JP2018530994A6 - インスリン受容体アプタマーおよびこれを含む薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インスリン受容体に特異的に結合するDNAアプタマー、これを有効成分として含有する糖尿病治療用組成物および糖尿病診断用組成物に関し、前記アプタマーは、既存のインスリンとは異なる結合機序を有することによって、癌発病率の増加および粥状動脈硬化のようなインスリンによる副作用を生じることなく、効果的に糖尿病を治療し診断できることを特徴とする。
Description
本発明は、インスリン受容体に特異的に結合するアプタマーおよびこれを用いてインスリン作用剤(agonist)として使用することができ、またはインスリン受容体に関連する疾患の治療または診断用薬学組成物に関する。
インスリン受容体(IR、Insulin receptor)は、チロシンキナーゼ受容体であって、インスリン、IGF−1またはIGF−2によって活性化される膜貫通受容体(transmembrane receptor)である。インスリン結合部を含むα鎖(719残基)2個と膜貫通部を含むβ鎖(620残基)2個とがS−S結合で連結された4量体構造となっている。インスリンが受容体と結合すると、β鎖の細胞内領域にあるチロシンキナーゼ活性が活発になり、受容体チロシン残基のリン酸化が起こる。この自己リン酸化が他の蛋白質のリン酸化を起こす。
インスリン受容体が活性化される場合、グルコース吸収を引き起こすが、インスリン受容体の信号伝達が減少する場合、グルコースの吸収が阻害され、第2糖尿またはこれに関連する合併症および過血糖(hyperglycemia)などが引き起こされる。
アプタマー(aptamer)は、ペプチドからなる抗体とは異なって4種類の核酸(nucleic acid)からなり、そのシーケンスの組み合わせに応じて対象蛋白質に対する特異性を示す物質である。対象蛋白質に特異的なアプタマーは、試験管でSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)により作られるが、この過程は、ランダムな組み合わせから構成されたアプタマーのプール(pool)で精製された蛋白質に特異的に結合するアプタマーを探し、PCRにより増幅する過程を含む。代表的な単鎖DNAアプタマー新薬のペガプタニブは、血管表皮成長因子を対象として血管表皮成長因子が血管表皮成長因子受容体に結合することを妨げる抗癌剤であって、FDAの承認を受けて臨床に使用されている。
現在、機能的アプタマーを発掘するためのほとんどの努力は、標的に対するアプタマーの阻害能力に焦点が当てられている。特に、臨床的応用のために標的分子の活性を妨げる多様な種類の阻害性アプタマー(inhibitory aptamer)が疾病治療のために開発されてきた(e.g Macgen,AS1411)。しかし、分子間の相互作用は必然的に構造的な変化を伴う点を踏まえた時、もし、アプタマー−蛋白質結合が蛋白質の適切な構造変化を誘導することができれば蛋白質機能の活性化が可能になると見られる。したがって、理論的にアプタマーは、特定の蛋白質−蛋白質結合を模倣することによって、機能的作用剤としての役割を果たせる潜在力を有する。しかし、現在、標的の機能を活性化させるアゴニストアプタマーの開発は難題として残されている。
また、今日、糖尿病患者の血糖を正常に調節するために多くの種類のインスリン誘導体が開発されて使用されているが、インスリンはブドウ糖吸収以外にも細胞分裂を誘導し、いくつかのインスリン誘導体に導入されたアミノ酸配列の変化はIGF−1受容体に対する結合力と活性化を増加させる。したがって、糖尿病治療のための長期間のインスリン投与は、逆に癌発生率を高めることがあり、粥状動脈硬化のようなインスリンによる副作用への懸念が持続的に提起されてきた。また、いくつかの疫学調査により持続したインスリン投与と癌発病率の増加との間に有意な相関関係があるという内容も報告された。したがって、細胞分裂を誘導せず、ブドウ糖吸収のみを増加させるインスリン受容体に対するバイアスアゴニスト(biased agonist)の開発は、インスリン投与に対する良い代案を提示するであろう。
したがって、インスリン受容体に特異的に結合するアプタマーおよびこれを用いた糖尿病の治療または診断技術の開発が求められる。
そこで、本発明は、インスリン受容体に特異的に結合し、5’−位置が疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシルを含む、インスリン受容体アプタマーを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを有効成分として含む糖尿病治療用組成物、前記インスリン受容体アプタマーの薬学的有効量を糖尿病患者に投与する段階を含む糖尿病の治療方法および糖尿治療のための用途を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを有効成分として含む糖尿病診断用組成物、および糖尿病診断のための用途を提供することを目的とする。
なお、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを用いて糖尿病の診断に情報を提供する方法を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明は、インスリン受容体の細胞外領域(Extracellular domain)に特異的に結合し、インスリン受容体のリン酸化を促進する、インスリン受容体アプタマー(aptamer)を提供する。
本明細書において、インスリン受容体アプタマーとは、インスリンに特異的な親和度で結合できるアプタマーを意味する。前記インスリン受容体は、ヒトインスリン受容体蛋白質に由来するものであってもよいが、これに限定されない。
前記インスリン受容体アプタマーは、5’−位置が疎水性官能基で置換されている修飾された塩基を含むことができる。前記アプタマーは、25〜90個、好ましくは27〜80個、さらに好ましくは27〜33個の塩基からなり、インスリン受容体に特異的に結合することを特徴とする。前記修飾された塩基以外の本発明のインスリン受容体アプタマーに使用される塩基は、特別な言及がない限り、A、G、C、T、およびこれらのデオキシ形態の塩基からなる群より選択されたものである。
インスリン受容体アプタマーの前記修飾された塩基の個数は、5〜15個、好ましくは6〜8個であってもよい。
好ましくは、前記アプタマーは、IR−A48と命名された配列番号1の塩基配列内の配列番号2の塩基配列を含み、両側に連続する33個〜80個のヌクレオチドである、インスリン受容体アプタマーであるか、IR−A62と命名された配列番号6の塩基配列内の配列番号7の塩基配列を必須として含み、配列番号7の塩基配列の両側に連続する27個〜79個または27個〜80個のヌクレオチドを追加的に含む、インスリン受容体アプタマーであってもよい。
さらに好ましくは、前記アプタマーは、配列番号1の塩基配列内の配列番号2の塩基配列を含み、両側に連続する33個〜80個の塩基配列からなるインスリン受容体アプタマー、または配列番号6の塩基配列内の配列番号7の塩基配列を必須として含む27個〜79個、または27個〜80個の塩基配列からなるインスリン受容体アプタマーであってもよい。
前記塩基配列は、アプタマーの結合力と特異性を高めるために、前記アプタマーに含まれているヌクレオチドの塩基の5’−位置が疎水性官能基で置換されたものであってもよい。例えば、可変領域のチミン(Thymine)塩基の5’−位置が疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシル、例えば、5−[N−(1−naphthylmethyl)carboxamide]−2’−deoxyuridine(Nap−dU)を可変領域に8個含む。前記疎水性官能基は、ナフチル基、ベンジル基、ピロールベンジル基、またはトリプトファンを含むことができ、さらに好ましくは、前記疎水性官能基は、ナフチル基である。
好ましくは、前記インスリン受容体アプタマーは、内部のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造を形成することができる。さらに好ましくは、前記ステム−ループ構造は、27個または33個のヌクレオチドから構成されたものであってもよい。
具体的には、前記33個のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造は、IR−A48Fと命名された配列番号1の塩基配列のうち15〜47番目の塩基によって形成され、前記15番目〜47番目のヌクレオチドからなる塩基配列は、配列番号2であってもよい。また、前記27個のヌクレオチドから構成されたステム−ループ構造は、IR−A62Fと命名された配列番号6の塩基配列のうち26〜45番目の塩基によって形成され、前記26番目〜45番目の塩基から構成されたステム−ループ構造の両端に追加のヌクレオチドを含む塩基配列は、配列番号1の22番目〜48番目の塩基を含む配列番号7であってもよい。
