JP7016544B2

JP7016544B2 - アプタマーを用いた生体分子の映像化方法

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Publication number: JP7016544B2
Application number: JP2019557747A
Authority: JP
Inventors: リ，ジュン・ファン; キム，ジョン・イン; イム，ジョン・フン; リ，ジョン・ウク; キム，ジン・ウ
Original assignee: Interoligo Corp
Current assignee: Interoligo Corp
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2022-03-03
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: KR102062115B1; CN110621351A; CN110621351B; US20200157543A1; JP2020517675A; EP3636287A4; EP3636287A1; KR20180120092A; US11499156B2

Description

本発明は、アプタマーを用いた生体分子の映像化方法に関し、詳細には、同位元素で標識されたアプタマーを成長因子受容体２（ＨＥＲ２）発現細胞株に結合して映像を得る方法に関する。

アプタマーの語源は、「フィットする」という意味のラテン語「aptus」と、「部分」という意味のギリシャ語「meros」である。このアプタマーは、一本鎖核酸で、長さが２０～９０個程度の塩基配列からなっている。通常、アプタマー発掘技術である試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸ）により、標的分子に非常に特異的で親和度の高いアプタマーを選別する。このため、アプタマーは、標的とする特定の分子の発現度を測定したり見つけたりするのに非常に有用な試薬であると考えられる。アプタマーは、安価な生産コスト、容易な合成、低い毒性、免疫原性を欠くこと、そして動物システムで作らないことなど、抗体に比べていくつかの利点がある。また、これは、診断の分野で比較的新しく開発された試薬である。様々な標的、トロンビン（thrombin）、ヌクレオリン（nucleolin）、ＰＳＭＡ、ＴＮＣ、そしてウイルス起源のタンパク質のような非常に多様な標的に対するアプタマーが開発されている。治療の分野では、２００４年に初めて加齢黄斑変性の治療薬としてＦＤＡに承認されたＶＥＦＧ標的アプタマーが開発された。現在では、非常に多くの種類のアプタマーが前臨床と臨床段階で開発中であり、より多くの試験が診断および治療に関連して進行中である。

ＨＥＲ２は、非常によく知られている癌遺伝子であり、乳がんの約１５～３０％程度に増加または過剰発現されている。また、いくつかの癌において高い再発率および予後不良に関連する因子である。ＨＥＲ２によって活性化される２つの信号伝達システムには、細胞増殖を促進するＭＡＰＫ経路と、癌細胞の生存を促進するＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路とが存在する。このため、がんの治療に適用するのに非常に適した標的であると考えられる。現在市販されている、よく知られている治療単一抗体としてＨＥＲ２を標的化するトラスツズマブ（transtuzumab）とペルツズマブ（pertuzummab）が存在するが、臨床で効果的であることが判明した。以前、ＨＥＲ２を標的とするいくつかのＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーが従来方法のＳＥＬＥＸと細胞を基盤とするＳＥＬＥＸにより発掘された。そして、そのＨＥＲ２アプタマーの癌を阻害する特性を薬学的に活用する例が最近報告された。

一方、分子映像によると、非侵襲的な方法で生きている細胞や組織または損傷を与えない物体の生化学的事件を細胞・分子レベルでリアルタイムに可視化することができる。磁性ナノ物質や蛍光材料に変形されたアプタマーは、標的化蛍光映像化や核磁気共鳴画像（magnetic resonance imaging、ＭＲＩ）で良い素材で提供することができる。いくつかの生体内ＭＲＩ研究では、癌のあるマウスにおいて癌を効果的に標的化することが観察された。しかし、代謝の変化は通常、解剖学的変化の前に発生するので、ＰＥＴは、明らかにコンピュータ断層撮影（computed tomography、ＣＴ）とＭＲＩなどの解剖学的技術よりも診断に有利な点がある。臨床活用において、ＰＥＴは、基礎研究と前臨床の分野で幅広く応用されている。例えばＰＥＴは、新しい放射線治療薬の分析、新しい治療薬の効能、そして薬剤の体内分布を検証するのに使用することができる。ＰＥＴの利点は、プローブの深さ、優れた敏感度、定量的データ、そして前臨床から臨床までの転換性にある。つまり、ＰＥＴは、代表的な分子映像装置であり、放射線医薬品を利用して、生きている生体の分子標的レベルでの生化学的変化を検出することができ、非常に敏感度が高いことから、基礎科学や前臨床領域をはじめとする幅広い分野で利用されている。アプタマーを用いたガン標的化は、最近生まれた分子映像技術であり、Hicke等の研究者らにより分子映像でアプタマーが用いられた事例がある。彼らは、細胞外質タンパク質であるテネイシンＣ（tenascin－C）に結合するＴＴＡ１というアプタマーに^９９ｍＴＣを共有結合し、生体内でガンマカメラ（gamma－camera）を用いて癌を映像化した。その後、ＰＥＴを用いた映像化も他のチームによって実現された。

しかし、ＨＥＲ２特異ＥＲＢＢ２アプタマーを用いたＰＥＴ映像化については、まだ知られていない。

アプタマーは、核酸類の一種であり、標的分子に高い特異性と親和度を有する物質である。本発明は、放射性同位元素や蛍光染料で標識されたアプタマーを用いて、生体内の分子的映像を得ることを目的とする。

図１に、放射性同位元素または蛍光標識ＥＲＢＢ２アプタマーのメカニズム模式図を示す。

本発明では、放射性同位元素や蛍光染料で標識されたＨＥＲ２アプタマーを生体内映像化のために活用した。

流動細胞計測法による分析によると、ＥＲＢＢ２アプタマーは、ＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株にはほとんど結合しないのに対して、ＨＥＲ２発現細胞株であるＢＴ４７４には非常に高い親和力を有することが示される。同様に、共焦点顕微鏡から得られた映像においても、このアプタマーは、ＨＥＲ２が発現している乳がん細胞株に結合することが観察され、ＨＥＲ２非発現細胞では、最小限に結合することが確認された。生体内ＢＴ４７４がん細胞株が移植されたマウスの陽電子断層撮影の分子映像では、^１８Ｆが標識されたＨＥＲ２特異ＥＲＢＢ２アプタマーのがん細胞への摂取が非常に増加した。ＥＲＢＢ２アプタマーは、試験管および生体内の両方でＨＥＲ２が発現している乳がん細胞株に優先的に結合することができ、これは、細胞表面でＨＥＲ２構造体を認識することが可能なためである。

