CN105722850A - 核苷酸类似物 - Google Patents

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Abstract

本文提供涉及核酸操作和检测的技术，包括但不限于涉及包含化学反应性连接部分的核苷酸的组合物、方法和试剂盒。

Description

核苷酸类似物
本申请要求2013年8月19日提交的美国临时专利申请顺序号61/867,202的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本文提供涉及核酸的操作和检测的技术，包括但不限于涉及包含化学反应性连接部分的核苷酸的组合物、方法和试剂盒。
发明背景
核酸检测方法依然在分子诊断学领域中用作关键工具。操作生物分子的能力明确且有效地提供许多成功检测技术的基础。例如，将化学、生物或物理部分与目标生物分子连接(例如加入“标签”)是一种涉及生物分子的后续操作、检测和/或鉴定的关键技术。
常规连接技术通常依靠酶辅助方法。例如，将所需标签附加在靶DNA上的一些方法利用连接酶使靶DNA与标签(例如包含标签的另一个DNA片段、用作标签本身的另一个DNA片段等)连接。在另一种方法中，聚合酶将聚合酶的标签修饰的底物(例如dNTP或修饰的dNTP)掺入核酸中。这些酶辅助方法的优势是生物分子与所述部分连接的键是允许进一步操作缀合产物的“天然”键。然而，一些重大缺点包括由于酶可识别的靶生物分子上存在的多个反应基团所致的产物收率低、反应效率低和特异性低。另外，常规方法在时间和金钱上费用高昂。
发明概述
因此，本文提供涉及使用化学缀合将各部分与生物分子连接的技术。这些连接反应比常规技术更有特异性并更有效，因为反应经设计以包括特定化学部分之间缀合的机制。
虽然生物催化剂(例如酶)不识别和/或加工大多数常见的化学共价键，从而限制缀合产物的后续操作，但是本文所述技术提供允许通过标准分子生物学和生物化学技术对缀合产物进行下游操作的化学健。
例如，虽然有许多目前可获得的可终止聚合酶反应的核苷酸类似物(例如二脱氧核苷酸和各种3′修饰的核苷酸类似物)，但这些分子抑制或严重限制被这些类似物终止的核酸的进一步操作。例如，后续酶促反应例如聚合酶链式反应被核苷酸类似物完全或基本上抑制。另外，一些溶液利用称为“可逆终止剂(reversibleterminator)”的核苷酸类似物，其中3′羟基被化学部分帽化，所述化学部分可用特殊化学反应脱去，从而再生游离的3′羟基。然而，使用这些核苷酸类似物需要额外的脱保护(去帽化)步骤以从核酸中脱去保护(帽化)部分以及额外的纯化步骤以从反应混合物中除去释出的保护(帽化)部分。
与常规技术形成对比，本文提供涉及包含化学反应基的核苷酸(例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸)类似物的设计、合成和应用的技术。例如，一些实施方案提供包含炔基的核苷酸类似物，例如包含3′炔基的核苷酸，例如在涉及3′-O-炔丙基脱氧核苷酸的技术的实施方案中提供。所述化学基团和键不损害或显著限制后续分子生物学技术的应用以操作包含核苷酸类似物的化合物(例如核酸、缀合物和其它生物分子)。因此，包含所述核苷酸类似物的化合物(例如核酸、缀合物和其它生物分子)可用于许多应用。
在一些实施方案中，核苷酸类似物用作功能性核苷酸终止剂，即核苷酸类似物终止通过聚合酶的核酸合成，并且另包含用于后续化学和/或生物化学加工、反应和/或操作的官能反应基。具体地说，一些实施方案提供其中3′羟基被包含例如炔(例如碳-碳三键，例如C≡C)的化学部分帽化的核苷酸类似物。当在合成期间通过聚合酶(例如DNA和/或RNA聚合酶)将3′炔核苷酸类似物掺入核酸中时，核酸的进一步延伸被停止(“终止”)，因为核酸没有游离的3′羟基以提供用于后续核苷酸添加的合适底物。
虽然核苷酸类似物不是常规分子生物学酶的天然底物，但是炔化学部分是众所周知的与特定官能部分起反应的化学缀合配偶体。例如，炔在铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成(“CuAAC”)反应中与叠氮基(例如N3，例如N=N=N)反应，在叠氮化物氮和烃基碳之间形成两个新的共价键。共价键在包含键合前的叠氮化物和炔部分的第一组分和第二组分之间形成化学键(例如包含五元三唑环)。这种类型的环加成反应是“点击化学(clickchemistry)”的基础反应之一，因为它提供所需的化学收率，是生理学上稳定的，并显示有利于产生单一产物(例如1,2,3-三唑的1,4-区域异构体)的“弹簧支承(spring-loaded)”反应的大的热力学驱动力。参见例如Huisgen(1961)“CentenaryLecture–1,3-DipolarCycloadditions(世纪演讲——1,3-偶极环加成)”,ProceedingsoftheChemicalSocietyofLondon357；Kolb,Finn,Sharpless(2001)“ClickChemistry:DiverseChemicalFunctionfromaFewGoodReactions(点击化学：来自少数良好反应的不同的化学功能)”,AngewandteChemieInternationalEdition40(11):2004-2021。例如：
，
其中R1和R2分别为任何化学结构或化学部分。
反应可在各种溶剂中进行，包括水性混合物、含水和/或水性混合物的组合物、和各种有机溶剂，包括包含醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔丁醇(TBA或tBuOH；亦称为2-甲基-2-丙醇(2M2P))和丙酮的组合物。在一些实施方案中，反应在包含基于铜的催化剂例如Cu/Cu(OAc)2、叔胺例如三-(苄基三唑基甲基)胺(TBTA)和/或四氢呋喃和乙腈(THF/MeCN)的环境中进行。
在一些实施方案中，三唑环连键具有以下结构：
，例如，例如，例如，，
其中R1和R2分别为任何化学结构或化学部分(且在不同结构中可以是相同或不同的化学结构或化学部分)，B、B1和B2分别表示核苷酸的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等)。
由炔-叠氮化物环加成形成的三唑环连键具有与存在于核酸中的天然磷酸二酯键类似的特性(例如物理学、生物学、生物化学、化学特性等)，因此是核酸骨架模拟物。因此，识别作为底物的天然核酸的常规酶也识别作为底物的通过按本文所述技术提供的炔-叠氮化物环加成形成的产物。参见例如El-Sagheer等(2011)“BiocompatibleartificialDNAlinkerthatisreadthroughbyDNApolymerasesandisfunctionalinEscherichiacoli(通过DNA聚合酶通读且在大肠杆菌中起作用的生物相容性的人工DNA接头)”,ProcNatlAcadSciUSA108(28):11338–43。
在一些实施方案中，使用包含炔的核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物)产生具有末端3′炔基的核酸(例如DNA或RNA多核苷酸片段)。例如，在一些实施方案中，在聚合酶延伸反应中将包含炔的核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物)掺入核酸的延伸链中；一旦掺入，核苷酸类似物便停止聚合酶反应。这些终止的核酸是用于点击化学反应(例如炔-叠氮化物环加成)的合适的化学反应物，例如用于与叠氮化物修饰的分子例如5′-叠氮化物修饰的核酸、包含叠氮化物的标记部分、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的蛋白质等，包括但不限于本文所述部分、实体和组分化学连接。在一些实施方案中，例如，核酸产物3′末端的3′-O-炔丙基用于使用例如通过点击化学反应提供的化学连接与叠氮化物修饰的标签的标记反应。使用这种化学法产生的共价键模拟天然核酸磷酸二酯键的共价键，从而提供化学连接的核酸在后续酶促反应(例如聚合酶链式反应)中的应用，其中三唑化学健引起酶促反应的最小的、有限的或无法检出的(例如无)抑制。
在一些实施方案中，使包含炔的核苷酸类似物在Staudinger连接中与包含膦部分的反应物反应。在Staudinger连接中，将亲电子陷阱(例如甲基酯)置于三芳基膦芳基(通常为磷原子的邻位)上，并与叠氮化物反应得到aza-ylide中间体，其然后重排(例如在水性介质中)得到具有酰胺基和氧化膦官能的化合物。Staudinger连接使两个起始分子连接(结合和共价连接)在一起。
因此，本文提供涉及包含具有下列结构的核苷酸类似物的组合物的技术：
，
其中B为碱基，P包含磷酸部分。在一些实施方案中，P包含四磷酸；三磷酸；二磷酸；一磷酸；5′羟基；α硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)、β硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)和/或γ硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)或α甲基膦酸、β甲基膦酸和/或γ甲基膦酸。
在一些实施方案中，P包含叠氮化物(例如N3，例如N=N=N)，因此在一些实施方案中提供本文所述的定向双官能聚合剂。
在一些实施方案中，B为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基。即，在一些实施方案中，B为嘌呤或嘧啶或修饰的嘌呤或修饰的嘧啶。该技术不限于应用于核苷酸类似物的碱基B。例如，B可为任何合成的、人工的或天然的碱基；因此，在一些实施方案中，B为合成碱基；在一些实施方案中，B为人工碱基；在一些实施方案中，B为天然碱基。在一些实施方案中，组合物包含核苷酸类似物和核酸(例如多核苷酸)。在一些实施方案中，组合物进一步包含聚合酶和/或核苷酸(例如常规核苷酸)。在一些实施方案中，在包含核苷酸和核苷酸类似物的组合物中，核苷酸类似物与核苷酸的数目比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:50、1:75、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:5000或1:10000。
在一些实施方案中，核酸包含本文提供的核苷酸类似物。在一些实施方案中，核酸在其3′端包含核苷酸类似物(例如核苷酸类似物在核酸的3′端)。在一些实施方案中，该技术涉及通过生物酶合成包含核苷酸类似物的核酸。即，生物酶识别作为底物的核苷酸类似物，并将核苷酸类似物掺入核酸中。例如，在一些实施方案中，核酸通过聚合酶产生。
在一些实施方案中，组合物进一步包含叠氮化物，例如包含叠氮化物的组分、实体、分子、表面、生物分子等。
在一些实施方案中，组合物包含多个核酸；因此，在一些实施方案中，组合物包含第二核酸(例如除包含核苷酸类似物的核酸以外)。该技术包括用于与包含核苷酸类似物的核酸反应的官能化核酸。因此，在一些实施方案中，第二核酸包含叠氮化物部分，例如，在一些实施方案中，第二核酸包含在第二核酸5′端的叠氮化物部分。
该技术不限于与包含核苷酸类似物的核酸反应的实体(例如包含叠氮基)。例如，在一些实施方案中，组合物进一步含有包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸、包含叠氮化物的生物素或包含叠氮化物的蛋白质。在一些实施方案中，使用被基于铜的催化剂催化的“点击化学”反应使炔部分和叠氮化物部分反应。因此，在一些实施方案中，组合物进一步包含基于铜的催化试剂。在一些实施方案中，叠氮化物和炔的反应得到三唑部分。在一些实施方案中，使包含炔的核酸(例如含有包含炔的核苷酸类似物的核酸)与包含叠氮化物的核酸反应，得到较长的核酸。因此，在一些实施方案中，该技术的组合物进一步含有包含三唑的核酸(例如在两个核酸之间形成键)。在一些实施方案中，炔和叠氮化物的反应具有区域选择性地进行，例如，在一些实施方案中，核酸包含1′,4′取代的三唑。在一些实施方案中，使包含核苷酸类似物的核酸与包含叠氮化物的条码寡核苷酸、衔接寡核苷酸(adaptoroligonucleotide)或包含条码(barcode)的衔接寡核苷酸反应。因此，在一些实施方案中，提供包含衔接寡核苷酸、包含条码的衔接寡核苷酸或条码寡核苷酸的反应混合物。
在一些实施方案中，核酸(例如通过炔和叠氮化物的“点击化学”反应由结合两个核酸所形成的核酸)包含以下结构：
或
其中R1和R2分别为任何化学结构或化学部分(且在不同结构中可以是相同或不同的化学结构或化学部分)，B1和B2分别表示核苷酸的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤，例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶，例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等)。
该技术的另一方面涉及用于合成修饰的核酸的方法的实施方案，所述方法包括提供包含炔基的核苷酸类似物，使核酸与核苷酸类似物连接，得到包含核苷酸类似物的修饰的核酸。在一些实施方案中，核苷酸类似物具有以下结构：
，
其中B为碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)，P包含三磷酸部分。所述方法的实施方案包括进一步提供例如模板、引物、核苷酸(例如常规核苷酸)和/或聚合酶。核苷酸类似物作为底物被生物酶(例如聚合酶)识别；因此，在一些实施方案中，聚合酶催化核酸与核苷酸类似物连接得到包含核苷酸类似物的修饰的核酸。修饰的核酸提供底物用于通过“点击化学”反应与带有叠氮化物的实体反应以形成例如缀合产物。因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括使修饰的核酸与叠氮化物部分反应。所述方法不限于包含叠氮化物部分的实体；例如，在一些实施方案中，所述方法包括使修饰的核酸与包含叠氮化物的第二核酸部分反应，例如，使修饰的核酸与在第二核酸的5′端包含叠氮化物的第二核酸部分、包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸和/或包含叠氮化物的蛋白质反应。
所述方法应用于使衔接寡核苷酸(例如用于下一代测序)与包含核苷酸类似物的核酸连接。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括使修饰的核酸与包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸、包含条码和包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸和/或包含叠氮化物部分的条码寡核苷酸反应，得到例如核酸-寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，通过基于铜的催化试剂催化核苷酸类似物(例如包含核苷酸类似物的核酸)和叠氮化物的反应。因此在一些实施方案中，相关方法包括使修饰的核酸与叠氮化物部分和基于铜的催化试剂反应。因为通过“点击化学”反应形成的三唑环基本不和/或不可检测地抑制生物酶活性，核酸-寡核苷酸缀合物提供有用的核酸用于进一步操作，例如，在一些实施方案中，修饰的核酸是生物酶的底物，修饰的核酸是聚合酶的底物，和/或修饰的核酸是测序反应的底物。
本文提供的核苷酸类似物是功能性终止剂，例如，它们起终止核酸合成的作用(例如类似于用于Sanger测序中的二脱氧核苷酸)，同时还包含用于进一步化学加工的反应基。因此，如本文所述，在一些实施方案中，所述方法进一步包括终止与核苷酸类似物的聚合。
在一些实施方案中，相关方法提供用于核酸测序的方法，所述方法包括使引物与核酸模板杂交形成杂交的引物/核酸模板复合物；提供多种核苷酸类似物，各核苷酸类似物包含炔部分；使杂交的引物/核酸模板复合物和核苷酸类似物与聚合酶反应以通过聚合酶反应将核苷酸类似物添加至引物中形成包含掺入的核苷酸类似物的延伸产物；并且使延伸产物与含叠氮化物的化合物反应形成包含三唑环的结构。在具体的实施方案中，核苷酸类似物是3′-O-炔丙基-dNTP核苷酸类似物，N选自A、C、G、T和U。因为通过“点击化学”反应形成的三唑环基本不抑制和/或无可检测地抑制生物酶活性，所以核酸-寡核苷酸缀合物提供有用的核酸用于进一步操作。因此，在一些实施方案中，将包含三唑环的结构用于后续酶促反应中，例如聚合酶链式反应和/或测序反应中。在一些实施方案中，另在常规(例如非终止剂)核苷酸存在下，在核苷酸类似物存在时进行聚合。相关方法包括提供常规核苷酸。
本文还提供试剂盒的实施方案。例如，在一些实施方案中，提供试剂盒用于合成修饰的核酸，试剂盒包括包含炔基的核苷酸类似物；和基于铜的催化试剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括应用于核酸处理和/或操作的其它组分。因此，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括聚合酶、包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸、和/或核苷酸(例如常规核苷酸)。
例如，该技术的一些实施方案涉及用于产生NGS测序文库和/或用于从靶核酸获得序列信息的试剂盒。例如，一些实施方案提供包括核苷酸类似物的试剂盒，例如用于按照本文提供的方法产生核苷酸片段阶梯。在一些实施方案中，核苷酸类似物是3′-O封闭的核苷酸类似物，例如3′-O-炔基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物。在一些实施方案中，在试剂盒中提供常规A、C、G、U和/或T核苷酸以及一种或多种(例如1、2、3或4种)A、C、G、U和/或T核苷酸类似物。
在一些实施方案中，试剂盒包括用于例如扩增(例如通过热循环、等温扩增)或测序等的聚合酶(例如天然聚合酶、修饰的聚合酶和/或改造的聚合酶等)。在一些实施方案中，试剂盒包括例如用于使衔接子与核酸(例如扩增子或阶梯片段)连接或用于使衔接子-扩增子环化的连接酶。试剂盒的一些实施方案包括例如用于点击化学反应，例如使叠氮化物和炔基反应形成三唑连接的基于铜的催化试剂。一些试剂盒实施方案提供缓冲剂、盐、反应容器、说明书和/或计算机软件。