本発明者らは、前記インスリン受容体アプタマーがインスリン受容体と非常に類似の構造を有するIGF−1(insulin−like growth factor)受容体には結合せず、インスリン受容体に特異的に結合することを確認した。具体的には、本発明のIR−A48と命名されたインスリン受容体アプタマーは、インスリンと相異なる位置で非競争的に結合可能であり、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が1nm〜20nMであり、好ましくは約3.5〜6.9nMである。IR−A62と命名されたインスリン受容体アプタマーは、インスリンと促進的相互作用(Positive cooperativity)によりインスリンの結合を増加させることができ、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が0.5nM〜40nMであり、好ましくは約2.4〜26.9nMである。
本発明者らは、SELEX方法を利用してインスリン受容体に結合するアプタマーを発掘し、発掘されたアプタマーがインスリン受容体と結合してインスリン受容体をリン酸化したことを確認した。
インスリンが受容体と結合すると受容体チロシン残基がリン酸化されるが、インスリン受容体のリン酸化は、信号伝達により脂肪細胞と筋肉でグルコース輸送担体4型(glucose transporter 4;GLUT4)の移動を調節してブドウ糖吸収を増加させる。このようなインスリン受容体による代謝機能は主にIRS−AKT経路によって調節され、また、インスリンの信号伝達過程で、PI3KはAKTのリン酸化に重要な役割を果たす。公知のPI3K阻害物質のLY29400は、AKTのリン酸化だけでなく、ブドウ糖吸収のようにAKTによって誘導される細胞機能を完全に遮断する。
本発明によるインスリン受容体アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を促進し、具体的には、インスリン受容体のY1150を優先的にリン酸化し、その後、AKT S473のリン酸化を促進させてインスリンレベルにブドウ糖を吸収することができる。本発明者らは、前記リン酸化およびブドウ糖吸収がPI3Kを介して誘導されることを確認した。
MAPK経路は、インスリン受容体を介して誘導される代表的な信号伝達経路であり、細胞分裂に重要な役割を果たし、インスリンもいくつかの癌細胞株で細胞分裂を誘導することがよく知られている。本発明者らは、前記インスリン受容体アプタマーは、インスリンの作用剤としてブドウ糖吸収(glucose uptake)を行えるものの、しかし、インスリンとは異なって細胞分裂に影響を及ぼさないことを確認した。したがって、本発明によるインスリン受容体アプタマーは、インスリンとは異なってMAPK経路を活性化させず、好ましくは、MAPK経路の活性化によるインスリン疾患に影響を及ぼさず、さらに好ましくは、癌細胞の成長による癌発生率の増加と血管平滑筋細胞の成長による粥状動脈硬化に影響を及ぼすことなく、血糖調節をするのに有用に使用できる。
また、前記アプタマーは、血清内の安定性を増進させたり腎クリアランス(renal clearance)を調節するために、5’末端、3’末端、中間または両末端に位置する塩基を少なくとも1つ以上修飾することができる。前記修飾は、5’末端、3’末端、中間または両末端に、PEG(polyethylene glycol)、ビオチン、idT(inverted deoxythymidine)、LNA(Locked Nucleic Acid)、2’−メトキシヌクレオシド、2’−アミノヌクレオシド、2’F−ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、およびコレステロールなどからなる群より選択された1種以上が結合して修飾されたものであってもよい。2’−メトキシヌクレオシド、2’−アミノヌクレオシドまたは2’F−ヌクレオシドは、アプタマーに含まれている塩基に結合して修飾された塩基を提供することによって、ヌクレアーゼ抵抗性(nuclease resistance)を付与する。
好ましくは、前記アプタマーは、ヌクレアーゼ抵抗性を確保して最適化されたin vivo投与のために修飾された塩基を含むことができ、さらに好ましくは、前記修飾は、2’−OMe(メトキシ)または2’−F(フッ素)であってもよい。
本発明による2以上のアプタマーが連結されて二量体(dimer)あるいは多量体(multimer)として存在し得る。
本願で使用されるもので、用語「インスリン受容体の作用剤」は、インスリン受容体に選択的に結合する薬学的に許容可能な製剤を示す。通常、インスリン受容体の作用剤は、効果的に血糖を調節するために開発された新たな種類の糖尿病治療剤を示す。本発明のインスリン受容体の作用剤は、インスリン受容体に特異的に結合するだけでなく、癌発生の副作用がない特徴がある。
したがって、前記インスリン受容体の作用剤は、インスリンに関連する多様な疾病の診断または治療用途に使用できる。
そこで、本発明の他の例は、前記アプタマーをインスリン受容体の作用剤として含むインスリンと関連疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。さらに他の例は、前記アプタマーをインスリン受容体の作用剤として含むインスリンと関連疾患の診断用組成物に関する。前記組成物は、インスリンを追加的に含んでもよい。前記インスリン関連疾患は、糖尿病、糖尿合併症、代謝性症候群、肥満、心血管疾患などを含むことができる。
前記薬学組成物は、多様な経口投与形態または非経口投与形態に剤形化される。例えば、錠剤、丸剤、硬質/軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤(elixirs)などの任意の経口投与用剤形になってもよい。このような経口投与用剤形は、各剤形の通常の構成により、前記有効成分のほか、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび/またはグリシンなどの希釈剤や、シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および/またはポリエチレングリコールなどの滑沢剤などの製薬上許容可能な担体を含むことができる。
また、前記経口投与用剤形が錠剤の場合、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび/またはポリビニルピロリジンなどの結合剤を含むことができ、場合によって、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤や、沸騰混合物および/または吸収剤、着色剤、香味剤または甘味剤などを含んでもよい。
そして、前記薬学組成物は、非経口投与形態に剤形化されてもよいが、この場合、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射などの非経口投与方法によって投与される。この時、前記非経口投与用剤形に製剤化するために、前記薬学組成物は、有効成分、つまり、化学式Iの誘導体またはその薬学的に許容可能な塩が安定剤または緩衝剤と共に水で混合されて溶液または懸濁液に製造され、このような溶液または懸濁液がアンプルまたはバイアルの単位投与型に製造される。
また、前記薬学組成物は、滅菌されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および/または緩衝剤などの補助剤をさらに含んでもよく、その他治療的に有用な物質をさらに含んでもよいし、混合、顆粒化またはコーティングの通常の方法により製剤化される。
本発明の薬学組成物の投与対象は、ヒトを含む哺乳類であってもよいし、好ましくは、げっ歯類、またはヒトであってもよい。
他の側面から、本発明は、前記インスリン受容体アプタマーを用いて糖尿病の診断に情報を提供する方法を提供する。
前記糖尿病の診断に情報を提供する方法は、
分離された生物学的試料を準備する段階と、
前記生物学的試料に、本発明によるインスリン受容体アプタマーを反応させる段階と、
前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階とを含み、
生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度が正常な試料より高い場合、糖尿病であると診断することを特徴とするものであってもよい。
分離された生物学的試料を準備する段階と、
前記生物学的試料に、本発明によるインスリン受容体アプタマーを反応させる段階と、
前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階とを含み、
