JP2014515729A - 新規petトレーサー - Google Patents
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Abstract
陽電子放出断層撮影(PET)イメージングのための新規放射性トレーサーが記載される。神経内分泌腫瘍の陽電子放出断層撮影(PET)イメージングのための新規放射性トレーサーが記載される。具体的には本発明は、新規な[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体、特に胃腸膵臓神経内分泌腫瘍の細胞表面に見出されるソマトスタチン受容体を標的化するものを記載する。本発明はまた、新規放射性トレーサーの中間体、前駆体、医薬組成物、製造方法及び使用方法も記載する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、陽電子放出断層撮影(PET)イメージング、詳しくは胃腸膵臓神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌腫瘍のイメージングのための新規放射性トレーサーを記載する。具体的には本発明は、新規な[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体を記載する。本発明の放射性トレーサーは、胃腸膵臓神経内分泌腫瘍の細胞表面に見出されるソマトスタチン受容体を標的化し得る。本発明はまた、新規放射性トレーサーの中間体、前駆体、医薬組成物、製造方法及び使用方法も記載する。
PETは、腫瘍学及び神経学において疾患の早期検出のためにますます重要となりつつある。特に放射性標識ペプチドは、疾患の検出、治療のモニタリング及びペプチド受容体放射線療法(PRRT)のために一層頻繁に研究されている(Chen,X.Y.,et al.,European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2004,31,(8),1081−1089;Lei,M.,et al.,Current Medical Imaging Reviews 6,(1),33−41)。
ペプチド[Tyr3]オクトレオテート(TOCA)(図1)は、以前には、イメージング目的(Nikolopoulou,A.,et al.,Journal of Peptide Science 2006,12,124−131;Li,W.P.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2002,13,721−728;Reubi,J.C.,et al.,European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2000,27,(3),273−282)及び神経内分泌腫瘍のPRRT(Teunissen,J.,et al.,European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2009,36,(11),1758−1766)のために各種の放射性同位体で標識されていた。[Tyr3]オクトレオテートは、ソマトスタチンより長い生物学的半減期(1.5〜2時間)を有しながら受容体特異性を保持するソマトスタチン類似体である(Weiner,R.E.,et al.,Seminars in Nuclear Medicine 2001,31,(4),296−311)。5つのサブタイプ(sstr−1〜5)が存在するソマトスタチン受容体は神経内分泌腫瘍の表面で過剰発現されることが判明している(Rufini,V.,et al.,Seminars in Nuclear Medicine 2006,36,(3),228−247)。この過剰発現は、放射性標識されたオクトレオテート類似体による腫瘍の選択的標的化を可能にする。ソマトスタチンを模倣するための最初に発見された8アミノ酸配列ペプチドはオクトレオチドであった。環状オクタペプチドはソマトスタチン受容体への結合のために重要な部位を含み、最初は急性及び慢性膵炎のような疼痛状態の治療のためにアヘンアンタゴニストとして使用された(Maurer,R.,et al.,PNAS 1982,79,4815−4817)ことが判明した(Uhl,W.,et al.,Digestion,International Journal of Gastroenterology 1999,60,23−31)。オクトレオチドと[Tyr3]オクトレオテートとを比較すると、後者はソマトスタチン受容体に対してより高い親和性を有することが証明されており(Reubi,J.C.,et al.,European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2000,27,(3),273−282;Wild,R.,et al.,European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2003,30,(10),1338−1347)、C末端においてチロシンをフェニルアラニンで置換しかつトレオニンをトレオニノールで置換することは親和性を高めるように思われる。それにもかかわらず、[111In]−DTPA−オクトレオチド(Octreoscan(商標))はなおも臨床において選択されるペプチドであり、1994年にはソマトスタチン受容体陽性神経内分泌腫瘍に対するイメージング剤としてFDAにより認可された(Rufini,V.,et al.,Seminars in Nuclear Medicine 2006,36,(3),228−247)。
ペプチド又は他の巨大分子を標識する場合、塩基性及び低反応性のような18Fの制約を克服するため一般に使用される方策は、補欠分子族(即ち、小さい放射性標識有機分子であって、次いで目的の主要ファーマコフォアにカップリングし得るもの)を使用することである(Okarvi,S.M.,European Journal of Nuclear Medicine 2001,28,(7),929−38)。これまで使用されてきたアプローチはいずれも、所要段階数、総合反応時間、単離収率及び単離方法の点で様々に異なっている。オクトレオチドは、以前には18F修飾有機補欠分子族で標識されていた。Hostetler et al.(Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals 1999,42,S720−S721)によって使用された初期の方策は、オクトレオチドのN末端を[18F]フルオロ安息香酸([18F]FBA)の活性化エステルで直接に標識するものであった。続く体内分布試験では、[18F]フルオロベンゾイル−オクトレオチド類似体は親油性が高すぎ、肝臓への顕著な取込みを示すことが証明された。オクトレオチドはまた、N末端において2−[18F]フルオロプロピオン酸4−ニトロフェニルエステルで直接に標識されたが、これ自体を合成するために3つの化学修飾段階を必要とする(Guhlke,S.,et al.,Applied Radiation and Isotopes 1994,45,(6),715−727)。この化学における主な欠点は、コンジュゲーション中にオクトレオチドのリシン側鎖をBoc保護する必要があり、最終段階でそれの除去が要求されることである(Guhlke,S.,et al.,Nuclear Medicine and Biology 1994,21,(6),819−825)。
Schottelius et al.(Clinical Cancer Research 2004,10,(11),3593−3606)は、以前の類似体に比べて向上した腫瘍取込み及び良好な薬物動態を有する18F標識オクトレオテートを開発することを望んだ。著者らは、親油性を低下させ、結果として肝排出を減少させて逆に腎排出を助けるため、オクトレオテートを炭水化物基で修飾することを選択した。グルコース修飾オクトレオテート(Gluc−Lys−TOCA)を開発し、ペプチドのリシンを2−[18F]フルオロプロピオン酸4−ニトロフェニルエステルで標識した。Meisetschlager et al.(Journal of Nuclear Medicine 2006,47,566−573)により、最終生成物Gluc−Lys([18F]FP)−TOCAが患者において評価され、神経内分泌腫瘍の検出時に[111In]−DTPA−オクトレオチドより優れていることが判明した。しかし、[111In]−DTPA−オクトレオチドは腫瘍取込みの向上を示したものの、非常に長い合成時間(3時間)及び低い収率(20〜30%)のためにそれは日常的な臨床用途のために実用可能な選択肢でない(Meisetschlager,G.,et al.,Journal of Nuclear Medicine 2006,47,566−573)。Schottelius et al.(Clinical Cancer Research 2004,10,(11),3593−3606)はまた、2種の他の炭水化物類似体(Cel−S−Dpr−[Tyr3]オクトレオテート及びGluc−S−Dpr[Tyr3]オクトレオテート)を[18F]フルオロベンズアルデヒドで標識してオキシム誘導体化放射性トレーサーを得た。Cel−S−Dpr([18F]FBOA)−[Tyr3]オクトレオテートは、Gluc−Lys([18F]FP)−TOCAに比べて腫瘍取込みの向上を示すと共に、向上した収率(65〜85%)を有しながら短い合成時間(50分)を有していた。Gluc−S−Dpr[Tyr3]オクトレオテートを[18F]フルオロプロピオネート([18F]FP)及び[18F]フルオロベンズアルデヒド([18F]FBOA)で標識した。Gluc−S−Dpr([18F]FP)−[Tyr3]オクトレオテート標識類似体はGluc−Lys([18F]FP)−TOCAと同様な腫瘍取込みを示したが、高い腫瘍/器官比(血液、肝臓及び筋肉)も有していた。Gluc−S−Dpr([18F]FBOA)−[Tyr3]オクトレオテートはCel−S−Dpr([18F]FBOA)−[Tyr3]オクトレオテートと同等な腫瘍取込みを示したが、高い腫瘍/筋肉比を有していた。
最も最近に公表された18F標識オクトレオチド類似体は、[18F]フッ化アルミニウム−1,4,7−トリアザシクロノナン−1,4,7−三酢酸オクトレオチド([18F]AlF−NOTA−オクトレオチド)であった(Laverman,P.,et al.,Journal of Nuclear Medicine 51,(3),454−461)。[18F]フッ化アルミニウム標識方法を使用することの利点は、フッ素−18共沸乾燥段階が必要とされないことであり、これは総反応時間がより短いことを意味する。HPLCによれば、生成物は2種の異性体として観察され、[18F]AlFがNOTAキレート中に組み込まれたものは約50%に等しく、残部は非キレート化[18F]AlFであると述べられていた。著者らは、2種の異性体がHPLCによって分離できたとコメントしていた。再分析したところ、2種の異性体への再平衡化が見られた。これら2種の異性体の立体配座はこれまで確立されていない。
ペプチドのフッ素−18標識においては、以前はクリック化学が利用されていた(Li,Z.B.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2007,(18),1987−1994;Ramenda,T.,et al.,Chemical Communications 2009,48,7521−7523;Hausner et al.J.Med.Chem,2008,5901;Mamat et al.Mini−Rev.Org.Chem.2009,6,21)。反応は効率が良いので、陽電子放出断層撮影(PET)用の短寿命同位体(18Fの半減期109.7分)による放射性標識トレーサー及びリガンドの合成にそれを適用することができる(Glaser,M.,and Arstad,E.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993;Glaser,M.,et al.,Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals 2009,52,(9−10),407−414)。
Marik and Sutcliffe(Marik,J.,et al.,Tetrahedron Letters 2006,(47),6681−6684)は、末端アルキンをフッ素−18で標識すると共に、アジド部分を各種のペプチドに付加するアプローチを採用した。最初、CuSO4/アスコルビン酸Naを触媒系として使用したが、標識ペプチドは10%の収率でしか単離されなかった。CuSO4をCuIで置き換えると共にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を添加した場合に改善が認められた。Sirion et al.(Tetrahedron Letters 2007,48,3953−3957)は、CuIを使用すると微量の1,5−置換トリアゾール副生物が生じることを見出した。著者らは4種のメシレート前駆体、2種のアセチレン及び2種のアジドを合成し、tBuOHを溶媒として使用しながらこれらの全てを[18F]TBAFで標識した(Kim,D.W.,et al.,Journal of the American Chemical Society 2006,128,16394−16397)。
