;92:897-965.
23. Hicke BJ, Stephens AW, Gould T, Chang YF, Lynott CK, Heil J et al. Tumor targeting by an aptamer. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 2006;47:668-78.
24. Jacobson O, Yan X, Niu G, Weiss ID, Ma Y, Szajek LP et al. PET imaging of tenascin-C with a radiolabeled single-stranded DNA aptamer. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 2015;56:616-21.
25. Pala K, Serwotka A, Jelen F, Jakimowicz P, Otlewski J. Tumor-specific hyperthermia with aptamer-tagged superparamagnetic nanoparticles. International journal of nanomedicine. 2014;9:67-76. and Lee JH, Chae YC, Kim Y, Kang H, Im JH, Kim JI, Kim KS, Jang SK, Oh IU, Choi MJ, Kang WJ. "압타머 which selectively binds to ERBB2 receptor and uses thereof" US 2015/0005368 A1 (Jan. 1, 2015)
26. Flagothier J, Kaisin G, Mercier F, Thonon D, Teller N, Wouters J et al. Synthesis of two new alkyne-bearing linkers used for the preparation of siRNA for labeling by click chemistry with fluorine-18. Applied radiation and isotopes : including data, instrumentation and methods for use in agriculture, industry and medicine. 2012;70:1549-57.
27. Ramenda T, Steinbach J, Wuest F. 4-[18F]Fluoro-N-methyl-N-(propyl-2-yn-1-yl)benzenesulfonamide ([18F]F-SA): a versatile building block for labeling of peptides, proteins and oligonucleotides with fluorine-18 via Cu(I)-mediated click chemistry. Amino acids. 2013;44:1167-80.
28. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research. 2003;31(13):3406-15.
29. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic acids research. 2007;35(Web Server issue):W43-6.
30. Tang G, Zeng W, Yu M, Kabalka G. Facile synthesis of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB) for protein labeling. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2008;51:68-71.
31. Tang G, Tang X, Wang X. A facile automated synthesis of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB) for 18F-labeled cell-penetrating peptide as PET tracer. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2010;53:543-7.
32. Scott PJH, Shao X. Fully automated, high yielding production of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB), and its use in microwave-enhanced radiochemical coupling reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2010;53:586-91.
33. Kraus MH, Popescu NC, Amsbaugh SC, King CR. Overexpression of the EGF receptor-related proto-oncogene erbB-2 in human mammary tumor cell lines by different molecular mechanisms. The EMBO journal. 1987;6:605-10.
34. Varmira K, Hosseinimehr SJ, Noaparast Z, Abedi SM. An improved radiolabelled RNA aptamer molecule for HER2 imaging in cancers. Journal of drug targeting. 2014;22:116-22.
35. Bouchard PR, Hutabarat RM, Thompson KM. Discovery and development of therapeutic aptamers. Annual review of pharmacology and toxicology. 2010;50:237-57.
36. Sun H, Zhu X, Lu PY, Rosato RR, Tan W, Zu Y. Oligonucleotide aptamers: new tools for targeted cancer therapy. Molecular therapy Nucleic acids. 2014;3:e182.
37. Lao YH, Phua KK, Leong KW. aptamer nanomedicine for cancer therapeutics: barriers and potential for translation. ACS nano. 2015;9:2235-54.
38. Sun H, Zu Y. A Highlight of Recent Advances in Aptamer Technology and Its Application. Molecules. 2015;20:11959-80.
39. Rosenberg JE, Bambury RM, Van Allen EM, Drabkin HA, Lara PN, Jr., Harzstark AL et al. A phase II trial of AS1411 (a novel nucleolin-targeted DNA aptamer) in metastatic renal cell carcinoma. Investigational new drugs. 2014;32:178-87.
40. Dassie JP, Hernandez LI, Thomas GS, Long ME, Rockey WM, Howell CA et al. Targeted inhibition of prostate cancer metastases with an RNA aptamer to prostate-specific membrane antigen. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2014;22:1910-22.