生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度が正常な試料より高い場合、糖尿病であると診断することを特徴とするものであってもよい。
前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階は、関連技術分野で通常使用されるDNAアプタマー結合測定技術を利用して行われ、例えば、インスリン受容体アプタマーの末端に蛍光または放射性物質を標識して蛍光または放射性強度を測定したり、イメージ化して観察する方法などを利用することができるが、これらに制限されるわけではない。
本発明のインスリン受容体アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を促進させてブドウ糖吸収を増加させながらも、インスリン受容体の代謝機能のみを選択的に誘導するバイアスアゴニスト(Biased Agonist)として機能することができる。それだけでなく、癌発病率の増加などのようなMAPK経路の活性化による各種インスリンによる疾患を起こすことなく、インスリン受容体を介して血糖を調節することができる。
以下、実施例を挙げて本発明の構成および効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実施例は本発明に対する理解のために例示の目的として提供されたものに過ぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるわけではない。
抗体および試薬の準備
ヒトインスリン受容体蛋白質は、R&D system(Minneapolie、MN)から購入して使用した。使用されたアプタマーは、Aptamer Science,Inc.(Pohang、Korea)とST Pharm(Siheung、Korea)により合成された。ウェスタンブロットの際に使用した抗体は、次の通りである:Anti−phosphor−ERK(T202/Y204)、Anti−AKT、Anti−phosphor−AKT(S473)、Anti−phosphor−AKT(T308)、anti−phospho−FoxO1/3a(T24/T32)、およびanti−phospho−AS160(T642)(signaling、Beverly、MA)。Anti−IR β−subunit(C−19)、anti−IGF−1R β−subunit(C−20)、anti−phospho−IR(10C3、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IRS1(Y632)、およびanti−phospho−Shc(Y239/Y240)抗体は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechmology、Snata Cruz、CA)から購入する。Anti−phospho−tyrosine(4G10)、anti−phospho−IRS1(Y612)human/(Y608)mouse、およびanti−phospho−IR(Y1146)(Millipore、Darmstadt、Germany)。Anti−phospho−IR(Y960)、anti−phospho−IR(pAb、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IR(Y1316)、anti−phospho−IR(Y1322)、anti−phospho−IR(Y1146/Y1150/Y1151)(Invitrogen、Carlsbad、CA)。
ヒトインスリン受容体蛋白質は、R&D system(Minneapolie、MN)から購入して使用した。使用されたアプタマーは、Aptamer Science,Inc.(Pohang、Korea)とST Pharm(Siheung、Korea)により合成された。ウェスタンブロットの際に使用した抗体は、次の通りである:Anti−phosphor−ERK(T202/Y204)、Anti−AKT、Anti−phosphor−AKT(S473)、Anti−phosphor−AKT(T308)、anti−phospho−FoxO1/3a(T24/T32)、およびanti−phospho−AS160(T642)(signaling、Beverly、MA)。Anti−IR β−subunit(C−19)、anti−IGF−1R β−subunit(C−20)、anti−phospho−IR(10C3、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IRS1(Y632)、およびanti−phospho−Shc(Y239/Y240)抗体は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechmology、Snata Cruz、CA)から購入する。Anti−phospho−tyrosine(4G10)、anti−phospho−IRS1(Y612)human/(Y608)mouse、およびanti−phospho−IR(Y1146)(Millipore、Darmstadt、Germany)。Anti−phospho−IR(Y960)、anti−phospho−IR(pAb、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IR(Y1316)、anti−phospho−IR(Y1322)、anti−phospho−IR(Y1146/Y1150/Y1151)(Invitrogen、Carlsbad、CA)。
細胞培養および分化
MCF7ヒト乳癌細胞株、ヒト胚腎臓細胞HEK293、マウス脂肪細胞3T3−L1は、American Type Culture Collection(Manassas、VA、USA)から購入した。インスリン受容体が過発現したRat−1線維細胞(Rat−1/hIR)は、University of CaliforniaのNicholas J.G.Webster博士から提供された。MCF7、HEK293、Rat−1/hIRは、10%fetal bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。3T3−L1は、0%Bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。
MCF7ヒト乳癌細胞株、ヒト胚腎臓細胞HEK293、マウス脂肪細胞3T3−L1は、American Type Culture Collection(Manassas、VA、USA)から購入した。インスリン受容体が過発現したRat−1線維細胞(Rat−1/hIR)は、University of CaliforniaのNicholas J.G.Webster博士から提供された。MCF7、HEK293、Rat−1/hIRは、10%fetal bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。3T3−L1は、0%Bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。
3T3−L1の脂肪細胞分化のために飽和状態に成長した細胞を2日間さらに培養した後、1μM デキサメタゾン、500nM IBMX、850nMインスリンと10%FBSが含まれているDMEMを2日間処理した。その後、850nMインスリンと10%FBSが含まれているDMEMを2日間処理し、10%FBSのみが含まれているDMEMを脂肪細胞への分化が完了するまで5〜6日間処理した。
実施例1:インスリン受容体アプタマーの発掘
SELEXを用いてインスリン受容体の細胞外領域に結合するアプタマーを発掘した。40merの可変配列と両側に20merずつ存在する不可変配列とから構成された単鎖DNAライブラリー(配列番号3)を用いてSELEXを進行させた。
SELEXを用いてインスリン受容体の細胞外領域に結合するアプタマーを発掘した。40merの可変配列と両側に20merずつ存在する不可変配列とから構成された単鎖DNAライブラリー(配列番号3)を用いてSELEXを進行させた。
1.1.修飾された核酸ライブラリーの合成
SELEXに必要な単鎖修飾DNAライブラリーを製造するために、5’にビオチン(biotin)の結合したアンチセンスライブラリー(配列番号3)を合成した。アンチセンスライブラリーを、0.5mMのdNTP(ATP、GTP、CTP、Bz−dU)、0.25U/ulのKOD XL(Invitrogen)、10X伸長緩衝液(1.2M Tris−HCl pH7.8、100mM KCl、60mM(NH4)2SO4、70mM MgSO4、1%TritonX−100、1mg/ml BSA)上で、70℃1時間、50uMの逆方向プライマー(配列番号4)と反応させて、二重螺旋DNAを製造した。これに、20mM NaOHを用いて単鎖修飾DNAライブラリーを溶出した後、HCL溶液で中和した。製造されたDNAライブラリーは、Amicon ultra−15(Millipore)を用いて濃縮した後、UV分光光度計(spectrophotometer)で定量した。