在一些实施方案中，试剂盒包括引物和/或衔接子。在一些实施方案中，衔接子包含适于例如通过点击化学使衔接子与核苷酸类似物连接的化学修饰。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括包含炔基的核苷酸类似物和包含叠氮基(N3)的衔接寡核苷酸。在一些实施方案中，“点击化学”过程例如叠氮化物-炔环加成用来通过三唑形成使衔接子与片段连接。
具体的试剂盒实施方案提供用于产生测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括包含第一反应基(例如叠氮化物)的衔接寡核苷酸、3′-O封闭的核苷酸类似物(例如包含炔基、例如包含例如使用点击化学与第一反应基形成化学键的第二反应基的例如3′-O-炔基核苷酸类似物或3′-O-炔丙基核苷酸类似物)、聚合酶(例如用于等温扩增或热循环的聚合酶)、第二衔接寡核苷酸、包含核苷酸或核苷酸的混合物的一种或多种组合物和连接酶或基于铜的点击化学催化试剂。
在试剂盒的一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物(例如一种或多种3′-O-炔基核苷酸类似物例如一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物和一种或多种包含叠氮基的衔接寡核苷酸(例如5′-叠氮基寡核苷酸，例如5′-叠氮基-甲基寡核苷酸))。一些试剂盒实施方案进一步提供包含条码的5′-叠氮基-甲基寡核苷酸。一些试剂盒实施方案进一步提供包含多种条码的多种5′-叠氮基-甲基寡核苷酸(例如各5′-叠氮基-甲基寡核苷酸包含与一种或多种包含不同条码的其它5′-叠氮基-甲基寡核苷酸的一种或多种其它条码可区分的条码)。进一步的试剂盒实施方案包含点击化学催化试剂(例如铜(I)催化试剂)。
除一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物(例如一种或多种3′-O-炔基核苷酸类似物例如一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物)以外，一些试剂盒实施方案还包括一种或多种标准dNTP。例如，一些试剂盒实施方案提供dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们在分开的容器中或作为与一种或多种3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和/或3′-O-炔丙基-dATP的混合物。
一些试剂盒实施方案进一步包括获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌(Thermococcus)物种(例如分类学谱系为古细菌(Archaea)、广古菌门(Euryarchaeota)、热球菌纲(Thermococci)、热球菌目(Thermococcales)、热球菌科(Thermococcaceae)、热球菌属(Thermococcus)的生物)的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种9°N-7。在一些实施方案中，聚合酶包含提供修饰的底物(例如修饰的二脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸)的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含提供包含修饰的3′官能团的核苷酸类似物(例如本文所述的3′-O-炔丙基dNTP)的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶的氨基酸序列包含相对于热球菌属物种9°N-7野生型聚合酶氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，例如，丙氨酸取代氨基酸141位的天冬氨酸(D141A)、丙氨酸取代氨基酸143位的谷氨酸(E143A)、缬氨酸取代氨基酸409位的酪氨酸(Y409V)和/或亮氨酸取代氨基酸485位的丙氨酸(A485L)。在一些实施方案中，在包含克隆的热球菌属物种9°N-7聚合酶基因的异源宿主生物(例如大肠杆菌)中提供例如包含一个或多个突变(例如D141A、E143A、Y409V和/或A485L)的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是由NewEnglandBioLabs(Ipswich,Mass.)以商品名THERMINATOR(例如THERMINATORII)销售的热球菌属物种9°N-7聚合酶。
因此，一些试剂盒实施方案包括一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和/或3′-O-炔丙基-dATP的一种或多种)、标准dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物、一种或多种5′-叠氮基-甲基寡核苷酸衔接子、获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种的聚合酶和用于从叠氮基和烃基形成三唑的点击化学催化剂。在一些实施方案中，同时提供一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和/或3′-O-炔丙基-dATP的一种或多种)和标准dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物，例如，试剂盒包括包含一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和/或3′-O-炔丙基-dATP的一种或多种)和标准dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物的溶液。在一些实施方案中，溶液包含比率为1:500-500:1(例如1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:150、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1或500:1)的一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和/或3′-O-炔丙基-dATP的一种或多种)和标准dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物。
试剂盒的一些实施方案进一步包括用于处理序列数据的软件，例如，从序列仪生成的数据中提取核苷酸序列数据；从序列仪生成的数据中鉴定条码和靶亚序列；从序列仪生成的数据中比对和/或装配亚序列以产生共有序列；和/或将亚序列和/或共有序列与参比序列进行比对。
在一些实施方案中，本文提供包含具有下列结构的核苷酸类似物的组合物：
，
其中B为碱基(例如嘌呤或嘧啶例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；例如修饰的嘌呤或修饰的嘧啶)，P包含磷酸部分(例如四磷酸；三磷酸；二磷酸；一磷酸；5′羟基；α硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)、β硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)和/或γ硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)或α甲基膦酸、β甲基膦酸和/或γ甲基膦酸)；核酸；聚合酶和核苷酸(例如包含碱基B的核苷酸，例如，核苷酸类似物与核苷酸的数目比率为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:50、1:75、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:5000或1:10000)。
还提供包含核酸(例如由聚合酶产生的核酸)的组合物的实施方案，其中核酸包含(例如在其3′端)具有以下结构的核苷酸类似物：
，
其中B为碱基(例如嘌呤或嘧啶例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；例如修饰的嘌呤或修饰的嘧啶)，P包含磷酸部分(例如四磷酸；三磷酸；二磷酸；一磷酸；5′羟基；α硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)、β硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)和/或γ硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)或α甲基膦酸、β甲基膦酸和/或γ甲基膦酸)；第二核酸(例如包含例如在其5′端的叠氮化物)、包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸、包含叠氮化物的生物素或包含叠氮化物的蛋白质；铜(例如基于铜的)催化试剂；包含三唑(例如1′,4′取代的三唑)的核酸；和/或例如以下的结构：
或，
其中R1和R2分别为任何化学结构或化学部分(且在不同结构中可以是相同或不同的化学结构或化学部分)，B1和B2分别表示核苷酸的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等)；衔接寡核苷酸、包含条码的衔接寡核苷酸或条码寡核苷酸。
另一方面，该技术提供用于合成修饰的核酸的方法，所述方法包括提供包含炔基的核苷酸类似物，例如具有以下结构的核苷酸：
，
其中B为碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)，P包含三磷酸部分；使核酸与核苷酸类似物连接以产生包含核苷酸类似物的修饰的核酸；提供模板；提供引物；提供核苷酸；提供聚合酶(例如催化核酸与核苷酸类似物连接)；终止与核苷酸类似物的聚合；使修饰的核酸与叠氮化物部分(例如与在其5′端包含叠氮化物部分的第二核酸、包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸、包含叠氮化物的蛋白质、包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸、包含条码和包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸或包含叠氮化物部分的条码寡核苷酸)反应，例如产生核酸-寡核苷酸缀合物(例如这是生物酶例如聚合酶的底物和/或提供测序反应的底物)；和/或使修饰的核酸与叠氮化物部分和基于铜的催化试剂反应。
在一些实施方案中，提供用于核酸测序的方法，所述方法包括使引物与核酸模板杂交形成杂交的引物/核酸模板复合物；提供多种核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dNTP核苷酸类似物，其中N选自A、C、G、T和U)，各核苷酸类似物包含炔部分；提供常规核苷酸；使杂交的引物/核酸模板复合物和核苷酸类似物与聚合酶反应以通过聚合酶反应将核苷酸类似物添加至引物中形成包含掺入的核苷酸类似物的延伸产物；并且使延伸产物与含叠氮化物的化合物反应形成包含三唑环的结构(例如这用于后续酶促反应，例如聚合酶链式反应)。
在一些实施方案中，提供用于合成修饰的核酸的试剂盒，试剂盒包括包含炔基的核苷酸类似物；基于铜的催化试剂；聚合酶；包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸和常规核苷酸。
具体的实施方案涉及以1:500-500:1(标准dNTP:3′-O-炔丙基-dNTP)的摩尔比率使用包含标准dNTP和3′-O-炔丙基-dNTP的聚合酶反应产生核酸片段阶梯。通过本文所述方法产生的终止的核酸片段在其3′端包含炔丙基。进一步的实施方案涉及采用化学缀合使衔接子与核酸片段的3′端连接。例如，在一些实施方案中，5′-叠氮基修饰的寡核苷酸(例如5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸)通过点击化学(例如在由铜(例如铜(I))试剂催化的反应中)与3′-炔丙基终止的核酸片段缀合。在一些实施方案中，首先扩增(例如通过PCR)靶区域以产生目标扩增子用于测序。在一些实施方案中，扩增靶区域包括扩增靶区域5-15个循环(例如“有限循环”或“低循环”扩增)。
进一步的实施方案提供靶扩增子包含标签(例如包含条码序列)，例如，靶扩增子是可识别的扩增子。在一些实施方案中，用于扩增靶区域的引物包含标签(例如包含条码序列)，其随后掺入靶扩增子中(例如在“拷贝和标签”反应中)以产生可识别的扩增子。在一些实施方案中，在扩增后(例如在连接酶反应中)使包含标签(例如包含条码序列)的衔接子与靶扩增子连接以产生可识别的衔接子-扩增子。在一些实施方案中，在拷贝和标签反应中用于产生可识别的扩增子的引物含有包含靶特异性引发序列(primingsequence)的3′区和包含侧接简并序列的2个不同的通用序列(例如通用序列A和通用序列B)的5′区。在一些实施方案中，与扩增子连接以产生可识别的衔接子-扩增子的衔接子是双链衔接子，例如，含有包含在5′端和3′端两端被2个不同的通用序列(例如通用序列A和通用序列B)侧接的简并序列(例如包含8-12个碱基)的一条链以及包含通用序列C(例如在5′端)和与通用序列B互补且在3′端位置具有另外的T的序列(例如在3′端)的第二条链。
该技术的实施方案提供从衔接子-扩增子产生核酸阶梯片段以例如提供NGS的测序文库。具体地说，该技术提供例如通过以1:500-500:1(标准dNTP:3′-O-炔丙基-dNTP)的摩尔比率，使用包含标准dNTP和3′-O-炔丙基-dNTP的聚合酶反应，3′-O-炔丙基-dN终止的核酸阶梯的产生用于核酸测序(例如NGS)。然后，在一些实施方案中，该技术提供采用化学缀合使衔接子与核酸片段的3′端连接。例如，在一些实施方案中，通过点击化学(例如在被铜(例如铜(I))试剂催化的反应中)使5′-叠氮基修饰的寡核苷酸(例如5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸)与3′-炔丙基终止的核酸片段缀合。
该技术的一些实施方案提供用作下一代测序文库以获得靶核酸的序列的组合物，所述组合物包含n种核酸(例如核酸片段文库)，其中n种核酸的每一种包含3′-O封闭的核苷酸类似物(例如3′-O-炔基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物)。在一些实施方案中，n种核酸的各核酸包含靶核苷酸序列的核苷酸亚序列。具体地说，实施方案提供所述包含n种核酸的组合物，其中n种核酸的每一种被3′-O封闭的核苷酸类似物(例如3′-O-炔基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物)终止。进一步的实施方案提供包含n种核酸(例如核酸片段文库)的组合物，其中n种核酸的每一种包含3′-O封闭的核苷酸类似物(例如3′-O-炔基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物)，且n种核酸的每一种通过三唑连键(例如通过例如点击化学反应由炔丙基和叠氮基的化学缀合形成的连键)与寡核苷酸衔接子缀合(例如连接)。例如，一些实施方案提供包含n种核酸(例如核酸片段文库)的组合物，其中n种核酸的每一种包含通过三唑连键(例如通过例如点击化学反应由炔丙基和叠氮基的化学缀合形成的连键)与寡核苷酸衔接子缀合(例如连接)的3′-O-炔丙基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dA、3′-O-炔丙基-dC、3′-O-炔丙基-dG和/或3′-O-炔丙基-dT)。
在一些实施方案中，用作下一代测序文库以获得靶核酸的序列的组合物通过以下方法产生，包括例如以1:500-500:1(例如1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:150、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1或500:1)的摩尔比率，使用dNTP的混合物和一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物(例如一种或多种3′-O-炔基核苷酸类似物，例如一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物)，合成n种核酸(例如核酸片段文库)。在一些实施方案中，组合物使用获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种(例如分类学谱系古细菌、广古菌门、热球菌纲、热球菌目、热球菌科、热球菌属的生物)的聚合酶产生。在一些实施方案中，聚合酶获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种9°N-7。在一些实施方案中，聚合酶包含提供修饰的底物(例如修饰的二脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸)的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含提供包含修饰的3′官能团的核苷酸类似物(例如本文所述3′-O-炔丙基dNTP)的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶的氨基酸序列包含相对于热球菌属物种9°N-7野生型聚合酶氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，例如，丙氨酸取代氨基酸141位的天冬氨酸(D141A)、丙氨酸取代氨基酸143位的谷氨酸(E143A)、缬氨酸取代氨基酸409位的酪氨酸(Y409V)和/或亮氨酸取代氨基酸485位的丙氨酸(A485L)。在一些实施方案中，在包含克隆的热球菌属物种9°N-7聚合酶基因的异源宿主生物(例如大肠杆菌)中提供例如包含一个或多个突变(例如D141A、E143A、Y409V和/或A485L)的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是由NewEnglandBioLabs(Ipswich,Mass.)以商品名THERMINATOR(例如THERMINATORII)销售的热球菌属物种9°N-7聚合酶。
