KR102084472B1 - 다양한 압타머에 적용 가능한 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 개발 및 표지방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 압타머에 적용 가능한 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 개발 및 표지방법에 관한 것으로, 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체와 압타머의 상보결합을 통해 방사성동위원소가 압타머에 표지 됨으로써 질환의 진단을 위한 영상 프로브 또는 악성 종양 치료에 사용할 수 있다.

Description

다양한 압타머에 적용 가능한 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 개발 및 표지방법{Development of radioisotope labeled nucleotide structure and its labeling method to various aptamers}
본 발명은 다양한 압타머에 적용 가능한 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 개발 및 표지방법에 관한 것이다.
양전자방출단층촬영(Positron emission tomography, PET)는 방사성동위원소 중 특히 양전자를 방출하는 핵종을 이용하여 영상을 촬영하는 기법이다. F-18 FDG가 개발된 이후 전신영상이 가능한 PET 기기가 도입되어 임상에 널리 이용되고 있다. 현재 PET이 가장 널리 사용되는 분야는 F-18 FDG를 이용한 종양 영상이며, 한국에서는 2006년 의료보험의 적용을 받는 영상분야로 발전하였다. 현재 국내 PET 보급은 195대(2013년 2월 건강보험심사평가원)이며, 2012년 국내 PET 검사 건수는 401,429건(대한핵의학회 홈페이지)으로 종양 영상에 필수적인 검사법으로 자리 잡고 있다. 최근에는 F-18 fluoride, C-11 acetate, C-11 methionine 등 다양한 PET용 방사성의약품들이 허가되어 임상에 이용되고 있다. 단일광자방출단층촬영(Single photon emission, SPECT)는 감마선 방출 핵종인 Tc-99m, Tl-201, I-123, I-131 등을 이용한 영상법으로 골스캔 (bone scan)이나 심근관류스캔(myocardial perfusion scan)등이 임상에 널리 사용되고 있다. 특히 Tc-99m은 발생기(generator)에서 생산이 가능하므로 Tc-99m 표지 방사성의약품을 이용한 다양한 검사가 가능하다.
한편, 압타머는 15-40개의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 단일가닥 핵산으로, 스템 루프(stem loop) 구조를 가지며, 특정 분자에 특이적으로 결합하는 성질이 있다. 압타머는 화학적으로 합성이 용이하며, 화학적 변형이 쉽고 열에 안정적이면서 타겟에 대한 특이도가 매우 높은 화합물이다. 압타머의 서열은 SELEX(selective evolution of ligands by exponential enrichment)란 방법으로 찾을 수 있으며, 이미 수백 종의 압타머 서열이 공개되어 있다. 압타머는 특이적으로 타겟과 결합한다는 점에서 흔히 항체와 비교되기도 하며 면역반응이 없다는 장점이 있다.
상기 압타머를 이용하여 다양한 영상화 프로브(imaging probe)에 대한 연구가 발표되고 있다. 최근에는 양전자방출단층촬영(PET)용 방사성의약품으로 개발하기 위해 플루오린-18(F-18) 방사성동위원소 표지방법 및 도입에 대한 연구가 보고되었다(J. Label . Compd . Radiopharm., 2007; 50, 1255-1259. 등). F-18을 이용하여 PET용 방사성의약품을 합성하는 방법으로 친핵성 불소화반응(nucleophilic fluorination)이 가장 널리 사용된다. 사이클로트론(cyclotron)에서 생산되는 F-18은 물에 용해된 상태로 물 분자와 강한 수소결합을 하고 있기 때문에 반응성이 전혀 없어 표지하기가 어렵다. 그러므로 수용액 상태로 공급되는 F-18의 물을 제거한 후 테트라알킬암모늄(tetrabutylammonium) 혹은 크라운에테르(특히 kriptofix 222) 등의 상전이 촉매 물질을 추가하여 F-18 방사성동위원소를 활성화한 다음 이탈기(leaving group)를 가지고 있는 전구체와 유기용매 상에서 친핵성 불소화반응을 하여 표지한다.