しかし当技術分野では、以前の標識類似体に比べて向上した腫瘍取込み及び薬物動態パラメーターを有する放射性標識オクトレオテートに対するニーズがなおも存在している。また、かかる放射性標識オクトレオテート類似体を製造するための効率的かつ効果的な方法に対するニーズも存在している。本発明は、以下に記載するように、これらのニーズに応えるものである。
本発明は、トリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
本発明は、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。本発明の化合物は、高い特異的結合と。高コントラストPETイメージングのための迅速な標的局在化及び迅速な薬物動態とを併せ持っている。
本発明は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の製造方法を提供する。
本発明は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を用いるイメージング方法を提供する。
本発明は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体及びその製造方法を提供する。
本発明は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の1種以上を、薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、インビトロ又はインビボでソマトスタチン受容体を検出する方法であって、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又はその医薬組成物を投与する段階を含んでなる方法を提供する。
本発明はさらに、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又はその医薬組成物を用いてインビトロ又はインビボでソマトスタチン受容体を検出する方法を提供する。
本発明は、次の式(I)のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
R1−LINKER−R2 (I)
式中、
R1は次式の基であり、
R1−LINKER−R2 (I)
式中、
R1は次式の基であり、
R2は次式の構造を有し、
本発明に従えば、レポーター部分Yの放射性同位体は、当技術分野で知られている任意のPET放射性同位体(例えば、18F、17Br、76Br、124I、11C、82Rb、68Ga、64Cu及び62Cu、好ましくは11C又は18F、最も好ましくは18F)であり得る。一実施形態では、放射性同位体は当技術分野で知られている任意のSPECT放射性同位体(例えば、123I、124I、131I)であり得る。放射性同位体は、レポーター部分Y中に直接組み込んでもよいし(例えば、−CH2CH2 18F又は−CH2CH2 11CH2F)、或いは当技術分野で知られている方法によってキレート化剤中に組み込んでもよい(例えば、国際公開第2006/067376号を参照されたい)。
本発明は、次の式(II)の2−フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
R1−LINKER−R2 (II)
式中、
R1は次式の基であり、
R1−LINKER−R2 (II)
式中、
R1は次式の基であり、
LINKER及びR2の各々は、式(I)に関して記載した通りである。
本発明は、次の式(III)の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
R1−LINKER−R2 (III)
式中、
R1は次式の基であり、
R1−LINKER−R2 (III)
式中、
R1は次式の基であり、
本発明は、それぞれ上記に記載したような式(I)、(II)及び/又は(III)のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供し、式中のR1及びR2の各々はそれぞれ式(I)、(II)及び(III)に関して記載した通りであり、LINKERはは−(ポリエチレングリコール)n−或いは次式の基である。
本発明の一実施形態では、それぞれ上記に記載したような式(I)、(II)及び(III)のR2化合物は次式の構造を有する。
R1は次式の基であり、
本発明は、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のFET−G−TOCA(3b)を提供する。
本発明は、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のFETE−TOCA(4b)を提供する。
本発明は、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のFET−βAG−TOCA(5b)を提供する。
本発明は、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のFET−βAG−[W−c−(CTFTYC)K](7b)を提供する。
本発明は、本明細書中に記載したような本発明のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又は2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の1種以上を、薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明は、本明細書中に記載したような本発明のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又は2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の1種以上を、哺乳動物への投与に適した薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。
当業者には理解される通り、薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーは、当技術分野で知られる任意の薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーであり得る。
「生体適合性キャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤー」は、医薬組成物が生理学的に認容され得るようにして(例えば、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして)本発明のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又は2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を懸濁又は溶解し得る任意の流体(特に液体)であり得る。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、(有利には注射用の最終生成物が等張性又は非低張性になるように平衡させ得る)食塩水のような水溶液、或いは1種以上の張度調整物質(例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩)、糖(例えば、グルコース又はスクロース)、糖アルコール(例えば、ソルビトール又はマンニトール)、グリコール(例えば、グリセロール)又は他の非イオン性ポリオール物質(例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど)の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。生体適合性キャリヤーはまた、エタノールのような生体適合性有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は配合物を可溶化するために有用である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用の生体適合性キャリヤーのpHは、好適には4.0〜10.5の範囲内にある。
本発明の医薬組成物は非経口的に(即ち、注射によって)投与でき、最も好ましくは水溶液である。かかる組成物は、緩衝剤、薬学的に許容される可溶化剤(例えば、シクロデキストリン或いはPluronic、Tween又はリン脂質のような界面活性剤)、薬学的に許容される安定剤又は酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、ゲンチシン酸又はp−アミノ安息香酸)のような追加成分を任意に含み得る。本発明の医薬組成物の製造方法はさらに、放射性標識化合物を含む医薬組成物を得るために必要な段階(例えば、有機溶媒の除去、生体適合性緩衝剤及び任意の追加成分の添加)を含むことができる。非経口投与のためには、本発明の医薬組成物が無菌性かつ非発熱原性であることを保証するための段階を採用することも必要である。かかる段階は当業者には公知である。
中間体
本発明は、次の式(IV)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
R1−LINKER−R2 (IV)
式中、
R1は次式の基であり、
本発明は、次の式(IV)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供する。
R1−LINKER−R2 (IV)
式中、
R1は次式の基であり、
本発明は、上記に記載したような式(IV)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を提供し、式中のR1及びR2の各々は式(IV)に関して記載した通りであり、LINKERはは−(ポリエチレングリコール)n−或いは次式の基である。
本発明の一実施形態では、上記に記載したような式(IV)のR2化合物は次式の構造を有する。
R1は次式の基であり、
本発明は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のG−TOCA(3a)を提供する。
本発明は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のE−TOCA(4a)を提供する。
本発明は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のβAG−TOCA(5a)を提供する。
本発明は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体である次式のβAG−[W−c−(CTFTYC)K](6a)を提供する。
本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体及び本発明のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、当技術分野で知られる方法(国際公開第2010/026388号(その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす))及び下記に例示される方法によって製造できる。
本明細書中に記載したようなPET放射性同位体(即ち、任意の陽電子放出放射性同位体)は、トリアゾール部分の形成前又は当技術分野で知られる任意の手段(例えば、国際公開第2010/026388号)によるトリアゾール部分の形成後において、式(I)、(II)又は(III)の化合物及び2−フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に導入することができる。SPECT放射性同位体は、同様にして、本明細書中にそれぞれ記載したような式(I)又は(II)の分子中に導入することができる。
本発明に従えば、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の製造方法は、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を銅触媒クリック化学条件下で2−[18F]フルオロエチルアジドと反応させることで、本明細書中にそれぞれ記載したような対応する2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を生成する段階を含んでいる。