SELEXに必要な単鎖修飾DNAライブラリーを製造するために、5’にビオチン(biotin)の結合したアンチセンスライブラリー(配列番号3)を合成した。アンチセンスライブラリーを、0.5mMのdNTP(ATP、GTP、CTP、Bz−dU)、0.25U/ulのKOD XL(Invitrogen)、10X伸長緩衝液(1.2M Tris−HCl pH7.8、100mM KCl、60mM(NH4)2SO4、70mM MgSO4、1%TritonX−100、1mg/ml BSA)上で、70℃1時間、50uMの逆方向プライマー(配列番号4)と反応させて、二重螺旋DNAを製造した。これに、20mM NaOHを用いて単鎖修飾DNAライブラリーを溶出した後、HCL溶液で中和した。製造されたDNAライブラリーは、Amicon ultra−15(Millipore)を用いて濃縮した後、UV分光光度計(spectrophotometer)で定量した。
1.2.インスリン受容体との結合
前記合成されたライブラリー1nmoleを選択緩衝液(selection buffer)(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)に入れて、95℃、70℃、48℃、37℃でそれぞれ5分間反応させた後、陰性選択(Negative selection)のために、10X蛋白質競争緩衝液(protein competition buffer)(10μM プロトロンビン、10μM カゼイン、0.1%(w/v)HSA(ヒト血清アルブミン、SIGMA)10μLを混合した後、上澄液の除去されたDynabeads(登録商標) MyOneTm ストレプトアビジン C1(SAビーズ)(50%(v/v)スラリー、10mg/ml Invitrogen)に添加して、37℃で10分間反応させた。
前記合成されたライブラリー1nmoleを選択緩衝液(selection buffer)(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)に入れて、95℃、70℃、48℃、37℃でそれぞれ5分間反応させた後、陰性選択(Negative selection)のために、10X蛋白質競争緩衝液(protein competition buffer)(10μM プロトロンビン、10μM カゼイン、0.1%(w/v)HSA(ヒト血清アルブミン、SIGMA)10μLを混合した後、上澄液の除去されたDynabeads(登録商標) MyOneTm ストレプトアビジン C1(SAビーズ)(50%(v/v)スラリー、10mg/ml Invitrogen)に添加して、37℃で10分間反応させた。
陰性選択反応後、上澄液のみを取って新しいチューブに移した後、His tagの結合したインスリン受容体蛋白質と結合させたDynabead TALONに、37℃で1時間反応させた。100μLで選択緩衝液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)DNAとインスリン受容体と結合したDynabeads TALONを5回洗浄した。5回洗浄時には新しいプレートに移して洗浄した。2mM NaOH溶液85μLを添加して標的に結合するライブラリーを溶出した後、8mM HCl溶液20μLで中和した。
1.3.増幅
標的に結合するライブラリーDNAをQPCR(quantitative PCR、IQ5 multicolor real time PCR detection system、Bio−rad)を用いて増幅した。先にライブラリーの製造に使用された逆方向プライマー(配列番号4)とアンチセンスライブラリー(配列番号3)を、それぞれ5uM(5X QPCR master Mix、Novagen)、0.075U/ul KOD(Novagen)、1mM dNTP(Roche Applied science)、25mM MgCl2、5XSYBRgreenI(Invitrogen)の総体積が125μLとなるように混合して、96℃15秒、55℃10秒、68℃30分の条件で1回、そして、96℃15秒、72℃1分の条件で30回繰り返して、二重鎖ライブラリーを製造した。
標的に結合するライブラリーDNAをQPCR(quantitative PCR、IQ5 multicolor real time PCR detection system、Bio−rad)を用いて増幅した。先にライブラリーの製造に使用された逆方向プライマー(配列番号4)とアンチセンスライブラリー(配列番号3)を、それぞれ5uM(5X QPCR master Mix、Novagen)、0.075U/ul KOD(Novagen)、1mM dNTP(Roche Applied science)、25mM MgCl2、5XSYBRgreenI(Invitrogen)の総体積が125μLとなるように混合して、96℃15秒、55℃10秒、68℃30分の条件で1回、そして、96℃15秒、72℃1分の条件で30回繰り返して、二重鎖ライブラリーを製造した。
1.4.eDNAの製造
eDNAは、酵素DNAでDNA鋳型とポリメラーゼを用いて生産したアプタマーを意味する。前記QPCRにより作られたDNAライブラリーを、25μL Myone SAビーズ(Invitrogen)に常温で10分間混合して固定した。この時、混合されたDNAの量は、QPCR産物で60ulとした。20mM NaOH溶液を添加して、単鎖DNAとして作った。そして、実施例1.1のライブラリーの製造と同様の方法で修飾された核酸を含むDNAを合成して次回に使用した。SELEXの一通りの手順を計8回行い、より選択的な結合のために、4回から6回まで、そして、7回から8回まで、それぞれDNAと蛋白質(インテグリンαVβ3)の複合体を10mM DxSO4(sigma)溶液に1/200、1/400に希釈して、DNAアプタマーを選別した。
eDNAは、酵素DNAでDNA鋳型とポリメラーゼを用いて生産したアプタマーを意味する。前記QPCRにより作られたDNAライブラリーを、25μL Myone SAビーズ(Invitrogen)に常温で10分間混合して固定した。この時、混合されたDNAの量は、QPCR産物で60ulとした。20mM NaOH溶液を添加して、単鎖DNAとして作った。そして、実施例1.1のライブラリーの製造と同様の方法で修飾された核酸を含むDNAを合成して次回に使用した。SELEXの一通りの手順を計8回行い、より選択的な結合のために、4回から6回まで、そして、7回から8回まで、それぞれDNAと蛋白質(インテグリンαVβ3)の複合体を10mM DxSO4(sigma)溶液に1/200、1/400に希釈して、DNAアプタマーを選別した。
1.5.アプタマー塩基配列の分析
SELEXの一通りの手順を8回経た後、その結果物をQPCR方法で二重鎖DNAに増幅した後、TAクローニングキット(SolGent)を用いてクローニングした。そして、ベクター上に存在するM13プライマー(配列番号5)をもってシーケンシングして、アプタマーの配列を得た。
SELEXの一通りの手順を8回経た後、その結果物をQPCR方法で二重鎖DNAに増幅した後、TAクローニングキット(SolGent)を用いてクローニングした。そして、ベクター上に存在するM13プライマー(配列番号5)をもってシーケンシングして、アプタマーの配列を得た。
1.6.最適なアプタマー配列の決定
アプタマーを探すために、発掘されたアプタマー(1uM)をインスリン受容体が過発現しているHEK293細胞に処理して、AKT S473のリン酸化が増加するかを分析した。ほとんどのアプタマーは効果がなかったが、発掘されたIR−A48FおよびIR−A62Fアプタマーは、AKTのリン酸化を大きく増加させた。IR−A48FおよびIR−A62Fの配列は、可変領域に8個のNap−dUを含む80merで構成されているが(図1A、図1D)、標的との結合に必要なアプタマーの最小配列を探すために、アプタマーの2次構造に基づいてアプタマー配列の最小化を行った。
アプタマーを探すために、発掘されたアプタマー(1uM)をインスリン受容体が過発現しているHEK293細胞に処理して、AKT S473のリン酸化が増加するかを分析した。ほとんどのアプタマーは効果がなかったが、発掘されたIR−A48FおよびIR−A62Fアプタマーは、AKTのリン酸化を大きく増加させた。IR−A48FおよびIR−A62Fの配列は、可変領域に8個のNap−dUを含む80merで構成されているが(図1A、図1D)、標的との結合に必要なアプタマーの最小配列を探すために、アプタマーの2次構造に基づいてアプタマー配列の最小化を行った。