하지만 일반적으로 단백질이나 펩타이드 등과 같이 수용액에만 녹는 물질의 경우에는 쉽게 F-18 방사성동위원소를 도입하기 어려운 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 보결기(prosthetic group)를 도입하여 우선 유기용매 하에서 F-18 방사성동위원소 표지반응을 진행하고, F-18로 표지된 보결기를 실제 단백질이나 펩타이드와 공유결합반응으로 표지하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 보결기를 수용성이 큰 분자에 도입하고자 하려면 여러 가지 방법이 있는데, 대표적인 방법으로 구리금속 촉매 하에서 반응하는 클릭(click) 반응이 있다. 클릭 반응의 장점은 수용액상에서 비교적 쉽게 공유결합반응이 진행되기 때문에 수용성물질의 표지반응 시 많이 선호한다. 하지만 클릭 반응에 사용되는 구리 금속으로 인해 단백질, 펩타이드 등이 금속과 반응하여 이들의 3차원 구조가 변형이 되는 것이 가장 문제이다. 압타머의 경우에도 이와 유사한 상황이다.
일반적으로 압타머는 물에 대한 용해도가 높고 수용액상태에서 안정적인 3차원 구조를 하고 있다. 하지만 앞에서 언급한 것처럼 수용액 상에서는 직접적인 F-18 동위원소 표지반응이 불가능하다. 또한 구리금속을 이용한 클릭 반응의 경우 구리금속이 압타머와 반응하여 3차원 구조가 변형될 수 있기 때문에 압타머에 직접적으로 클릭 반응을 하기 어렵다.
새로운 압타머를 발굴하는 과정을 살펴보면 원하는 표적분자와 높은 특이성을 가진 압타머를 선별(target selection)하고, 이 압타머를 고체상 화합물 합성(solid phase synthesis)을 하기 위하여 10개의 염기서열(10 mers) 이상의 임의의 서열을 갖는 짧은 프라이머(primer)에 발굴된 압타머 서열을 화학적으로 붙여나가는 반응을 수행한 후 최종적으로 초기 도입된 프라이머를 제거하는 것이 일반적인 방법이다.
본 발명자들은 이러한 여러 가지 방법을 이용하여 3차원 구조에 영향을 끼치지 않고 가장 쉽게 압타머에 F-18 동위원소를 도입하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
유럽 공개특허 제2036981호 (2009.03.18) 대한민국 공개특허 제2010-0132484호 (2010.12.17)
Current Radiopharmaceuticals, 2010, vol.3, pp.174-201
본 발명의 목적은 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체와 압타머의 상보결합을 통해 방사성동위원소가 표지된 압타머, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 방사성동위원소 표지된 보결기(prosthetic group)와, 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 결합된 핵산 구조체; 및 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 표적물질 특이적인 단일가닥 압타머를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 및 이의 상보적인 서열은 상보결합되어 있는 핵산 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 방사성동위원소 표지된 보결기와, 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 결합된 핵산 구조체를 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 표적물질 특이적인 단일가닥 압타머와 상보결합반응시키는 단계를 포함하는 핵산 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 양전자방출단층촬영(PET) 또는 단일광자방출단층촬영(SPECT)을 위한 영상 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 치료용 동위원소 표지 핵산 복합체를 포함하는 악성 종양 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 압타머의 구조적 변형 없이 효과적으로 방사성동위원소를 표지할 수 있어 다양한 치료용 및 진단용 프로브 특히, 양전자방출단층촬영용 또는 단일광자단층촬영(SPECT)용 프로브로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 감마선 외에도 치료용 방사선인 베타선을 동시에 방출하는 치료용 방사성 핵종을 핵산 복합체에 표지할 수 있어 악성종양 등의 치료에 사용할 수 있다. 치료의 대상이 되는 악성종양의 종류는 압타머의 종류에 따라 달라질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에서, F-18이 표지된 전구체의 분리 정제 조건 확립을 위해 합성된 cold authentic 화합물의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 F-18을 표지한 전구체, 1-아지도-11-[18F]플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸을 HPLC를 통한 분리 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 1-아지도-11-[18F]플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸의 HPLC 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 [F-18]올리고머의 HPLC를 통한 분리 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 표지반응 후 분리 정제된 [F-18]올리고머의 HPLC(RI detector) 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 [F-18]올리고머의 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 압타머의 UV상(UV 290 nm)에서 머무름시간 분석도이다.