41. Xu W, Siddiqui IA, Nihal M, Pilla S, Rosenthal K, Mukhtar H et al. Aptamer-conjugated and doxorubicin-loaded unimolecular micelles for targeted therapy of prostate cancer. Biomaterials. 2013;34:5244-53.
42. Lim EK, Kim B, Choi Y, Ro Y, Cho EJ, Lee JH et al. Aptamer-conjugated magnetic nanoparticles enable efficient targeted detection of integrin alphavbeta3 via magnetic resonance imaging. Journal of biomedical materials research Part A. 2014;102:49-59.
43. Hu H, Dai A, Sun J, Li X, Gao F, Wu L et al. Aptamer-conjugated Mn3O4@SiO2 core-shell nanoprobes for targeted magnetic resonance imaging. Nanoscale. 2013;5:10447-54.
<110> INTEROLIGO CORPORAION <120> PET IMAGING OF HER2 EXPRESSION WITH AN RADIO-LABELED APTAMER <130> 105903 <150> KR 2017/053456 <151> 2017-04-26 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-A01_A05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 1 angnnagagn nngccngagn gccncgnaag ggcgnaacaa 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-A02_B05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 2 nacngggccc gnnagccncn ggcgcnccnn cgcnngngcc 40 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-A03_C05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 3 nnancaacgc acngagggcg ncagcnncnn nnnagg 36 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-A04_D05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 4 angnagagnn ngccngagng ccncgcaagg gcgnaacag 39 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-A06_E05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 5 nccngncccg gnnnacacaa gnnaaggcag ccgcnggana 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B02_F05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 6 gncngaacac cgagannagc ngaacgaacg gnanggacgn 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B03_G05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 7 nccnggcang nncganggag gccnnngann acagcccaga 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B04_H05, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 8 cgcgannaga ngaacgcaca anacccgnnc ngagnaaagn 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B08_A06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 9 gncngaacac cgagannagc cgaacgaacg gnanggacgn 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B09_B06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 10 gnnagacnga acgcacngag ggccgcagcc nancngaagg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-B12_C06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 11 angnnagagn nngccngagn gccncgcaag ggcgnaacaa 40 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-C03_E06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 12 gncngagcan cgcgnnnagc cgaacgcncg gngaggnaga n 41 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-C05_F06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 13 ncanggcang nncganggag gccnnngann acagcccaga 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-C06_G06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 14 cnacacgaan caacnccccn ccgcanacng aacancacaa 40 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-C08_H06, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 15 nnagcaaaan gccangngcg nccngncccg gnnnacagc 39 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-C10_A07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 16 ngangncccc aacncagcng ngaancnang cccccgccca 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D01_B07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 17 cngagcggnn acnacaccac cgngagaccn nagnnacaaa 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D02_C07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 18 annagangaa agcgcanncc aacaacagan aancngaggg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D04_E07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 19 nnnggagngn cnnacggnng gagnaancga ggangganga 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D05_F07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 20 ccgnnaccna ccnccncgac cgngggngcc cnnagnccca 40 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D06_G07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 