^１８Ｆなどの放射性同位元素や蛍光染料が標識されたＥＲＢＢ２アプタマーは、ヒト乳癌細胞におけるＨＥＲ２の発現を認識して、適切な視覚化を可能にする。この結果は、同位元素や蛍光染料標識ＥＲＢＢ２アプタマーのＨＥＲ２陽性乳がん細胞に対する標的治療への適用や、いかに治療するかに関する潜在的な応用法を示す。

図１は、放射線または蛍光標識ＥＲＢＢ２アプタマーのメカニズム模式図である。図２は、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ－Ｘ（Ｒ＝Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ、Ｘ＝Ｈ、またはｉｄＴ）とｃＯＤＮ－Ｃｙ５とのハイブリダイゼーション（hybridization）の結果物であるＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５をTyphoon FLA7000 ３％アガロースゲルで分析したものである。図３は、５０℃、５５℃、６０℃の温度によるコレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮアプタマーと蛍光標識ｃＯＤＮ（ｃＯＤＮ－Ｃｙ５）との相補的塩基対を３％アガロースゲルで確認した結果（黒色：アプタマー、赤色：ｃＯＤＮ－Ｃｙ５）である。図４は、９５℃に加熱したコレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮアプタマーと蛍光標識ｃＯＤＮ（ｃＯＤＮ－Ｃｙ５）との相補的塩基対をアガロースゲルで確認した結果である。図５は、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５のＫＰＬ４、Ｎ８７、およびＳＫ－ＢＲ細胞株に対する共焦点像（confocal image）結果である。ＨＥＲ２陽性細胞株における［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５と［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５アプタマーの共焦点顕微鏡映像である。（ａ）ＫＰＬ４、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株をＣｙ５標識アプタマーで処理、（ｂ）Ｎ８７癌細胞株を同じアプタマーで処理、（ｃ）ＳＫ－ＢＲ－３癌細胞株を同じアプタマーで処理（標識ＤＡＰＩ：青色、Ｃｙ５－アプタマー：赤色）。図６は、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５のＫＰＬ４、Ｎ８７、およびＳＫ－ＢＲ細胞株に対するＦＡＣＳ分析結果である。表３は、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ－Ｘ（Ｒ＝Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ、Ｘ＝Ｈ、またはｉｄＴ）とｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８（Ｌ＝リンカー（linker））とのハイブリダイゼーション（hybridization）構造をＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８で示すものである。図７は、［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図７は、［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図８は、［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図８は、［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図９は、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図９は、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図１０は、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図１０は、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図１１は、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図１２は、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８のmicro ＰＥＴ画像の結果である。図１３は、ＫＰＬ４癌のあるマウスにおいて、［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８、［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ｉｄＴ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８を比較した映像である。図１４は、ヒト乳癌細胞株におけるウェスタンブロットによるＨＥＲ２発現度を示す図である。図１５は、ＨＥＲ２抗体とＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）を用いて、乳がん細胞株を流動細胞計測法で分析した結果である。（ａ）点図表は、抗体からのＢＴ４７４と（ＨＥＲ２陽性細胞株）、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（ＨＥＲ２陰性細胞株）に対する蛍光シグナルを示す。ＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）（赤色）または対照群塩基配列（青色）、（ｂ）抗体とＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）、そして陰性対照群を用いた両細胞株での流動細胞分析グラフである。図１５は、ＨＥＲ２抗体とＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）を用いて、乳がん細胞株を流動細胞計測法で分析した結果である。（ａ）点図表は、抗体からのＢＴ４７４と（ＨＥＲ２陽性細胞株）、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（ＨＥＲ２陰性細胞株）に対する蛍光シグナルを示す。ＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）（赤色）または対照群塩基配列（青色）、（ｂ）抗体とＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）、そして陰性対照群を用いた両細胞株での流動細胞分析グラフである。図１６は、ＨＥＲ２陽性細胞株における選別されたＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）の共焦点顕微鏡映像である。（ａ）ＢＴ４７４、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株をＦＩＴＣ標識アプタマーで処理、（ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞株を同じＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）で処理（標識ＤＡＰＩ：青色、ＦＩＴＣ－ＥＲＢＢ２アプタマー：緑色）。図１６は、ＨＥＲ２陽性細胞株における選別されたＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）の共焦点顕微鏡映像である。（ａ）ＢＴ４７４、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株をＦＩＴＣ標識アプタマーで処理、（ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞株を同じＥＲＢＢ２アプタマー（ＡＰ００１－２５）で処理（標識ＤＡＰＩ：青色、ＦＩＴＣ－ＥＲＢＢ２アプタマー：緑色）図１７は、ＢＴ４７４癌のあるマウスにおける^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝を示すＰＥＴ生体内の映像である。Ｈｙ（ｂｐ）は、ハイブリダイゼーション（hybridization）（塩基対合（base pairing））であり、ＯＤＮ／ｃＯＤＮハイブリダイゼーション（hybridization）を示す。図１８は、癌のあるマウスにおける^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝の生体分布を研究したものである。資料は、組織のグラムあたり注入された活性化を百分率で表したものである（％ＩＤ／ｇ）。エラーバー（Error bars）、ＳＤ（Ｎ＝４）。図１９は、ＨＥＲ２陽性および陰性癌のあるマウスにおける^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝を示すＰＥＴ生体内の映像である。（ａ）ＨＥＲ２過剰発現ＢＴ４７４癌（左脇）は、（ｂ）ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ２３１癌（右脇）と比較してより増加した摂取を示す。（ｃ）毎分当たりの数値（ＣＰＭ）と癌組織にグラムあたり注入された量（％ＩＤ／ｇ）を^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマーで計算した。図１９は、ＨＥＲ２陽性および陰性癌のあるマウスにおける^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝を示すＰＥＴ生体内の映像である。（ａ）ＨＥＲ２過剰発現ＢＴ４７４癌（左脇）は、（ｂ）ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ２３１癌（右脇）と比較してより増加した摂取を示す。（ｃ）毎分当たりの数値（ＣＰＭ）と癌組織にグラムあたり注入された量（％ＩＤ／ｇ）を^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマーで計算した。図１９は、ＨＥＲ２陽性および陰性癌のあるマウスにおける^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２５］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝を示すＰＥＴ生体内の映像である。（ａ）ＨＥＲ２過剰発現ＢＴ４７４癌（左脇）は、（ｂ）ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ２３１癌（右脇）と比較してより増加した摂取を示す。（ｃ）毎分当たりの数値（ＣＰＭ）と癌組織にグラムあたり注入された量（％ＩＤ／ｇ）を^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマーで計算した。図２０は、ＨＥＲ２に対するＨ＆ＥおよびＩＨＣ染色の結果を示す（原倍率４００Ｘ）。