도 7은 본 발명의 [F-18]올리고머와 특정 압타머의 결합반응 후 형성된 [F-18]압타머의 HPLC(RI detector, UV 290 nm) 분석 결과이다.
도 8은 C6 종양세포를 이식한 마우스에서 [F-18]올리고머의 정맥주사 후 획득한 PET 영상 결과이다.
도 9는 C6 종양세포를 이식한 마우스에서 본 발명의 [F-18]압타머의 정맥주사 후 획득한 PET 영상 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 방사성동위원소 표지된 보결기(prosthetic group)와, 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 결합된 핵산 구조체; 및 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 표적물질 특이적인 단일가닥 압타머를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 및 이의 상보적인 서열은 상보결합되어 있는 핵산 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 복합체는 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체에 있는 올리고뉴클레오타이드와 이의 상보적인 서열이 도입된 압타머에서 상기 올리고뉴클레오타이드와 이의 상보적인 서열이 상보결합을 통해 이중가닥을 형성함으로써 방사성동위원소 표지된 보결기 부분, 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 이중가닥 부분, 및 단일가닥 압타머 부분으로 구성되어 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 방사성동위원소가 표지된 압타머란 방사성동위원소 표지된 보결기 부분이 압타머에 연결되어 있는 구조를 의미한다.
상기 방사성동위원소로 표지된 압타머는 제조 과정에서 클릭 반응 이후 구리 촉매가 제거되기 때문에, 구리 촉매로 인한 구조적 변형을 겪지 않아 검출 감도가 높은 것을 특징으로 한다.
상기 압타머는 표적물질에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "핵산 구조체"란 방사성동위원소를 표지할 수 있는 보결기 및 올리고뉴클레오타이드가 연결된 구조를 의미하며, [A]oligomer(올리고머)와 혼용되어 사용한다. 여기서, A는 방사성동위원소를 뜻한다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 상보적인 서열과 상보결합이 가능한 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어질 수 있어 그 길이와 종류는 특별히 제한하지는 않는다. 예컨대, 6 내지 15개의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 방사성동위원소가 표지된 보결기는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112013094515417-pat00001
상기 화학식 1에서,
A는 방사성동위원소를 나타낸다.
상기 방사성동위원소는 진단 목적, 장치, 치료 목적 등에 따라 다양하게 표지할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, F-18, I-124, I-125, I-131, Cu-64, Cu-67, Zr-89, Tc-99m, Y-90, Sm-153, Lu-177, Re-186, 또는 Re-188 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 복합체는 PET 영상 분석을 수행할 만큼 동물 종양 모델에서 충분한 섭취율을 보이며, 생체내 온도, 예컨대 37℃에서 인간 혈청 내에서 안정성을 유지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 방사성동위원소 표지된 보결기와, 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 결합된 핵산 구조체를 상기 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 표적물질 특이적인 단일가닥 압타머와 상보결합반응시키는 단계를 포함하는 핵산 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 핵산 복합체의 제조방법은 크게 두 가지 과정을 거쳐 진행될 수 있다. 즉, 구리 촉매 하에서 올리고뉴클레오타이드가 결합된 알킨 화합물과 방사성동위원소 표지된 아자이드 화합물 간의 [3+2]고리화 반응(클릭 반응)을 통해 핵산 구조체를 제조하는 제1단계와, 상기 핵산 구조체의 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 도입된 압타머와 상기 핵산 구조체를 상보결합반응 시키는 제2단계를 포함할 수 있다.