因此，该技术涉及反应混合物，其包含靶核酸；例如1:500-500:1(例如1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:150、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1或500:1)的摩尔比率的dNTP的混合物和一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物(例如一种或多种3′-O-炔基核苷酸类似物，例如一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物)；和用于使用dNTP和一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物合成核酸的聚合酶(例如获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种的聚合酶)。在一些实施方案中，靶核酸是扩增子。在一些实施方案中，靶核酸包含条码。在一些实施方案中，靶核酸是包含条码的扩增子。在一些实施方案中，靶核酸是与包含条码的衔接子连接的扩增子。一些实施方案提供包含多种靶核酸的反应混合物，各靶核酸包含与靶核酸的可识别特征有关的条码。
一些实施方案提供含有包含靶核酸的亚序列的模板(例如包含通用核苷酸序列和/或条码核苷酸序列的例如环状模板)、聚合酶、阶梯片段文库的一个或多个片段和3′-O封闭的核苷酸类似物的反应混合组合物。
一些实施方案提供反应混合组合物，其包含核酸的文库，所述核酸的文库包含平铺在靶核酸上的重叠的短核苷酸序列(例如重叠的短核苷酸序列涵盖包含100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、600个碱基、700个碱基、800个碱基、900个碱基、1000个碱基或大于1000个碱基、例如、2000个碱基、2500个碱基、3000个碱基、3500个碱基、4000个碱基、4500个碱基、5000个碱基或大于5000个碱基的靶核酸的区域)且彼此抵消1-20、1-10或1-5个碱基(例如1个碱基)，文库的每个核酸包含小于100个碱基、小于90个碱基、小于80个碱基、小于70个碱基、小于60个碱基、小于50个碱基、小于45个碱基、小于40个碱基、小于35个碱基或小于30个碱基。
下面提供其它实施方案并作为本领域普通技术人员所理解的所述技术的变化。
附图简述
参照下列附图，可更好地理解本发明技术的这些和其它特征、方面和优势：
图1是显示使用3′-O-炔丙基-dGTP的聚合酶延伸反应的示意图。在掺入3′-O-炔丙基-dGTP后聚合酶延伸停止，得到产物1。采用点击化学使5′-叠氮化物修饰的DNA片段与产物1化学连接，得到产物2。因三唑环的形成产生的共价键模拟天然DNA骨架磷酸二酯键的共价键。随后在酶促反应(例如PCR)中使用产物2。
图2是显示使用dNTP和3′-O-炔丙基-dNTP的组合的聚合酶延伸反应的示意图。产生了每个片段3′端具有炔基的DNA阶梯片段(n+1片段)。通过点击化学，使这些DNA阶梯片段与具有“通用”序列和/或条码序列和/或引物结合位点的5′-叠氮化物修饰的DNA分子连接。连接的DNA片段随后经处理，并用作下一代测序(NGS)过程的输入。具有n+1特性的这些DNA片段通过汇编短读数(shortread)产生DNA测序数据，从而显著缩短NGS运行时间。
图3显示按本文所述合成的3′-O-炔丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(3′-O-炔丙基-dCTP)的分析数据。图3A显示3′-O-炔丙基-dCTP的1HNMR数据。图3B显示图3A所示3′-O-炔丙基-dCTP的1HNMR数据的放大部分。图3C显示图3A所示3′-O-炔丙基-dCTP的1HNMR数据的放大部分。图3D显示3′-O-炔丙基-dCTP的31PNMR数据。图3E显示图3D所示3′-O-炔丙基-dCTP的31PNMR数据的放大部分。图3F显示3′-O-炔丙基-dCTP的阴离子交换HPLC数据。图3G显示3′-O-炔丙基-dCTP的高分辨质谱数据。
图4显示按本文所述合成的3′-O-炔丙基-2′-脱氧胸苷-5′-三磷酸(3′-O-炔丙基-dTTP)的分析数据。图4A显示3′-O-炔丙基-dTTP的1HNMR数据。图4B显示图4A所示3′-O-炔丙基-dTTP的1HNMR数据的放大部分。图4C显示图4A所示3′-O-炔丙基-dTTP的1HNMR数据的放大部分。图4D显示3′-O-炔丙基-dTTP的31PNMR数据。图4E显示图4D所示3′-O-炔丙基-dTTP的31PNMR数据的放大部分。图4F显示3′-O-炔丙基-dTTP的阴离子交换HPLC数据。图4G显示3′-O-炔丙基-dTTP的高分辨质谱数据。
图5显示按本文所述合成的3′-O-炔丙基-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸(3′-O-炔丙基-dATP)的分析数据。图5A显示3′-O-炔丙基-dATP的1HNMR数据。图5B显示图5A所示3′-O-炔丙基-dATP的1HNMR数据的放大部分。图5C显示图5A所示3′-O-炔丙基-dATP的1HNMR数据的放大部分。图5D显示3′-O-炔丙基-dATP的31PNMR数据。图5E显示图5D所示3′-O-炔丙基-dATP的31PNMR数据的放大部分。图5F显示3′-O-炔丙基-dATP的阴离子交换HPLC数据。图5G显示3′-O-炔丙基-dATP的高分辨质谱数据。
图6显示按本文所述合成的3′-O-炔丙基-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(3′-O-炔丙基-dGTP)的分析数据。图6A显示3′-O-炔丙基-dGTP的1HNMR数据。图6B显示图6A所示3′-O-炔丙基-dGTP的1HNMR数据的放大部分。图6C显示图6A所示3′-O-炔丙基-dGTP的1HNMR数据的放大部分。图6D显示3′-O-炔丙基-dGTP的31PNMR数据。图6E显示图6D所示3′-O-炔丙基-dGTP的31PNMR数据的放大部分。图6F显示3′-O-炔丙基-dGTP的阴离子交换HPLC数据。图6G显示3′-O-炔丙基-dGTP的高分辨质谱数据。
要了解，附图不一定按比例绘制，附图中的对象在彼此的关系上也不必按比例绘制。附图是旨在阐明和理解本文公开的仪器、系统和方法的不同实施方案的描述。如有可能，在整个附图中将使用相同的参考号以提及相同或类似部分。此外应认识到，附图无意以任何方式限制本发明教导的范围。
发明详述
本文提供涉及核酸的操作和检测的技术，包括但不限于涉及包含化学反应性连接部分的核苷酸的组合物、方法、系统和试剂盒。在具体的实施方案中，该技术提供包含碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)、糖(例如核糖或脱氧核糖)和例如与糖的3′氧(例如脱氧核糖的3′氧或核糖的3′氧)连接的炔化学部分的核苷酸类似物。核苷酸类似物(例如3′-炔基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基dNTP或3′-O-炔丙基NTP)应用于该技术的实施方案以通过聚合酶延伸反应将特定的化学部分(例如炔)引入核酸(例如DNA或RNA)的末端(例如3′端)，并因此产生不存在于天然生物学系统的核酸修饰。采用点击化学，以高效率和特异性实现聚合酶延伸产物和合适的缀合配偶体(例如叠氮化物修饰的实体)之间的化学连接。利用本文提供的功能性核苷酸终止剂的实施方案产生可用于各种分子生物学、生物化学和生物技术应用的核酸。
该技术提供超过现有技术的几个优势。例如，该技术在比现行技术短的运行时间内提供比现行技术好(例如更高的质量、更长的读数、更少的错误等)或相当的序列数据。此外，该技术提供可拼合在一起以提供高质量的较长读数的序列数据读取。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为以任何方式限制所述主题。在不同实施方案的这种详细描述中，出于解释的目的，提出许多具体细节以提供对所公开的实施方案的全面了解。然而，本领域技术人员应认识到，可在有或没有这些具体细节的情况下实施这些不同的实施方案。在其它实例中，以框图形式显示结构和装置。此外，本领域技术人员可容易地认识到，其中提供和进行的方法的具体次序是说明性，并且预期次序可变化并仍保留在本文公开的不同实施方案的精神和范围内。
本申请引述的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、专著和互联网网页，通过引用以其整体明确予以结合用于任何目的。除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有本文所述不同实施方案所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。当所结合的参考文献中术语的定义显得不同于本发明教导提供的定义时，应以本发明教导提供的定义为准。
定义
为了便于理解本发明技术，下面定义了多个术语和短语。在整个发明详述中给出了其它定义。
在整个说明书和权利要求书中，下面的术语具有本文明确相关的意义，除非文中另有说明。本文所用短语“在一个实施方案中”不一定是指相同的实施方案，虽然它可指相同的实施方案。此外，本文所用短语“在另一个实施方案中”不一定是指不同的实施方案，虽然它可指不同的实施方案。因此，如下所述，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，可容易地使本发明的不同实施方案组合。
另外，本文所用术语“或”是包括性的“或”功能词，等同于术语“和/或”，除非文中另有明确说明。术语“基于”不是排外的，允许基于未描述的其它因素，除非文中另有明确说明。另外，在整个说明书中，“a”、“an”和“the”的含义包括复数指代物。“in”的含义包括“在……中”和“在……上”。
本文所用“核苷酸”包含“碱基”(或者“核碱基”或“含氮碱基”)、“糖”(具体为5碳糖，例如核糖或2-脱氧核糖)和一个或多个磷酸基(例如分别由1、2、3、4或更多个连接的磷酸组成的一磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸等)的“磷酸部分”。在没有磷酸部分的情况下，核碱基和糖构成“核苷”。核苷酸因此也可称为一磷酸核苷或二磷酸核苷或三磷酸核苷，这取决于所连接的磷酸基的数目。磷酸部分通常与糖的5-碳连接，虽然一些核苷酸包含与糖的2-碳或3-碳连接的磷酸部分。核苷酸含有嘌呤(例如在核苷酸腺嘌呤和鸟嘌呤中)或嘧啶碱基(例如在核苷酸胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中)。一些核苷酸含有非天然碱基。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖为脱氧核糖的核苷酸。
本文所用“核酸”可指任何核酸分子，包括而不限于DNA、RNA和其杂合体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域众所周知的。该术语应理解为包括由核苷酸类似物构成的DNA或RNA的类似物作为等同物。本文所用术语还包括是例如通过反转录酶的作用从RNA模板产生的互补DNA的cDNA。众所周知，DNA(脱氧核糖核酸)是由4种类型的核苷酸—A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)—组成的核苷酸链，RNA(核糖核酸)是由4种类型的核苷酸—A、U(尿嘧啶)、G和C—组成的核苷酸链。另已知，这5种类型的核苷酸全部都在称为互补碱基配对的组合中彼此特异性结合。即腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对(然而在RNA的情况下，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对)，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对，使得这些碱基对各自形成双链。本文所用“核酸测序数据”、“核酸测序信息”、“核酸序列”、“基因组序列”、“遗传序列”、“片段序列”或“核酸测序读数”表示表明在DNA或RNA的分子(例如全基因组、全转录物组、外显子组(exome)、寡核苷酸、多核苷酸、片段等)中核苷酸碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶/尿嘧啶)的顺序的任何信息或数据。应了解，本发明教导考虑了采用所有可获得的各种方法、平台或技术所获得的序列信息，包括但不限于：毛细管电泳、微阵列、基于连接的系统、基于聚合酶的系统、基于杂交的系统、直接或间接核苷酸鉴定系统、焦磷酸测序(pyrosequencing)、基于离子或pH的检测系统、基于电子签名的系统、基于微孔(例如纳米孔)、基于可视化的系统等。
对碱基、核苷酸或另一种分子的提及可为单数或复数。即，“碱基”可指例如溶液中该碱基的单个分子或多个碱基。
“多核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指由核苷间键连接的核苷(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷或其类似物)的线性聚合物。通常，多核苷酸包含至少3个核苷。通常寡核苷酸大小的范围为几个单体单元(例如3-4个)到几百个单体单元。每当多核苷酸例如寡核苷酸用一连串字母(例如“ATGCCTG”)表示时，应了解核苷酸是从左到右呈5′-3′顺序，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，除非另有说明。字母A、C、G和T可用来指碱基本身、核苷或包含碱基的核苷酸，如本领域的标准一样。
本文所用短语“dNTP”意指脱氧核苷酸三磷酸，其中核苷酸包含核苷酸碱基，例如A、T、C、G或U。
本文所用术语“单体”意指可通过指定聚合酶掺入延伸的分子链中的任何化合物。所述单体包括而不限于天然存在的核苷酸(例如ATP、GTP、TTP、UTP、CTP、dATP、dGTP、dTTP、dUTP、dCTP、合成类似物)、各核苷酸的前体、非天然存在的核苷酸及其前体或可通过指定聚合酶掺入延伸的聚合物链中的任何其它分子。
本文所用“互补”一般是指特定的核苷酸二联化形成规范的Watson-Crick碱基对，如本领域技术人员了解的一样。然而，互补还包括能够与A、T、G或C核苷酸和提高双链体热稳定性的锁定核酸进行通用碱基-配对的核苷酸类似物的碱基配对。本领域技术人员应认识到，杂交严格性在通过杂交形成的双链体的匹配或错配程度中是决定因素。
本文所用“部分”是指某物可分成两个或更多个部件(例如系链(tether)、分子或探针的不同部件)中的一个。
本文所用“接头”是连接两个分子或部分和/或在两个分子或部分之间提供间距使得它们能够以既定方式起作用的分子或部分。例如，接头可包含二胺烃链，其通过一端上的反应基与寡核苷酸类似物分子共价连接，和通过另一端上的反应基与固相支持体(例如珠粒表面)共价连接。接头与目标核苷酸和底物构建体的偶联可通过使用本领域已知的偶联试剂实现(参见例如Efimov等,NucleicAcidsRes.27:4416-4426,1999)。使有机分子衍生化和偶联的方法是有机和生物有机化学领域众所周知的。接头还可以是可切割的(例如光可切割的)或可逆的。
“聚合酶”是一般用于连接3′-OH、5′-三磷酸核苷酸、寡聚体及其类似物的酶。聚合酶包括但不限于依赖DNA的DNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶、依赖RNA的DNA聚合酶、依赖RNA的RNA聚合酶、T7DNA聚合酶、T3DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、DNA聚合酶1、Klenow片段、水生栖热菌(Thermophilusaquaticus)DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、DeepVentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、BstDNA聚合酶大片段、Stoeffel片段、9°NDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、TflDNA聚合酶、RepliPHIPhi29聚合酶、TliDNA聚合酶、真核DNA聚合酶β、端粒酶、Therminator聚合酶(NewEnglandBiolabs)(例如TherminatorI、TherminatorII和其它变体)、KODHiFi.DNA聚合酶(Novagen)、KOD1DNA聚合酶、Q-β复制酶、末端转移酶、AMV反转录酶、M-MLV反转录酶、Phi6反转录酶、HIV-1反转录酶、通过生物勘探(bioprospecting)发现的新的聚合酶和在美国专利申请公布号2007/0048748和美国专利号6,329,178、6,602,695和6,395,524中引述的聚合酶。这些聚合酶包括野生型、突变同工型和基因工程变体例如exo–聚合酶和例如容许修饰的(例如标记的)核苷酸并将其掺入核酸链的其它突变体。
术语“引物”是指当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如在核苷酸和诱导剂例如聚合酶存在时并且在合适的温度和pH下)，能够起合成起始点的作用、不论是作为在纯化的限制消化中天然存在的还是合成产生的寡核苷酸。引物优选为单链的，适于扩增的最大效率，但备选可为双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前首先对引物进行处理以分离其链。优选引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物的来源和方法的采用。