Mfoldプログラムによって予測されたIR−A48Fアプタマーの2次構造は図1Bに示し、6個のNap−dUを含むアプタマー内部の33個のヌクレオチドが安定したステム−ループ構造を形成する。Mfoldプログラムによって予測されたIR−A62Fアプタマーの2次構造は図1Eに示し、6個のNap−dUを含むアプタマー内部の27個のヌクレオチドが安定したステム−ループ構造を形成する。
前記実験の結果、標的に対する結合分析により、この内部のステム−ループ配列(IR−A48)(3.5nM Kd)がIR−A48F(6.9nM Kd)と似たレベルでインスリン受容体に結合することを確認した。また、IR−A48は、インスリン受容体と非常に類似の構造を有するインスリン類似成長因子1(insulin−like growth factor1、IGF−1)受容体は結合しないことから、インスリン受容体に対して非常に高い特異性を有することを確認した。同様に、10C3抗体を用いてIR−A48がIGF−1受容体のリン酸化に及ぼす影響を調べた結果、結合特異性と一致して、IR−A48は、インスリンとは異なってIGF−1受容体のリン酸化に何ら影響を及ぼさなかった。前記結果を図1Cおよび図3Cに示した。
また、標的に対する結合分析により、この内部のステム−ループ配列(IR−A62)(2.4nM Kd)がIR−A48F(26.9nM Kd)と似たレベルでインスリン受容体に結合することを確認した。さらに、IR−A62は、インスリン受容体と非常に類似の構造を有するインスリン類似成長因子1(insulin−like growth factor1、IGF−1)受容体は結合しないことから、インスリン受容体に対して非常に高い特異性を有することを確認した。同様に、10C3抗体を用いてIR−A62がIGF−1受容体のリン酸化に及ぼす影響を調べた結果、結合特異性と一致して、IR−A62は、インスリンとは異なってIGF−1受容体のリン酸化に何ら影響を及ぼさなかった。前記結果を図1Fおよび図3Cに示した。
以降のすべての実験は、最小化が進んだIR−A48およびIR−A62を用いて行った。
1.7.アプタマーの合成および精製
アプタマーは、核酸専用の固相合成器であるBioautomation社のMermade12合成器を用いて、オリゴ固相合成(Solid Phase Oligo Synthesis)方法で自体合成した。オリゴヌクレオチド合成器(Bioautomation、Mermade12)を用いてβ−シアノエチル ホスホロアミダイト固相化学反応(solid phase b−cyanoethyl phosphoramidite chemistry)で合成し、合成後、CPG(200nmole 合成カラム、1000A(MM1−1000−))を開裂(cleavage)溶液[t−ブチルアミン:メタノール:水(体積比1:1:2)]に入れて、70℃で5時間開裂/脱保護(deprotection)後に真空乾燥させた後、HPLC(GE、AKTA basic)を用いて分離/精製した。使用したカラムは、RP−C18カラム(Waters、Xbridge OST C18 10x50mm)であり、UV254nm/290nm、流速:5ml/分、温度:65℃の条件で、0.1M TEAB/アセトニトリル緩衝液を用いた。これらのアプタマーはいずれも、LC−ESI MS分光計(Waters HPLC systems(Waters)+Qtrap2000(ABI))で0.02%の誤差範囲内で正確な分子量を測定し、HPLCを用いた純度測定から80−90%を得ることができた。
アプタマーは、核酸専用の固相合成器であるBioautomation社のMermade12合成器を用いて、オリゴ固相合成(Solid Phase Oligo Synthesis)方法で自体合成した。オリゴヌクレオチド合成器(Bioautomation、Mermade12)を用いてβ−シアノエチル ホスホロアミダイト固相化学反応(solid phase b−cyanoethyl phosphoramidite chemistry)で合成し、合成後、CPG(200nmole 合成カラム、1000A(MM1−1000−))を開裂(cleavage)溶液[t−ブチルアミン:メタノール:水(体積比1:1:2)]に入れて、70℃で5時間開裂/脱保護(deprotection)後に真空乾燥させた後、HPLC(GE、AKTA basic)を用いて分離/精製した。使用したカラムは、RP−C18カラム(Waters、Xbridge OST C18 10x50mm)であり、UV254nm/290nm、流速:5ml/分、温度:65℃の条件で、0.1M TEAB/アセトニトリル緩衝液を用いた。これらのアプタマーはいずれも、LC−ESI MS分光計(Waters HPLC systems(Waters)+Qtrap2000(ABI))で0.02%の誤差範囲内で正確な分子量を測定し、HPLCを用いた純度測定から80−90%を得ることができた。
実施例2:インスリン受容体アプタマーの結合特性
2.1.細胞実験のための準備
アプタマーを処理する前、血清欠乏のために、細胞をFBSのないDMEMに3時間処理した。以降、1時間、Krebs−Ringer HEPES緩衝液[25mM HEPES(pH7.4)、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、および1.3mM KH2PO4]に細胞処理した。細胞処理のためのすべてのアプタマーは、同一のKrebs−Ringer HEPES緩衝液に準備され、正確な2次構造形成のために、95℃で5分間加熱して、常温でゆっくり冷やす過程を経た。
2.1.細胞実験のための準備
アプタマーを処理する前、血清欠乏のために、細胞をFBSのないDMEMに3時間処理した。以降、1時間、Krebs−Ringer HEPES緩衝液[25mM HEPES(pH7.4)、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、および1.3mM KH2PO4]に細胞処理した。細胞処理のためのすべてのアプタマーは、同一のKrebs−Ringer HEPES緩衝液に準備され、正確な2次構造形成のために、95℃で5分間加熱して、常温でゆっくり冷やす過程を経た。
2.2.インスリン競合分析(Insulin competition assay)
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62のインスリン受容体に対する結合特性を調べるために、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いてインスリン競合分析(Insulin competition assay)を進行させた。Rat−1/hIR細胞を、5mM EDTAが含まれているPBSを用いて細胞培養容器から引き離した。準備された細胞にブロッキング緩衝液(Blocking buffer)(PBS、1%BSA、および0.1%NaN3)を処理して、4℃で30分間、20rpmで回転して反応させた。以降、FITCの結合したインスリンを多様な濃度のIR−A48と共に処理して、それぞれの結合が平衡状態に至るように、4℃で1時間反応させた。細胞をPBSで2回洗った後、4%パラホルムアルデヒドが含まれているPBSで常温に30分間固定させた。細胞に結合したインスリンの量をフローサイトメトリー(Flow cytometry、BD FACSCantoTM II)によりFITCの蛍光を測定することによって観察した。
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62のインスリン受容体に対する結合特性を調べるために、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いてインスリン競合分析(Insulin competition assay)を進行させた。Rat−1/hIR細胞を、5mM EDTAが含まれているPBSを用いて細胞培養容器から引き離した。準備された細胞にブロッキング緩衝液(Blocking buffer)(PBS、1%BSA、および0.1%NaN3)を処理して、4℃で30分間、20rpmで回転して反応させた。以降、FITCの結合したインスリンを多様な濃度のIR−A48と共に処理して、それぞれの結合が平衡状態に至るように、4℃で1時間反応させた。細胞をPBSで2回洗った後、4%パラホルムアルデヒドが含まれているPBSで常温に30分間固定させた。細胞に結合したインスリンの量をフローサイトメトリー(Flow cytometry、BD FACSCantoTM II)によりFITCの蛍光を測定することによって観察した。