방사성동위원소 표지된 핵산 구조체는 방사성동위원소 표지된 보결기와 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 결합된 상태로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 상보적인 서열과 상보결합이 가능한 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어질 수 있어 그 길이와 종류는 특별히 제한하지는 않는다. 예컨대, 6 내지 15개의 염기서열(6~15 mers)로 이루어진 특정 서열, 예컨대, SEQ ID NO:1로 표시되는 서열(TGTGGTGGTCGG)일 수 있다.
본 명세서에서, "소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드"란 하나 이상의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로서, 이의 상보적인 서열과의 상보결합반응은 특정 결합온도(어닐링 온도)에서 수행되므로, 일정 길이 미만에서는 결합반응이 일어나지 않을 수 있고, 일정 길이를 초과하는 경우에는 제조 비용이 증가하고 전체 크기가 커져 원하는 결과가 나오지 않을 가능성이 있다. 경제적인 면과 효율 면을 고려하여, 본 발명에서는 바람직한 예로 6 내지 15개의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 사용하나, 염기서열의 길이와 종류는 당업자 수준에서 적절히 채택할 수 있는 것이다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 압타머와의 상보결합반응을 위해서 어떠한 형태로든지 변경이 가능하다. 예컨대, 알킨기로 치환되어 있을 수 있다.
상기 핵산 구조체는 구리 촉매 하에서 올리고뉴클레오타이드가 결합된 알킨 화합물과 방사성동위원소 표지된 아자이드 화합물 간의 [3+2]고리화 반응(클릭 반응)에 의해 합성될 수 있다.
상기 방사성동위원소 표지된 아자이드 화합물은 메실레이트(mesylate), 토실레이트(tosylate), 트리플레이트(triflate) 등의 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate)기 및 아자이드기(azide)를 함유하는 화합물과 이온 상태의 방사성동위원소를 반응시켜 제조할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 메실레이트 또는 토실레이트기는 친핵성 불소화 반응을 통해 방사성 불소 원자로 치환될 수 있다.
상기 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate)기 및 아자이드기를 함유하는 화합물은 14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사-1-테트라데카놀 메실레이트, 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트, 트리에틸렌 글리콜 모노-톨루엔설포네이트 모노-아자이드 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
상기 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate)기 및 아자이드기를 함유하는 화합물은 화학적 합성을 통해 제조된 것을 사용하거나, 시판중인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 하기 반응식 1 및 2와 같이, 방사성동위원소를 유기용매에서 친핵성 불소화 반응으로 전구체에 도입하고(반응식 1), 이 전구체를 구리 촉매 하에서 알킨과 아자이드 간의 [3+2]고리화반응을 이용하여 올리고뉴클레오타이드와 결합시켜 핵산 구조체를 합성한다(반응식 2).
이 전구체로, 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트(11-azido-3,6,9-trioxa-1-undecanol mesylate)(3)를 사용하며, 상기 전구체는 F-18 동위원소를 표지하기 위하여 메실레이트기를 가지고 있고, 클릭 반응을 위해 아자이드기를 가지고 있다. 하기 반응식 1에서 (4)의 화합물은 콜드 화합물로서 전구체 및 반응 확인을 위한 것으로 표지 반응 이후 HPLC를 통해 분리 확인하기 위해 합성한다.