本文所用“衔接子”是与核酸连接或经设计与核酸连接以将核酸引入测序工作流程的寡核苷酸。衔接子可为单链的或双链的(例如双链DNA或单链DNA)。本文所用术语“衔接子”是指处于与某一核酸连接的状态且处于不与另一核酸连接的状态的衔接子核酸。
衔接子的至少一部分包含已知序列。例如，衔接子的一些实施方案包含用于核酸扩增和/或用于测序引物结合的引物结合序列。一些衔接子包含用于互补俘获探针杂交的序列。一些衔接子包含用于俘获和/或固定在固相支持体(例如包含抗生物素蛋白部分)上的化学或其它部分(例如生物素部分)。衔接子的一些实施方案包含标记、指标(index)、条码、标签或可鉴定衔接子和其所连接的核酸的其它序列。
一些衔接子包含通用序列。通用序列是多种衔接子所共有的序列，所述衔接子除通用序列以外另可具有不同的序列。例如，通用序列提供来自不同的靶核酸(例如其可包含不同条码)的一批核酸的共同引物结合位点。
衔接子的一些实施方案包含范围确定但未知的序列。例如，衔接子的一些实施方案包含规定数目的碱基的简并序列(例如1-20个碱基的简并序列)。即使每个个别的序列未知，但所述序列是范围确定的—所述序列仍可用作指标、条码、标签等，从例如相同的靶核酸中标记核酸片段。
一些衔接子包含平端，而一些衔接子包含具有一个或多个碱基突出的末端。
在本文提供的具体实施方案中，衔接子包含叠氮基部分，例如，衔接子包含在其5′端处的叠氮基(例如叠氮基-甲基)部分。因此，一些实施方案涉及是5′-叠氮基修饰的寡核苷酸或5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸或包含5′-叠氮基修饰的寡核苷酸或5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸的衔接子。
在一些实施方案中，使用独特指标(在一些实施方案中为“标记”)使片段与其从中产生的模板核酸相关联。在一些实施方案中，独特指标是合成核苷酸的独特序列或天然核苷酸的独特序列，其允许容易地鉴定含有不同序列的一批复杂的寡核苷酸(例如片段)内的靶核酸。在某些实施方案中，在连接衔接子序列之前，使独特指标标识符与核酸片段连接。在一些实施方案中，衔接子序列内含有独特指标标识符使得测序读数中含有独特序列。这确保了可根据与各片段连接的独特指标检测同源片段，因此进一步提供共有序列的明确重建。例如偶尔因基因组重复序列、源于同源染色体的2个片段或源于同一染色体上的重叠位置的片段所致，可产生同源片段。同源片段还可产生于密切相关的序列(例如密切相关的基因家族成员、共生同源物(paralog)、直向同源物(ortholog)、ohnolog、异向同源物和/或假基因)。可放弃所述片段以确保可明确地计算长片段装配。可按上文针对衔接子序列所述使标记连接。衔接子序列中可包括指标(例如标记)。
在一些实施方案中，独特指标(例如指标标识符、标签、标记等)是“条码”。本文所用术语“条码”是指允许鉴定条码与之关联的核酸的一些特征的已知核酸序列。在一些实施方案中，待鉴定的核酸的特征是核酸来源于其中的样品或来源。在一些实施方案中，条码为长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条码的长度短于10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。在一些实施方案中，同与其它核酸关联的条码相比，与一些核酸关联的条码具有不同的长度。一般而言，条码具有足够的长度，并包含充分不同以允许根据其与之关联的条码鉴定样品的序列。在一些实施方案中，可在条码序列中在一个或多个核苷酸突变、插入或缺失，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸突变、插入或缺失之后，准确鉴定条码和与之关联的样品源。在一些实施方案中，多种条码中的各条码在2个或更多个核苷酸位置处，例如在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位置处不同于多种条码中的每个其它的条码。在一些实施方案中，一个或多个衔接子包含多个条码序列的至少一个。在一些实施方案中，该技术的方法进一步包括根据靶核酸与之连接的条码序列，鉴定靶核酸来源于其中的样品或来源。在一些实施方案中，该技术的方法进一步包括根据靶核酸与之连接的条码序列鉴定靶核酸。所述方法的一些实施方案进一步包括通过测定条码核苷酸序列鉴定靶核苷酸序列的来源或样品。所述方法的一些实施方案进一步包括分子计数应用(例如数字条码枚举和/或框并(binning))以测定所需靶标的表达水平或拷贝数状态。一般而言，条码可包含当与靶核酸连接时用作靶多核苷酸来源于其中的样品的标识符的核酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸例如引物、衔接子等包含“通用”序列。通用序列是已知序列，例如，使用已知序列(例如与通用序列互补的序列)的引物或探针用作引物或探针结合位点。虽然在该技术的实施方案中，引物的模板特异性序列、引物的条码序列和/或衔接子的条码序列例如从片段到片段、从样品到样品、从来源到来源或从目标区域到目标区域可能不同，但是该技术的实施方案提供从片段到片段、从样品到样品、从来源到来源或从目标区域到目标区域是相同的通用序列，使得包含通用序列的所有片段例如可采用类似方法或技术(例如使用相同的引物或探针)，以相同或相似方式操作和/或处理(例如，扩增、鉴定、测序、分离等)。
在具体的实施方案中，使用包含通用序列(例如通用序列A)、条码序列和模板特异性序列的引物。在具体的实施方案中，使用包含通用序列(例如通用序列B)的第一衔接子，而在具体的实施方案中，包使用含通用序列(例如通用序列C)的第二衔接子。通用序列A、通用序列B和通用序列C可以是任何序列。使用该命名法以注释包含通用序列A的第一核酸(例如片段)的通用序列A与包含通用序列A的第二核酸(例如片段)的通用序列A相同，包含通用序列B的第一核酸(例如片段)的通用序列B与包含通用序列B的第二核酸(例如片段)的通用序列B相同，包含通用序列C的第一核酸(例如片段)的通用序列C与包含通用序列C的第二核酸(例如片段)的通用序列C相同。虽然通用序列A、B和C在该技术的实施方案中通常不同，但是它们不必不相同。因此，在一些实施方案中，通用序列A和B相同；在一些实施方案中，通用序列B和C相同；在一些实施方案中，通用序列A和C相同；而在一些实施方案中，通用序列A、B和C相同。在一些实施方案中，通用序列A、B和C不同。
例如，如果要对2个目标区域测序(例如来自相同或不同的来源，或例如来自相同核酸、染色体、基因等的2个不同区域)，则可使用2个引物，一个引物包含用于从第一目标区域引发的第一模板特异性序列和使第一扩增产物与第一目标区域关联的第一条码，第二引物包含用于从第二目标区域引发的第二模板特异性序列和使第二扩增产物与第二目标区域关联的第二条码。然而，在一些实施方案中，这两个引物可包含用于合并和下游一起加工的相同的通用序列(例如通用序列A)。可使用两个或更多个通用序列，一般而言，通用序列的数目小于用于合并样品和处理单一样品库(批)的靶特异性序列和/或条码序列的数目。
因此，在一些实施方案中，测定第一核苷酸亚序列和第二核苷酸亚序列包括从通用序列引发。在一些实施方案中，测定第一核苷酸亚序列和第二核苷酸亚序列包括用3′-O封闭的核苷酸类似物终止聚合。例如，在一些实施方案中，测定第一核苷酸亚序列和第二核苷酸亚序列包括用3′-O-炔基核苷酸类似物终止聚合，例如，在一些实施方案中，测定第一核苷酸亚序列和第二核苷酸亚序列包括用3′-O-炔丙基核苷酸类似物终止聚合。在一些实施方案中，测定第一核苷酸亚序列和第二核苷酸亚序列包括用包含可逆终止剂的核苷酸类似物终止聚合。
获得的短序列读数按照其条码划分(即多路分用)，把源于相同样品、来源、目标区域等的读数框并在一起，例如存入单独的文档或保持在允许按原样鉴定框并读数的有序数据结构中。然后将框并的短序列装配成共有序列。序列装配一般可分成两大类：重新装配和参比基因组作图装配。在重新装配中，将序列读数装配在一起，使得它们形成之前未知的新的序列。在参比基因组作图中，针对现有骨架序列(例如参比序列等)装配序列读数，以构建与骨架序列相似但不必相同的序列。
因此，在一些实施方案中，采用重新装配重建对应于各目标区域的靶核酸。为了开始重建过程，通过查找重叠并使其延伸使短读数以生物信息的方法拼合在一起以产生共有序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将共有序列定位于参比序列。该技术的方法利用代表碱基调用置信度(basecallingconfidence)的测序质量分数以重建全长片段。除重新装配以外，可使用片段以通过观察源于任一个染色体的共有序列，获得基因组变体的定相(分配到染色体的同源拷贝)。
本文所用“系统”表示真实或抽象的一套组分，其包括一个整体，其中该整体内各组分与至少一个其它组分相互作用或相关联。
各种核酸测序平台、核酸装配和/或作图系统(例如计算机软件和/或硬件)描述于例如美国专利申请公布号2011/0270533，其通过引用结合到本文中。
本文所用术语“烃基”和前缀“烃-”包括直链和支链的饱和或不饱和基团和环状基团两者，例如环烷基和环烯基。除非另有说明，否则无环烃基为1-6个碳。环状基团可为单环或多环的，优选具有3-8个环碳原子。示例性环状基团包括环丙基、环戊基、环己基和金刚烷基。烃基可被一个或多个取代基取代或是未取代的。示例性取代基包括烃氧基、芳氧基、巯基、烃基硫代、芳基硫代、卤素、烃基甲硅烷基、羟基、氟代烃基、全氟烃基、氨基、氨基烃基、二取代氨基、季氨基、羟基烃基、羧基烃基和羧基。当使用前缀“烃”时，用紧接该术语前的范围给予烃基链中所含碳的数目，其中基团的其它部分中所含的碳的数目包括本文其它部分定义的该前缀中。例如，术语“C1-C4烃芳基”举例说明了与1-4个碳的烃基连接的6-18个碳的芳基(例如见下文)。
本文所用术语“烃氧基”是指式-OR的化学取代基，其中R为烃基。所谓“芳氧基”意指式-OR'的化学取代基，其中R'为芳基。
本文所用术语“炔”是指包含碳-碳三键的烃。含炔官能团的一个实例为炔丙基。炔丙基是具有结构HC≡C?CH2?的2-丙炔基的烃基官能团，来源于炔丙炔。
本文所用术语“叠氮化物”或“叠氮基”是指其中具有N3 –部分的任何化合物。叠氮化物可以是有机叠氮化物或金属叠氮化物。涉及叠氮化物的一个反应是点击化学的一种类型，称为铜(I)催化的1,3-偶极环加成反应。该反应使炔和叠氮化物缀合形成提供共价键的五元三唑环。
本文所用术语“骨架”是指核酸分子的结构组分，其为一起形成连续分子链的一系列共价键合的原子。在“天然”核酸中，骨架包含连接交替的糖(例如核糖或脱氧核糖)和磷酸部分(涉及磷酸)的磷酸二酯键。
本文所用“靶部位”是期望生物活性剂送达且发挥活性的受试者的部位。靶部位可以是细胞、细胞类型、组织、器官、区域或受试者的解剖学和/或生理学的其它名称。
术语“蛋白质”和“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。本文如下使用常规的一字母和三字母氨基酸代码—丙氨酸：Ala，A；精氨酸：Arg，R；天冬酰胺：Asn，N；天冬氨酸：Asp，D；半胱氨酸：Cys，C；谷氨酸：Glu，E；谷氨酰胺：Gln，Q；甘氨酸：Gly，G；组氨酸：His，H；异亮氨酸：Ile，I；亮氨酸：Leu，L；赖氨酸：Lys，K；甲硫氨酸：Met，M；苯丙氨酸：Phe，F；脯氨酸：Pro，P；丝氨酸：Ser，S；苏氨酸：Thr，T；色氨酸：Trp，W；酪氨酸：Tyr，Y；缬氨酸：Val，V。本文所用代码Xaa和X是指任何氨基酸。
在一些实施方案中，该技术的化合物包含抗体组分或部分，例如，抗体或其片段或衍生物。本文所用“抗体”，亦称为“免疫球蛋白”(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)，包含通过二硫键彼此连接的2条重链和2条轻链，轻链各自通过二硫键与重链连接。抗体的特异性在于抗体的抗原结合部位(或抗原互补位)和抗原决定簇(或表位)之间的结构互补性。抗原结合部位由主要来自超变区或互补决定区(CDR)的残基构成。偶尔，来自非超变区或构架区的残基影响总体结构域结构并因此影响结合位点。在一些实施方案中，靶向部分是抗体的片段，例如含有任何蛋白质或多肽的分子，其包含免疫球蛋白分子的至少一部分以例如允许所述分子和抗原间的特异性相互作用。免疫球蛋白分子的部分可包括但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分。所述片段可通过本领域已知的和/或本文描述的酶促切割、合成或重组技术产生。还可使用其中已在天然终止位点上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因，产生抗体的多种截短形式。可通过常规技术以化学方法使抗体的不同部分连接在一起，或可采用遗传改造技术制成邻接蛋白。
抗体的片段包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)、F(ab')2(例如通过胃蛋白酶消化)、Fab'(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)片段。
Fab片段通过将抗体用蛋白酶木瓜蛋白酶处理获得。此外，Fab可如下制备：通过将编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统或真核表达系统的载体中，将载体导入原核生物或真核生物中以表达Fab。F(ab')2可通过将抗体用蛋白酶胃蛋白酶处理获得。此外，F(ab')2可通过经硫醚键或二硫键结合Fab'来产生。Fab可通过将F(ab')2用还原剂(例如二硫苏糖醇)处理获得。此外，可通过将编码抗体Fab'片段的DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体中，将载体导入原核生物或真核生物用于其表达，来产生Fab'。Fv片段可在例如4℃和pH4.0下通过用胃蛋白酶的限制性切割来产生(一种称为“冷胃蛋白酶消化”的方法)。Fv片段由通过强的非共价相互作用保持在一起的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成。scFv片段可如下制备：通过按之前所述获得编码VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体中，然后将表达载体导入原核生物或真核生物中以表达scFv。
一般而言，通常可采用本领域目前众所周知的多种常规技术，产生抗任何抗原的抗体。可使用具有治疗或诊断益处、在哺乳动物机体部位以足够浓度存在的抗原的任何靶向抗体，来制备本文提供的化合物。
本文所用术语“缀合的”是指当一种分子或作用剂以物理学或化学方法与另一种分子或作用剂偶联或粘附时。缀合的实例包括共价键和静电络合。术语“络合的”、“与……络合”和“缀合的”在本文可互换使用。
本文所用术语“治疗”定义为将本文所述或通过本文所述方法鉴定的治疗剂应用于或给予患者，或将治疗剂应用于或给予患有疾病、疾病症状或有易染病体质的患者的分离组织或细胞系，其目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、医治、改善、改进或影响疾病、疾病症状或易染病体质。
由于取代基和取代基模式的选择结果，本发明技术的某些化合物可具有不对称中心，且可作为立体异构体的混合物或作为单一非对映异构体或对映异构体存在。这些化合物的所有异构形式，不论是分离的还是混合物，都在本发明技术的范围内。药学上可接受的盐包括金属(无机)盐和有机盐两者，Remington’sPharmaceuticalSciences，第17版，第1418页(1985)中给出了其列表。本领域技术人员熟知根据物理学和化学性质选择合适的盐形式。正如本领域技术人员所知，药学上可接受的盐包括但不限于无机酸的盐例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐和硝酸盐；或有机酸的盐例如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐或双羟萘酸盐、水杨酸盐和硬脂酸盐。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵(特别是与仲胺的铵盐)。还包括在该技术范围内的为晶体形式、水合物和溶剂合物。
可以药学上可接受的盐的形式给予该技术的组合物。术语“药学上可接受的盐”是指具有母体化合物的功效且不是生物学或别的方面不良的盐(例如对其接受者即非有毒也非另外有害的盐)。合适的盐包括酸加成盐，其例如可通过将本技术的化合物的溶液与例如盐酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸或苯甲酸等药学上可接受的酸的溶液混合形成。应用于本发明技术的某些化合物可带有酸性部分(例如COOH或酚基)，在此情况下其合适的药学上可接受的盐可包括碱金属盐(例如钠或钾盐)、碱土金属盐(例如钙或镁盐)和与合适的有机配体形成的盐例如季铵盐。此外，在酸(COOH)或醇基存在的情况下，可使用药学上可接受的酯以改进化合物的溶解性或水解特性。
术语“给予”及其变体(例如“给予”化合物)在提及化合物时意指向需要治疗或预防的个体提供化合物或化合物的前药。当该技术的化合物或其前药与一种或多种其它活性剂组合提供时，“给予”及其变体各自要理解为包括在同一时间或在不同时间提供化合物或前药和其它作用剂。当组合的作用剂在同一时间给予时，它们可在单一组合物中一起给予，或它们可分别给予。本文所用术语“组合物”预期包括包含规定量的规定成分的产品，以及直接或间接产生于将规定量的规定成分混合的任何产品。
所谓“药学上可接受的”意指药用组合物的成分必须彼此相容且对其接受者无害。
本文所用术语“受试者”是指是治疗、观察或实验的对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。