本発明で用いる乳がんに関連するＨｅｒ２受容体に特異的に結合するＥＲＢＢ２アプタマーは、５’－ＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣ－［コア配列（Core sequence）］－ＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧ－３’の塩基配列を有し、コア配列（Core Sequence）の数字「６」や添付する塩基配列リストの「ｎ」は、NaptyldUを示す。

６＝ＮａｐｄＵ（5-(N-ナフチルカルボキシアミド)-［0070］2’-デオキシウリジン（5-(N-Naphthylcarboxyamide)-［0070］2’-deoxyuridine））。本発明では、例えば^１８Ｆ、^３２Ｐ、^１２３Ｉ、^８９Ｚｒ、^６７Ｇａ、^２０１Ｔｌ、^１１１Ｉｎ－１１１の放射性同位元素や、例えばシアニン蛍光染料であるＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７などの蛍光染料で標識されたＨＥＲ２アプタマーを生体内映像化のために活用した。本発明の実施形態では、同位元素や蛍光染料で標識されたＥＲＢＢ２アプタマーに対して、生体内の分子的映像のための標的特異性と臨床適用可能性に関して評価を行った。

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に対するＥＲＢＢ２アプタマーを^１８Ｆ－フッ化物（fluoride）同位元素で標識した。ＨＥＲ２が発現している癌細胞株にアプタマーが入ることを確認するために、流動細胞計測法および共焦点顕微鏡により対照群アプタマーと比較した。^１８Ｆが標識されたＨＥＲ２特異ＥＲＢＢ２アプタマーを陽電子断層撮影し、ＢＴ４７４またはＫＰＬ４細胞が移植されたマウスの生体分子映像をそれぞれ時間別に得た。

以下、本発明を詳細に説明する。

細胞培養
ＨＥＲ２が発現しているヒト乳癌細胞株であるＢＴ４７４、ＫＰＬ４、Ｎ８７およびＳＫ－ＢＲ－３を試験管および生体内試験に用いた。そして対照群として、他のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１をもって実験を行った。すべての細胞株は、ＡＴＣＣから購入したものであり、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地に培養して維持した。

細胞溶解、ウェスタンブロット
細胞内タンパク質を抽出するために、タンパク質分解酵素阻害剤が含まれた細胞溶解液を氷上で３０分間培養した。このようにして得られた細胞溶解液を４℃、２０分間遠心分離して精製した。タンパク質定量のためにブラッドフォード（Bradford）法を用いて定量化し、それぞれのサンプルから３０μｇのタンパク質抽出物を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動して分離した。その後、ニトロセルロース膜に移してＨＥＲ２抗体と対照群であるβ－アクチン（beta-actin）抗体をプローブとして用いて、ＥＣＬでｘ線（x-ray）フィルムに感光した。

ＥＲＢＢ２アプタマーの合成
ＨＥＲ２－（＋）標的ＥＲＢＢ２アプタマーの塩基配列は、下記表２に示す。

ＥＲＢＢ２アプタマーであるＡＰ００１－２４は、ターゲットへの結合力（Ｋｄ）が３．１ｎＭであり、ＡＰ００１－２５は０．９ｎＭである。

ここで、「６」は、下記構造式のＮａｐｄＵ（５－（Ｎ－ナフチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）であり、Ａ＝２’－デオキシアデノシン、Ｇ＝２’－デオキシグアノシン、Ｃ＝２’－デオキシシチジンである。

アプタマーハイブリダイゼーション（aptamer hybridization）のために、ＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２４］および［ＡＰ００１－２５］｝の３’に完全マッチング配列（fully matching sequence）であるＯＤＮ（５’－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’）を含む合成を行った。

［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮの合成
５’－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝を次のようにして合成した。

アプタマーは、ホスホロアミダイト（phosphoramidite）カップリング反応を用いた固相合成方法を用いて合成した。合成後、ｔ－ブチルアミン：メタノール：水（１：１：２ｖ／ｖ／ｖ）の溶液７０℃、５時間反応により切断（cleavage）と脱保護（deprotection）過程を経て完全なアプタマーを得た後に乾燥した。合成アプタマーをＨＰＬＣ［Ｃ１８カラム（Waters、Xbridge OST C18、１０×５０ｍｍ、２６０ｎｍ）］で分離した後、ＥＳＩＭＳ質量分析計（Qtrap2000、ABI）を用いて分子量を測定した。

前記表１の１１番目のアプタマー（配列番号１１）がＡＰ００１－２４に該当する。

［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮの合成：
５’－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ｝を、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

表１の１２番目のアプタマー（配列番号７）がＡＰ００１－２５に該当する。

同じ方式により、ＣＡＧ－３’｛表１の（配列番号１～３５）の各アプタマー－ＯＤＮ｝を、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成
５’－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－ｉｄＴ－３’｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴ（逆位dT（invert dT））ＣＰＧ（Glen、20－0302－10）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成：
５’－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－ｉｄＴ－３’｛［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴＣＰＧ（Glen、20－0302－10）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮの合成
５’－コレステリル－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３ ’｛コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝を、コレステロール－ＰＡ（Glen、10－1976－90）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