[반응식 1]
Figure 112013094515417-pat00002
[반응식 2]
Figure 112013094515417-pat00003
상기 압타머는 상술한 핵산 구조체의 올리고뉴클레오타이드와 상보결합성(complementary binding ability)을 가진 서열이 도입된 압타머로 그 예로써, 핵산 구조체 3‘-TGTGGTGGTCGG-hexyne에 상응하는 서열인 5‘-Aptamer-CCACACCACCAGCC-3’을 도입하여 서로 상보결합반응이 가능한 형태를 지닐 수 있다. 단일가닥의 압타머 부분은 표적물질 특이적인 DNA 또는 RNA 압타머일 수 있다.
본 발명의 핵산 복합체의 제조방법은 상보결합반응 전에 구리 촉매를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 구조체는 클릭 반응을 통해 방사성동위원소를 도입 시 사용한 구리금속을 간단한 방법, 예컨대, 컬럼 또는 SPE filter 등으로 제거가 가능하므로 압타머와의 상보결합반응(complementary interaction) 시 금속의 영향도 없고 반응용 시약에 대한 영향도 없게 된다.
상기 핵산 구조체의 올리고뉴클레오타이드와 이의 상보적인 서열이 도입된 압타머의 상보결합반응은 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체 내 올리고뉴클레오타이드의 결합온도(annealing temperature)까지 가열한 다음 실온까지 냉각시키는 것일 수 있다. 상기 결합온도는 올리고뉴클레오타이드의 염기서열 길이와 종류에 따라 결정되므로 올리고뉴클레오타이드와 이의 상보적인 서열의 상보결합이 일어날 수 있는 온도라면 특별히 제한하지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 하기 반응식 3과 같이 방사성동위원소 표지된 핵산 구조체와 상보적인 서열이 도입된 압타머를 실온에서 시작하여 약 60℃까지 천천히 가열한 후 다시 실온에서 천천히 냉각하는 상보결합반응을 통해 핵산 복합체가 제조될 수 있다.
[반응식 3]
Figure 112013094515417-pat00004
본 발명의 핵산 복합체의 제조방법에 따르면, 핵산 구조체만 준비된다면 상보결합반응을 통해 다양한 특정 압타머들을 동시에 표지할 수 있다. 또한, 핵산구조체에 결합하는 보결기를 변형하여 F-18 이외에 다른 방사성동위원소를 표지할 경우 진단용 및 치료용으로도 다양하게 압타머를 활용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 양전자방출단층촬영(PET) 또는 단일광자방출단층촬영(SPECT)을 위한 영상 프로브에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 악성 종양 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 핵산 복합체는 표적물질 특이적인 압타머를 포함하고 있어 질환의 진단 또는 치료를 위한 프로브로 사용할 수 있다.
PET용 또는 SPECT용 영상 프로브로 사용될 경우, 방사성동위원소로, F-18, I-124, I-125, I-131, Cu-64, Zr-89, Tc-99m 등을 적절히 채택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 복합체는 진단을 위한 감마선 외에도 질환 치료에 사용할 수 있는 베타선을 방출하는 치료용 방사성 핵종으로 표지될 수 있어 악성종양의 치료에 사용할 수 있다(Nuclear Medicine Therapy edited by Janet F. Eary and Winfried Brenner 참조).
상기 치료용 방사성 핵종으로, I-131, Cu-64, Cu-67, Y-90, Sm-153, Lu-177, Re-186, 또는 Re-188 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 악성 종양의 종류는 사용하는 압타머에 따라 달라질 수 있어 특별히 제한하지는 않는다. 예컨대, ERBB2 타겟 압타머에 치료용 방사성 핵종을 표지한 경우 ERBB2 발현 종양의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.
따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀(11-Azido-3,6,9-trioxa-1-undecanol)(2)의 제조
11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀은 하기 반응식 4와 같이 제조하였다.