その結果、IR−A48は、アゴニストとして活性を有するにもかかわらず、インスリンの結合を妨げないことを確認した(図2A)。これは、IR−A48がインスリンの結合するオルソステリックサイト(orthosteric site)でない、完全に異なるアロステリックサイト(allosteric site)に結合するとの意味を有する。IR−A62は、アゴニストとして活性を有するにもかかわらず、インスリンの結合を増加させる促進的相互作用(Positive cooperativity)を有することを確認した(図2C)。
2.3.フィルタ結合分析(filter binding assay)
選別されたアプタマーの結合力を調べるために、フィルタ結合分析法(filter binding assay)を行った。まず、アプタマーの5’末端にTdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase、NEB)でα−P32ATP(PerkinElmer)を標識した。アプタマー1μM0.25μL、α−P32ATP(5μM、perkinelmer)、0.25μL、TdTおよび10X NEB緩衝液4 10μL 反応体積で37℃で30分間反応させ、70℃で10分間インキュベーションして、TdTを不活性化させた。標識されたDNAプールは、Micro spin G−50 カラム(GE healthcare)を用いて精製した。
選別されたアプタマーの結合力を調べるために、フィルタ結合分析法(filter binding assay)を行った。まず、アプタマーの5’末端にTdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase、NEB)でα−P32ATP(PerkinElmer)を標識した。アプタマー1μM0.25μL、α−P32ATP(5μM、perkinelmer)、0.25μL、TdTおよび10X NEB緩衝液4 10μL 反応体積で37℃で30分間反応させ、70℃で10分間インキュベーションして、TdTを不活性化させた。標識されたDNAプールは、Micro spin G−50 カラム(GE healthcare)を用いて精製した。
標識されたアプタマー20,000cpmを100μL 1xSB緩衝液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)に入れて、95℃から1秒に0.1℃ずつ37℃までゆっくり冷却させた。そして、緩衝液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)を用いて、インスリン受容体蛋白質を100nMから12pointで順次に希釈した後、前記加熱および冷却させたDNAプール30μLをそれぞれ添加して、37℃で30分間反応させた。ナイロンメンブレン(Nylon membrane、GE healthcare)にDNAとインテグリンαVβ3との混合物をそれぞれ2μLずつスポッティングした後、zorbax樹脂(Agilent)5.5μLを添加した。そして、予め1X SB緩衝液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)50μLに浸しておいたDuraporeフィルタ(Millipore)に入れて、減圧をかけた。そして、メンブレンフィルタを100μLの1X選択緩衝液(selection buffer)(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)で洗った。フィルタプレートをイメージプレートに一晩露出させた後、FLA−5100(Fuji)でイメージを定量化した。
その結果、IR−A48およびIR A48FのKdはそれぞれ3.5nMおよび6.9nMであり、IR−A48はインスリン受容体には結合したが、IGF−1受容体には結合しないことを確認することができた。前記結果を図1Cに示した。
また、その結果、IR−A62およびIR−A62FのKdはそれぞれ2.4nMおよび26.9nMであり、IR−A62はインスリン受容体には結合したが、IGF−1受容体には結合しないことを確認することができた。前記結果を図1Fに示した。
実施例3:インスリン受容体アプタマーのリン酸化
3.1.ウェスタン ブロッティング
インスリン受容体および信号伝達蛋白質のリン酸化を観察するために、溶解緩衝溶液[50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、20mM NaF、10mM β−グリセロリン酸、2mM Na3VO4、1mM PMSF、10%グリセロール、1%Triton−X、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル]に細胞を溶解させた。細胞溶解物は、95℃、14,000rpmで15分間遠心分離して蛋白質を分離した。準備された細胞溶解物は6%〜16%SDS−PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース膜(Nitrocellulose membrane)に移された。膜に1次抗体を4℃で12時間反応させた後、HPR(ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase))あるいはIRDye800CW(LI−COR)の結合した2次抗体を常温で1時間反応させた。蛋白質の存在およびリン酸化の程度は、ECL(Thermo Scientific、MA)を介したChemiluminescenceあるいはInfrared fluorescence system(Odyssey、LI−COR)を用いて測定された。
3.1.ウェスタン ブロッティング
インスリン受容体および信号伝達蛋白質のリン酸化を観察するために、溶解緩衝溶液[50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、20mM NaF、10mM β−グリセロリン酸、2mM Na3VO4、1mM PMSF、10%グリセロール、1%Triton−X、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル]に細胞を溶解させた。細胞溶解物は、95℃、14,000rpmで15分間遠心分離して蛋白質を分離した。準備された細胞溶解物は6%〜16%SDS−PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース膜(Nitrocellulose membrane)に移された。膜に1次抗体を4℃で12時間反応させた後、HPR(ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase))あるいはIRDye800CW(LI−COR)の結合した2次抗体を常温で1時間反応させた。蛋白質の存在およびリン酸化の程度は、ECL(Thermo Scientific、MA)を介したChemiluminescenceあるいはInfrared fluorescence system(Odyssey、LI−COR)を用いて測定された。
3.2.インスリン受容体のリン酸化
実施例1のIR−A48およびIR−A62アプタマーがインスリンの結合に及ぼす影響を調べるために、IR−A48、IR−A62およびインスリンを処理する場合、インスリン受容体のリン酸化の程度を前記記載のウェスタンブロッティング法により観察し、その結果を図2Bおよび図2Dに示した。
実施例1のIR−A48およびIR−A62アプタマーがインスリンの結合に及ぼす影響を調べるために、IR−A48、IR−A62およびインスリンを処理する場合、インスリン受容体のリン酸化の程度を前記記載のウェスタンブロッティング法により観察し、その結果を図2Bおよび図2Dに示した。
Rat−1/hIR細胞においてインスリンによるIRS、AKT、ERKのリン酸化は、IR−A48またはIR−A62と共に処理したにもかかわらず、何ら影響を受けなかった。しかし、IR−A48またはIR−A62によるインスリン受容体のリン酸化はインスリンとは異なった。インスリン受容体キナーゼ領域のY1150/Y1151のリン酸化は、インスリンとIR−A48またはIR−A62ともによって増加した。IR−A48とインスリンが共に処理された時、Y1150/Y1151のリン酸化は協力的に増加し、IR−A48とインスリンが共に処理された時、Y1150/Y1151のリン酸化は大きく増幅された。全体チロシンのリン酸化はインスリンによってのみ大きく増加し、IR−A48とIR−A62の影響はわずかであった。まとめてみれば、これらの結果は、IR−A48であるインスリンと独立して作用し、IR−A62はインスリンの活性を増幅させるが、その活性はキナーゼ領域の特定チロシン(Y1150/Y1151)に偏っていることを示す。
3.3.ELISA−細胞内チロシンのリン酸化