本文所用术语“有效量”意指在研究人员、兽医、医生或其它临床医生正寻找的细胞、组织、器官、系统、动物或人中诱导生物学或医学反应的活性化合物或药剂的量。在一些实施方案中，有效量是用于减轻待治疗的疾病或病况的症状的“治疗有效量”。在一些实施方案中，有效量是用于预防待预防的疾病或病况的症状的“预防有效量”。该术语在本文中还包括足以抑制盐皮质激素受体，从而诱导待寻找的反应的活性化合物的量(例如“抑制有效量”)。当活性化合物作为盐给予时，提及活性成分的量是指化合物的游离形式(非盐形式)。在一些实施方案中，该量介于1mg和1000mg/天之间，例如介于1mg和500mg/天之间(介于1mg和200mg/天之间)。
在本发明技术的方法中，可通过活性剂与活性剂的作用部位产生接触的任何方法给予化合物，任选为盐的形式。它们可通过可用于与药物结合使用的任何常规方法给予，作为单独的治疗剂或与治疗剂组合。它们可单独给予，但通常与根据选定的给药途径和标准药学实践选择的药用载体一起给予。例如可以含有有效量的化合物和常规无毒的药学上可接受的载体、辅助剂和溶媒的药用组合物的单位剂型，口服、胃肠外(包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术)、通过吸入喷雾剂或直肠给予该技术的化合物。适于口服给药的液体制剂(例如混悬剂、糖浆剂、酏剂等)可按照本领域已知技术制备，并可应用任何常用介质，例如水、二醇、油、醇等。适于口服给药的固体制剂(例如散剂、丸剂、胶囊剂和片剂)可按照本领域已知技术制备，并可使用如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等固体赋形剂。胃肠外组合物可按照本领域已知技术制备，通常使用无菌水作为载体和任选其它成分，例如溶解度助剂(solubilityaid)。注射溶液剂可按照本领域已知技术制备，其中载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或含有盐水和葡萄糖的混合物的溶液。Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro编辑,MackPublishingCo.,1990中提供了适用于制备用于本发明技术的药用组合物的方法和适用于所述组合物的成分的进一步描述。本技术的化合物可通过本文提供的合成反应流程中描述的各种方法制备。用于制备这些化合物的起始原料和试剂一般可获自供应商例如AldrichChemicalCo.，或按照例如以下参考文献中给出的程序，通过本领域技术人员已知方法制备：Fieser和Fieser’sReagentsforOrganicSynthesis,Wiley&Sons:NewYork,第1-21卷；R.C.LaRock,ComprehensiveOrganicTransformations,第2版,Wiley-VCH,NewYork1999；ComprehensiveOrganicSynthesis,B.Trost和I.Fleming(编辑)第1-9卷,Pergamon,Oxford,1991；ComprehensiveHeterocyclicChemistry,A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon,Oxford1984,第1-9卷；ComprehensiveHeterocyclicChemistryII,A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon,Oxford1996,第1-11卷；以及OrganicReactions,Wiley&Sons:NewYork,1991,第1-40卷。本文提供的合成反应流程和实例只是说明可籍以合成本技术的化合物的一些方法，可对这些合成反应流程进行的各种修改，以及向参照本申请所包含的公开内容的本领域技术人员建议对这些合成反应流程的修改。
需要时，可采用常规技术，包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等，分离和纯化合成反应流程的起始原料和中间体。可采用常规方法，包括物理学常数和光谱数据，表征所述材料。
描述
本文所述技术涉及核苷酸类似物和用于操作、检测、分离和测序核酸的相关方法、组合物(例如反应混合物)、试剂盒和系统。具体地说，核苷酸类似物的一些实施方案包括提供终止和连接官能团两者的炔部分。该技术提供超过常规方法的优势，例如成本较低和复杂性降低。
1.核苷酸类似物
本文提供核苷酸的类似物。在一些实施方案中，核苷酸类似物包含一个或多个炔终止剂部分。例如，在一些实施方案中，该技术提供3′-O封闭的核苷酸类似物，其是3′-O-炔基核苷酸类似物。在一些实施方案中，3′-O封闭的核苷酸类似物是具有以下所示结构的3′-O-炔丙基核苷酸类似物：
，
其中B为核苷酸的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，例如，B为以下之一
或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤，例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶，例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等，且其中P包含本文定义的磷酸部分(例如一磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸)；5′羟基；α硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)、β硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)和/或γ硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)或α甲基膦酸、β甲基膦酸和/或γ甲基膦酸。
核苷酸类似物不限于特定的磷酸基。在一些实施方案中，磷酸基是一磷酸基或多磷酸例如二磷酸基、三磷酸基或四磷酸基。在一些实施方案中，磷酸基是焦磷酸。在一些实施方案中，P表示包含5′羟基的基团；α硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)、β硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)和/或γ硫代磷酸(例如硫代磷酸或二硫代磷酸)或α甲基膦酸、β甲基膦酸和/或γ甲基膦酸。
此外，核苷酸类似物的碱基不限于特定的碱基。在一些实施方案中，碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶及其类似物，例如非环状碱基。核苷酸类似物不限于特定的糖部分。在一些实施方案中，所述糖部分为核糖、脱氧核糖、二脱氧核糖及其类似物、衍生物和/或修饰(例如硫代呋喃糖、硫代核糖、硫代脱氧核糖等)。在一些实施方案中，糖部分为阿拉伯糖或其它相关的糖。
在一些实施方案中，核苷酸类似物是3′-O-炔丙基-dNTP，其中N选自A、C、G、T和U。在一些实施方案中，核苷酸类似物包含可检测标记或标签例如光学可检测部分(例如荧光染料)、电化学可检测部分(例如氧化还原活性基团)、量子点、色原、生物学成像造影剂、递药载体标签等。
按照例如Bentley等(2008)“Accuratewholegenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry(采用可逆终止剂化学的精确全基因组测序)”Nature456(7218):53-9和Ju等(2006)“FourColorDNASequencingbysynthesisusingcleavablefluorescentnucleotidereversibleterminators(使用可切割的荧光核苷酸可逆终止剂通过合成的四色DNA测序),”PNAS103(52):19635-40(通过引用结合到本文中)所述，进行本文提供的化合物的合成，需要时加以修改，以提供本文所述不同的核苷酸类似物。另外，在一些实施方案中，利用各种分子表征法例如NMR、质谱法和色谱法/亲和力分析，以证实正确化合物的成功合成。
在一些实施方案中，本文所述技术所包括和考虑的化合物的合成方法包括下列合成方案的一种或多种或其修改：
在一些实施方案中，使用核苷酸类似物通过例如聚合酶将炔部分掺入核酸聚合物中。在一些实施方案中，聚合酶经修饰以提高本文公开的核苷酸类似物的掺入。示例性修饰的聚合酶公开于美国专利号4,889,818、5,374,553、5,420,029、5,455,170、5,466,591、5,618,711、5,624,833、5,674,738、5,789,224、5,795,762、5,939,292和美国专利申请号2002/0012970和2004/0005599。修饰的聚合酶的非限制性实例包括公开于美国专利申请号2005/0037398的G46EE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS5DNA聚合酶、E615GTaqDNA聚合酶、ΔZO5R聚合酶和G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是由NewEnglandBioLabs(Ipswich,Mass.)以商品名THERMINATOR(例如THERMINATORII)销售的热球菌属物种9°N-7聚合酶。修饰的聚合酶的生产可采用本文所述和本领域已知的分子生物学和重组DNA中的许多常规技术实现。在一些实施方案中，使用掺入NTP以及dNTP的聚合酶突变体(例如描述于美国专利号5,939,292的聚合酶突变体)。
在一些实施方案中，除炔部分以外，核苷酸类似物含有标签(见上文)。在一些实施方案中，使用具有3′炔部分的核苷酸类似物以终止聚合酶反应。然后可通过点击化学，将含有叠氮基部分的化学标签附加在核酸聚合物上。在一些实施方案中，终止剂炔化合物与含有叠氮基部分的化合物反应形成三唑化合物。在一些实施方案中，三唑化合物起核酸骨架的作用，并且在三唑化合物上进行进一步的酶促反应例如PCR。
2.寡核苷酸
在一些实施方案中，核苷酸类似物应用于三唑-骨架修饰的核酸(例如寡核苷酸类似物)的合成。例如，核苷酸类似物应用于含水固相寡核苷酸合成的方法。所述方法因此避免在一些常规合成中尤其使用有机溶剂、脱保护步骤和帽化步骤的需要；另外，水法例如在循环合成期间使合成的化合物中的非期望的磷的氧化降低到最小或消除。预期水相合成的优势是比常规有机相合成技术快。
在一些实施方案中提供包含本文提供的核苷酸类似物的三唑-骨架修饰的寡核苷酸。即，本文所述核苷酸类似物应用于分子骨架中包含一个或多个核苷酸类似物且包含三唑基的修饰的寡核苷酸的合成。在一些实施方案中，寡核苷酸包含不同比例的一些常规核苷酸和一些核苷酸类似物。在一些实施方案中，寡核苷酸只包含核苷酸类似物且不含常规核苷酸。
因此，在一些实施方案中，提供本文其它部分所述的例如具有以下结构的核苷酸类似物：
其中B为核苷酸的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等)。
所述核苷酸类似物及其变体和修饰衍生物(例如包含本文所述碱基类似物或替代糖)提供定向双官能核苷酸类似物(例如定向双官能聚合剂)用于例如寡核苷酸(例如寡核苷酸类似物，例如包含本文所述核苷酸类似物的寡核苷酸)的合成。在一些实施方案中，定向双官能核苷酸类似物提供以5′-3′方向的寡核苷酸的合成，而在一些实施方案中，定向双官能核苷酸类似物提供以3′-5′方向的寡核苷酸的合成。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成包括使用炔丙基部分和与固相支持体连接的接头(例如在酸性(例如微酸性)条件下可切割的接头(例如羧酸接头))。在一些实施方案中，寡核苷酸的合成包括使用炔丙基部分和与固相支持体连接的叠氮化物接头。在一些实施方案中，3′-硫代-修饰的炔丙基部分与固相支持体连接，并用包含硝酸银或氯化汞的试剂切割。在一些实施方案中，固相支持体包含可控孔度玻璃、二氧化硅、交联葡聚糖、琼脂糖、丙烯酰胺、乳胶或聚苯乙烯等，在一些实施方案中作为微球体提供。
如下提供用于产生寡核苷酸的代表性合成方案：
a.使用3′-炔基/5′-叠氮基核苷酸类似物合成3′-5′寡核苷酸
在示例性合成流程a中，X为固相支持体，波形线(~)为可裂解接头，B1为第一核苷酸碱基，B2为可与B1相同或不同的第二核苷酸碱基。第1步(1)使第一核苷酸类似物与固相支持体连接(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)。然后，一轮或多轮(例如多轮)的第二步(2)(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)导致寡核苷酸类似物的合成，其每一步将另一个核苷酸类似物加到延伸的聚合物链中。
b.使用3′-炔基/5′-叠氮基核苷酸类似物合成5′-3′寡核苷酸
在示例性合成流程b中，X为固相支持体，波形线(~)为可裂解接头(例如羧酸接头)，B1为第一核苷酸碱基，B2为可与B1相同或不同的第二核苷酸碱基。在使第一核苷酸类似物与包含接头和反应性羧酸部分的固相支持体反应(例如形成酯键)后，一轮或多轮(例如多轮)的核苷酸添加和反应(1)(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)导致寡核苷酸类似物的合成，其每一步将另一个核苷酸类似物加到延伸的聚合物链中。
c.使用3′-叠氮基/5′-炔基核苷酸类似物合成5′-3′寡核苷酸
在示例性合成流程c中，X为固相支持体，波形线(~)为可裂解接头，B1为第一核苷酸碱基，B2为可与B1相同或不同的第二核苷酸碱基。第1步(1)使第一核苷酸类似物与固相支持体连接(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)。然后，一轮或多轮(例如多轮)第二步(2)(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)导致寡核苷酸类似物的合成，其每一步将另一个核苷酸类似物加到延伸的聚合物链中。
d.使用3′-叠氮基/5′-炔基核苷酸类似物合成3′-5′寡核苷酸
在示例性合成流程d中，X为固相支持体，波形线(~)为可裂解接头，B1为第一核苷酸碱基，B2为可与B1相同或不同的第二核苷酸碱基。第1步(1)使第一核苷酸类似物与固相支持体连接(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)。然后，一轮或多轮(例如多轮)第二步(2)(例如采用点击化学反应，例如使用基于铜的催化剂)导致寡核苷酸类似物的合成，其每一步将另一个核苷酸类似物加到延伸的聚合物链中。
在一些实施方案中，使寡核苷酸和/或核苷酸类似物与接头反应以使寡核苷酸和/或核苷酸类似物与例如珠粒、平坦表面(阵列)、柱等固相支持体连接。本文所用术语“固相支持体”是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的材料或一组材料。在许多实施方案中，固相支持体的至少一个表面基本是平的，但在一些实施方案中，可能需要以例如孔、凸起区、针、蚀刻槽等分隔固体支持体的区域。按照其它实施方案，固相支持体呈珠粒、树脂、凝胶、微球体或其它几何构型的形式。有关示例性底物参见例如美国专利号5,744,305和美国专利公布号20090149340和20080038559。在一些实施方案中，接头为可裂解接头(例如通过光、热、化学或生物化学反应可裂解的接头)。
在示例性合成方案a、b、c和d中，用于合成寡核苷酸的方法的实施方案包括加入核苷酸类似物、使核苷酸类似物反应、洗去和/或以其它方式除去未结合的核苷酸类似物(例如在合成步骤之后)、切割接头、分离合成的寡核苷酸、纯化合成的寡核苷酸和/或将标签或标记加入合成的寡核苷酸中的一个或多个其它步骤。
3.加标签和标记
核酸检测方法在分子诊断学领域中起关键作用。特异性且有效操作生物分子的能力是在许多成功的核酸检测技术后面的核心驱动力。在许多分子生物学技术中，标记或“加标签于”目标生物分子的能力是随后检测和鉴定生物分子的关键技术。
因此，在一些实施方案中，该技术提供涉及加标签于生物分子(例如核酸和/或核苷酸)的组合物、方法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，在聚合酶延伸反应中将含炔的核苷酸例如3′-O-炔丙基修饰的核苷酸(例如3′-O-炔丙基dNTP)掺入核酸中。在一些实施方案中，核苷酸类似物终止聚合酶反应。在一些实施方案中，在采用化学连接(例如点击化学反应)的用叠氮化物修饰的标签或标记试剂的标记反应中使用含炔的核苷酸(例如无需进一步处理和/或纯化)。采用这种化学法产生的共价键模拟天然核酸磷酸二酯键，因此提供适用于后续酶促反应(例如聚合酶链式反应)的缀合产物。
标记和标签是适于允许区分不同标记和/或标签的至少一种检测和/或分离方法的化合物、结构或元件。例如，标记和/或标签包括半导体纳米晶体、金属化合物、肽、抗体、小分子、同位素、粒子或具有与之关联或包埋在其中的不同形状、颜色、条码或衍射图的结构、数字串、蛋白质或核酸的随机片段或不同的同位素。
术语“标记”或“标签”在本文可互换使用，是指与核苷酸或核酸连接的任何化学部分，其中连接可以是共价或非共价的。优选标记是可检测的，并向该技术实践者提供可检测的核苷酸或核酸。与本文提供的技术一起使用的示例性可检测标记包括例如荧光标记、化学发光标记、猝灭剂、放射性标记、生物素和金或其组合。可检测标记包括发光分子、荧光染料、荧光猝灭剂、有色分子(例如用于原位杂交(ISH、FISH)和明视场成像应用的色原)、放射性同位素或闪烁体。可检测标记还包括任何有用的接头分子(例如生物素、抗生物素蛋白、洋地黄毒苷、链霉抗生物素、HRP、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、Grb2、多聚组氨酸、Ni2+、FLAG标签、myc标签)、重金属、酶(实例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和萤光素酶)、电子供体/接纳体、吖啶酯、染料和量热底物(calorimetricsubstrate)。还预期质量变化可视为例如作为应用于表面等离子体共振检测的可检测标记。