本発明の一実施形態では、2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の合成は自動化される。[18F]放射性トレーサーは、自動放射合成装置の使用により、自動化方式で簡便に製造できる。かかる装置には、Tracerlab(商標)及びFASTlab(商標)(共にGE Healthcare Ltd製)をはじめとするいくつかの市販例が存在している。かかる装置は通常、放射化学を実施するための(しばしば使い捨ての)「カセット」を含んでいて、これは放射合成を実施するため装置に取り付けられる。カセットは、普通、流体通路、反応器、及び試薬バイアルを受け入れるためのポート並びに放射合成後の清掃段階で使用される任意の固相抽出カートリッジを含んでいる。
したがって本発明は、別の態様では、本明細書中に記載したようなPET放射性トレーサーの自動化合成のためのカセットであって、
(i)本明細書中に記載したようなアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を含む容器、
(ii)容器(iii)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体とクリック化学反応を行い得るアジド(例えば、MeCN、DMSO又はDMF中のトリルエチルアジド溶液)を含む容器、及び
(iii)前記容器(ii)の内容物を18Fの適当な供給源に添加する手段
を含んでなるカセットを提供する。
(i)本明細書中に記載したようなアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を含む容器、
(ii)容器(iii)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体とクリック化学反応を行い得るアジド(例えば、MeCN、DMSO又はDMF中のトリルエチルアジド溶液)を含む容器、及び
(iii)前記容器(ii)の内容物を18Fの適当な供給源に添加する手段
を含んでなるカセットを提供する。
本発明に従えば、本発明のカセットはさらに、下記の要素の1以上をを任意に含み得る。
(iv)QMAカートリッジ、
(v)K222、MeCN、水及び塩基(例えば、TBAHCO3、K2CO3、Cs2CO3)からなる、捕捉されたフッ素−18を遊離させるためのQMA溶離剤、
(vi)銅触媒(例えば、銅(I)触媒、硫酸銅水溶液)を含む容器、
(vii)アスコルビン酸Na(好ましくはpH5.0の酢酸ナトリウム緩衝液中のもの)を含む容器、
(viii)銅(I)安定化リガンド(例えば、BPDS)を含む容器、
(ix)HPLCシステムに導く管路、及び
(x)過剰の18Fを除去するためのイオン交換カートリッジ。
(iv)QMAカートリッジ、
(v)K222、MeCN、水及び塩基(例えば、TBAHCO3、K2CO3、Cs2CO3)からなる、捕捉されたフッ素−18を遊離させるためのQMA溶離剤、
(vi)銅触媒(例えば、銅(I)触媒、硫酸銅水溶液)を含む容器、
(vii)アスコルビン酸Na(好ましくはpH5.0の酢酸ナトリウム緩衝液中のもの)を含む容器、
(viii)銅(I)安定化リガンド(例えば、BPDS)を含む容器、
(ix)HPLCシステムに導く管路、及び
(x)過剰の18Fを除去するためのイオン交換カートリッジ。
試薬及び溶媒は、Sigma Aldrich Co.Ltd(ギリンガム、英国)及びVWR International Ltd(英国)から購入し、それ以上精製せずに使用した。BPDS(9)は、Pfaltz & Bauer Inc(ウォーターベリー、米国)から購入した。[18F]−AlF−NOTAは、Laverman P,et al,J Nucl Med,2010;51:454−461に従って合成した。[68Ga]−DOTATATEは、Covidien(UK)Commercial Ltd(ゴスポート、英国)から購入した。
MALDI−TOFは、The London School of PharmacyにおいてFinnigan Lasermat 2000計測器上で測定した。分析HPLCは、Beckman Gold計測器をKarat32ソフトウェア及びLauraソフトウェアと共に用いて実施した。放射性HPLCシステムは、γ線検出器(Bioscan Flow−count)を備えたBeckman System Gold計測器であった。分析HPLCのためには、Phenomenex Luna C18(2)カラム(50×4.6mm,3μm;流量:1mL/分)を使用した。ペプチドの最終精製のためには、半分取カラム(Phenomenex Luna C18,100×10mm,5μm,110A;流量:3mL/分)を使用した。分析HPLCのためには次の移動相系を使用した:溶媒A,水/TFA(0.1%);溶媒B,アセトニトリル/TFA(0.1%);15分で5〜80%溶媒ACN/0.1%TFAの直線勾配。非放射性化合物は、分取HPLC(Agilent 1200,カラム:Phenomenex Luna C18(2),75×30mm,5μm,流量:15mL/分)を用いて精製した。log D計算用の試料を分離するためには、MSE Micro Centaur遠心装置を使用し、Wallac 1282 Compugamma Universalガンマカウンターを用いてガンマカウントを実施し、EdenTerm v1.2ソフトウェアを用いて結果を記録した。[18F]フッ化物イオンは、濃縮[18O]H2Oターゲットの16.4MeVプロトン照射による18O(p,n)18F核反応を使用しながらサイクロトロン(PET Trace、GE Medical Systems社)によって製造した。
略語
ACN: アセトニトリル
DCM: ジクロロメタン
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc: 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HBTU: O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチ
ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt: 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMP: 1−メチル−2−ピロリジノン
PyBOP: (ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェート
SASRIN: 超酸感受性樹脂
TFA トリフルオロ酢酸
TIS: トリイソプロピルシラン
例1:[ 19 F]フルオロエチルトリアゾールペプチド標準の合成のための一般的方法
(a)銅粉末(20mg、−40メッシュ)を仕込んだホイートンバイアルに、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体(アルキン−ペプチド)(5mg)のDMF/H2O(1:1 v/v(60μL))溶液をを添加した。これに、[18F]フルオロエチルアジド(1.5eq、DMF中0.354M)(Glaser,M.,and Arstad,E.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993)を添加した。反応物を室温で30分間撹拌し続け、次いで0.1mLの20%MeCN/H2O/0.1%TFAで脱活した後、Agilent分取HPLCを用いた精製のために注入した。全ての類似体は、30分で20〜80%MeCN/H2O/0.1%TFAの勾配を用いて単離した。質量分析の結果を下記表1に要約して示す。
ACN: アセトニトリル
DCM: ジクロロメタン
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc: 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HBTU: O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチ
ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt: 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMP: 1−メチル−2−ピロリジノン
PyBOP: (ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェート
SASRIN: 超酸感受性樹脂
TFA トリフルオロ酢酸
TIS: トリイソプロピルシラン
例1:[ 19 F]フルオロエチルトリアゾールペプチド標準の合成のための一般的方法
(a)銅粉末(20mg、−40メッシュ)を仕込んだホイートンバイアルに、アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体(アルキン−ペプチド)(5mg)のDMF/H2O(1:1 v/v(60μL))溶液をを添加した。これに、[18F]フルオロエチルアジド(1.5eq、DMF中0.354M)(Glaser,M.,and Arstad,E.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993)を添加した。反応物を室温で30分間撹拌し続け、次いで0.1mLの20%MeCN/H2O/0.1%TFAで脱活した後、Agilent分取HPLCを用いた精製のために注入した。全ての類似体は、30分で20〜80%MeCN/H2O/0.1%TFAの勾配を用いて単離した。質量分析の結果を下記表1に要約して示す。
例2a:2−[ 18 F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr 3 ]オクトレオテート類似体の合成のための一般的方法
下記スキーム1に示すように、本発明の放射性標識[Tyr3]オクトレオテート類似体は、試薬2−[18F]フルオロエチルアジドを使用しながら銅触媒アジド−アルキン環付加反応(CuAAC)によってアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を標識して、1,4−置換トリアゾールを形成することで製造できる(即ち、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体)。試験した各アルキン類似体に関しては、CuAAC反応中に予想外の反応性変動が認められた。
下記スキーム1に示すように、本発明の放射性標識[Tyr3]オクトレオテート類似体は、試薬2−[18F]フルオロエチルアジドを使用しながら銅触媒アジド−アルキン環付加反応(CuAAC)によってアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を標識して、1,4−置換トリアゾールを形成することで製造できる(即ち、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体)。試験した各アルキン類似体に関しては、CuAAC反応中に予想外の反応性変動が認められた。
5種のアルキン官能化オクトレオテート類似体(図1)は、下記に記載するβAB−TOCA(5a)の合成と同様にして合成された。スクランブルドペプチド(6b)は、ソマトスタチン受容体に対して特異性を示さない陰性対照として設計された。オクトレオテートとアルキン官能基との間のリンカーは、ペプチドを補完しかつ合成を容易にするように選択された。2種の類似体は、ポリエチレングリコール基を含むように設計された((1a)及び(2a))。オクトレオテートアルキン(1a〜5a)及びスクランブルド類似体(6a)は、[18F]フルオロエチルアジド(8)を用いて標識された(スキーム1)。
例2b.1:βAB−TOCA(5a)の合成
2b.1.1:プロピノイル−β−Ala−OHの合成
2b.1.1:プロピノイル−β−Ala−OHの合成
プロピノイル−β−Ala−OHをACN/水/0.1%TFA(200mL)に溶解し、この溶液を0.1M NaOHでpH11に調整した。溶液を1時間撹拌し、次いで真空中で減容した。生成物精製のため、残留物(50mL)を分取HPLCカラム上に注入した。
精製及び特性決定
分取HPLC(勾配:60分で0%ACN/0.1%TFA)によって精製することで、260mg(3mmolの出発原料に基づいて61%)の純粋なプロピノイル−β−Ala−OHを得た。
分取HPLC(勾配:60分で0%ACN/0.1%TFA)によって精製することで、260mg(3mmolの出発原料に基づいて61%)の純粋なプロピノイル−β−Ala−OHを得た。
精製物質を分析LC−MSによって分析した(勾配:5分で0〜15%ACN/0.1%TFA、tR:0.29分、実測m/z:142.3、予測MH+:142.0)。
2b.1.2:固体担体上でのH−Gly−[Tyr 3 ]オクトレオテートのアセンブリ