[반응식 4]
Figure 112013094515417-pat00005
테트라에틸렌글리콜(1)(35 g, 180.2 mmol)을 출발물질로 하여 테트라하이드로퓨란(THF) 용매에 녹인 후 트리에틸아민(triethylamine)(34.7 mL, 248.7 mmol)을 가하고 온도를 0℃로 맞추었다. 다음으로, 메탄설포닐 클로라이드(methanesulfonyl chloride)(15.8 mL, 162.2 mmol)를 3시간 동안 천천히 적가 후 30분 더 교반하였다. 다음으로, 유기용매로 추출을 하여 얻은 유기층을 감압 증류하여 제거 후 에탄올을 가해 녹이고 소듐 아자이드(sodium azide)(17.57 g, 270.3 mmol)을 넣고 14 시간 동안 환류(reflux) 시켰다. 반응이 완료되면 에탄올 용매를 감압증류하여 제거하고 반응물에 물을 가해 화합물을 녹이고 2N NaOH 를 넣어 pH 12로 조정하고 디에틸에테르(diethyl ether)로 추출하여 불순물을 제거하고 남은 물층에 6N HCl을 가해 pH 2-3 정도까지 낮추고 디클로로메탄(dichloromethane) 용매를 이용하여 물층을 추출하고 감압증류하여 목적화합물 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀(2)(16.63 g, 34%) 를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 3.77-3.70(m, 2H), 3.69-3.64(m, 10H), 3.63-3.61(m, 2H), 3.40(t, 2H, J = 4.8Hz), 2.49(brs, 1H)
<제조예 2> 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트(11-Azido-3,6,9-trioxa-1-undecanol mesylate)(3)의 제조
11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트(3)는 하기 반응식 5와 같이 제조하였다.
[반응식 5]
Figure 112013094515417-pat00006
상기 제조예 1에서 제조된 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀(2)(5 g, 22.81 mmol)을 출발물질로 하여 디클로로메탄(dichloromethane) 용매 하에서 트리에틸아민(4.77 mL, 34.21 mmol)을 반응용기에 넣고 온도를 0℃로 맞추었다. 다음으로, 메탄설포닐 클로라이드(1.94 mL, 25.09 mmol)을 천천히 적가하고 30분간 0 ℃에서 교반시켰다. 이 후 상온으로 천천히 온도를 올려주어 1시간 반 동안 더 교반하였다. 얼음물을 가해 반응을 중지시키고 물층과 유기층을 디클로로메탄 용매를 이용하여 추출하고 이때 얻어진 유기층의 용매를 감압증류하여 제거하고 40% 에틸아세테이트/헥산용매를 이용하여 분리 컬럼크로마토그래피하여 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트(3)(6.31 g, 93%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 4.39-4.37 (m, 2H), 3.78-3.76 (m, 2H), 3.68-3.65 (m, 10H), 3.39 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.07(s, 3H)
<제조예 3> 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(1-Azido-11-fluoro-3,6,9-trioxaundecane)(4)의 제조
1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(4)는 하기 반응식 6과 같이 제조하였다.
[반응식 6]
Figure 112013094515417-pat00007
상기 제조예 2에서 제조된 11-아지도-3,6,9-트리옥사-1-운데카놀 메실레이트(3)(3 g, 10.09 mmol)을 출발물질로 하여 테트라부틸암모늄 플루오라이드(tetrabutylammonium Fluoride; TBAF)(3.96 g, 15.14 mmol)을 넣고 아세토나이트릴(acetonitrile) 용매를 가하여 녹이고 반응물질들을 2 시간 동안 가열하여 환류시켰다. 그리고 반응이 종결되면 반응물을 감압하여 용매를 제거하고 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 와 물을 넣어서 유기층을 분리하고 이때 물층을 추출하여 얻은 유기층을 모아서 감압증류하여 유기용매를 제거하고 50% 에틸아세테이트/헥산 용매를 이용하여 분리 컬럼크로마토그래피하여 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(4) (1.75 g, 78%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 4.64-4.61 (m, 1H), 4.52-4.49 (m, 1H), 3.79-3.77 (m, 1H), 3.72-3.66 (m, 11H), 3.39 (t, 2H, J = 5.2Hz)
1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(4)을 이용하여 최적의 HPLC 분리 조건을 찾아내고, 이 조건을 근거로 하여 F-18 표지 반응 이후에 분리 정제 조건으로 최적화하였다.