该技术还应用于例如使含有炔的DNA与成像造影剂(例如葡甲胺、ferumoxsil、ferumoxides、钆双胺、钆弗塞胺、镓化合物、铟化合物、铊化合物、铷化合物、锝化合物、碘帕醇等)连接的应用，例如用于生物医学成像(例如磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)扫描、X射线等)、使DNA与寡聚体和/或反义递药载体标签(例如类固醇类、脂质、胆固醇、维生素、激素、碳水化合物和/或受体特异性配体(例如叶酸、烟酰胺、乙酰胆碱、GABA、谷氨酸、5-羟色胺等)偶联和与色原部分偶联用于原位杂交应用。技术人员应容易地识别可用于本发明操作中的上文未提及的有用的可检测标记。
因此，该技术不限于如在点击化学反应中通过使用叠氮化物标记试剂与核酸连接的标记或标签。因此，在一些实施方案中，标记包含以染料为基础的荧光可检测部分，其中染料为呫吨、荧光素、罗丹明、BODIPY、花青、香豆素、芘、酞菁、藻胆蛋白、ALEXAFLUOR?350、ALEXAFLUOR?405、ALEXAFLUOR?430、ALEXAFLUOR?488、ALEXAFLUOR?514、ALEXAFLUOR?532、ALEXAFLUOR?546、ALEXAFLUOR?555、ALEXAFLUOR?568、ALEXAFLUOR?568、ALEXAFLUOR?594、ALEXAFLUOR?610、ALEXAFLUOR?633、ALEXAFLUOR?647、ALEXAFLUOR?660、ALEXAFLUOR?680、ALEXAFLUOR?700、ALEXAFLUOR?750、荧光半导体晶体或方青(squaraine)染料。在一些实施方案中，标签或标记包含放射性同位素、自旋标记、量子点或生物发光部分。在一些实施方案中，标记为描述于例如Haugland(2005年9月)MOLECULARPROBESHANDBOOKOFFLUORESCENTPROBESANDRESEARCHCHEMICALS(第10版)(其通过引用以其整体结合到本文中)的荧光可检测部分。
在一些实施方案中，标记(例如荧光可检测标记)是可获自ATTO-TECGmbH(AmEichenhang50，57076Siegen，Germany)的例如描述于美国专利申请公布号20110223677、20110190486、20110172420、20060179585和20030003486和美国专利号7,935,822(其所有通过引用结合到本文中)的标记。
在一些实施方案中，包含修饰的核苷酸，例如包含炔基的核酸和/或核苷酸用通过与第二部分特异性相互作用提供核酸和/或核苷酸的检测和/或分离的部分加标签。例如，在一些实施方案中，使核酸和/或核苷酸(例如通过点击化学反应)与包含以下的标签连接：叠氮化物和生物素部分、表位、抗原、适体、亲和标签、组氨酸标签、条码寡核苷酸、聚A尾、俘获寡核苷酸、蛋白质、糖、螯合剂、质量标签(例如2-硝基-甲基-苯甲基、2-硝基-甲基-3-氟苯甲基、2-硝基-α-甲基-3,4-二氟苯甲基、2-硝基-α-甲基-3,4-二甲氧基苯甲基、2-硝基-α-甲基-苯甲基、2-硝基-α-甲基-3-氟苯甲基、2-硝基-甲基-3,4-二氟苯甲基、2-硝基-α-甲基-3,4-二甲氧基苯甲基)、电荷标签。
在一些实施方案中，含炔的核酸和/或核苷酸与包含叠氮化物的接头反应以将核酸和/或核苷酸与例如珠粒、平坦表面(阵列)、柱等固相支持体连接。在一些实施方案中，接头为可裂解接头(例如光、热、化学或生物化学反应可裂解的接头)。
4.反应
在一些实施方案中，该技术应用于使寡核苷酸与核酸(例如DNA、RNA)连接。例如，在一些实施方案中，使包含核苷酸类似物的核酸(例如包含炔基的核酸，例如3′-O-炔丙基核苷酸，例如3′-O-炔丙基dNTP)例如通过点击化学反应与包含与核苷酸类似物的化学部分起化学反应的基团(例如叠氮基)的寡核苷酸连接。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链的，而在一些实施方案中，寡核苷酸是双链的。在一些实施方案中，核酸为DNA，而在一些实施方案中，核酸为RNA；在一些实施方案中，寡核苷酸为DNA，而在一些实施方案中，寡核苷酸为RNA。
在一些实施方案中，该技术的方法包括使衔接子与核酸连接。在一些实施方案中，衔接子包含用于与核苷酸类似物化学连接的官能部分。例如，在一些实施方案中，衔接子包含例如通过点击化学反应(例如使用铜(例如基于铜的)催化试剂)与炔基(例如炔丙基，例如在包含核苷酸类似物的核酸的3′端)起反应的叠氮基(例如在5′端)。
在一些实施方案中，炔为炔丁基或其结构衍生物。在一些实施方案中，炔包含硫原子，例如提供硫代-炔基、硫代-炔丙基(例如3′-S-炔丙基)或其结构衍生物。
在一些实施方案中，衔接子包含通用序列和/或指标，例如条码核苷酸序列。另外，衔接子可含有多个序列元件的一个或多个，包括但不限于一个或多个扩增引物退火序列或其互补序列、一个或多个测序引物退火序列或其互补序列、一个或多个条码序列、多个不同的衔接子或不同衔接子的亚组共用的一个或多个共有序列(例如通用序列)、一个或多个限制性酶识别位点、与一个或多个靶多核苷酸突出端互补的一个或多个突出端、一个或多个探针结合位点(例如由Illumina,Inc.开发的例如用于与测序平台、例如用于大量平行测序的流动池连接)、一个或多个随机或近随机序列(例如从一个或多个位置处的一组两个或更多个不同核苷酸随机选择的一个或多个核苷酸，其中衔接子库中所代表的一个或多个位置处选择的不同核苷酸的每一个包含随机序列)及其组合。两个或更多个序列元件可以是彼此不邻接的(例如被一个或多个核苷酸隔开)、彼此邻接、部分重叠或完全重叠。例如，扩增引物退火序列还可用作测序引物退火序列。序列元件可位于或接近3′端、位于或接近5′端或在衔接寡核苷酸内部。当衔接寡核苷酸能够形成二级结构(例如发夹)时，序列元件可以部分或完全位于二级结构之外、部分或完全位于二级结构之内、或在参与二级结构的序列间。例如，当衔接寡核苷酸包含发夹结构时，序列元件可以部分或完全位于可杂交序列(“茎”)之内或之外，包括介于可杂交序列之间的序列(“环”)中。在一些实施方案中，具有不同条码序列的多种衔接寡核苷酸中的衔接寡核苷酸包含在所有衔接寡核苷酸中公用的序列元件。序列元件中的差异可为任一种，使得例如由于序列长度的改变、一个或多个核苷酸的缺失或插入或一个或多个核苷酸位置处核苷酸组成的改变(例如碱基改变或碱基修饰)所致，不同衔接子的至少一部分不完全成对齐。在一些实施方案中，衔接寡核苷酸包含与一个或多个靶多核苷酸互补的5′突出端、3′突出端或两者。互补突出端的长度可为一个或多个核苷酸，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸。互补突出端可包含固定序列。互补突出端可包含一个或多个核苷酸的随机序列，使得从在一个或多个位置处的一组两个或更多个不同的核苷酸随机选择一个或多个核苷酸，其中在具有互补突出端的衔接子库中所代表的一个或多个位置处选择的不同核苷酸的每一个包含随机序列。在一些实施方案中，衔接子突出端与由限制性内切核酸酶消化产生的靶多核苷酸突出端互补。在一些实施方案中，衔接子突出端由腺嘌呤或胸腺嘧啶组成。
在一些实施方案中，衔接子序列含有分子结合位点鉴定元件以促进用于下游应用的靶核酸的鉴定和分离。分子结合作为亲和机制允许两个分子之间的相互作用以导致稳定的缔合络合物。可参与分子结合反应的分子包括蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和有机小分子例如配体、肽或药物。
当核酸分子结合位点用作衔接子的一部分时，它可用来利用选择性杂交以分离靶序列。选择性杂交可限制含有具有分子结合位点的衔接子的靶核酸和与分子结合位点充分互补的俘获核酸大量杂交。因此，通过“选择性杂交”，可检测含有许多核酸库的含杂质样品中的靶多核苷酸的存在。核苷酸-核苷酸选择性杂交分离系统的一个实例包括具有若干俘获核苷酸的系统，所述俘获核苷酸是分子结合鉴定元件的互补序列，并任选固定在固相支持体上。在其它实施方案中，俘获多核苷酸与靶序列本身或衔接子内所含的条码或独特标签互补。可将俘获多核苷酸固定在不同的固相支持体(例如板孔的内部、单分散球体、微阵列或本领域已知的任何其它合适的支持表面)上。可通过洗掉不需要的未结合的核酸，留下需要的靶多核苷酸，来分离与固相支持体连接的杂交的互补衔接子多核苷酸。如果将互补衔接子分子固定至用于分离的顺磁球体或类似珠粒技术，则然后可将球体在管中与含有衔接子的靶多核苷酸混合在一起。当衔接子序列与固定在球体上的互补序列杂交时，可洗掉不需要的分子，同时将球体保留在具有磁体或类似物质的管中。随后可通过升高温度、改变pH或通过使用本领域已知的任何其它合适的洗脱方法，释放出所需的靶分子。
如本文其它部分所述，“条码”或“条码寡核苷酸”是已知的允许鉴定条码与之关联的核酸的一些特征的核酸序列。例如，在一些实施方案中，待鉴定的核酸的特征是核酸来源于其中的样品或来源。条码序列一般包括使序列例如在测序反应中成为有用的某些特征。例如，设计了在条码序列内具有最小或没有均聚物区(例如在一排中2个或更多个相同碱基，例如AA或CCC)的条码序列。在一些实施方案中，还设计条码序列，使得当进行操作或分子生物学过程(例如碱基逐一测序)时，远离碱基添加顺序至少一个编辑距离，确保第一个和最后一个碱基不匹配预期的序列碱基。
在一些实施方案中，设计条码序列，使得各序列与特定的核酸相关。设计条码序列集的方法见例如美国专利号6,235,475，其内容通过引用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，条码序列的范围为约5个核苷酸-约15个核苷酸。在一个具体的实施方案中，条码序列的范围为约4个核苷酸-约7个核苷酸。在一些实施方案中，设计条码序列的长度和序列以实现测定核酸身份所需的精度水平。例如，在一些实施方案中，设计条码序列，使得在可容许数目的点突变后，推导出具有所需精度的相关核酸的身份。在一些实施方案中，Tn-5转座酶(市购可获自EpicentreBiotechnologies；Madison,Wis.)将核酸切成片段，并将短的DNA段插入切段中。使用短的DNA段掺入条码序列。
用于设计条码序列集的方法和用于连接衔接子(例如包含条码序列的衔接子)的其它方法见美国专利号6,138,077、6,352,828、5,636,400、6,172,214、6235,475、7,393,665、7,544,473、5,846,719、5,695,934、5,604,097、6,150,516、RE39,793、7,537,897、6172,218和5,863,722，其各自内容通过引用以其整体结合到本文中。
以对反应方案的适当变化，考虑5′炔基/3′叠氮基和5′叠氮基/3′炔基核苷酸类似物的使用在与用于例如通过点击化学连接核苷酸类似物的5′和/或3′端的合适反应底物的反应中是可互换的。
在一些实施方案中，该技术应用于引物延伸反应(参见例如图1)和/或衔接子连接(参见例如图1)。在具体的实施方案中，退火至模板(例如靶核酸)的引物通过聚合酶延伸，这将核苷酸类似物添加至引物中。虽然图1显示模板中C碱基对面含G的核苷酸类似物的示例性加入，但是引物延伸技术不限于加入的碱基。然后，在一些实施方案中，使叠氮化物修饰的DNA(例如衔接子，例如包含引物结合位点和/或条码的衔接子)与引物延伸产物连接(例如通过点击化学)。连接产物包含模拟常规核酸骨架的连接(例如三唑)，并且与下游酶促和/或化学反应例如PCR生物相容(例如参见图1)。
5.测序
在一些实施方案中，核苷酸类似物应用于核酸测序，例如“下一代测序”(NGS)。例如，通过合成的DNA测序(SBS)包括通过检测在通过聚合酶反应掺入核苷酸时产生的某些信号(例如焦磷酸基)来测定DNA序列。其它SBS方法包括检测核苷酸的聚合酶添加的备选手段，例如光发射、荧光的变化、pH的变化或一些其它的物理学或化学变化的检测。例如，Illumina可逆终止剂测序依赖含染料的可逆终止剂碱基。当一个这类碱基加到延伸的核酸聚合物中时，反应被停止，且末端核酸上的染料是可检测的。含有终止剂的分子然后用逆转终止并允许添加额外核苷酸的切割酶处理。该逐步过程是对较早技术的改进，但额外的切割步骤和随后的样品纯化为进一步的改进留下余地。
在一些实施方案中，发明提供掺入延伸的核酸聚合物中并终止延伸反应的含有3′-炔的功能性终止剂核苷酸。3′-炔可直接用于通过点击化学与叠氮化物修饰的标签的反应中。通过点击化学产生的键模拟天然核酸磷酸二酯键，并提供缀合产物在后续酶促反应例如PCR中的应用。这样，本发明的一些实施方案避开可逆终止剂测序反应的终止剂切割步骤，因此缩短反应的运行时间(参见例如图2所示实施方案)。
在一些实施方案中，将核苷酸类似物，例如3′-炔基核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基核苷酸类似物，例如3′-O-炔丙基dNTP)用于聚合酶反应中，制备其中3′端包含炔基的核酸延伸产物。炔修饰的核酸产物随后可在通过点击化学(例如铜(I)催化的1,3-偶极环加成反应)的与含有叠氮基部分的化合物的化学连接反应中用作特异性底物。这种类型的点击化学使炔和叠氮化物缀合，在含炔化合物和含叠氮化物的化合物之间形成共价连接(例如五元三唑环)。例如可采用点击化学，将5′-叠氮化物修饰的DNA片段与3′-炔修饰的DNA片段化学连接。这种缀合的DNA产物然后可在后续酶促反应例如PCR或测序中用作输入，因为通过五元三唑环产生的共价连接模拟DNA骨架的天然磷酸二酯键，并且不显著和/或可检测地抑制随后的酶促活性。
包括核苷酸类似物的预期反应提供多个潜在的检测事件。在一些实施方案中，核苷酸类似物将特定的荧光团掺入延伸的核酸链中。在一些实施方案中，核苷酸类似物的添加产生可检测信号，例如焦磷酸。在一些实施方案中，核苷酸类似物的掺入可通过光发射、荧光变化、pH变化、构象变化或一些其它化学变化检测。在一些实施方案中，可以类似于核苷酸类似物掺入的方式检测掺入的核苷酸类似物和包含叠氮基部分的化合物之间的点击化学反应。
由于点击化学，含炔的核苷酸类似物容易与含有叠氮基部分的化合物反应。采用该点击化学，可将不同的标签共价插入含有核苷酸类似物之一的延伸的核酸链中。这类标签的实例包括但不限于荧光染料、DNA、RNA、寡核苷酸、核苷、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖、核酸、合成聚合物和病毒。
在一些实施方案中，该技术涉及用于核酸测序的方法。在一些实施方案中，通过以下次序的事件，示例性地使用包含3′-O-炔丙基部分的核苷酸类似物，进行测序。首先，使核苷酸类似物定位于聚合酶活性部位(例如通过聚合酶)以与模板链的互补碱基进行碱基配对，并与延伸的合成链的游离3′羟基邻接。接着，通过聚合酶，例如通过酶催化的攻击核苷酸类似物α-磷酸上的3′羟基，将核苷酸类似物加入延伸链的3′端。因聚合酶引起的链的进一步延伸被掺入的核苷酸类似物上的3′-O-炔丙基终止基团阻断。在一些实施方案中，然后使链进行PCR反应，并用于各种测序方法。
在一些实施方案中，将3′-O-炔丙基终止部分用叠氮化物标记的DNA分子处理。这除去终止剂炔。一旦除去终止剂，则延伸链是游离的用于进一步聚合：掺入下一个碱基以继续另一个循环，例如，将核苷酸类似物定位于聚合酶活性部位，通过聚合酶将核苷酸类似物加入延伸链的3′端，并查询核苷酸类似物以鉴定所加入的碱基。
一些实施方案涉及平行(例如大规模平行)测序。
在一些实施方案中，本文所述技术涉及用于核酸测序的方法，所述方法包括：使引物与核酸杂交形成杂交的引物/核酸复合物，提供多种核苷酸类似物，各核苷酸类似物包含核苷酸和与核苷酸连接的炔部分，使杂交的引物/核酸复合物和核苷酸类似物与聚合酶反应以通过聚合酶反应将核苷酸类似物添加至引物中形成包含掺入的核苷酸类似物的延伸产物，查询延伸产物以鉴定掺入的核苷酸类似物，使延伸产物与含叠氮化物的化合物反应以形成包含三唑环的结构。在一些实施方案中，核苷酸类似物包含3′-O-炔丙基-dNTP，其中N选自A、C、G、T和U。在一些实施方案中，包含三唑环的核酸缀合物用于后续酶促反应例如聚合酶链式反应中。在一些实施方案中，所述方法包括在提供核苷酸类似物的相同步骤期间提供常规核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述技术提供用于核酸测序的方法，所述方法包括：使引物与核酸杂交形成杂交的引物/核酸复合物，提供多种核苷酸(其一些为包含核苷酸和与核苷酸连接的炔部分的核苷酸类似物)，使杂交的引物/核酸复合物和核苷酸类似物与聚合酶反应以通过聚合酶反应将核苷酸类似物添加至引物中形成包含掺入的核苷酸类似物的延伸产物，查询包含三唑环的结构以鉴定掺入的类似核苷酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使延伸产物与含叠氮化物的化合物反应以形成包含三唑环的结构。在一些实施方案中，核苷酸类似物包含3′-O-炔丙基-dNTP，其中N选自A、C、G、T和U。在一些实施方案中，将包含三唑环的结构用于后续酶促反应例如聚合酶链式反应中。在一些实施方案中，所述方法包括在提供核苷酸类似物的相同步骤期间提供常规核苷酸。
在包括使用聚合酶将核苷酸类似物掺入核酸中的一些具体实施方案中(例如PCR、引物延伸、DNA测序(例如NGS)、单一碱基延伸等)，聚合酶是获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种(例如分类学谱系古细菌、广古菌门、热球菌纲、热球菌目、热球菌科、热球菌属的生物)的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶获自、来源于、分离自、克隆自(等)热球菌物种9°N-7(参见例如Southworth等(1996)“CloningofthermostableDNApolymerasesfromhyperthermophilicmarineArchaeawithemphasisonThermococcussp.9°N-7andmutationsaffecting3'-5'exonucleaseactivity(来自超嗜热海洋古细菌侧重于热球菌属物种9°N-7和影响3'-5'外切核酸酶活性的突变的耐热DNA聚合酶的克隆)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5281，通过引用以其整体结合到本文中)。编码野生型热球菌属物种9°N-7聚合酶的核苷酸序列由GenBank登记号U47108提供(例如聚合酶基因以登记号U47108的核苷酸40开始)，野生型热球菌属物种9°N-7聚合酶的氨基酸序列由GenBank登记号AAA88769提供。