標準的なペプチド合成法を用いて、ペプチド樹脂H−Gly−D−Phe−Cys(Trt)−Tyr(tBu)−D−Trp(Boc)−Lys(Boc)−Thr(tBu)−Cys(Trt)−Thr(tBu)−ポリマーをアセンブルした。0.25mmolのFmoc−Thr(tBu)−SASRIN樹脂から出発するFmoc化学を用いて、商業的に入手可能なCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成装置上でペプチジル樹脂H−Gly−D−Phe−Cys(Trt)−Tyr(tBu)−D−Trp(Boc)−Lys(Boc)−Thr(tBu)−Cys(Trt)−Thr(tBu)−ポリマーをアセンブルした。各カップリング段階(80℃で5分)では、インサイチュ活性化のために0.9mmol HBTU/0.9mmol HOBt/2.0mmol DIPEAを使用しながら1.0mmolのアミノ酸を適用した。Fmocは、樹脂をNMP中の20%ピペリジン溶液で処理することで除去した。
標準的なペプチド合成法を用いて、ペプチド樹脂H−Gly−D−Phe−Cys(Trt)−Tyr(tBu)−D−Trp(Boc)−Lys(Boc)−Thr(tBu)−Cys(Trt)−Thr(tBu)−ポリマーをアセンブルした。0.25mmolのFmoc−Thr(tBu)−SASRIN樹脂から出発するFmoc化学を用いて、商業的に入手可能なCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成装置上でペプチジル樹脂H−Gly−D−Phe−Cys(Trt)−Tyr(tBu)−D−Trp(Boc)−Lys(Boc)−Thr(tBu)−Cys(Trt)−Thr(tBu)−ポリマーをアセンブルした。各カップリング段階(80℃で5分)では、インサイチュ活性化のために0.9mmol HBTU/0.9mmol HOBt/2.0mmol DIPEAを使用しながら1.0mmolのアミノ酸を適用した。Fmocは、樹脂をNMP中の20%ピペリジン溶液で処理することで除去した。
2b.1.3:プロピノイル−β−Ala−Gly−[Tyr
3
]オクトレオテート(す即ち、βAB−TOCA(5a))の合成
2.5%のTIS及び2.5%の水を含むTFA(100mL)中で、側鎖保護基の同時除去及び樹脂からのペプチドの切断を90分間実施した。樹脂を濾過によって除去し、TFAで洗浄し、合わせた濾液を真空中で蒸発させた。残留物にジエチルエーテルを添加し、生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。乾燥した沈殿を50%ACN/水に溶解し、残留するTrp保護基を除去するために一晩放置した。次いで溶液を凍結乾燥することで、294mg(96%)の祖プロピノイル−β−Ala−Gly−D−Phe−Cys−Tyr−D−Trp−Lys−Thr−Cys−Thr−OHを得た。
ACN/水/0.1%TFA(300mL)に溶解した祖プロピノイル−β−Ala−Gly−D−Phe−Cys−Tyr−D−Trp−Lys−Thr−Cys−Thr−OH(294mg)に、ACN(0.75mL)に溶解した2,2'−ジチオジピリジン(0.27mmol、59mg)を3等分して添加し、溶液を30分間振盪した。生成物精製のため、反応混合物を分取HPLCカラム上に装填した。
精製及び特性決定
分取HPLC(勾配:60分で20〜40%ACN/0.1%TFA)によって精製することで、140mg(48%)の純粋なプロピノイル−β−Ala−Gly−[Tyr3]オクトレオテートを得た。
分取HPLC(勾配:60分で20〜40%ACN/0.1%TFA)によって精製することで、140mg(48%)の純粋なプロピノイル−β−Ala−Gly−[Tyr3]オクトレオテートを得た。
精製物質を分析LC−MSによって分析した(勾配:5分で20〜30%ACN/0.1%TFA、tR:2.49分、実測m/z:1229.5、予測MH+:1229.5)。
放射化学
例3:2−[ 18 F]フルオロエチルアジド(8)の製造
8を合成するために使用した方法は、Glaser et al.(Glaser,M.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993;Demko,Z.P.,et al.,Angewandte Chemie−International Edition 2002,41,(12),2113−2116)によって使用されたものを僅かに変更したものであった。[18F]フッ化物イオン乾燥段階においてK2CO3の代わりにKHCO3を使用することは、温和な塩基の使用による前駆体7の安全性のため、蒸留による精製後により一貫した単離収率を与えた。
例3:2−[ 18 F]フルオロエチルアジド(8)の製造
8を合成するために使用した方法は、Glaser et al.(Glaser,M.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993;Demko,Z.P.,et al.,Angewandte Chemie−International Edition 2002,41,(12),2113−2116)によって使用されたものを僅かに変更したものであった。[18F]フッ化物イオン乾燥段階においてK2CO3の代わりにKHCO3を使用することは、温和な塩基の使用による前駆体7の安全性のため、蒸留による精製後により一貫した単離収率を与えた。
Kryptofix 222(5mg、13.3μmol)、炭酸水素カリウム(100μL水中の1.4mg、16.7μmol)及びアセトニトリル(0.5mL)の混合物に、水(0.1〜1mL)中の[18F-]フッ化物イオン(5〜15mCi)を添加した。窒素流(100mL/分)下において100℃で加熱することで溶媒を除去した。その後、アセトニトリル(0.5mL)を添加し、蒸留を続けた。この操作をさらに2回繰り返した。室温に冷却した後、無水アセトニトリル(0.2mL)中のアジドエチル−4−トルエンスルホン酸(7)(Glaser,M.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993;Demko,Z.P.,et al.,Angewandte Chemie−International Edition 2002,41,(12),2113−2116)の溶液を添加した。反応混合物を80℃で15分間撹拌した。[18F]8を130℃で、アセトニトリル(30μL)を含むトラッピングバイアル中に蒸留した(Arstad,E.,国際公開第2008/015391号)。化合物[18F]8は、50〜55%(崩壊補正)の放射化学収率で収集された。
続いてインビボ試験で使用する試料をクリック化学によって製造するための2−[18F]フルオロエチルアジドの生成は、Hammersmith Imanet社で組み立てた遠隔制御装置上で実施した。このシステムは、出発放射能として約200〜300mCiの[18F]フッ化物イオンを使用することを可能にする。このシステムを用いた単離[18F]フルオロエチルアジドの放射化学収率(崩壊補正)は、19〜26%の範囲内にある。しかし、2−[18F]フルオロエチルアジドの生成は、当技術分野で知られる他の手段(Glaser,M.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2007,18,(3),989−993;Demko,Z.P.,et al.,Angewandte Chemie−International Edition 2002,41,(12),2113−2116;国際公開第2008/015391号)によっても達成できる。
例4:一般的な標識方法
アルキン1a、2a及び4aに関しては、水(25μL)中の硫酸銅(II)五水和物(4eq)の溶液に、25μLの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0、250mM)中のL−アスコルビン酸ナトリウム(4.4eq)をN2下で添加し、次いで25μL中のBPDS(9)(5eq)を添加した。アルキン3a及び5aに関しては、CuSO4(2eq)、アスコルビン酸Na(2.2eq)及びBPDS(9)(4eq)を使用した。
アルキン1a、2a及び4aに関しては、水(25μL)中の硫酸銅(II)五水和物(4eq)の溶液に、25μLの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0、250mM)中のL−アスコルビン酸ナトリウム(4.4eq)をN2下で添加し、次いで25μL中のBPDS(9)(5eq)を添加した。アルキン3a及び5aに関しては、CuSO4(2eq)、アスコルビン酸Na(2.2eq)及びBPDS(9)(4eq)を使用した。
MeCN(100μL)中の[18F]8溶液、次いでDMF(30μL)中のアルキン(2mg)を添加し、室温で反応を実施した(最適反応時間に関しては表2を参照されたい)。次いで、反応物をH2O/0.1%TFA(100μL)で希釈し、表2に示す勾配を用いた逆相分取HPLCによって精製した。次いで、HPLC画分をH2O(15〜19mL)で希釈し、tC18 light SPEカートリッジ上に装填した。生成物をエタノールで100μLずつの画分に溶出し、>98%のRCPを有する10%エタノール/PBS緩衝液(pH7.0)の溶液に調製した。
振盪フラスコ法を用いてオクタノール/PBS分配係数を測定した。両溶媒を一緒に5分間振盪することで互いに予備飽和させた。500μLのオクタノール及びPBSの溶液に、20μLのEtOH中放射性標識リガンドを添加した(n=3)。溶液混合物をロータミキサー内で5分間振盪した。平衡化の後、良好な分離を達成するために混合物を(13000rpmで10分間)遠心した。各層からの試料(25μL)を採取し、γカウンターで測定し、次式に従ってLog Dを算出した。
Log D=log(オクタノール層中のcpm/水性層中のcpm)
Log D値は、18F標識トリアゾールを用いて測定した。予想された通り、類似体1b及び2bに関するLog D値はPEG化のために最低であり、最高のLog D値を有する類似体は4bであった(表3)。[ 19 F]1b〜6bに関する受容体親和性は、標識放射性トレーサーとして[111In]−OctreoScanを使用するAR42J腫瘍細胞での競合結合アッセイによって測定した。半最大阻害濃度(IC50)値を算出し、置換曲線の結果を要約して示す(表3)。参照ペプチドとして、オクトレオチドに関するIC50値を測定したところ、14.7±7.7nMであることが判明した。オクトレオテート類似体に関するIC50値はオクトレオチドと同等又はそれより低いことが判明し、これはソマトスタチン受容体に対する高い結合親和性を表している。全てが該受容体に対してナノモル濃度範囲内の高い結合親和性を示している。フルオロエチルトリアゾール部分の導入は[ 19 F]2b、3b、4b及び5bに関する親和性を低下させたが。有意ではなく、値はなおもオクトレオチドより低いか又はそれと同等であった。この試験では、化合物[ 19 F]5bは1.6±0.2nMのIC50値を有する最高の親和性を示した。6個の連続したエチレングリコール基の追加によるペプチドのPEG化は、[ 19 F]1b及び[ 19 F]2bの総合親和性に顕著な影響を及ぼすようには思われず、それぞれ2.9±1.3nM及び13.2±7.8nMのIC50値を与えた。それに比べて、スクランブルドアミノ酸配列を含む[ 19 F]6bは低い親和性を示し、>10mMのIC50値を与えた。この結果は、本発明の類似体がソマトスタチン受容体に対して特異的に結合していることを示した。
Log D値は、18F標識トリアゾールを用いて測定した。予想された通り、類似体1b及び2bに関するLog D値はPEG化のために最低であり、最高のLog D値を有する類似体は4bであった(表3)。[ 19 F]1b〜6bに関する受容体親和性は、標識放射性トレーサーとして[111In]−OctreoScanを使用するAR42J腫瘍細胞での競合結合アッセイによって測定した。半最大阻害濃度(IC50)値を算出し、置換曲線の結果を要約して示す(表3)。参照ペプチドとして、オクトレオチドに関するIC50値を測定したところ、14.7±7.7nMであることが判明した。オクトレオテート類似体に関するIC50値はオクトレオチドと同等又はそれより低いことが判明し、これはソマトスタチン受容体に対する高い結合親和性を表している。全てが該受容体に対してナノモル濃度範囲内の高い結合親和性を示している。フルオロエチルトリアゾール部分の導入は[ 19 F]2b、3b、4b及び5bに関する親和性を低下させたが。有意ではなく、値はなおもオクトレオチドより低いか又はそれと同等であった。この試験では、化合物[ 19 F]5bは1.6±0.2nMのIC50値を有する最高の親和性を示した。6個の連続したエチレングリコール基の追加によるペプチドのPEG化は、[ 19 F]1b及び[ 19 F]2bの総合親和性に顕著な影響を及ぼすようには思われず、それぞれ2.9±1.3nM及び13.2±7.8nMのIC50値を与えた。それに比べて、スクランブルドアミノ酸配列を含む[ 19 F]6bは低い親和性を示し、>10mMのIC50値を与えた。この結果は、本発明の類似体がソマトスタチン受容体に対して特異的に結合していることを示した。