21 nccnggcang nncganggag gccnnngann acagccaga 39 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D07_H07, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 22 ccgnnaccna ccnccncgac cgngggngcc nnnagnccca 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D09_A08, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 23 angnnagagn nngccngagn gccncgcaag ggcgnaacaa 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-D11_B08, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 24 nccnggcang nncganggag gccnnngann acagcccagn 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-E04_D08, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 25 annagangaa agcacanncc aacaacagan aancngaggg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-E11_F08, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 26 angnnagagn nngccngagn gcgncgcaag ggcgnaacag 40 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-E12_G08, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 27 ngagaagggc ngngccnnac ncaaaannng ggancngaa 39 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-F05_D09, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 28 nccnggnang nncganggag gccnnngann acagcccaga 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-F08_E09, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 29 nagancncng annaggnaga acgcccnacn cnaacggcag 40 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-F09_F09, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 30 ngagaagggc ngngccnnac ncaaaannng gggancngaa 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-F11_G09, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 31 ngagaagggc ngngccnnac ncaaaannng gggancngaa 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-G04_B10, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 32 cgnccnnggn gagnnngggn cngagcagga gcacgngagn 40 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-H01_E10, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 33 annagangaa agcacanncc aacaacagan aancngaggg 40 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-H03_G10, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 34 annagangaa agcacanncc aacaacagan aancngaggg 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence represented by Clone No. 9-ER-N-H09_B11, wherein n is NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine] <400> 35 angnnagagn cngccngagn gccncgcaag ggcgnaacag 40

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 압타머 및 화학식 2의 표지 cODN이 혼성화된 표지 압타머를 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물:
    [화학식 1]
    R-[ERBB2 압타머]-ODN(oligodeoxynucleotide)-X
    (식 중, R은 H, 콜레스테롤, 또는 PEG(폴리에틸렌글리콜)이고,
    ERBB2 압타머는 서열번호 AP001-24 또는 서열번호 AP001-25의 염기서열로 이루어진 것이고,
    ODN은 올리고디옥시뉴클레오티드이고,
    X는 H, idT(inverteddeoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오타이드, 2'-아미노 뉴클레오타이드, 또는 2'F-뉴클레오타이드임)
    [화학식 2]
    cODN-Y
    (식 중, cODN은 상기 ODN에 상보적인 서열의 올리고디옥시뉴클레오티드이고,
    Y는 시아닌 형광염료 또는 링커-방사성 동위원소이고, 상기 동위원소는 18F, 32P, 123I, 89Zr, 67Ga, 201Tl, 111In-111에서 선택되는 것임).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 동위원소는 18F인 것을 특징으로 하는 영상화용 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 형광염료는 Cy5인 것을 특징으로 하는 영상화용 조성물.
  10. 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 제1항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 영상화용 조성물을 처리하는 단계,
    상기 시료에서의 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계, 및
    상기 시료에서의 압타머의 결합 정도와 정상 시료에서의 압타머의 결합 정도를 비교하는 단계를 포함하는,
    암 또는 암 전이 진단 정보를 제공하는 방법.
  11. 하기 화학식 2의 cODN과 Y를 반응시켜, 화학식 2의 표지 cODN을 제조하고, 이를 정제하여 얻는 단계; 및
    상기 표지 cODN을 하기 화학식 1의 압타머와 혼성화시켜 표지 압타머를 얻는 단계;를 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    R-[ERBB2 압타머]-ODN(oligodeoxynucleotide)-X
    (식 중, R은 H, 콜레스테롤, 또는 PEG이고,
    ERBB2 압타머는 서열번호 AP001-24 또는 서열번호 AP001-25의 염기서열로 이루어진 것이고,
    ODN은 올리고디옥시뉴클레오티드이고,
    X는 H, idT(inverteddeoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오타이드, 2'-아미노 뉴클레오타이드, 또는 2'F-뉴클레오타이드임)
    [화학식 2]
    cODN-Y
    Y는 시아닌 형광염료 또는 링커-방사성 동위원소이고, 상기 동위원소는 18F, 32P, 123I, 89Zr, 67Ga, 201Tl, 111In-111에서 선택되는 것임).