<제조예 4> 핵산 구조체의 F-18 표지
방사성동위원소 표지된 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸은 하기 반응식 7과 같이 제조하였다.
[반응식 7]
Figure 112013094515417-pat00008
Cold 화합물을 이용하여 HPLC 분리 조건과 확인 조건을 확립한 이후, 실제 F-18 표지 반응에 대한 연구를 진행하였다. 고준위의 방사성동위원소를 이용하기 위해서는 자동합성장치로 반응조건을 확립하는 것이 중요한데, 본 발명자들은 상용화된 자동합성장치(FXFn, GE, USA)를 이용하여 F-18 표지 조건을 확립하였다. 사이클로트론에서 생산된 수용액 상태의 플로라이드 이온(18F-)을 QMA light SepPak® 카트리지에 흡착시켰다. 크립토픽스 222(15 mg), 아세토니트릴(0.9 mL), 포타슘 카보네이트(0.1 mL의 물에 녹인 3 mg)의 혼합용액을 QMA 카트리지에 흘려 용출시킨 후 포타슘 플로라이드 크립토픽스 222(K+[18F]F-/K222)의 혼합물을 고순도 질소의 흐름 하에 120℃에서 건조시켜 용매를 제거하였다. 메실레이트(mesylate) 전구체(5~10 mg)와 아세토니트릴(1 mL)를 첨가한 후 110℃ 15분간 반응시킨 후 preparative HPLC(Phenomenex Gemini 5μ C18, 10×250 mm; 24% MeCN/water에서 5 mL/min)를 이용하여 1-아지도-11-[18F]플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸을 분리하여 회수하였다. 여기에 물 40 mL을 첨가하여 희석한 후 C18 SepPak® 카트리지에 통과시켜 흡착시킨 후 10 mL의 물로 세정하고, 불활성 기체를 3분간 통과시켜 건조시킨 후 에탄올 1 mL로 용출하여 방사성동위원소 표지된 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸을 얻었다. 이때 표지반응 수율은 30~35%였고 분리 정제한 1-아지도-11-[18F]플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(1-Azido-11-[18F]fluoro-3,6,9-trioxaundecane)의 순도는 99% 이상이었다.
다음으로, 방사성동위원소 표지된 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸과 말단에 알킨기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 구리(I) 촉매 하에서 [3+2]고리화 반응을 이용하여 [F-18]올리고머(Oligomer)를 합성하였다.
[반응식 2]
Figure 112013094515417-pat00009
구체적으로는 알킨기를 갖는 올리고뉴클레오타이드(100 ㎍)를 물(10 ㎕)에 녹인 후 요오드화구리(0.1M)와 N,N-디이소프로필에틸아민(1M)를 가하고 방사성동위원소 표지된 1-아지도-11-플루오로-3,6,9-트리옥사운데칸(100 ㎕)을 첨가하여 75℃에서 20분간 표지 반응하여 [F-18]올리고머를 얻었다. 이때 표지반응 수율은 60~70%였고 분리 정제한 [F-18]올리고머의 순도는 99% 이상이었다.
반응식 7과 반응식 2에서 수득한 화합물은 HPLC(Waters, Xbridge OST C18 10×50 mm; 5% CH3CN/0.1M TEAA에서 100% CH3CN/0.1M TEAA로 15분간 gradient; 5 mL/min)를 이용하여 머무름 시간(retention time)을 각각 예측하였다.
<실시예 1> 핵산 복합체([F-18]압타머)의 제조
반응식 2에서 수득한 [F-18]올리고머와 상보적인 서열이 도입된 압타머를 상보결합반응을 시켜 핵산 복합체를 제조하였다.