[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体( 19 F−1b〜6b)及びアルキン−オクトレオテート類似体(1a〜6a)の結合親和性を測定するため、Hofland及び共同研究者ら(Hofland,L.J.,et al.,Endocrinology 1995,136,(9),3698−706)によって以前に報告された方法のの変法を用いてインビトロアッセイを行った。AR42J細胞(5×104個)を24ウェルプレートに播種し、PBSで2回洗浄し、増加する濃度(0,0.01、0.1、1、1.0、10、100、1000及び10000nM)の分析すべき化合物と共に室温で10分間インキュベートしたが、これはこれらの実験条件下で結合が起こるのに十分な時間であった(Scemama,J.L.,et al.,Gut 1987,28 Suppl,233−6)。次いで、プレートを[111In]−OctreoScan(Covidien社(ゴスポート、英国)、50000cpm/ウェル)と共にさらに30分間インキュベートした。ウェル当たり0.25mLの最終容量のインキュベーション緩衝液を使用した。インキュベーション緩衝液は、10mM HEPES、5.0mM MgSO4・6H2O、1.0mMバシトラシン及び1%BSAからなり、最終pHは7.4に調整した。インキュベーションの終了後、プレートを氷冷インキュベーション緩衝液で3回洗浄し、0.2N NaOH溶液で可溶化した。次いで、各ウェルの内容物を計数管に移し、ガンマカウンター(Biosoft社、ファーガソン、米国ミズーリ州)を用いて試料をカウントした。各濃度について四重反復試験を実施し、実験を3回繰り返した。結果は対照(標識[111In]−OctreoScanのみで処理した最初の4つのウェル)に対する百分率として表される。IC50値は、Windows用GraphPad Prismソフトウェア(version 4.00)(GraphPad Software,Inc)を用いて当てはめたS字状置換曲線から算出した。
例7:触媒としての銅線の使用
代わりの触媒銅(I)源としての銅線の使用を検討した。CuSO4/アスコルビン酸Na法を用いた場合に他の類似体に比べて向上した反応性を有することから、実験は3aを用いて実施した。銅線とアルキンとを予め混合してから加熱した後に8を添加すれば、反応は5分以内に完了することが判明した(表4、項目2)。2種の成分を予め混合しないと、クリック反応は完了するまでにより長い時間を要した(表4、項目1)。他のpH緩衝液系(表4、項目4、5及び6)も適用したが、いずれも酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0、250mM)(表4、項目1)より劣ることが判明した。銅線を用いた反応物にCuSO4及びBPDS(9)を添加したが、このアプローチの背後にある根拠は、添加したCuSO4が利用可能なCu(II)の濃度を高めることでコンプロポーショネーション反応を向上させるであろうというものであった(Gopin,A.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2006,17,1432−1440;Bonnet,D.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2006,17,1618−1623)。前述したリガンド(9)は、Cu(II)化学種を安定化するために添加した。この方策はうまく働き、室温での収率の向上を示した(表4、項目7)。これがタンデム効果であるか否かを確認するため、両方の追加試薬を別々に試験するための反応を実施した(表4、項目7及び8)。両試薬は速度にある程度の影響を及ぼすが、一緒に使用すれば反応速度に一層大きい影響を与えるように思われる。代替リガンドとしてMonoPhos(商標)(Campbell−Verduyn,L.S.,et al.,Chemical Communications 2009,(16),2139−2141)を試験したが、反応については効率が低いことが判明した(表4、項目10)。
代わりの触媒銅(I)源としての銅線の使用を検討した。CuSO4/アスコルビン酸Na法を用いた場合に他の類似体に比べて向上した反応性を有することから、実験は3aを用いて実施した。銅線とアルキンとを予め混合してから加熱した後に8を添加すれば、反応は5分以内に完了することが判明した(表4、項目2)。2種の成分を予め混合しないと、クリック反応は完了するまでにより長い時間を要した(表4、項目1)。他のpH緩衝液系(表4、項目4、5及び6)も適用したが、いずれも酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0、250mM)(表4、項目1)より劣ることが判明した。銅線を用いた反応物にCuSO4及びBPDS(9)を添加したが、このアプローチの背後にある根拠は、添加したCuSO4が利用可能なCu(II)の濃度を高めることでコンプロポーショネーション反応を向上させるであろうというものであった(Gopin,A.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2006,17,1432−1440;Bonnet,D.,et al.,Bioconjugate Chemistry 2006,17,1618−1623)。前述したリガンド(9)は、Cu(II)化学種を安定化するために添加した。この方策はうまく働き、室温での収率の向上を示した(表4、項目7)。これがタンデム効果であるか否かを確認するため、両方の追加試薬を別々に試験するための反応を実施した(表4、項目7及び8)。両試薬は速度にある程度の影響を及ぼすが、一緒に使用すれば反応速度に一層大きい影響を与えるように思われる。代替リガンドとしてMonoPhos(商標)(Campbell−Verduyn,L.S.,et al.,Chemical Communications 2009,(16),2139−2141)を試験したが、反応については効率が低いことが判明した(表4、項目10)。
アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体G−TOCA(3a)及びβAG−TOCA(5a)は、クリック反応において高い反応性を有し、温和な条件及び短い合成時間(20℃で5分)で2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体FET−G−TOCA(3b)及びFET−βAG−TOCA(5b)への完全な転化を示すことが確認された。合成の容易性ばかりでなく、インビトロでの膵臓腫瘍AR42J細胞への結合は、FET−G−TOCA(3b)及びFET−βAG−TOCA(5b)の両方がそれぞれ4.0±1.4nM及び1.6±0.2nMのIC50というソマトスタチン受容体に対する高い親和性を有することを示した。
アルキン−ペプチド1a〜5aに関して認められたクリック反応速度の変動は、ペプチド部分には変化がないので、リンカーの違いに帰因させることができる。末端アルキン中心に隣接する基の電子的性質は、反応速度を増大させたり低下させたりしないと考えられる(Hein,J.E.,et al.,Chemical Society Reviews 2010,(39),1302−1315)。これとは逆に、アミド部分で直接に置換された末端アルキン(1a、3a、5a、6a(図1))は、エチル結合アミドで直接に置換されたもの(2a及び4a(図1))に比べて向上した反応性を有することがこのたび見出された。同様な結果は、1,3−ヒュスゲン(Huisgen)環付加反応の研究中にLi et al.(Tetrahedron Letters 2004,45,3143−3146)によって見出され、別にCuAACの速度に対するアジド部分周囲の電子求引基及び立体障害の効果を研究したGolas et al.(Macromolecular Rapid Communications 2008,29,1167−1171)によっても見出された。アルキンの電子的性質と共に考慮に入れるべき別の要因は、アルキン−ペプチドのサイズである。運動論的には、アルキン−ペプチドが大きいほど反応速度が遅くなると予想され、これはPEG化類似体(1a、2a)の場合に正しいことが判明した。1aは3a及び5aより遅く反応することがわかる(表5、条件B)。電子的には、これらは同様であり、全てが直接に結合したアミドで置換された末端アルキンであるが、1aは6個の連続したエチレングリコール基を含んでいる。PEG鎖がバルキーな水雲によって包囲され、これがアルキンの官能性を立体的に妨害する可能性がある(Shiffman,M.L.,Current Hepatitis Reports 2003,2,17−23)。アルキン2a及び4aは同じ点に関して比較可能であり(PEG化対非PEG化)、2aはCuAACに際してより遅い反応速度を示すことが認められた。クリック反応に際して1a及び2aを用いて見出された遅い反応速度及び変動のため、試薬の濃度を増加させることが必要であった。再現性及び反応速度の点で改善が見られた(条件D、表5)。類似体1b〜6bを単離することで、90〜120分後に(出発フッ化物イオン放射能に基づいて)3〜7%の非崩壊補正収率を得た。高い反応温度を用いると反応速度は増大して反応時間が減少したが、これは顕著な副生物生成をもたらし、精製を一層困難にした(表5、条件C)。
類似体1a〜6aを用いたクリック反応に際して見出された一般的傾向として、HPLCモニタリング時に2種の安定な副生物が見られた。2種の副生物11及び12(スキーム2、図1A)は、5a(図1)を用いた反応媒質から単離された。これらを分離し、回収し、衝突誘起解離質量分析法(CID−MS)によって分析した。極性がより高い化合物12は、CID−MS分析に際してアルキン前駆体(5a)であると解明された。このような事実が判明したものの、反応混合物を5aと混合してクロマトグラフィーで評価した場合、副生物12はHPLCトレース上で共溶出しなかった。2−[18F]フルオロエチルアジド(8)の不完全な組込みを示す反応は、12の存在下でもそれ以上は顕著に進行しないことが判明し、これはCuAAC反応におけるこの化学種の不十分な反応性を示唆している。副生物11を分析したところ、1−ビニルトリアゾール(スキーム2)に一致することが判明した。
CuSO4/アスコルビン酸Naを用いて実施された実験は、一般にpH6.0の酢酸ナトリウム緩衝液(AB)を用いて行った。3aを用いた実験を蒸留水中で実施した場合、放射性標識生成物への転化は遅く、緩衝系を用いた場合の>98%の転化率に比べて5分で78%の転化率を示した。
8の蒸留が回避されるワンポット反応を実施した。2a及び3aを用いて反応を試みたが、恐らくは競合する副反応のため、いずれも遅い反応速度を示した。反応速度に影響を与え得る別の変量は、2−[18F]フルオロエチルアジドの容量である。2a及び50μlの2−[18F]フルオロエチルアジド(8)と共に条件B(表5)を用いて実施された反応は、30分後に3bへの84%の転化率を与えた。同じ条件下で1400μlの8を使用した場合、いかなる反応も認められなかった(表5)。
Cu(I)安定化リガンド(Gill,H.S.,et al.,Journal of Medicinal Chemistry 2009,52,5816−5825)であるBPDSリガンド(9)を用いると、クリック反応の速度が大幅に増大することが見出された。いかなるリガンドも使用せずに反応を評価した。9なしで4aを用いて実施された反応(表5、条件A)は所望生成物への14%の転化率を示したが、9を添加すると(条件B)47%の転化率を与えた。同じ試薬濃度を使用しながら反応物を80℃に加熱すると、5分後に4bへの>98%の転化率が得られた(表5、条件C)。この温度における生成物への転化率は優れていたものの、副生物の増加が認められ、その一部は4bと共溶出した。
例8:インビトロ結合アッセイ