KR1020180046550A 2017-04-26 2018-04-23 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법 KR102062115B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18791814.9A EP3636287A4 (en) 2017-04-26 2018-04-25 BIOMOLECULAR IMAGING METHOD WITH THE AID OF AN APTAMER
PCT/KR2018/004770 WO2018199607A1 (ko) 2017-04-26 2018-04-25 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법
JP2019557747A JP7016544B2 (ja) 2017-04-26 2018-04-25 アプタマーを用いた生体分子の映像化方法
US16/608,645 US11499156B2 (en) 2017-04-26 2018-04-25 Biomolecule imaging method using aptamer
CN201880027916.2A CN110621351B (zh) 2017-04-26 2018-04-25 使用适配体的生物分子成像方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170053456 2017-04-26
KR20170053456 2017-04-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180120092A KR20180120092A (ko) 2018-11-05
KR102062115B1 true KR102062115B1 (ko) 2020-01-03

Family

ID=64329202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180046550A KR102062115B1 (ko) 2017-04-26 2018-04-23 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11499156B2 (ko)
EP (1) EP3636287A4 (ko)
JP (1) JP7016544B2 (ko)
KR (1) KR102062115B1 (ko)
CN (1) CN110621351B (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114703194B (zh) * 2022-05-24 2022-09-02 中山大学附属第五医院 一种氟-18标记的cd63靶向化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
KR101759209B1 (ko) * 2010-01-22 2017-07-19 성균관대학교산학협력단 Ｈｅｒ－２ 과발현 유방암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
KR101279584B1 (ko) 2011-06-24 2013-06-28 대한민국 (식품의약품안전처장) Ｅｒｂｂ2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
KR101405440B1 (ko) 2012-07-31 2014-06-20 연세대학교 산학협력단 인테그린αｖβ３에 특이적 압타머 및 이의 용도
KR101279585B1 (ko) 2013-01-09 2013-06-27 대한민국 (식품의약품안전처장) Ｅｒｂｂ2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
KR102084472B1 (ko) 2013-10-21 2020-03-04 연세대학교 산학협력단 다양한 압타머에 적용 가능한 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 개발 및 표지방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020517675A (ja) 2020-06-18
JP7016544B2 (ja) 2022-03-03
US20200157543A1 (en) 2020-05-21
KR20180120092A (ko) 2018-11-05
EP3636287A4 (en) 2021-01-27
US11499156B2 (en) 2022-11-15
EP3636287A1 (en) 2020-04-15
CN110621351A (zh) 2019-12-27
CN110621351B (zh) 2022-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. PET imaging of HER2 expression with an 18F-fluoride labeled aptamer
Zhu et al. Combinatorial screening of DNA aptamers for molecular imaging of HER2 in cancer
Cerchia et al. Targeting cancer cells with nucleic acid aptamers
Ko et al. A multimodal nanoparticle-based cancer imaging probe simultaneously targeting nucleolin, integrin αvβ3 and tenascin-C proteins
Liang et al. Multimodality nuclear and fluorescence tumor imaging in mice using a streptavidin nanoparticle
Delač et al. Aptamer for imaging and therapeutic targeting of brain tumor glioblastoma
US20220175977A1 (en) Compounds and methods for the detection of trpv-6 cancers and drug delivery
Park et al. Hybridization-based aptamer labeling using complementary oligonucleotide platform for PET and optical imaging
López‐Colón et al. Aptamers: turning the spotlight on cells
Perkins et al. Radiolabelled aptamers for tumour imaging and therapy
Kang et al. Multimodal imaging probe for targeting cancer cells using uMUC-1 aptamer
Yang et al. Improved cellular delivery of antisense oligonucleotide for miRNA-21 imaging in vivo using cell-penetrating peptide-based nanoprobes
Croci et al. 64Cu and fluorescein labeled anti-miRNA peptide nucleic acids for the detection of miRNA expression in living cells
Wang et al. Framework nucleic acids in nuclear medicine imaging: shedding light on nano–bio interactions
KR102062115B1 (ko) 압타머를 이용한 생체 분자 영상화 방법
Vi et al. Diagnostics and therapeutics in targeting HER2 breast cancer: a novel approach
Jia et al. Activatable dual cancer-related RNA imaging and combined gene-chemotherapy through the target-induced intracellular disassembly of functionalized DNA tetrahedron
JP2024052931A (ja) 細胞認識およびインテグレーションのための核酸
Choi et al. In vivo positron emission tomography imaging for PD-L1 expression in cancer using aptamer
Cultrara et al. Size matters: arginine-derived peptides targeting the PSMA receptor can efficiently complex but not transfect siRNA
oh Jung et al. A new fluorescence/PET probe for targeting intracellular human telomerase reverse transcriptase (hTERT) using Tat peptide-conjugated IgM
Feng et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy
Case et al. Engineered charge redistribution of Gp2 proteins through guided diversity for improved PET imaging of epidermal growth factor receptor
Park et al. Enhancement of in vivo targeting properties of ErbB2 aptamer by chemical modification
EP4031667B1 (en) Ca-ix aptamers and diagnostic and therapeutic uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)