コレステリル－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮの合成：
５’－コレステリル－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛コレステリル－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ｝を、コレステロール－ＰＡ（Glen、10－1976－90）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成
５’－コレステリル－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－ｉｄＴ－３’｛コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴＣＰＧ（Glen、20－0302－10）およびコレステロール－ＰＡ（Glen、10－1976－90）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

コレステリル－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成：
５’－コレステリル－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－ｉｄＴ－３’｛コレステリル－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴＣＰＧ（Glen、20－0302－10）およびコレステロール－ＰＡ（Glen、10－1976－90）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮの合成
５’－ペグ化（PEGylated）－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝を、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ２０００ＣＥＤＰＡ（ChemGenes、CLP－2119）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮの合成：
５’－ペグ化（PEGylated）－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ｝を、ポリエチレングリコール（Polyethyleneglycol）２０００ＣＥＤＰＡ（ChemGenes、CLP－2119）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成
５’－ペグ化（PEGylated）－［６ＣＣ６ＧＧＣＡ６Ｇ６６ＣＧＡ６ＧＧＡＧＧＣＣ６６６ＧＡ６６ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－ｉｄＴ－３’｛ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴＣＰＧ（Glen、20－0302－10）およびポリエチレングリコール（Polyethyleneglycol）２０００ＣＥＤＰＡ（ChemGenes、CLP－2119）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴの合成：
５’－ペグ化（PEGylated）－［Ａ６Ｇ６６ＡＧＡＧ６６６ＧＣＣ６ＧＡＧ６ＧＣＣ６ＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧ６ＡＡＣＡＡ］－ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’｛ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ｝を、ｉｄＴＣＰＧ（Glen、20－0302－10）およびポリエチレングリコール（Polyethyleneglycol）２０００ＣＥＤＰＡ（ChemGenes、CLP－2119）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

Ｃｙ５コンジュゲートされた（conjugated）ｃＯＤＮ（相補オリゴヌクレオチド（Complementary Oligonucleotide））［ｃＯＤＮ－Ｃｙ５］の合成：
下記図は、ｃＯＤＮ－Ｃｙ５およびｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８（Ｌ＝リンカー（linker））の構造および合成を示す。

５’－Ｃｙ５－［ＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧ］－３’［ｃＯＤＮ－Ｃｙ５］をＣｙ５－ＰＡ（Glen、10－5915－10）を用いて、前述した｛［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ｝の合成方法により合成した。

Ｃｙ５－標識ＥＲＢＢ２アプタマーの形成
下記表３に、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ－Ｘ（Ｒ＝Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ、Ｘ＝Ｈ、またはｉｄＴ）とｃＯＤＮ－Ｃｙ５とのハイブリダイゼーション（hybridization）構造をＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５で示す。

Ｃｙ５－標識ＥＲＢＢ２アプタマー、｛Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５｝を次のようにして作成した。

まず、同じモル数のｃＯＤＮ－Ｃｙ５と［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮをアニーリングバッファー（ＰＢＳ）に入れる。このとき、ＭｇＣｌ_２の濃度は、最終的に１０ｍＭとなるように調整する。前記反応物を９５℃で５分間おき、常温でゆっくりと冷ます。ｃＯＤＮ－Ｃｙ５と［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮのハイブリダイゼーション率（Hybridization efficiency）は、電気泳動（Typhoon FLA7000 ３％アガロースゲル分析）およびＨＰＬＣを用いて分析した（XBridge OST analytical column（２．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、Waters、２５４ｎｍ、０．１ＭＴＥＡＡ／アセトニトリル））。図２に、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ－Ｘ（Ｒ＝Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ、Ｘ＝ＯＨ、またはｉｄＴ）とｃＯＤＮ－Ｃｙ５とのハイブリダイゼーション（hybridization）の結果物であるＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５をTyphoon FLA7000 ３％アガロースゲルで分析した結果を示す。

蛍光物質Ｃｙ５が標識された合成オリゴヌクレオチド（ｃＯＤＮ－Ｃｙ５）と［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮとの相補的塩基対を確認した。コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮとｃＯＤＮ－Ｃｙ５とを１：１の割合で混ぜた後、５５℃、６０℃、６５℃で互いに結合するように温度を維持した。結合を確認するために、３％アガロースゲルで電気泳動を行った後、Ｃｙ５はＦＬＡ５０００を用いて蛍光を映像化し、全体的なアプタマーは、ＥｔＢｒで染色してＵＶで映像化した。結果を図３に示す。コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮとｃＯＤＮ－Ｃｙ５との相補的塩基対を比較するために、１：１で混ぜて９５℃で５分間加熱して結合した後、前述のような方法で確認した。コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、コレステリル－［ＡＰ００１－２４］－ＯＤＮ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮ－ｉｄＴ、ペグ化（PEGylated）－［ＡＰ００１－２５］－ＯＤＮと蛍光標識ＯＤＮ（ｃＯＤＮ－Ｃｙ５）との相補的塩基対を、９５℃に加熱したものと加熱していないものを確認して比較した。比較の結果は図４に示す。

Ｆ^１８放射性同位元素標識ｃＯＤＮ（相補オリゴヌクレオチド（Complementary Oligonucleotide））［ｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８］
^１８Ｆ－標識（labeled）ｃＯＤＮの合成は、既に報告されている過程（参考文献２４）を中心にした。担体無添加（No-carrier-added）１８Ｆ－フッ化物イオン（fluoride ion）を合成機（Tracerlab FXFN、GE Healthcare、Milwaukee、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて生成した後、メシレート（mesylate）と反応（１００℃、１０分間）した後、^１８Ｆ－フルオロ（fluoro）－ＰＥＧ－アジド（azide）（１８Ｆ－ＦＰＡ）をＨＰＬＣを用いて精製した。５’－ヘキシニル相補オリゴヌクレオチド（5’-hexynyl complementary oligonucleotide）（５’－ｈｅｘ－ｃＯＤＮ２００ｍｇ）にアセトニトリル（１０ｍＬ）中の１ＭＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、アセトニトリル（２０ｍＬ）中の１００ｍＭヨウ化銅（Ｉ）を入れ、１８Ｆ－ＦＰＡ（７５０ｅ１１００ＭＢｑ）を入れてクリックケミストリー（click chemistry）反応を行った（７０℃、２０分間）。合成された^１８Ｆ－標識（labeled）ｃＯＤＮ（ｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８）は、ＨＰＬＣＨ（Xbridge OST C18、１０×５０ｍｍ、溶離液アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ５：９５～９５：５２０分かけて流速：５ｍＬ/分、ＵＶ（２５４ｎｍ））を用いて精製した。