対照の低親和性受容体サブタイプとしてのsstr−3及びsstr−4と比較した、ソマトスタチン受容体サブタイプsstr−2に対する本発明の2−[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体の親和性を、フルオロメトリックイメージングプレートリーダー(FLIPR)を用いて決定した。本アッセイは、カルシウム色素をプレロードしたsstr−2、3又は4発現Chem−1細胞(Millipore社、セントチャールズ、米国ミズーリ州)において、カルシウムフラックスの[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート誘起活性化を測定することを含んでいる。簡単に述べれば、特異的sstrサブタイプを発現するChem−1細胞を50000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、5%CO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。細胞をFluo−8−No−Washで洗浄し、5%CO2インキュベーター内においてGPCRProfiler(商標)アッセイ緩衝液(Millipore社)中のCa2+色素を30℃で90分間ロードした。本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート又はソマトスタチン(Sigma社、陽性対照)を様々な濃度で添加した後、蛍光測定を行った。本アッセイはアゴニストモードにおいて二重反復試験で実施した。アゴニスト活性を有していたので、アンタゴニスト活性は評価しなかった。蛍光出力を測定し、データを基線補正後に%最大蛍光信号として表した。各種のリガンドに関する半最大受容体活性を、Windows用GraphPad Prism version 4.00)(GraphPad Software社、サンディエゴ、米国カリフォルニア州)を用いたS字状用量応答曲線当てはめによって推定した。
対照の低親和性受容体サブタイプとしてのsstr−3及びsstr−4と比較した、ソマトスタチン受容体サブタイプsstr−2に対する本発明の2−[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体の親和性を、フルオロメトリックイメージングプレートリーダー(FLIPR)を用いて決定した。本アッセイは、カルシウム色素をプレロードしたsstr−2、3又は4発現Chem−1細胞(Millipore社、セントチャールズ、米国ミズーリ州)において、カルシウムフラックスの[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート誘起活性化を測定することを含んでいる。簡単に述べれば、特異的sstrサブタイプを発現するChem−1細胞を50000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、5%CO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。細胞をFluo−8−No−Washで洗浄し、5%CO2インキュベーター内においてGPCRProfiler(商標)アッセイ緩衝液(Millipore社)中のCa2+色素を30℃で90分間ロードした。本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート又はソマトスタチン(Sigma社、陽性対照)を様々な濃度で添加した後、蛍光測定を行った。本アッセイはアゴニストモードにおいて二重反復試験で実施した。アゴニスト活性を有していたので、アンタゴニスト活性は評価しなかった。蛍光出力を測定し、データを基線補正後に%最大蛍光信号として表した。各種のリガンドに関する半最大受容体活性を、Windows用GraphPad Prism version 4.00)(GraphPad Software社、サンディエゴ、米国カリフォルニア州)を用いたS字状用量応答曲線当てはめによって推定した。
例9:動物及び腫瘍モデル
6〜8週齢の雌BALB/c nu/nu無胸腺マウスを、Harlan United Kingdom Ltd(ビセスター、英国)から入手した。高sstr−2膵臓腫瘍細胞株AR42J(Taylor J.E.,et al.,1994;15:1229−1236)及び低sstr−2ヒト結腸癌細胞株HCT116(LGC Standards社、ミドルセックス、英国)をそれぞれ、10%(v/v)ウシ胎児血清、2mmol/L L−グルカミン、100単位/mLペニシリン及び100g/mLストレプトマイシンを含むF12K及びRPM1640増殖培地中で培養し、5%CO2インキュベーター内において37℃で増殖させた。1×106細胞を含む100μlのPBSの皮下注射によって腫瘍を確立した。全ての動物実験は、動物の手術(科学操作)に関する英国ホームオフィスガイダンス法1986に従い、かつ癌研究における動物の福利に関して英国国立癌研究所委員会が制定した指針(Workman,P.,et al.,Br J Cancer.2010;102:1555−1577)の範囲内で、許可された研究者達によって実行された。カリパスを用いて腫瘍の寸法を連続的に測定し、式:体積=(π/6)×a×b×c(式中、a、b及びcは腫瘍の3つの直交軸を表す。)によって腫瘍体積を算出した。マウスは腫瘍が約200mm3に達した時点で使用した。
6〜8週齢の雌BALB/c nu/nu無胸腺マウスを、Harlan United Kingdom Ltd(ビセスター、英国)から入手した。高sstr−2膵臓腫瘍細胞株AR42J(Taylor J.E.,et al.,1994;15:1229−1236)及び低sstr−2ヒト結腸癌細胞株HCT116(LGC Standards社、ミドルセックス、英国)をそれぞれ、10%(v/v)ウシ胎児血清、2mmol/L L−グルカミン、100単位/mLペニシリン及び100g/mLストレプトマイシンを含むF12K及びRPM1640増殖培地中で培養し、5%CO2インキュベーター内において37℃で増殖させた。1×106細胞を含む100μlのPBSの皮下注射によって腫瘍を確立した。全ての動物実験は、動物の手術(科学操作)に関する英国ホームオフィスガイダンス法1986に従い、かつ癌研究における動物の福利に関して英国国立癌研究所委員会が制定した指針(Workman,P.,et al.,Br J Cancer.2010;102:1555−1577)の範囲内で、許可された研究者達によって実行された。カリパスを用いて腫瘍の寸法を連続的に測定し、式:体積=(π/6)×a×b×c(式中、a、b及びcは腫瘍の3つの直交軸を表す。)によって腫瘍体積を算出した。マウスは腫瘍が約200mm3に達した時点で使用した。
例10:FET−βAG−TOCAのインビボ血漿安定性
FET−βAG−TOCA(約3.7MBq)を尾静脈から非腫瘍担持BALB/c nu/nuマウスに注射した。注射から30分後に全身イソフルオラン麻酔下で血液を採取し、血漿試料を調製し、直ちに氷上で凍結した。分析のためには、使用の直前に試料を融解し、4℃で保存した。血漿(約0.2mL)を氷冷メタノール(1.5mL)の添加によって清澄化し、次いで混合物を遠心した(3分、20000×g、4℃)。上澄みを、回転蒸発器(Heidolph Instruments GMBH & Co、シュヴァバッハ、ドイツ)を35℃の浴温度で用いて蒸発乾固した。残留物をHPLC移動相(1.2mL)中に再懸濁し、清澄化し(0.2μmフィルター)、1mL試料ループを通して試料(1mL)をHPLC上に注入した。試料を、γ−RAM Model 3γ線検出器(IN/US Systems Inc.、米国フロリダ州)及びLaura 3ソフトウェア(Lablogic社、シェフィールド、英国)及びUV(254nm)を備えたAgilent 1100シリーズHPLCシステム(Agilent Technologies社、ストックポート、英国)上での放射性HPLCによって分析した。Waters μBondapak C18逆相カラム(300mm×7.8mm)固定相を、67%水(0.1%TFA)/33%アセトニトリル(0.1%TFA)からなる移動相を3mL/分でイソクラティックに送入することで溶出した。
FET−βAG−TOCA(約3.7MBq)を尾静脈から非腫瘍担持BALB/c nu/nuマウスに注射した。注射から30分後に全身イソフルオラン麻酔下で血液を採取し、血漿試料を調製し、直ちに氷上で凍結した。分析のためには、使用の直前に試料を融解し、4℃で保存した。血漿(約0.2mL)を氷冷メタノール(1.5mL)の添加によって清澄化し、次いで混合物を遠心した(3分、20000×g、4℃)。上澄みを、回転蒸発器(Heidolph Instruments GMBH & Co、シュヴァバッハ、ドイツ)を35℃の浴温度で用いて蒸発乾固した。残留物をHPLC移動相(1.2mL)中に再懸濁し、清澄化し(0.2μmフィルター)、1mL試料ループを通して試料(1mL)をHPLC上に注入した。試料を、γ−RAM Model 3γ線検出器(IN/US Systems Inc.、米国フロリダ州)及びLaura 3ソフトウェア(Lablogic社、シェフィールド、英国)及びUV(254nm)を備えたAgilent 1100シリーズHPLCシステム(Agilent Technologies社、ストックポート、英国)上での放射性HPLCによって分析した。Waters μBondapak C18逆相カラム(300mm×7.8mm)固定相を、67%水(0.1%TFA)/33%アセトニトリル(0.1%TFA)からなる移動相を3mL/分でイソクラティックに送入することで溶出した。
例11:PETイメージング試験
専用の小動物PETスキャナー(Siemens Inveon PET module、Siemens Molecular Imaging Inc、英国)上で動的PETイメージングスキャンを実施した(Workman,P.,et al.,Br J Cancer.2010;102:1555−1577;Leyton,J.,et al.,Cancer Res.2006;66:7621−7629)。簡単に述べれば、全身麻酔(イソフルオラン)下で尾静脈にカニューレを挿入した。動物をスキャナー内のサーモスタット制御環境中に置き、試験期間を通じて心拍数をモニターした。マウスに3.0〜3.7MBqの様々な放射性標識化合物を注射し、動的PET−CTスキャンを60分間にわたってリストモードフォーマットで取得した。FET−βAG−TOCAの場合には、ブロッキング試験も行った。それによれば、10mg/kgの非標識オクトレオチド(Sigma社)をマウスに静脈内注射してから10分後に放射性トレーサー注射及びイメージングを開始した。このオクトレオチド用量は、放射性トレーサー注射液中の非標識FET−βAG−TOCAの等価用量の約100倍であった。全ての場合における取得データを、画像再構成のため、0.5mmシノグラムビン及び19の時間枠(0.5×0.5×0.5mmボクセル、4×15秒、4×60秒及び11×300秒)内にソートした。得られた画像データセットを、Siemens Inveon Research Workplaceソフトウェアを用いて可視化及び定量化した。5つの隣接した腫瘍、肝臓、腎臓、筋肉及び尿/膀胱領域(それぞれ厚さ0.5mm)上に三次元の検査対象領域(3D ROI)を手作業で定義した。データを19の時点の各々において組織に関して平均することで、時間放射能曲線(TAC)を得た。各組織に関する放射性トレーサー取込みを注射量に対して基準化し、組織1mL当たりのパーセント注射放射能(%ID/mL)として表した。
専用の小動物PETスキャナー(Siemens Inveon PET module、Siemens Molecular Imaging Inc、英国)上で動的PETイメージングスキャンを実施した(Workman,P.,et al.,Br J Cancer.2010;102:1555−1577;Leyton,J.,et al.,Cancer Res.2006;66:7621−7629)。簡単に述べれば、全身麻酔(イソフルオラン)下で尾静脈にカニューレを挿入した。動物をスキャナー内のサーモスタット制御環境中に置き、試験期間を通じて心拍数をモニターした。マウスに3.0〜3.7MBqの様々な放射性標識化合物を注射し、動的PET−CTスキャンを60分間にわたってリストモードフォーマットで取得した。FET−βAG−TOCAの場合には、ブロッキング試験も行った。それによれば、10mg/kgの非標識オクトレオチド(Sigma社)をマウスに静脈内注射してから10分後に放射性トレーサー注射及びイメージングを開始した。このオクトレオチド用量は、放射性トレーサー注射液中の非標識FET−βAG−TOCAの等価用量の約100倍であった。全ての場合における取得データを、画像再構成のため、0.5mmシノグラムビン及び19の時間枠(0.5×0.5×0.5mmボクセル、4×15秒、4×60秒及び11×300秒)内にソートした。得られた画像データセットを、Siemens Inveon Research Workplaceソフトウェアを用いて可視化及び定量化した。5つの隣接した腫瘍、肝臓、腎臓、筋肉及び尿/膀胱領域(それぞれ厚さ0.5mm)上に三次元の検査対象領域(3D ROI)を手作業で定義した。データを19の時点の各々において組織に関して平均することで、時間放射能曲線(TAC)を得た。各組織に関する放射性トレーサー取込みを注射量に対して基準化し、組織1mL当たりのパーセント注射放射能(%ID/mL)として表した。
例12:組織放射能の直接カウンティング
60分のPETスキャン後、全身イソフルオラン麻酔下で心臓穿刺によって放血した後にマウスから腫瘍組織の一部を採取した。全ての試料を秤量し、崩壊補正を適用するCobra IIオートガンマカウンター(以前はPackard Instruments Meriden CT USA)を用いてその放射能を直接に測定した。結果は1グラム当たりの注射量の百分率(%ID/g)として表した。