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62アプタマーのリン酸化効果を調べるために、6種類の抗体を使用した。インスリンが受容体に結合する時、細胞内領域の7つのチロシン(Y953、Y960、Y1146、Y1150、Y1151、Y1316およびY1322)がリン酸化されるが、このうち、Y953に対する抗体は開発されず、計6つのチロシンに対して実験した。
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62アプタマーのリン酸化効果を調べるために、6種類の抗体を使用した。インスリンが受容体に結合する時、細胞内領域の7つのチロシン(Y953、Y960、Y1146、Y1150、Y1151、Y1316およびY1322)がリン酸化されるが、このうち、Y953に対する抗体は開発されず、計6つのチロシンに対して実験した。
抗体の抗原特異性を観察するためにELISAを行ったが、まず、抗原として用いられる3種類のペプチド(MTRDIYETD−pY−pY−RKGGKGLL、MTRDIYETD−pY−YRKGGKGLL、MTRDIYETDY−pY−RKGGKGLL)は、Selleckchem(Houston、TX)で合成された。PBSに溶かした20pmol/100μlのペプチドをN−オキシスクシンイミドエステル基でコーディングされた96プレート(Corning、MA)に4℃で12時間反応させて共有結合で連結させた。1%BSAが含まれているPBSで1時間blocking後、TTBS緩衝溶液[50mM Tris−HCl(pH7.6)、150mM NaCl、および0.05%Tween−20]で1回洗った。抗体をTTBS緩衝溶液に1:1000で稀釈させた後、常温で1時間、96プレートに結合した抗原と結合させた。TTBS緩衝溶液で3回洗った後、AP(アルカリホスファターゼ(Alkaline phosphatase))の結合した2次抗体1:2000で希釈して、1時間常温で結合させた。TTBS緩衝溶液で3回洗った後、100ulのCSPDを添加して常温で30分間反応させた後、光度計(Luminoskan Ascent)を用いて化学発光を測定した。
Y1150/Y1151に偏ったリン酸化を明確に検証するために、2つの異なる種類のpY1150/pY1151抗体を使用した:10C3(sc−81500、Santa Cruz)pAb(44804G、Invitrogen)。また、Y1150とY1151は独立してリン酸化されるため、2つの抗体がそれぞれpY1150、pY1151、pY1150/pY1151に互いに異なる特異性を有していると仮定し、これを検証するために、pY1150、pY1151、pY1150/pY1151に対応する合成ペプチド(peptides)を準備しながら、ELISAにより抗体の特異性を確認した。
その結果を図3Aに示し、インスリンはY960、Y1146、Y1150、Y1151、Y1316、Y1322のすべてのリン酸化を増加させたが、IR−A48およびIR−A62は単にキナーゼ領域のY1150/Y1151のリン酸化だけを増加させたことが分かる。
図3Bから分かるように、10C3抗体はpY1150/pY1151とpY1150のすべてに似た程度に結合したが、pAb抗体は単にpY1150/pY1151にだけ強く結合した。この結果により、IR−A48がインスリン受容体キナーゼ領域のY1150のみを優先的にリン酸化させるバイアスアゴニスト(biased agonist)であることが裏付けられた。
3.4.信号伝達蛋白質のリン酸化
実施例1で発掘されたIR−A48によるY1150のリン酸化がインスリンの信号伝達にどのような異なる影響を及ぼすかをインスリンと比較した。
実施例1で発掘されたIR−A48によるY1150のリン酸化がインスリンの信号伝達にどのような異なる影響を及ぼすかをインスリンと比較した。
前記実験の結果、IR−A48は、インスリンに匹敵する程度の信号伝達を活性化させた。インスリン(50nmol/L)が処理された3T3−L1脂肪細胞においてインスリン受容体とIRS、AKT、ERKなどの蛋白質のリン酸化は5分間急速に増加し、時間の経過と共に次第に減少した。インスリンとは対照的に、IR−A48(200nmol/L)は、RS(Y608、Y632)、AKT(T308、S473)、AS160(T642)、GSK3 α/β(S21/S9)、FOXO1/3a(T24/T32)のリン酸化を2時間かけてゆっくり増加させ、リン酸化は4時間持続した。前記結果を図4Aに示した。
インスリン受容体のリン酸化は信号伝達において2つの役割を果たすが、第一、キナーゼ領域のリン酸化(Y1146、Y1150、Y1151)はキナーゼの活性を調節し、第二、Y960とY1322のリン酸化がインスリン受容体に結合する信号伝達蛋白質の結合位置として使用される。このようなY1150に偏ったリン酸化を考慮する時、IR−A48は、他のチロシンの低いリン酸化によってインスリンの信号伝達を大きく高められないと考えられたにもかかわらず、IR−A48はインスリンレベルの信号伝達活性を示して予期せぬ効果を示したことを確認した。
何よりも、IR−A48は、特定インスリンの信号伝達に偏った活性を示した。IR−A48によって、AKT S483のインスリンと比較して98%程度の高いリン酸化程度を示したが、AKT T308のリン酸化は単に37%にとどまった(図4A、4B、および4C)。また、IR−A48は、EKRのリン酸化にはほとんど影響を及ぼさなかった(図4Aおよび4D)。このように、IR−A48はインスリン受容体の信号伝達を活性化させるが、インスリンによる信号伝達とは明確に異なる特性を有している。
実施例4:インスリン受容体アプタマーのブドウ糖吸収
4.1.3T3−L1脂肪細胞におけるブドウ糖吸収
前記実施例1で発掘されたIR−48がAKT S473のリン酸化を増加させたため、ブドウ糖吸収に対するIR−A48の活性を3T3−L1脂肪細胞で調べた。
4.1.3T3−L1脂肪細胞におけるブドウ糖吸収
前記実施例1で発掘されたIR−48がAKT S473のリン酸化を増加させたため、ブドウ糖吸収に対するIR−A48の活性を3T3−L1脂肪細胞で調べた。
完全に分化した3T3−L1脂肪細胞を血清欠乏のためにFBSのないDMEMに3時間処理した後、1時間、Krebs−Ringer HEPES緩衝溶液で処理した。インスリンあるいはアプタマーを当該時間の間処理した後、2−デオキシ[14C]グルコース(0.1μCi/ml)を10分間処理した。20mMブドウ糖が添加されたPBSで3回洗い、0.5N NaOHと1%SDSが含まれている溶液で細胞を溶かした。液体閃光計数器(Liquid scintillation counter)を用いて細胞内に吸収した2−デオキシ−D−グルコースの量を観察した。
3T3−L1脂肪細胞にインスリン(50nmol/L)を処理した時、ブドウ糖吸収は、30分から1時間程度で最も高く増加してからゆっくり減少して8時間後には半分以下に低下した。Y1150に偏ったリン酸化にもかかわらず、IR−A48(200nmol/L)は、インスリンと似た程度のレベルにブドウ糖吸収を増加させた。しかし、信号伝達蛋白質のリン酸化パターンと同様に、ブドウ糖吸収も4時間かけてゆっくり増加させ、8時間以上持続した。また、IR−A48とインスリンを共に処理した時は、IR−A48のアロステリック結合(allosteric binding)のため、ブドウ糖吸収は協力的に増加した。前記結果を図6Aに示した。
遅い増加速度にもかかわらず、IR−A48は、高濃度でブドウ糖吸収を十分に増加させた。インスリンとIR−A48の濃度に応じた活性を測定するために、それぞれ最も高い反応を示した処理時間にブドウ糖吸収を観察した(インスリンは30分、IR−A48は4時間)。最も高い濃度でインスリンとIR−A48とも似た程度の飽和したブドウ糖吸収程度を示した。しかし、インスリンの場合、濃度に応じて徐々に増加するブドウ糖吸収を示したが(ヒル係数(Hill coefficient):0.77)、IR−A48は、20nmol/Lと200nmol/Lとの間で急激に増加する様子を示した(ヒル係数:0.77)。その結果、IR−A48(66.2nmol/L)のEC50はインスリン(8.9nmol/L)より高かったが、IR−A48(202.4nmol/L)のEC95はインスリン(261.9nmol/L)より若干低かった。前記結果を図6Bに示した。
4.2.PI3Kによるブドウ糖吸収の誘導
前記実施例1で発掘されたIR−A48の活性がPI3Kを介して伝達されるか否かを確認するために、3T3−L1でPI3K阻害剤(LY294002)を1時間処理した後、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加を調べた。その結果、IR−A48によるブドウ糖吸収だけでなく、AKTのリン酸化もLY294002によって阻害することを確認した。その結果を図6Cおよび図6Dに示し、これは、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加は、インスリンと同様に、PI3Kを介して誘導されることを示す。