Ｆ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマー［Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８］の形成
下記表４にＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー（aptamer）］－ＯＤＮ－Ｘ（Ｒ＝Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ、Ｘ＝ＯＨ、またはｉｄＴ）とｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８（Ｌ＝リンカー（linker））とのハイブリダイゼーション（hybridization）構造をＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー（aptamer）］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８で示す。

Ｆ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマー、｛Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ^１８｝を次のような方式により作成した。

まず、同じモル数のｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８と［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮをアニーリングバッファー（ＰＢＳ）に入れる。このとき、ＭｇＣｌ_２の濃度は、最終的に１０ｍＭとなるように調整する。前記反応物を９５℃で５分間おき、常温でゆっくりと冷ます。ｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ^１８と［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮとのハイブリダイゼーション率（Hybridization efficiency）は、ＨＰＬＣを用いて分析した（XBridge ＯＳＴ analytical column（２．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、Waters、２５４ｎｍ、０．１ＭＴＥＡＡ／アセトニトリル））。その結果、９８％以上の混成化率で結合した。

共焦点顕微鏡
ＢＴ４７４、ＫＰＬ４、Ｎ８７、ＳＫ－ＢＲ－３、およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株をカバーガラス（coverslip）に分注して一晩培養した。約８０％程度が成長したとき、注意深く洗浄し、蛍光が標識されたＥＲＢＢ２アプタマー｛Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５｝を２５０ｎＭの濃度で処理して培養した。培養後、注意深く洗浄し、ＤＡＰＩを含有する培養液をスライドに取り付けた。ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。顕微鏡のセッティングは、ＦＩＴＣ観察には４８８ｎｍレーザーを、励起（excitation）、放出（emission）にはＢＰ４９０－５５５を、そしてテキサスレッド（Texas red）では６３９ｎｍレーザーを、放出にはＬＰ６４０フィルタを用いた。

前述の実験と同様な方法により、ＥＲＢＢ２過剰発現乳癌細胞株であるＫＰＬ４、Ｎ８７とＳＫ－ＢＲ－３をカバーガラス（coverslip）に分注して一晩培養した。約８０％程度が成長したとき、注意深く洗浄し、Ｃｙ５蛍光が標識されたＯＤＮを相補塩基対を用いて、ＥＲＢｂ２アプタマーに結合した試料を処理して培養した。培養後、注意深く洗浄し、ＤＡＰＩを含有する培養液をスライドに取り付けた。ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。結果は図５に示す。

流動細胞計測法
ＥＲＢＢ２アプタマーの特異度を流動細胞計測システム（BD Biosciences）を用いて、蛍光活性細胞分離法で検証した。ＢＴ４７４、ＫＰＬ４、Ｎ８７、ＳＫ－ＢＲ－３、またはＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞株をペトリ皿に適正数継代培養し、８０％程度まで成長するように培養した。細胞にトリプシンを処理し、ＰＢＳで洗浄した後、蛍光が標識されたＯＤＮを温度による相補的塩基でＥＲＢＢ２アプタマーに結合した。結合が完了した試料を細胞に処理した。ＥＲＢＢ２アプタマー｛Ｒ－［ＥＲＢｂ２アプタマー］－ｈｙ（ｂｐ）－Ｃｙ５｝と対照群として１％ＦＢＳを含有する抗体をそれぞれ４℃で３０分間処理した。処理が完了した試料を洗浄した後、結合したＥＲＢＢ２アプタマーを測定し、蛍光活性細胞分離法により分析した。結果は、図６に示す。

生体内実験
４週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下に１７ββ－エストラジオール（estradiol）ペレットを首の側面部位に、癌が発生するほどの量でエストロゲンが放出するように移植した。数日後、１匹マウス当たり７×１０^６程度の数でＢＴ４７４またはＫＰＬ４ヒト乳癌細胞株を皮下に移植した。癌が３週間発生するようにした後、癌の成長をカリパス（caliper）で測定した。

Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにヒト乳癌細胞株であるＫＰＬ４細胞の１×１０^５個を右肩に皮下移植した。その後、癌が発生するように誘導した。

Ｆ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマーのＰＥＴ映像化
マウスにＦ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマーを注射して６０分後から１０分間の静的映像をInveon micro ＰＥＴ（Siemens、Knoxville、ＴＮ、ＵＳＡ）スキャナを用いて取得した。Ｆ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマーの注射は、２％イソフルラン（Isoflurane）で呼吸麻酔した後、マウスの尾静脈に７．４ＭＢｑのＦ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマーを注射した。取得されたリストモード（listmode）データは、サイノグラムに変換後、３Ｄサブセット化による期待値最大化（Ordered Subset Expectation Maximization（ＯＳＥＭ））アルゴリズムで再構成し、ＡＳＩｐｒｏ（Concorde Microsystems Inc、Knoxville、ＴＮ）を用いて分析した。

Ｆ^１８放射性同位元素標識ＥＲＢＢ２アプタマーを、ヒト乳癌細胞の注入により腫瘍を成長させたマウスに静脈内注射した後、シーメンス社製のinveopn ＰＥＴを用いてＰＥＴを行った。注入量は、１３．７±１．１ＭＢｑ（３７０±３０ｕＣｉ）であり、力学ＰＥＴ研究は、１０個１分の映像と４個５分の映像プロトコルに基づいて３０分間行った。二つの停止状態での研究を、注入後１０、６０、９０および１２０分間行った。ＰＥＴ信号の部分定量は、ＡＭＩＤＥソフトウェアを用いて行った。映像は、陽電子標識プローブの組織濃度（％ＩＤ／ｇ）に比例するフォールスカラースケール（false-color scale）を用いて具現した。赤色は、最も高い濃度を示し、黄色、緑色、青色は順次に低濃度を示す。