60分のPETスキャン後、全身イソフルオラン麻酔下で心臓穿刺によって放血した後にマウスから腫瘍組織の一部を採取した。全ての試料を秤量し、崩壊補正を適用するCobra IIオートガンマカウンター(以前はPackard Instruments Meriden CT USA)を用いてその放射能を直接に測定した。結果は1グラム当たりの注射量の百分率(%ID/g)として表した。
例13:統計
ソフトウェアGraphPad Prism,version 4.00(GraphPad社、サンディエゴ、米国カリフォルニア州)を用いて統計分析を実施した。ノンパラメトリックMann−Whitney検定を用いて群間の比較を行った。≦0.05の両側P値は有意と見なした。
ソフトウェアGraphPad Prism,version 4.00(GraphPad社、サンディエゴ、米国カリフォルニア州)を用いて統計分析を実施した。ノンパラメトリックMann−Whitney検定を用いて群間の比較を行った。≦0.05の両側P値は有意と見なした。
結果
放射性トレーサー。全ての放射性トレーサーは、>98%の放射化学純度をもって成功裡に製造された。総合成時間は約1.5時間であった。放射性トレーサーの親油性(Log D)は、当技術分野で知られる方法(Barthel,H.,et al.,Br J Cancer.2004;90:2232−2242)を用いて測定し、測定されたLog Dを表6に示す。動物は異なる日にスキャンされたので、各放射性トレーサーに関する平均比放射能も示す(表6)。
放射性トレーサー。全ての放射性トレーサーは、>98%の放射化学純度をもって成功裡に製造された。総合成時間は約1.5時間であった。放射性トレーサーの親油性(Log D)は、当技術分野で知られる方法(Barthel,H.,et al.,Br J Cancer.2004;90:2232−2242)を用いて測定し、測定されたLog Dを表6に示す。動物は異なる日にスキャンされたので、各放射性トレーサーに関する平均比放射能も示す(表6)。
FET−βAG−TOCAはインビボで安定である。FET−βAG−TOCAのインビボ安全性を調べた。投与溶液及び30分マウス血漿の典型的な放射性クロマトグラムを図15に示す。ET−βAG−TOCAの代謝産物は見られず、インタクトな母体トレーサーのみが見出された。
sstr受容体に対する高い結合親和性と非標識組織からの迅速な洗浄除去との総合効果により、FET−βAG−TOCAに関して図16に示されるように、インビボで高コントラストのPET画像が生成された。インビボ動的PET画像データから導かれるFET−βAG−TOCAの腫瘍時間−放射能曲線(図17)が上昇することは、FET−βAG−TOCAの高い選択的結合を反映していた。放射性トレーサーはマウスにおいて代謝的に安定であり、低い骨取込みを有していて、これは顕著な脱フッ素化が起こらないことを表している。
[ 18 F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr 3 ]オクトレオテート類似体の薬物動態及びインビボ腫瘍局在化。FET−βAG−TOCAの高い親和性及び体内安定性を仮定すれば、腫瘍における放射性トレーサーの良好な局在が観察されることは保証されていた。図16Aは、sstr−2を発現するAR42J腫瘍担持マウスの典型的な横断面及び矢状断面のPET画像スライスを示しており、FET−βAG−TOCAが高い信号−バックグラウンドコントラストを有しながら腫瘍、腎臓及び膀胱/尿に局在することを実証している。それとは対照的に、スクランブルドペプチドFET−βAG−[W−c−(CTFTYC)K]を注射した場合にマウスの腫瘍及び腎臓には、いかなる放射性トレーサーの局在も見られなかった(図16B)。この場合には、主として脳、尿、肝臓及び腸におけるトレーサーの局在が見られた(データは示さず)。腫瘍、腎臓、肝臓、筋肉及び膀胱/尿における[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体の比較薬物動態を図17に示す。AR42J腫瘍における放射性トレーサー取込みは、60分の走査期間全体にわたる急速な上昇によって特徴づけられた。FET−G−TOCAが最高の腫瘍取込みを有し、次いでFET−βAG−TOCAが[18F]−AlF−NOTA−OCより高いか又は同等の取込みを有していた。これらのトレーサーは、腫瘍取込みに関しては、臨床用放射性トレーサー[68Ga]−DOTATATEより優れていた(表6)。FET−G−PEG−TOCA及びFETE−PEG−TOCAの構造中に組み込まれたPEGリンカーは、腫瘍取込みを低下させた(図17、表6)。肝臓における非特異的取込みは一般に低く(<7%ID/mL)、FET−βAG−TOCAは最低の肝臓取込みを示し、FET−G−TOCA及びFETE−PEG−TOCAは最高の肝臓取込みを示した。PEG−TOCA類似体は、その最低の親油性に合致して最高の尿クリアランスを有していた。しかし、やはりsstrを発現する腎臓における放射性トレーサーの動態プロファイルは腫瘍におけるものとは異なっていて、取込みの大きさは2種の放射性トレーサーFET−βAG−TOCA及びFET−G−TOCAに関して最高であり、[18F]−AlF−NOTA−オクトレオチドは比較的低い腎臓取込みを有していた。平均筋肉取込みは、全ての放射性トレーサーに関して<3%ID/mLであった。骨における放射性トレーサー取込みは全ての類似体に関して低く、脱フッ素化がほとんど/全く起こらないことを表していた。我々はねイメージング試験における放射性トレーサーの取込みを直接組織カウンティングと比較した。プロファイルは一般的に一致していたが、大きさは直接カウンティングの方が高く、部分体積平均化に一致していた。組織の一部のみの直接放射能測定(ガンマカウンティング)は、イメージングの場合における腫瘍全体のサンプリングに比べて、系統的な差を生み出した可能性もある。
FET−βAG−TOCAの取込みは特異的である。放射性トレーサーの高い腫瘍取込みを仮定して、我々は次に、FET−βAG−TOCAをプロトタイプの[18F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテートとして使用しながらインビボで取込みの特異性を評価した。我々は放射性トレーサーの取込みが特異的であることを実証した。i)sstr−2に対する低い親油性に合致して、放射性標識スクランブルドペプチド(FET−βAG−[W−c−(CTFTYC)K])はインビボでAR42Jモデルにおける検出可能な腫瘍取込みを示さなかった(図18)。FET−βAG−[W−c−(CTFTYC)K]の取込みはまた、高sstr発現性の正常組織(腎臓)においても低く、肝臓においてはFET−βAG−TOCAに比べて高かった。ii)放射性トレーサーの腫瘍取込みが受容体を媒介したものであることを示すため、
マウスに過剰の非標識オクトレオチド(100倍モル当量)を予め注射してsstr結合部位を飽和させることでブロッキング試験を行った。これは、AR42J異種移植片においてFET−βAG−TOCAの(直接カウンティングによれば)2倍低い取込みをもたらした(図18、表6)。非標識オクトレオチドによるブロッキング後には、腎臓(初期時点のみ)、筋肉及び(僅かながら)肝臓の放射能濃度は増加し、尿の放射能は減少した(図18)。iii)FET−βAG−TOCAの取込みの特異性に関する追加の証拠は、低sstr発現性のHCT116異種移植片における取込みがAR42J異種移植片に比べて低いことによって与えられた(表6)。
マウスに過剰の非標識オクトレオチド(100倍モル当量)を予め注射してsstr結合部位を飽和させることでブロッキング試験を行った。これは、AR42J異種移植片においてFET−βAG−TOCAの(直接カウンティングによれば)2倍低い取込みをもたらした(図18、表6)。非標識オクトレオチドによるブロッキング後には、腎臓(初期時点のみ)、筋肉及び(僅かながら)肝臓の放射能濃度は増加し、尿の放射能は減少した(図18)。iii)FET−βAG−TOCAの取込みの特異性に関する追加の証拠は、低sstr発現性のHCT116異種移植片における取込みがAR42J異種移植片に比べて低いことによって与えられた(表6)。
興味深いことには、FET−G−TOCA及びFET−βAG−TOCA化合物に関する腫瘍取込みは、これまでに報告された最高の部類に位置し、臨床的に使用されている[68Ga]−DOTA−TATEのものより高かった(表6)。同様に、2種の[19F]フルオロエチルトリアゾール−[Tyr3]オクトレオテート類似体の腫瘍取込みは、同じ腫瘍モデルにおいてFroidevaux et al.(Froidevaux,S.,et al.,Endocrinology.2000;141:3304−3312)により報告された[111In]−DTPA−オクトレオチドの値(3.03±0.26%ID/g)より顕著に高かった。これらのトレーサーはまた、[18F]−AlF−NOTA−OCに比べて同等以上の取込みを示した。FET−G−TOCA及びFET−βAG−TOCAの高い腫瘍取込みとは対照的に、2種のPEG化類似体は低い腫瘍(及び腎臓)取込みを示した。ペプチドのPEG化はしばしば半減期を増加させ、一般に身体からの総合クリアランスを減少させることを考えると(Veronese,F.M.,et al.,Drug Discov Today.2005;10:1451−1458)、これは意外な所見であった。この所見は、一つには、PEG化の性質の1つが分子の水溶性を高めることであるという事実によって説明できる(Veronese,F.M.,et al.,BioDrugs.2008;22:315−329)。これは、親水性の低い非PEG化類似体に比べて循環からより迅速なクリアランスが起こることによって裏付けられ、また高い尿クリアランスによって裏づけられる(図17F)。PEG−TOCA類似体の低い取込みはまた、そのインビトロ親和性が低いことによっても説明できよう(図14)。
受容体発現が欠如している肝臓及び筋肉のような組織(Reynaert,H.,et al.,Gut.2004;53:1180−1189)は、放射性トレーサーの低い取込みを示すものと予測された。PEG−TOCA類似体は、より低い非標的組織取込みを示した。この系列においてPEG化から生じる高い親水性は、非標的組織からのより迅速な排出をもたらすように思われる。PET試験からの時間経過にわれば、この効果を定量化することができる。興味深いことには、PEG化類似体に比べて中間の親水性を有するFET−βAG−TOCA(表6)は、肝臓及び筋肉を含む非標的組織において同様な低い取込みを示した。これは、最高の腫瘍取込みを有するFET−G−TOCAでは理解されなかったFET−βAG−TOCAのプラスとなる属性である。
イメージング
本発明のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又は2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、ソマトスタチン受容体の増加したレベル又は高いレベルを示す病態又は腫瘍に対する放射性トレーサー又はイメージング剤として使用できる。
本発明のトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体又は2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、ソマトスタチン受容体の増加したレベル又は高いレベルを示す病態又は腫瘍に対する放射性トレーサー又はイメージング剤として使用できる。
一実施形態では、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、ソマトスタチン受容体の増加したレベル又は高いレベルを示す病態又は腫瘍に対するPET放射性トレーサーとして使用できる。一実施形態では、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、増加したレベルのソマトスタチン受容体を発現することが知られている神経内分泌腫瘍のインビボ検出のために有用なPET放射性トレーサーとして使用できる。一実施形態では、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、高いレベルのソマトスタチン受容体を発現する肺腫瘍の検出のために有用なPET放射性トレーサーとして使用できる。
したがって一態様では、本発明は、ソマトスタチン受容体の増加したレベルを示す病態又は腫瘍の分布及び/又は程度を決定するためのPETイメージング方法であって、