前記実施例1で発掘されたIR−A48の活性がPI3Kを介して伝達されるか否かを確認するために、3T3−L1でPI3K阻害剤(LY294002)を1時間処理した後、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加を調べた。その結果、IR−A48によるブドウ糖吸収だけでなく、AKTのリン酸化もLY294002によって阻害することを確認した。その結果を図6Cおよび図6Dに示し、これは、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加は、インスリンと同様に、PI3Kを介して誘導されることを示す。
実施例5:癌細胞成長の誘導
実施例1で発掘されたIR−A48が細胞分裂に及ぼす影響を調べるために、インスリンの細胞分裂誘導能力を実験するのに幅広く使用されるMCF−7癌細胞株を使用した。
実施例1で発掘されたIR−A48が細胞分裂に及ぼす影響を調べるために、インスリンの細胞分裂誘導能力を実験するのに幅広く使用されるMCF−7癌細胞株を使用した。
MCF7細胞を24−ウェル プレートにウェルあたり10000個培養した後、24時間育てる。血清欠乏のために、0.5%FBS DMEMで追加的に24時間さらに育てる。インスリンあるいはアプタマーを72時間処理し、24時間経過するたびに培地を新たに入れ替えた。処理が終わった後、細胞を4%パラホルムアルデヒドが含まれているPBSで常温に30分間固定させた。細胞が有するDNAを1μM SYTO60蛍光色素が含まれているPBSで染色させた後、LI−COR Odysseyスキャナで蛍光を測定することにより、細胞の量を定量した。
MCF−7にインスリンとIR−A48をそれぞれ単独処理した結果、インスリンは細胞分裂を2.1倍増加させたが、IR−A48は何ら影響がなかった。また、IR−A48(1umol/L)をインスリンと共に混合して処理した時も、インスリンによる細胞分裂に何ら影響を及ぼさなかった。IR−A48がMCF−7細胞に存在するインスリン受容体を活性化させない可能性を排除するために、MCF−7細胞においてIR−A48によるインスリンの信号伝達を確認した。その結果、3T3−L1脂肪細胞と同様に、MCF−7細胞においてもインスリン受容体Y1150とAKT S473をリン酸化させることを確認した。前記結果を図5A〜図5Cに示し、その結果、IR−A48によって誘導される信号伝達は、インスリン受容体による細胞分裂の誘導と完全に分離された機能を有することが分かった。
実施例6:in vivo血糖実験
前記実施例3〜実施例6の結果をin vivoで証明するために、実施例1で発掘されたIR−A48がマウスの血糖に及ぼす影響を測定した。
前記実施例3〜実施例6の結果をin vivoで証明するために、実施例1で発掘されたIR−A48がマウスの血糖に及ぼす影響を測定した。
血液中でIR−A48が3’エキソヌクレアーゼ(3’exonucleases)によって急速に分解されるのを防止するために、IR−A48の3’末端に逆位デオキシチミジン(inverted deoxythymidine、idT)を追加した。8週齢の雄C57Bl/6J実験マウスを12時間絶食させた後、10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kgのIR−A48をPBSに溶かして、静脈注射により実験マウスに投与した。投与後、15分、30分、60分、90分、120分経過した時、尾から血液を採取して血糖測定器(Accu−Check Active;Roche Diagnostics)により血糖の変化を観察した。投与30分後、10mg/kg IR−A48が投与されたマウスの血糖(41%減少)は、0.6unit/kgのインスリン(51%減少)と似た程度に減少した。しかし、30分後に急速に血糖が回復するインスリンとは異なって、IR−A48が投与されたマウスは、1時間まで血糖が持続的に減少し、その後にゆっくり回復する様相を示した。前記結果を図7に示した。
これにより、IR−A48がin vitroだけでなく、in vivoにおいても活性があることを確認し、これは、IR−A48がアロステリックの調節により、インスリンとは独立して血糖を調節できることを示す。
Claims (21)
- インスリン受容体の細胞外領域に特異的に結合し、インスリン受容体のリン酸化を促進するアプタマーである、インスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、IGF−1受容体には結合しないことを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、5’−位置に疎水性官能基で置換されて修飾されたデオキシリボースウラシルを含むものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体のY1150をリン酸化するか、またはAKT S473をリン酸化させるものである、請求項4に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、MAPK経路と独立した経路で活性化させることを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を起こすが、細胞の成長または分裂を起こさないものである、請求項5に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号2または配列番号7の塩基配列を含むものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号1の塩基配列内の配列番号2の塩基配列を必須として含み、前記配列番号2の塩基配列の少なくとも一末端に連続する33個〜80個のヌクレオチドからなるものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号6の塩基配列内の配列番号7の塩基配列を必須として含み、前記配列番号7の塩基配列の少なくとも一末端に連続する27個〜80個のヌクレオチドからなるものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号2または配列番号7の塩基配列がステム−ループ構造を形成するものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記疎水性官能基は、ナフチル基、ベンジル基、ピロールベンジル基、およびトリプトファンからなる群より選択された1種以上である、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記配列番号2の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が1〜20nMである、請求項8に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記配列番号2の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が0.5〜40nMである、請求項8に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーに含まれている少なくとも1つの塩基は、PEG、ビオチンidT、LNA、2’−メトキシヌクレオシド、2’−アミノヌクレオシド、2’F−ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、およびコレステロールからなる群より選択された1種以上が結合して修飾されたことを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 二量体または多量体として存在する、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを含む、インスリン受容体作用剤。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、IGF−1受容体には結合しないことを特徴とする、請求項16に記載の作用剤。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、インスリン関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 前記疾患は、糖尿病、糖尿合併症、代謝性症候群、肥満または心血管疾患である、請求項18に記載の薬学組成物。
- インスリンを追加的に含む、請求項19に記載の薬学組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、糖尿病または糖尿合併症の診断用組成物。
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