ＰＥＴ画像を図７～図１３に示す。

結果
ＨＥＲ２発現の証明と標的癌細胞に対するアプタマーの親和度
乳がん細胞株であるＢＴ４７４の発現を調べるために、ウェスタンブロットと流動細胞計測法を行った。ウェスタンブロット分析により、遺伝子増幅に起因してＨＥＲ２が過剰発現することが知られているＳＫＢＲ３細胞株だけでなく、ＢＴ４７４における過剰発現を確認した。陰性対照群細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１では、該当する位置で信号が示されないことを確認した（図１４）。

図１５に示すように、ＨＥＲ２抗体は、流動細胞計測法を用いて、ＨＥＲ２－陽性ＢＴ４７４細胞株に非常に特異的に結合することが示される。抗体と比較して、ＥＲＢＢ２アプタマーは、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株では非常に弱いのに対して、ＢＴ４７４細胞株では強く結合することを確認できる。さらに、ランダム核酸オリゴでは、いずれの細胞株でも結合することを確認することができなかった。この結果は、ＥＲＢＢ２アプタマーがＨＥＲ２陽性乳がん細胞株に優先的に結合することを示し、これは、このような細胞株の表面にＨＥＲ２構造を認識することにより可能である。同様な方法により、乳がん細胞株であるＫＰＬ４とＳＫ－ＢＲ－３細胞株の蛍光標識アプタマーが強く結合することが観察された。

共焦点顕微鏡分析
ＥＲＢＢ２アプタマーの細胞結合を、共焦点顕微鏡でさらに評価した（図１６）。ＢＴ４７４ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株にアプタマーを処理した。ＥＲｂＢ２アプタマーは、蛍光で標識されて細胞表面で蛍光が観測され、このような細胞の表面にＨＥＲ２構造体があることが確認された。細胞膜に沿ってアプタマーが示す蛍光が観測され、陰性対照群であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株では、いずれの蛍光シグナルも観測されなかったので、ＨＥＲ２が存在しないものと見られる。したがって、このＥＲＢＢ２アプタマーは、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株に結合することができ、ＨＥＲ２陰性細胞には、最小結合することが観察された。蛍光標識ＯＤＮと相補的塩基対をなしているＥＲＢＢ２アプタマー｛［ＡＰ００１－２４］および［ＡＰ００１－２５］｝を前述の実験と同様な方法により、乳がん細胞株であるＫＰＬ４、Ｎ８７、ＳＫ－ＢＲ－３に処理した後、共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。２種のＥＲＢＢ２アプタマーの両方とも、乳癌細胞株によく結合することが確認された。［ＡＰ００１－２４］は、細胞膜に沿って細胞表面で蛍光が観測され、［ＡＰ００１－２５］は、細胞内部でも蛍光が観測された。

生体内ＰＥＴ映像、生体分布、免疫組織化学
動物micro ＰＥＴを用いて、ＢＴ４７４またはＫＰＬ４癌のあるマウスの生体内分子の画像を時間別に得た。図１７によると、１８Ｆ標識ＨＥＲ２特異ＥＲＢＢ２アプタマーが、マウスの左脇に存在する癌組織に摂取が非常に増加することが観察された。１２０分間得られた映像では、がんは、水平面と冠状面の映像においてＥＲＢＢ２アプタマーによって明らかに標識された。腸と膀胱での生理的な摂取が明らかに示されたことから、放射線医薬品の二つの主な排出経路を反映する。

生体分布は、^１８Ｆで標識されたＥＲＢＢ２アプタマーを注入してから１時間後に、癌のあるマウスで検証された。動物を犠牲にした後、癌を含むそれぞれの組織における放射能数値をガンマ計測器を用いて測定し、％ＩＤ／ｇを表現した（図１８）。下記表５にも示す。

^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマーの癌での摂取は、１時間当たりに０．６２±０.０４であった。生体分布度に関する研究は、^１８Ｆ標識ＥＲＢＢ２アプタマーの二つの主な排出経路が腎臓と腸であることを示す。

図１９は、ＨＥＲ２陽性と陰性の癌があるマウスで^１８Ｆ標識ＥＲＢｂ２アプタマーを示す映像である。ＨＥＲ２過剰発現ＢＴ４７４癌は、ＨＥＲ２陰性ＭＳＡ－ＭＢ２３１癌と比較して高い同位元素摂取を示す。半定量的分析のために、それぞれＶＯＩ（関心ボクセル（voxel－of－interest）または関心体積（volume－of－interest））中の全活性（ｎＣｉ）を計算した。ＢＴ４７４とＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株との間のＴ／Ｍ（腫瘍／筋肉（tumor/muscle））の摂取割合を比較したところ、ＢＴ４７４癌に過剰発現ＨＥＲ２でＴ／Ｍ割合と対照イメージが高く示された（図１９）。免疫組織化学により、それぞれのマウスのグループから摘出されたＢＴ４７４癌でＨＥＲ２が高く発現すること、およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞でＨＥＲ２が低く発現することが確認された（図２０）。ＢＴ４７４癌細胞（上段）は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株（下段）と比較して、ＨＥＲ２に対してより強く細胞膜が染色されることが観察される。

本発明では、ＨＥＲ２標的ＥＲＢＢ２アプタマーを生体内で成功的にＰＥＴ映像化した。本発明は、特異的なＥＲＢＢ２アプタマーを用いて、ＨＥＲ２標的をＰＥＴ映像化した最初の事例である。ＢＴ４７４癌のあるマウスのＰＥＴ映像は、ＥＲＢＢ２アプタマーが生体内でＨＥＲ２を認識して、がんを比較的鮮明に見せることが確認された。この結果は、放射線標識ＥＲＢＢ２アプタマーをＨＥＲ２陽性乳がん細胞株に対する標的治療に応用したり、治療方法を決定するのに潜在的に適用することができる。