[반응식 3]
Figure 112013094515417-pat00010
구체적으로는 [F-18]올리고머를 C18 SepPak® 카트리지에 흡착시킨 후 20 mL의 물로 세정하여 불순물을 제거한 후 에탄올 1 mL로 용출한 후 불활성 기체인 아르곤의 흐름 하에 건조시켰다. 건조된 [F-18]올리고머에 포스페이트 완충액 pH 7.2(200 ㎕)와 상보적인 서열이 도입된 압타머(Tenascin C, 100 ㎍)을 첨가한 후 실온에서 시작하여 60℃까지 천천히 가열한 후 다시 실온에서 천천히 냉각하여 반응식 3의 [F-18]압타머를 얻었다. 이때 표지반응 수율은 80% 이상이었고 분리 정제한 [F-18]압타머의 순도는 99% 이상이었다.
<실험예 1> [F-18]올리고머 및 [F-18]압타머의 안정성
[F-18]올리고머 및 [F-18]압타머의 실온과 37 ℃에서의 안정성을 보기 위하여 표지화합물을 30분, 60분, 120분 동안 실온과 37℃에서 배양한 후 HPLC(Waters, Xbridge OST C18 10×50 mm; 5% CH3CN/0.1M TEAA에서 100% CH3CN/0.1M TEAA로 15분간 gradient; 5 mL/min)를 이용하여 확인하였다.
[F-18]올리고머 및 [F-18]압타머는 120분 동안 실온 및 37℃에서 매우 안정함을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 마우스 PET 영상 시험
본 발명에 따른 [F-18]올리고머 및 [F-18]압타머의 마우스 생체 내 분포를 확인하기 위하여 하기 PET 영상을 획득하였다. C6 Glioma 종양을 이식한 마우스에 [F-18]올리고머 및 [F-18]압타머 5.6MBq(0.1 mL)를 각각 꼬리정맥으로 주사하고 2% 이소플루란으로 마취한 다음 15분, 30분, 60분 후 동물용 PET 스캐너(Siemens)를 이용하여 영상을 획득하였다.
도 8 및 9에 나타난 바와 같이, [F-18]올리고머 및 [F-18]압타머 모두 신장으로 빠른 시간 내 배설되고, 종양부위에서 [F-18]올리고머는 섭취되지 않으나 [F-18]압타머는 섭취됨을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Postech Academy-Industry Foundation <120> Development of radioisotope labeled nucleotide structure and its labeling method to various aptamers <130> P130872 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotides for labeling radioisotope <400> 1 tgtggtggtc gg 12

Claims (14)

  1. 방사성동위원소 표지된 보결기(prosthetic group)와, 소정의 길이를 갖는 염기서열로 이루어진 단일가닥 올리고뉴클레오타이드가 결합된 핵산 구조체; 및
    상기 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열이 결합된 표적물질 특이적인 단일가닥 압타머를 포함하고,
    상기 핵산 구조체의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 및 상기 압타머에 결합된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 서열은 상보결합에 의해 이중가닥을 형성하여 핵산 구조체와 압타머의 복합체를 이루는 것인, 핵산 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    단일가닥 압타머는 DNA 또는 RNA 압타머인 핵산 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    방사성동위원소 표지된 보결기는 하기 화학식 1로 표시되는 핵산 복합체:
    [화학식 1]
    Figure 112013094515417-pat00011

    상기 화학식 1에서,
    A는 방사성동위원소를 나타낸다.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    방사성동위원소는 F-18, I-124, I-125, I-131, Cu-64, Cu-67, Zr-89, Tc-99m, Y-90, Sm-153, Lu-177, Re-186, 또는 Re-188 인 핵산 복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 6 내지 15개의 염기서열로 이루어진 것인 핵산 복합체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 양전자방출단층촬영(PET) 또는 단일광자단층촬영(SPECT)을 위한 영상 프로브.
  14. 제1항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 악성 종양 치료용 조성물.
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