在一些实施方案中，聚合酶包含提供修饰的底物(例如修饰的二脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸)的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含提供包含修饰的3′官能团的核苷酸类似物，例如本文所述3′-O-炔丙基dNTP的掺入得以改进的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶的氨基酸序列包含相对于热球菌属物种9°N-7野生型聚合酶氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，例如，丙氨酸取代氨基酸141位的天冬氨酸(D141A)、丙氨酸取代氨基酸143位的谷氨酸(E143A)、缬氨酸取代氨基酸409位的酪氨酸(Y409V)和/或亮氨酸取代氨基酸485位的丙氨酸(A485L)。
在一些实施方案中，在包含克隆的热球菌属物种9°N-7聚合酶基因的异源宿主生物(例如大肠杆菌)中提供例如包含一个或多个突变(例如D141A、E143A、Y409V和/或A485L)的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是由NewEnglandBioLabs(Ipswich,Mass.)以商品名THERMINATOR(例如THERMINATORII)销售的热球菌属物种9°N-7聚合酶。
在一些实施方案中，用于产生聚合酶突变体和筛选其活性(例如修饰的核苷酸的掺入)的方法描述于例如Gardner和Jack(1999)“DeterminantsofnucleotidesugarrecognitioninanarchaeonDNApolymerase(古DNA聚合酶中核苷酸糖识别的决定簇)”NucleicAcidsResearch27(12):2545，通过引用以其整体结合到本文中。具体地说，例如Gardner和Jack(2002)“AcyclicanddideoxyterminatorpreferencesdenotedivergentsugarrecognitionbyarchaeonandTaqDNApolymerases(无环和二脱氧终止剂优先选择表明通过古DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶的趋异糖识别)”NucleicAcidsResearch30(2):605(通过引用以其整体结合到本文中)提供用于产生和鉴定掺入修饰的核苷酸的聚合酶突变体的方法。用于表征通过不同聚合酶掺入修饰的核苷酸的其它测定法描述于例如Ruparel等(2005).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.26:5932；Barnes(1978).J.Mol.Biol.119:83；Sanger等(1977).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74:5463；Haff和Simirnov(1997)GenomeMethods7:378；以及美国专利号5,558,991，各通过引用以其整体结合到本文中。
6.应用
本文提供的核苷酸类似物应用于广泛的应用。所述核苷酸类似物的应用的非限制性实例包括用作抗病毒剂和/或抗癌剂。在一些实施方案中，本文提供的核苷酸类似物应用于诊断医学成像，例如作为用于例如MRI、计算机体层摄影术(CT)扫描、X射线成像、血管造影术(例如静脉造影术、数字减影血管造影术(DSA)、动脉造影术)、静脉尿路造影术、静脉肾盂造影术、脊髓造影术、介入医学(例如血管成形术(例如经皮腔内血管成形术)、动脉消融和/或闭塞(例如治疗癌症和/或血管异常)和放置支架)、关节造影术、涎管造影术、逆行性胆总管胰腺造影术、排尿性膀胱造影术等的造影剂。所述造影剂的其它说明性和非限制性应用包括用于人诊断学的体内成像、药物发现和模型系统(小鼠模型等)中的药物开发。
在一些实施方案中，包含一个或多个本文所述核苷酸类似物的寡核苷酸应用于纳米缀合物(例如包含纳米粒子例如二氧化钛纳米粒子、寡核苷酸(例如包含核苷酸类似物)和/或造影剂(例如重金属造影剂例如钆))，用于成像和/或治疗(例如中子俘获癌症疗法)。参见例如Paunesku等,Nanomedicine4(3):201-7,2008。
在一些实施方案中，该技术用作递药标签，例如用于寡核苷酸和反义治疗剂(例如siRNA、miRNA等)的靶向细胞递送。在一些实施方案中，该技术用于递送与包含核苷酸类似物的核酸连接的药物，其中核酸用作打靶部分。在一些实施方案中，该技术包含使用细胞打靶部分以指导和/或递送寡核苷酸至特定的细胞、组织、器官等中。细胞打靶部分使化合物(例如按照本文所述技术与例如下述细胞打靶部分/递药部分连接的寡核苷酸(例如寡核苷酸类似物))具有特性，使得相对于一种或多种其它非靶细胞类型，化合物和/或寡核苷酸优选被一种或多种靶细胞类型识别、结合、输入、加工、激活等。例如，内皮细胞对肽打靶部分Arg-Gly-Asp(RGD)具有高亲和力，癌细胞和肾细胞优先与具有叶酸部分的化合物相互作用，免疫细胞对甘露糖具有亲和力，心肌细胞对肽CWLSEAGPVVTVRALRGTGSW具有亲和力(参见例如Biomaterials31：8081-8087，2010)。其它打靶部分/递送部分是本领域已知的。因此，包含打靶部分的化合物优先与靶定的细胞类型相互作用并被靶定的细胞类型吸收。
在一些实施方案中，化合物包含RGD肽。RGD肽包含4-30(例如5-20或5-15)个氨基酸，并靶向肿瘤细胞(例如内皮肿瘤细胞)。所述肽和来源于其中的药剂是本领域已知的，并描述于Beer等,载于MethodsMol.Biol.680:183-200(2011)和Theranostics1:48-57(2011)；Morrison等,载于Theranostics1:149-153(2011)；Zhou等,载于Theranostics1:58-82(2011)；以及Auzzas等,载于Curr.Med.Chem.17:1255-1299(2010)。
在一些实施方案中，打靶部分是叶酸，例如用于靶向表达叶酸受体的细胞。相对于正常细胞的较低水平，叶酸受体在例如脑、肾、肺、卵巢和乳腺的癌的人癌细胞的细胞表面上过量表达(参见例如SudimackJ,等,2000“Targeteddrugdeliveryviathefolatereceptor(通过叶酸受体的靶向递药)”AdvDrugDelivRev41:147-162)。
在一些实施方案中，打靶部分包含运铁蛋白，其使化合物靶向例如巨噬细胞、骨髓中的红系前体细胞和癌细胞。当运铁蛋白蛋白质遇到细胞表面上的运铁蛋白受体时，运铁蛋白受体与运铁蛋白结合，并将运铁蛋白转运至细胞。与运铁蛋白连接的药物和其它化合物和/或部分也转运至细胞，在一些情况下，输入细胞中。在一些实施方案中，运铁蛋白的片段使该技术的化合物靶向靶细胞。参见例如Qian等(2002)“Targeteddrugdeliveryviathetransferrinreceptor-mediatedendocytosispathway(通过运铁蛋白受体介导的胞吞途径靶向递药)”,Pharmacol.Rev.54:561-87；Daniels等(2006)“ThetransferrinreceptorpartI:Biologyandtargetingwithcytotoxicantibodiesforthetreatmentofcancer(运铁蛋白受体第I部：生物学和用细胞毒性抗体打靶用于癌症治疗)”,Clin.Immunol.121:144-58。
在一些实施方案中，打靶部分包含肽VHSPNKK。该肽使化合物靶向表达血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的细胞，例如靶向活化内皮细胞。靶向活化内皮细胞应用于例如将治疗剂递送至细胞以治疗炎症和癌症。某些黑素瘤细胞利用VCAM-1与内皮粘附，并且VCAM-1参与单核细胞募集至动脉粥样硬化部位。因此，肽VHSPNKK应用于使本技术的化合物靶向癌(例如黑素瘤)细胞和动脉粥样硬化部位。
参见例如Lochmann,等(2004)“Drugdeliveryofoligonucleotidesbypeptides(通过肽的寡核苷酸的药物递送)”Eur.J.PharmaceuticsandBiopharmaceutics58:237-251(通过引用结合到本文中)，论述了打靶部分和被这些部分靶中的细胞。
在一些实施方案中，细胞打靶部分包含抗体或其衍生物或片段。抗细胞特异性分子例如蛋白质(例如细胞表面蛋白质、膜蛋白质、蛋白聚糖、糖蛋白、肽等)；多核苷酸(核酸、核苷酸)；脂质(例如磷脂、糖脂等)或其包含被抗体特异性识别的表位或抗原的片段的抗体，使该技术的化合物靶向表达细胞特异性分子的细胞。
例如，许多抗体和抗体片段特异性结合由肿瘤或感染性病变(包括病毒、细菌、真菌和寄生虫感染)产生的或与之有关的标志物和与所述微生物有关的抗原和产物(参见例如美国专利号3,927,193、4,331,647、4348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,460,459、4,460,561、4,818,709和4,624,846，通过引用结合到本文中)。此外，靶向心肌梗死的抗体公开于例如美国专利号4,036,945。靶向正常组织或器官的抗体公开于例如美国专利号4,735,210。抗血纤蛋白抗体作为与动脉粥样硬化斑和淋巴细胞自体反应性克隆结合的抗体，是本领域已知的。
对于癌症(例如乳腺癌)及其转移，一种或多种特异性标志物可选自细胞表面标志物，例如MUC型黏蛋白家族的成员、上皮生长因子(EGFR)受体、癌胚抗原(CEA)、人癌抗原、血管内皮生长因子(VEGF)抗原、黑素瘤抗原(MAGE)基因、家族抗原、T/Tn抗原、激素受体、生长因子受体、簇标识/分化(CD)抗原、肿瘤抑制基因、细胞周期调节因子、癌基因、癌基因受体、增殖标志物、粘附分子、参与胞内基质降解的蛋白酶、恶性转化相关因子、细胞凋亡相关因子、人癌抗原、糖蛋白抗原、DF3、4F2、MGFM抗原、乳腺肿瘤抗原CA15-3、钙调理蛋白、组织蛋白酶、CD31抗原、增殖细胞核抗原10(PC10)和pS2。对于其它形式的癌症及其转移，一种或多种特异性标志物可选自细胞表面标志物，例如血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、癌胚抗原(CEA)家族的成员、抗独特型mAB的类型、神经节苷脂模拟物的类型、簇标识分化抗原的成员、表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员、细胞粘附分子的类型、MUC型黏蛋白家族的成员、癌症抗原(CA)的类型、基质金属蛋白酶的类型、糖蛋白抗原的类型、黑素瘤相关抗原(MAA)的类型、蛋白水解酶、钙调蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员、血管生成标志物的类型、被T细胞识别的黑素瘤抗原(MART)抗原、黑素瘤抗原编码基因(MAGE)家族的成员、前列腺膜特异性抗原(PMSA)、小细胞肺癌抗原(SCLCA)、T/Tn抗原、激素受体、肿瘤抑制基因抗原、细胞周期调节因子抗原、癌基因抗原、癌基因受体抗原、增殖标志物、参与胞内基质降解的蛋白酶、恶性转化相关因子、细胞凋亡-相关因子和人癌抗原的类型。
抗体可对与免疫系统疾病相关的靶标具有亲和力，所述靶标例如蛋白质、细胞因子、趋化因子、感染性生物体等。在另一个实施方案中，抗体可靶向与病原体传播条件有关的预期靶标。特定的靶标和抗体对病原体传播条件的类型有特异性，但不限于此。病原体定义为任何致病因子，例如细菌、病毒、微生物、真菌、朊病毒和寄生物。抗体可对病原体或病原体相关物质具有亲和力。抗体可对细胞标志物或与病原体传播条件有关的标志物具有亲和力。可以选择一种或多种标志物，使得它们表示受感染细胞上的可行的靶标。对于病原体传播条件，可选择抗体以靶向病原体本身。对于细菌情况，预定靶标可以是细菌本身，例如大肠杆菌或炭疽杆菌(Bacillusanthracis)。对于病毒情况，预定靶标可以是病毒本身，例如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、肝炎病毒例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒例如HIV、HIV-1或HIV-2或疱疹病毒例如疱疹病毒6。对于寄生物情况，预定靶标可以是寄生物本身，例如克氏锥虫(Trypanasomacruzi)、动基体类(Kinetoplastid)、曼氏裂体吸虫(Schistosomamansoni)、日本裂体吸虫(Schistosomajaponicum)或Schistosomabrucei。对真菌情况，预定靶标可以是真菌本身，例如曲霉(Aspergillus)、假丝酵母(Candida)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)或根毛霉(Rhizomucor)。
在另一个实施方案中，抗体可靶向与不期望的靶标有关的预定靶标。特定的靶标和抗体可对不期望的靶标的类型有特异性，但不限于此。不期望的靶标是与疾病或不良情况有关的靶标，但也存在于正常情况下。例如，靶标可存在于升高的浓度下或以别的方式在疾病或不良状态下改变。抗体可对不期望的靶标或与不期望的靶标有关的生物分子途径具有亲和力。抗体可对细胞标志物或与不期望的靶标有关的标志物具有亲和力。对于不期望的靶标，预定靶标的选择对于使用本发明技术的化合物(例如药物和/或治疗部分)的疗法是重要的。可选择抗体以靶向与疾病或不良情况有关的生物物质。对于动脉硬化，预定靶标可为例如低密度脂蛋白(LDL)上的载脂蛋白B。对于肥胖症，一种或多种预定的标志物可选自细胞表面标志物，例如胃抑多肽受体和CD36抗原之一。另一种不期望的预定靶标可以是凝固血。在另一个实施方案中，抗体可靶向与移植入患者的器官的反应有关的预定靶标。特定的靶标和抗体可对器官移植物的类型有特异性，但不限于此。抗体可对与器官移植物的反应有关的生物分子具有亲和力。抗体可对细胞标志物或与对器官移植物的反应有关的标志物具有亲和力。可以选择一种或多种标志物，使得它们代表免疫系统的T细胞或B细胞上的可行的靶标。在另一个实施方案中，抗体可靶向与患者中的毒素有关的预定靶标。毒素定义为由生物体产生的任何毒物，包括但不限于细菌毒素、植物毒素、昆虫毒素、动物毒素和人造毒素。特定的靶标和抗体可对毒素的类型有特异性，但不限于毒素的类型。抗体对毒素或与对毒素的反应有关的生物分子可具有亲和力。抗体对细胞标志物或与对毒素的反应有关的标志物可具有亲和力。在另一个实施方案中，抗体可靶向与激素相关疾病有关的预定靶标。特定的靶标和抗体可对具体的激素疾病有特异性，但不限于具体的激素疾病。抗体可对激素或与激素途径有关的生物分子具有亲和力。抗体可对细胞标志物或与激素疾病有关的标志物具有亲和力。在另一个实施方案中，抗体可靶向与非癌患病组织有关的预定靶标。特定的靶标和抗体可对特定的非癌患病组织(例如非癌患病沉积物和前体沉积物)有特异性，但不限于此。抗体可对与非癌患病组织有关的生物分子具有亲和力。抗体可对细胞标志物或非癌患病组织有关的标志物具有亲和力。在另一个实施方案中，抗体可靶向蛋白质性病原体。特定的靶标和抗体可对特定的蛋白质性病原体有特异性，但不限于此。抗体可对蛋白质性病原体或与蛋白质性病原体有关的生物分子具有亲和力。抗体可对细胞标志物或与蛋白质性病原体有关的标志物具有亲和力。对于朊病毒疾病，亦称为传染性海绵状脑病，预定靶标可为例如朊病毒蛋白3F4。
对于靶标、细胞特异性标志物(例如被抗体部分靶向的抗原)、抗体和与这些靶标、细胞特异性标志物和抗原/抗体有关的适应症的列表，参见例如美国专利申请公布号20050090732(具体为表I)，通过引用结合到本文。
在一些实施方案中，该技术应用于成像，例如用于原位杂交(ISH)。在一些实施方案中，本文提供的核苷酸类似物应用于ISH和荧光原位杂交(FISH)的杂交探针的核酸。在一些实施方案中，核苷酸类似物应用于直接ISH和/或免疫组织化学应用，而无需使用二次检测试剂。
7.药物制剂
在一些实施方案中，在药物制剂中提供核苷酸类似物、包含核苷酸类似物的寡核苷酸等用于给予受试者。一般预期，配制与该技术有关的化合物(例如核苷酸类似物、包含核苷酸类似物的寡核苷酸、核苷酸类似物和/或包含核苷酸类似物的寡核苷酸的缀合物等)用于给予哺乳动物，尤其给予患有对给予所述化合物起反应的病况的人。因此，在预期的化合物以药物组合物给予时，考虑预期的化合物与药学上可接受的载体混合配制。例如，预期的化合物可作为药理学上可接受的盐口服给予，或在生理盐水溶液(例如缓冲至约7.2-7.5的pH)中静脉内给予。常规缓冲剂例如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐可用于该目的。当然，本领域普通技术人员可在说明书的教导范围内改进制剂以提供用于特定给药途径的多种制剂。具体地说，可对预期的化合物进行修饰以使其更溶于水或其它溶媒中，例如，这可容易地用本领域普通技术人员所掌握的少量改动来实现(盐制剂、酯化等)。也尽在本领域普通技术人员掌握中的是，改进具体化合物的给药途径和剂量方案以控制本发明化合物的药代动力学用于患者的最大有益效果。
在某些药物剂型中，可形成预期化合物的前药形式用于各种目的，包括降低毒性、提高器官或靶细胞特异性等。在不同的前药形式中，优选本发明化合物的酰化(乙酰化等)衍生物、吡啶酯和各种盐形式。本领域普通技术人员应认识到如何将本发明化合物修饰成前药形式以利于将活性化合物递送至宿主生物或患者内的靶部位。适当时，在将本发明化合物递送至宿主生物或患者内的靶定部位时，本领域普通技术人员还可利用前药形式的有利的药代动力学参数，使化合物的预期作用最大化。同样地，应认识到，预期的化合物也可代谢成为其生物学活性形式，因此明确考虑了本文化合物的所有代谢物。另外，预期的化合物(及其组合)可与另外其它的作用剂组合给予。
至于给予受试者，考虑化合物以药用有效量给予。普通技术人员认识到药用有效量随所用治疗剂、受试者的年龄、情况和性别及受试者的疾病程度而变化。一般而言，剂量不应大到引起不良副作用，例如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。还可由各医生或兽医调整剂量以实现所需的治疗目的。