前記実施例から確認したように、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー（aptamer）］－ＯＤＮ－ＸとｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ１８とを結合して、Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー（aptamer）］－ＯＤＮ－Ｘ／ｃＯＤＮ－Ｌ－Ｆ１８［前記ではＲ－［ＥＲＢＢ２アプタマー（aptamer）］－Ｘ－ｈｙ（ｂｐ）－Ｌ－Ｆ１８で示す］を製造したとき、Ｒ＝Ｈ（No Protecting）、Ｘ＝Ｈ（No protecting）からＲ＝コレステロール、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、Ｘ＝ｉｄＴ（逆位デオキシチミジン（inverted deoxythymidine））、ＬＮＡ（ロックド核酸（Locked Nucleic Acid））、２’－メトキシヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、２’Ｆ－ヌクレオチドなどに５’末端位置または３’末端位置、あるいは両方において化学的に変形された（protecting）アプタマーの場合に映像が良くなる。

これらの化合物による変形により、ｔ１／２血液クリアランス（blood clearence）を高める効果、即ち、体内で血中半減期を高めることにより、放射性同位元素を結合させたＥＲＢＢ２アプタマーが腫瘍にさらに多く結合して映像効率を高める効果を示す（Ｒ＝Ｈ、Ｘ＝Ｈがｔ１／２＝１０分であるのに対し、ＲとＸが保護されて変形した場合、１時間が増加することにより映像が良くなることを確認した）。

参考文献
1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990;249:505-10.
2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990;346:818-22.
3. Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. SELEX--a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular engineering. 2007;24:381-403
4. Spiridonova VA, Kopylov AM. DNA aptamers as radically new recognition elements for biosensors. Biochemistry Biokhimiia. 2002;67:706-9.
5. Jayasena SD. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical chemistry. 1999;45:1628-50.
6. Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 1992;355(6360):564-6.
7. Bates PJ, Laber DA, Miller DM, Thomas SD, Trent JO. Discovery and development of the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment for cancer. Experimental and molecular pathology. 2009;86:151-64.
8. Lupold SE, Hicke BJ, Lin Y, Coffey DS. Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer research. 2002;62:4029-33.
9. Daniels DA, Chen H, Hicke BJ, Swiderek KM, Gold L. A tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003;100:15416-21.
10. James W. Aptamers in the virologists' toolkit. The Journal of general virology. 2007;88(Pt 2):351-64.
11. Doggrell SA. Pegaptanib: the first antiangiogenic agent approved for neovascular macular degeneration. Expert opinion on pharmacotherapy. 2005;6:1421-3.
12. Dausse E, Da Rocha Gomes S, Toulme JJ. aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline? Current opinion in pharmacology. 2009;9:602-7.
13. Mitri Z, Constantine T, O'Regan R. The HER2 Receptor in Breast Cancer: Pathophysiology, Clinical Use, and New Advances in Therapy. Chemotherapy research and practice. 2012;2012:743193.
14. Burstein HJ. The distinctive nature of HER2-positive breast cancers. The New England journal of medicine. 2005;353:1652-4.
15. Tan M, Yu D. Molecular mechanisms of erbB2-mediated breast cancer chemoresistance. Advances in experimental medicine and biology. 2007;608:119-29.
16. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nature reviews Cancer. 2009;9:463-75.
17. Dastjerdi K, Tabar GH, Dehghani H, Haghparast A. Generation of an enriched pool of DNA aptamers for an HER2-overexpressing cell line selected by Cell SELEX. Biotechnology and applied biochemistry. 2011;58:226-30.
18. Liu Z, Duan JH, Song YM, Ma J, Wang FD, Lu X et al. Novel HER2 aptamer selectively delivers cytotoxic drug to HER2-positive breast cancer cells in vitro. Journal of translational medicine. 2012;10:148.
19. Mahlknecht G, Maron R, Mancini M, Schechter B, Sela M, Yarden Y. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110:8170-5.
20. Mahlknecht G, Sela M, Yarden Y. Aptamer Targeting the ERBB2 Receptor Tyrosine Kinase for Applications in Tumor Therapy. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2015;1317:3-15.
21. Moosavian SA, Jaafari MR, Taghdisi SM, Mosaffa F, Badiee A, Abnous K. Development of RNA aptamers as molecular probes for HER2(+) breast cancer study using cell-SELEX. Iranian journal of basic medical sciences. 2015;18:576-86.
22. James ML, Gambhir SS. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological reviews. 2012;92:897-965.
23. Hicke BJ, Stephens AW, Gould T, Chang YF, Lynott CK, Heil J et al. Tumor targeting by an aptamer. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 2006;47:668-78.
24. Jacobson O, Yan X, Niu G, Weiss ID, Ma Y, Szajek LP et al. PET imaging of tenascin-C with a radiolabeled single-stranded DNA aptamer. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 2015;56:616-21.
25. Pala K, Serwotka A, Jelen F, Jakimowicz P, Otlewski J. Tumor-specific hyperthermia with aptamer-tagged superparamagnetic nanoparticles. International journal of nanomedicine. 2014;9:67-76. and Lee JH, Chae YC, Kim Y, Kang H, Im JH, Kim JI, Kim KS, Jang SK, Oh IU, Choi MJ, Kang WJ. "