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体内のソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における病態の分布及び程度を決定する段階であって、病態の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体内のソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における病態の分布及び程度を決定する段階であって、病態の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
別の態様では、本発明は、被験体における1つ又は複数の神経学的腫瘍の分布及び/又は程度を決定するためのPETイメージング方法であって、
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体における前記神経内分泌腫瘍の表面にあるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における神経内分泌腫瘍の分布及び程度を決定する段階であって、神経内分泌腫瘍の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体における前記神経内分泌腫瘍の表面にあるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における神経内分泌腫瘍の分布及び程度を決定する段階であって、神経内分泌腫瘍の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
別の態様では、本発明は、被験体における1つ又は複数の肺腫瘍の分布及び/又は程度を決定するためのPETイメージング方法であって、
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体における肺腫瘍の表面にあるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における肺腫瘍の分布及び程度を決定する段階であって、肺腫瘍の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
i)本明細書中に記載したような本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体に投与する段階、
ii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体における肺腫瘍の表面にあるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
iii)本発明の前記2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体中に含まれる18Fから放出される信号を検出する段階、並びに
iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階
を含んでなる方法を提供する。本方法はさらに、前記被験体における肺腫瘍の分布及び程度を決定する段階であって、肺腫瘍の前記分布及び程度が前記信号と直接に相関している段階を任意に含んでいる。
本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を前記被験体を「投与する」段階は、好ましくは非経口的に実施され、最も好ましくは静脈内に実施される。静脈内経路は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を被験体の身体全域に送達するための最も効率的な方法である。静脈内投与は、被験体に対して実質的な物理的介入も実質的な健康リスクももたらさない。本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は、好ましくは、本明細書中に定義されているような本発明の放射性医薬組成物として投与される。投与段階は、本発明のPETイメージング方法の完全な定義のためには必要でない。したがって本発明のPETイメージング方法は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を予め投与した被験体に関して実施される、上述の段階(ii)〜(v)を含むものとして理解することもできる。
投与段階後かつ検出段階前に、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体をソマトスタチン受容体に結合させる。例えば、被験体がインタクトな哺乳動物である場合、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体は哺乳動物の身体を通って動的に移動し、体内の様々な組織に接触する。ひとたび本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体がソマトスタチン受容体に接触すれば、特異的な相互作用が起こる結果、ソマトスタチン受容体をもった組織からの本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体がソマトスタチン受容体のクリアランスは、ソマトスタチン受容体をもたない組織又はソマトスタチン受容体の少ない組織よりも長い時間がかかる。一定の時点に達すれば、ソマトスタチン受容体をもった組織に結合したPET放射性トレーサーとソマトスタチン受容体をもたない組織又はソマトスタチン受容体の少ない組織に結合したものとの比の結果として、ソマトスタチン受容体に特異的に結合した本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体の検出が可能となる。
本発明の方法の「検出」段階は、本発明の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体に含まれる18Fから放出される信号を、前記信号に対して感受性を有する検出器(例えば、PETカメラ)の使用によって検出することを含んでいる。この検出段階はまた、信号データの取得として理解することもできる。
本発明の方法の「生成」段階は、取得された信号データに再構築アルゴリズムを適用してデータセットを得るコンピューターによって実施される。次いで、このデータセットを操作することで、18Fから放出される信号の位置及び/又は量を示す画像が生成される。放出される信号はソマトスタチン受容体の発現と直接に相関する結果、生成された画像を評価することで「決定」段階を行うことができる。
本発明の「被験体」は、任意のヒト又は動物被験体であり得る。好ましくは、本発明の被験体は哺乳動物である。最も好ましくは、前記被験体はインタクトな哺乳動物生体である。特に好ましい実施形態では、本発明の被験体はヒトである。本発明のインビボイメージング方法は、健常な被験体において、或いはソマトスタチン受容体の異常発現に関連する病的状態を有することが知られ又は疑われる被験体においてソマトスタチン受容体を試験するために使用できる。
別の態様では、本発明のPETイメージング方法は前記被験体に関する治療計画の進行中に繰り返して実施することができ、前記計画は神経内分泌腫瘍と戦うための薬物の投与を含んでいる。例えば、本発明のPETイメージング方法は、神経内分泌腫瘍と戦うための薬物による治療前、治療中及び治療後に実施できる。このようにすれば、前記治療の効果を経時的にモニターすることができる。PETは、優れた感度及び分解能を有する結果、病変部における比較的小さい変化でも経時的に観察できるのでこの用途に特によく適しており、これは治療モニタリングにとって特別の利点である。
上記に論議及び/又は引用された全ての特許、雑誌論文、刊行物及び他の文書の内容は、援用によって本明細書中に組み込まれる。
Claims (17)
- 次の式(III)の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
R1−LINKER−R2 (III)
(式中、
R1は次式の基であり、
- 下記の化合物からなる群から選択される2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
次の式(1b)のFET−G−PEG−TOCA、
次式のFET−βAG−TOCA(5b)。
R1は次式の基であり、
- R2が次式の構造を有する、請求項1又は請求項2記載の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
- 次式のFET−βAG−[W−c−(CTFTYC)K](7b)である2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
R1は次式の基であり、
- R3が次式の構造を有する、請求項4記載の2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
- 請求項1乃至請求項5に記載の化合物の1種以上及び薬学的に許容されるキャリヤー、賦形剤又は生体適合性キャリヤーを含んでなる医薬組成物。
- 次の式(IV)のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
R1−LINKER−R2 (IV)
(式中、
R1は次式の基であり、
- 下記の化合物からなる群から選択されるアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
次の式(1a)のG−PEG−TOCA、
次式のβAG−TOCA(5a)。
R1は次式の基であり、
- R2が次式の構造を有する、請求項7又は請求項8記載のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
- 次式のβAG−[W−c−(CTFTYC)K](6a)であるアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
R1は次式の基であり、
- R3が次式の構造を有する、請求項10記載のアルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体。
- アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を銅触媒クリック化学条件下で2−[18F]フルオロエチルアジドと反応させて対応する2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体を生成する段階を含んでなる製造方法。
- 前記アルキン結合[Tyr3]オクトレオテート類似体が請求項1記載の化合物であり、前記対応する2−[18F]フルオロエチルトリアゾール結合[Tyr3]オクトレオテート類似体が請求項1記載の化合物である、請求項12記載の方法。
- 請求項1記載の化合物を被験体に投与する段階、及び前記被験体において前記化合物を検出する段階を含んでなるイメージング方法。
- 被験体においてソマトスタチン受容体の増加したレベル又は高いレベルを示す病態又は腫瘍をインビボで検出する方法であって、
(i)請求項1記載の化合物又はその医薬組成物を前記被験体に投与する段階、
(ii)前記化合物又はその医薬組成物を前記被験体内に見出されるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
(iii)前記化合物又はその医薬組成物中の放射性同位体から放出される信号を検出する段階、
(iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階、並びに任意には
(v)前記被験体における前記病態の分布及び程度を決定する段階
を含んでなる方法。 - 被験体における神経内分泌腫瘍をインビボで検出する方法であって、
(i)請求項1記載の化合物又はその医薬組成物を前記被験体に投与する段階、
(ii)前記化合物又はその医薬組成物を前記被験体における神経内分泌腫瘍の表面に見出されるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
(iii)前記化合物又はその医薬組成物中の放射性同位体から放出される信号を検出する段階、
(iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階、並びに任意には
(v)前記被験体における前記神経内分泌腫瘍の分布及び程度を決定する段階
を含んでなる方法。 - 被験体における肺腫瘍をインビボで検出する方法であって、
(i)請求項1記載の化合物又はその医薬組成物を前記被験体に投与する段階、
(ii)前記化合物又はその医薬組成物を前記被験体における肺腫瘍の表面に見出されるソマトスタチン受容体に結合させる段階、
(iii)前記化合物又はその医薬組成物中の放射性同位体から放出される信号を検出する段階、
(iv)前記信号の位置及び/又は量を表す画像を生成する段階、並びに任意には
(v)前記被験体における前記肺腫瘍の分布及び程度を決定する段階
を含んでなる方法。
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