which selectively binds to ERBB2 receptor and uses thereof" US 2015/0005368 A1 (Jan. 1, 2015)
26. Flagothier J, Kaisin G, Mercier F, Thonon D, Teller N, Wouters J et al. Synthesis of two new alkyne-bearing linkers used for the preparation of siRNA for labeling by click chemistry with fluorine-18. Applied radiation and isotopes : including data, instrumentation and methods for use in agriculture, industry and medicine. 2012;70:1549-57.
27. Ramenda T, Steinbach J, Wuest F. 4-[18F]Fluoro-N-methyl-N-(propyl-2-yn-1-yl)benzenesulfonamide ([18F]F-SA): a versatile building block for labeling of peptides, proteins and oligonucleotides with fluorine-18 via Cu(I)-mediated click chemistry. Amino acids. 2013;44:1167-80.
28. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research. 2003;31(13):3406-15.
29. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic acids research. 2007;35(Web Server issue):W43-6.
30. Tang G, Zeng W, Yu M, Kabalka G. Facile synthesis of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB) for protein labeling. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2008;51:68-71.
31. Tang G, Tang X, Wang X. A facile automated synthesis of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB) for 18F-labeled cell-penetrating peptide as PET tracer. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2010;53:543-7.
32. Scott PJH, Shao X. Fully automated, high yielding production of N-succinimidyl 4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB), and its use in microwave-enhanced radiochemical coupling reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2010;53:586-91.
33. Kraus MH, Popescu NC, Amsbaugh SC, King CR. Overexpression of the EGF receptor-related proto-oncogene erbB-2 in human mammary tumor cell lines by different molecular mechanisms. The EMBO journal. 1987;6:605-10.
34. Varmira K, Hosseinimehr SJ, Noaparast Z, Abedi SM. An improved radiolabelled RNA aptamer molecule for HER2 imaging in cancers. Journal of drug targeting. 2014;22:116-22.
35. Bouchard PR, Hutabarat RM, Thompson KM. Discovery and development of therapeutic aptamers. Annual review of pharmacology and toxicology. 2010;50:237-57.
36. Sun H, Zhu X, Lu PY, Rosato RR, Tan W, Zu Y. Oligonucleotide aptamers: new tools for targeted cancer therapy. Molecular therapy Nucleic acids. 2014;3:e182.
37. Lao YH, Phua KK, Leong KW. aptamer nanomedicine for cancer therapeutics: barriers and potential for translation. ACS nano. 2015;9:2235-54.
38. Sun H, Zu Y. A Highlight of Recent Advances in Aptamer Technology and Its Application. Molecules. 2015;20:11959-80.
39. Rosenberg JE, Bambury RM, Van Allen EM, Drabkin HA, Lara PN, Jr., Harzstark AL et al. A phase II trial of AS1411 (a novel nucleolin-targeted DNA aptamer) in metastatic renal cell carcinoma. Investigational new drugs. 2014;32:178-87.
40. Dassie JP, Hernandez LI, Thomas GS, Long ME, Rockey WM, Howell CA et al. Targeted inhibition of prostate cancer metastases with an RNA aptamer to prostate-specific membrane antigen. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2014;22:1910-22.
41. Xu W, Siddiqui IA, Nihal M, Pilla S, Rosenthal K, Mukhtar H et al. Aptamer-conjugated and doxorubicin-loaded unimolecular micelles for targeted therapy of prostate cancer. Biomaterials. 2013;34:5244-53.
42. Lim EK, Kim B, Choi Y, Ro Y, Cho EJ, Lee JH et al. Aptamer-conjugated magnetic nanoparticles enable efficient targeted detection of integrin alphavbeta3 via magnetic resonance imaging. Journal of biomedical materials research Part A. 2014;102:49-59.
43. Hu H, Dai A, Sun J, Li X, Gao F, Wu L et al. Aptamer-conjugated Mn3O4@SiO2 core-shell nanoprobes for targeted magnetic resonance imaging. Nanoscale. 2013;5:10447-54.

Claims

下記化学式１のアプタマー及び化学式２の標識ｃＯＤＮが混成化された標識アプタマーを含む腫瘍性疾患部位の映像化用組成物。
［化学式１］
Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）－Ｘ
〔式中、Ｒは、Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）であり、
ＥＲＢＢ２アプタマーは、次の配列番号３５または配列番号３６の塩基配列を含み、
ＯＤＮは、配列番号３８の配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｈ、ｉｄＴ（逆位デオキシチミジン（inverted deoxythymidine））、ＬＮＡ（ロックド核酸（Locked Nucleic Acid））、２’－メトキシヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、または２’Ｆ－ヌクレオチドである。〕
［化学式２］
ｃＯＤＮ－Ｙ
〔式中、ｃＯＤＮは、前記ＯＤＮに相補的な配列のオリゴデオキシヌクレオチドであり、
Ｙは、蛍光染料またはリンカー－放射性同位元素である。〕
前記同位元素は、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^１２３Ｉ、^８９Ｚｒ、^６７Ｇａ、^２０１Ｔｌ、^１１１Ｉｎ－１１１から選択されることを特徴とする請求項１に記載の映像化用組成物。
前記同位元素は、^１８Ｆであることを特徴とする請求項２に記載の映像化用組成物。
前記蛍光染料は、シアニン蛍光染料であることを特徴とする請求項１に記載の映像化用組成物。
前記蛍光染料は、Ｃｙ５であることを特徴とする請求項４に記載の映像化用組成物。
患者から分離された生物学的試料に請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の映像化用組成物を処理するステップと、
前記試料におけるアプタマーの結合程度を測定するステップと、
前記試料におけるアプタマーの結合程度と、正常な試料におけるアプタマーの結合程度を比較するステップであって、前記試料におけるアプタマーの結合度合が、前記正常な試料よりも高い場合には、癌または癌転移の存在を検出する、ステップとを含む、生体外で癌または癌転移を検出する方法。
下記化学式２のｃＯＤＮとＹを反応させ、化学式２の標識ｃＯＤＮを製造し、それを精製して得るステップと、
前記標識ｃＯＤＮを下記化学式１のアプタマーと混成化して標識アプタマーを得るステップとを含む、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の腫瘍性疾患部位の映像化用組成物の製造方法。
［化学式１］
Ｒ－［ＥＲＢＢ２アプタマー］－ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）－Ｘ
〔式中、Ｒは、Ｈ、コレステロール、またはＰＥＧであり、
ＥＲＢＢ２アプタマーは、次の配列番号３５または配列番号３６の塩基配列を含み、
ＯＤＮは、配列番号３８の配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドであり、
Ｘは、Ｈ、ｉｄＴ（逆位デオキシチミジン（inverted deoxythymidine））、ＬＮＡ（ロックド核酸（Locked Nucleic Acid））、２’－メトキシヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、または２’Ｆ－ヌクレオチドである。〕
［化学式２］
ｃＯＤＮ－Ｙ
〔式中、ｃＯＤＮは、前記ＯＤＮに相補的な配列のオリゴデオキシヌクレオチドであり、
Ｙは、蛍光染料またはリンカー－放射性同位元素である。〕