本文所用术语“药用有效量”所包括的实际量将取决于给药途径，待治疗的受试者的类型和研究中具体受试者的身体特性。这些因素及其与确定这个量的关系为医学、兽医和其它相关领域熟练从业人员所熟知。可调整给予的这个量和方法以使功效最大化，但仍将取决于例如体重、饮食、同期药物等因素和本领域技术人员应了解的其它因素。
药用组合物优选包含一种或多种本技术的化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的载体是本领域已知的，例如描述于例如RemingtonsPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaro编辑,1985)，通过引用明确结合到本文用于所有目的。
因此，在一些实施方案中，将免疫治疗剂配制为片剂、胶囊剂、延时释放片剂、延时释放胶囊剂；延时释放小丸剂；慢释片剂、慢释胶囊剂；慢释小丸剂；快释片剂、快释胶囊剂；快释小丸剂；舌下片剂；凝胶胶囊剂；微囊剂；经皮递送制剂；经皮凝胶剂；经皮贴剂；无菌溶液剂；制备用作肌内或皮下注射、用作直接注射入靶定部位或用于静脉内给药的无菌溶液剂；制备用于直肠给药的溶液剂；制备用于胃饲管或十二指肠饲管给药的溶液剂；用于直肠给药的栓剂；作为溶液剂或酏剂制备的口服液体剂；局部乳膏剂；凝胶剂；洗剂；酊剂；糖浆剂；乳液剂或混悬剂。
在一些实施方案中，延时释放制剂是持续释放、持续作用、延长释放、控释、改良释放或连续释放机制，例如，配制组合物以快速、缓慢或以化合物随时间推移的任何合适的释放速率溶解。
在一些实施方案中，配制组合物，使得活性成分嵌入不溶性物质(例如各种丙烯酸酯、壳多糖)的基质中，使得溶解的化合物例如通过扩散寻求通过基质中的孔的出路。在一些实施方案中，制剂被封在基于聚合物的片剂中，其一面具有激光钻孔，另一面为多孔膜。胃酸穿过多孔膜，因此推动药物穿出激光钻孔。整个药物剂量及时释放进入系统，而聚合物外壳保持完整，稍后通过正常消化排出。在一些持续释放制剂中，化合物溶解进入基质，基质物理性地膨胀形成凝胶，允许化合物通过凝胶的外表面流出。在一些实施方案中，制剂呈微囊化形式，例如，其在一些实施方案中使用时，产生复杂的溶出曲线。例如，通过将化合物包覆在惰性片芯上，将其用不溶性物质成层堆积形成微球，一些实施方案以在具体的实施方案中与其它受控(例如立即)释放药物成分混合的便利形式提供更一致和可再现的溶解速率，例如提供多部分凝胶胶囊剂。
在一些实施方案中，提供呈颗粒剂的该技术的药物制品和/或制剂。本文所用“颗粒剂”在制药背景下意指可构成本文所述化合物的整体或部分的纳米粒剂或微粒剂(或在一些情况下较大)。颗粒剂可含有被包衣材料(包括但不限于肠溶包衣)环绕的片芯中的制品和/或制剂。制品和/或制剂也分散在整个颗粒剂中。制品和/或制剂还可吸附在颗粒剂上。颗粒剂可具有任何级次释放动力学，包括零级释放、一级释放、二级释放、延缓释放、持续释放、立即释放及其任何组合等。除了制品和/或制剂以外，颗粒剂可包括常规用于制药和医学领域的材料任一种，包括但不限于易蚀的、非易蚀的、生物可降解的或生物不可降解的材料或其组合。颗粒剂可以是微囊剂，其含有呈现溶液或半固体状态的制剂。颗粒剂可具有几乎任何形状。
生物不可降解的和生物可降解的聚合材料两者可用于制备递送制品和/或制剂的颗粒剂。所述聚合物可以是天然或合成的聚合物。根据释放需要的时间选择聚合物。特别有益的生物粘附聚合物包括H.S.Sawhney,C.P.Pathak和J.A.Hubell在Macromolecules,(1993)26:581-587(其教导通过引用结合到本文)中描述的生物可蚀解的水凝胶。这些包括多聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯和聚丙烯酸十八烷基酯。
该技术还提供用于制备含有化合物或其盐的含水溶液以抑制降解产物形成的稳定药物制剂的方法。提供含有化合物或其盐和至少一种抑制剂的溶液。在最终将溶液灌装在密封容器之前和/或之后，将溶液在至少一种灭菌技术下加工，形成稳定的药物制剂。本发明制剂可通过本领域已知的各种方法制备，只要制剂基本上是均质的，例如药物基本上均匀地分布在制剂内。所述均匀分布有利于控制药物从制剂中释放。
在一些实施方案中，化合物用缓冲剂配制。缓冲剂可以是任何药学上可接受的缓冲剂。缓冲系统包括柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂和磷酸缓盐冲剂。缓冲剂的实例包括柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸、磷酸钠和磷酸、抗坏血酸钠、酒石酸、马来酸、甘氨酸、乳酸钠、乳酸、抗坏血酸、咪唑、碳酸氢钠和碳酸、琥珀酸钠和琥珀酸、组氨酸和苯甲酸钠和苯甲酸。
在一些实施方案中，化合物用螯合剂配制。螯合剂可以是任何药学上可接受的螯合剂。螯合剂包括乙二胺四乙酸(也与EDTA、依地酸、verseneacid和西奎斯特林同义)和EDTA衍生物，例如依地酸二钾、依地酸二钠、依地酸钙二钠、依地酸钠、依地酸三钠和依地酸钾。其它螯合剂包括柠檬酸及其衍生物。柠檬酸亦称为柠檬酸一水合物。柠檬酸的衍生物包括无水柠檬酸和柠檬酸三钠二水合物。另外其它的螯合剂包括烟酰胺及其衍生物和脱氧胆酸钠及其衍生物。
在一些实施方案中，化合物用抗氧化剂制备。抗氧化剂可以是任何药学上可接受的抗氧化剂。抗氧化剂为本领域技术人员所熟知，包括例如抗坏血酸、抗坏血酸衍生物(例如抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙等)、丁羟茴醚、丁羟甲苯、没食子酸烷基酯、偏硫酸氢钠、硫酸氢钠、连二亚硫酸钠、巯基乙酸钠、甲醛次硫酸钠、生育酚及其衍生物(d-α生育酚、乙酸d-α生育酚、乙酸dl-α生育酚、琥珀酸d-α生育酚、β生育酚、δ生育酚、γ生育酚和琥珀酸d-α生育酚聚氧乙二醇1000)、单硫代甘油和亚硫酸钠等材料。所述材料通常以0.01-2.0%的范围加入。
在一些实施方案中，化合物用冷冻保护剂制备。冷冻保护剂可以是任何药学上可接受的冷冻保护剂。普通的冷冻保护剂包括组氨酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、甘露糖醇和多元醇。
在一些实施方案中，化合物用等张剂制备。等张剂可以是任何药学上可接受的等张剂。该术语在本领域与等渗剂可互换使用，已知为加入药物制剂中以提高渗透压的化合物，例如，在一些实施方案中，是指与人胞外液体(例如血浆)等渗的0.9%氯化钠溶液。优选的等渗剂为氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖和甘油。
药物制剂可任选包含防腐剂。普通防腐剂包括选自三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯甲醇和苯酚的那些。合适的防腐剂包括但不限于：三氯叔丁醇(0.3-0.9%w/v)、对羟基苯甲酸酯(0.01-5.0%)、硫柳汞(0.004-0.2%)、苯甲醇(0.5-5%)、苯酚(0.1-1.0%)等。
在一些实施方案中，化合物用湿润剂配制以在口服应用时提供舒适的口感。本领域已知的湿润剂包括胆固醇、脂肪酸、甘油、月桂酸、硬脂酸镁、季戊四醇和丙二醇。
在一些实施方案中，制剂中包括乳化剂，例如以确保所有赋形剂，尤其疏水组分例如苯甲醇完全溶解。许多乳化剂是本领域已知的，例如聚山梨醇酯60。
对于与口服给药有关的一些实施方案，可能需要加入药学上可接受的矫味剂和/或甜味剂。化合物例如糖精、甘油、单糖浆和山梨糖醇可用作甜味剂。
8.给药、治疗和剂量
在一些实施方案中，该技术涉及向受试者提供一定剂量的核苷酸类似物、包含核苷酸类似物的寡核苷酸或其缀合物(例如包含打靶部分、造影剂、标记、标签等)的方法。在一些实施方案中，以药用有效量给予化合物、其衍生物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以治疗有效剂量给予化合物、其衍生物或其药学上可接受的盐。
选择剂量和频率以产生化合物的有效水平而无重大的有害作用。当口服或静脉内给药时，化合物或相关化合物的剂量的范围一般可为0.001-10,000mg/kg/天或剂量(例如0.01-1000mg/kg/天或剂量；0.1-100mg/kg/天或剂量)。
给予药用有效量的方法包括而不限于胃肠外、口服、腹膜内、鼻内、局部、舌下、直肠和阴道形式给药。胃肠外给药途径包括例如皮下、静脉内、肌内、胸骨内注射和输注途径。在一些实施方案中，口服给予化合物、其衍生物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，将单剂量的化合物或相关化合物给予受试者。在其它实施方案中，在以几小时、几天、几周等间隔的两个或更多个时间点给予多剂量。在一些实施方案中，在一段长时间内(例如长期)给予化合物，例如持续数月或数年的时间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月或年)。在所述实施方案中，可在有规律的预定基础(例如每日、每周一次等)上服用化合物持续延长的一段时间。
该技术还涉及用适于受试者疾病的药物治疗受试者的方法。按照该技术的另一方面，提供用有效量的化合物或其盐治疗需要所述治疗的受试者的方法。所述方法包括给予受试者有效量的上文所述、本文详述和/或权利要求书给出的药物制剂的任一种的化合物或其盐。受试者可以是需要所述治疗的任何受试者。在之前的描述中，该技术与化合物或其盐联合。所述盐包括但不限于溴化物盐、氯化物盐、碘化物盐、碳酸盐和硫酸盐。然而，应了解，化合物是一类化合物的成员，该技术预期包括含有该类别的相关衍生物的药物制剂、方法和药盒。该技术的另一方面则包括前面的概述，但在各方面中无论“化合物”出现在哪里，就像所述衍生物被取代一样进行阅读。
在一些实施方案中，对受试者进行测试以评价疾病和/或病况的存在、缺乏或水平。例如通过测定或测量生物标志物、代谢物、身体症状、适应症等，进行所述测试以确定疾病或病况的风险或存在情况。在一些实施方案中，根据试验结果，用化合物治疗受试者。在一些实施方案中，对受试者进行治疗，获得样品，测量可检测物质(detectableagent)的水平，然后根据测量的可检测物质的水平，再次对受试者进行治疗。在一些实施方案中，对受试者进行治疗，获得样品，测量可检测物质的水平，根据测量的可检测物质的水平，再次对受试者进行治疗，然后获得另一样品，并测量可检测物质的水平。在一些实施方案中，在不同阶段，例如在作为初始剂量的指导的初始治疗之前，也采用其它试验(例如不基于测量可检测物质的水平)。在一些实施方案中，根据试验结果调整后续治疗，例如改变剂量、剂量方案、药物特性等。在一些实施方案中，对患者进行测试、治疗，然后再次测试以监测对疗法的反应和/或改变疗法。在一些实施方案中，可发生测试和治疗的循环而不限于测试和治疗的方式、周期性或各测试和治疗期的间隔的持续时间。因此，该技术考虑测试和治疗的各种组合而不限于例如试验/治疗、治疗/试验、试验/治疗/试验、治疗/试验/治疗、试验/治疗/试验/治疗、试验/治疗/试验/治疗/试验、试验/治疗/试验/试验/治疗/治疗/治疗/试验、治疗/治疗/试验/治疗、试验/治疗/治疗/试验/治疗/治疗等。
虽然本文的公开内容提及某些说明性实施方案，但要了解，通过实例而非通过限制的方式来提供这些实施方案。
实施例
实施例1-核苷酸类似物的表征
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，核苷酸类似物通过分析化学方法表征。具体地说，3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP、3′-O-炔丙基-dGTP和3′-O-炔丙基-dTTP按照本文所述合成方案合成，并通过1HNMR、31PNMR、阴离子交换HPLC和高分辨质谱法表征。分析测试表明合成和纯化是成功的(图X-Y)。
实施例2-用于鉴定相容聚合酶的测定法
在一些实施方案中，该技术涉及将核苷酸类似物掺入核酸中。因此，该技术提供鉴定识别核苷酸类似物(例如3′-O-炔丙基-dNTP)作为底物的聚合酶的测定法。例如，在一些示例性测定法和/或实施方案中，相容聚合酶通过聚合酶延伸反应(例如单碱基延伸反应)鉴定。参见例如Ausebel等(编辑),CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork:JohnWiley&Sons,Inc；Sambrook等(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual.(第2版).ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratoryPress。
例如，鉴定相容聚合酶包括提供试验的聚合酶和适于聚合酶的反应缓冲液。对于获自供应商(例如NewEnglandBioLabs,UnitedStatesBiologicals,Promega,Invitrogen,Worthington,Sigma-Aldrich,Fluka,Finnzymes,Roche,5Prime,Qiagen,KAPABiosystems,ThermoScientific,Agilent,LifeTechnologies等)的聚合酶，聚合酶常常与合适的反应缓冲液一起供应。示例性反应缓冲液包括例如相容缓冲液(例如20mMTris-HCl)、盐(例如10mMKCl)、镁源或锰源(例如2mMMgSO4；2mMMnCl2等)、去垢剂(例如0.1%TRITONX-100)，并具有合适的pH(例如在约25℃下约pH8.8)。一些聚合酶的活性在其它化合物存在下得到改进，例如硫酸盐及其它盐(例如10mM(NH4)2SO4)。用于聚合酶延伸反应的反应混合物通常使用Mg2+或Mn2+作为酶辅因子测试。
通过在反应混合物中提供DNA模板、与DNA模板互补的DNA引物和一种或多种核苷酸和/或核苷酸类似物，来测试聚合酶。模板和引物的典型浓度为约1-100nM，核苷酸和/或核苷酸类似物的典型浓度为约1-125μM(例如对于各核苷酸和/或核苷酸类似物1-125μM和/或对于所有核苷酸和/或核苷酸类似物的总浓度1-500μM)。模板和引物通过本领域已知方法合成(例如使用固相支持体和亚磷酸酰胺化学法)，且可获自若干供应商(例如IntegratedDNATechnologies,Coralville,Iowa)。
通常产生预退火引物/模板用于测试聚合酶。例如，通常以合适的浓度，例如以1-500μM(例如以100μM)将引物重新悬浮于合适的缓冲液(例如Tris-EDTA，pH8.0)中，并且通常以合适的浓度，例如以1-500μM(例如以100μM)将模板重新悬浮于合适的缓冲液(例如Tris-EDTA，pH8.0)中。然后，在退火缓冲液中通过将大致等量的引物和模板混合，来产生预退火引物/模板。例如，预退火引物/模板如下产生：将约100μl约1-500μM(例如以100μM)引物溶液与约100μl约1-500μM(例如以100μM)模板溶液在约800μl的退火缓冲液(例如200mMTris，100mM氯化钾和0.1mMEDTA，pH8.45)中混合，以提供1毫升的引物/模板溶液。本领域技术人员可调节体积和浓度作为适于具体分析的合适的浓度和体积。然后，将引物/模板溶液的等分部分(例如100μl)加热以使分子内和/或分子间二级结构变性(例如通过在约85℃-97℃下(例如在约95℃下)加热例如1-5分钟(例如2分钟)。接下来，使等分部分冷却至退火温度(例如20℃-60℃(例如25℃)，并温育1-10分钟(例如约5分钟)以允许引物和模板退火形成引物/模板。可将引物/模板在合适的底物稀释缓冲液(例如20mMTris、10mM氯化钾和0.01mMEDTA，pH8.45；例如上述退火缓冲液的1:10稀释液)中稀释用于贮存。例如，可将引物/模板在底物稀释缓冲液中稀释至0.01μM的终浓度(例如以提供10×原液)，等分并保存在-20℃下。
软件包是本领域已知的，其在设计用于这些测定法的模板和引物时提供辅助。另外，可获得几个方程式以计算变性(例如解链(Tm)温度)和退火温度。标准参考文献描述了当核酸在1MNaCl下的含水溶液中时，可通过以下方程式计算的Tm值的简单估值：Tm=81.5+0.41*(%G+C)(参见例如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,载于NucleicAcidHybridization(1985)。其它参考文献(例如llawi和SantaLucia，Biochemistry36：10581-94(1997)包括说明结构、环境和序列特性的更复杂的计算。
使用引物和模板或预退火模板以测试聚合酶。例如，在含有合适缓冲液(例如通过聚合酶的供应商提供，或上述示例性反应缓冲液)的约1-100μl(例如10-20μl)的最终体积中，用1-100nM(例如50nM)的引物/模板、dNTP(例如1-125μM的各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、修饰的dATP(例如3′-O-炔丙基-dATP)、修饰的dCTP(例如3′-O-炔丙基-dCTP)、修饰的dGTP(例如3′-O-炔丙基-dGTP)和/或修饰的dTTP(例如3′-O-炔丙基-dTTP)的混合物)和聚合酶(例如1-100U的耐热/嗜热聚合酶或嗜温聚合酶)进行引物延伸测定法。在一些测定法中，反应混合物包含1-50U(例如1U)的耐热焦磷酸酶。
在一些测定法中，使用dNTP和修饰的dNTP的混合物。例如，一些测定法测试将单个碱基掺入核酸(例如在单碱基延伸测定法中)。在所述测定法中，引物与模板中的互补区杂交形成双链体，使得引物的末端3′端紧接待测试的核苷酸类似物的碱基配对配偶体。在一个成功的试验中，待测试的候选聚合酶将单个核苷酸类似物掺入引物的3′端。可获得许多方法，包括荧光标记、用于质谱法的质量标记、使用蛋白质部分测量酶活性和同位素标记，以检测核苷酸类似物的掺入。
具体地说，该测定法测试通过模板所指导的修饰的核苷酸(例如3′-O-炔丙基-dNTP)掺入引物的3′端。在所述测定法中，反应混合物可含有3种dNTP和通过模板所指导的加入引物3′端的1种特定的修饰的dNTP。一些测定法包括使用包含设计的退火至模板的4种引物(例如4种引物/模板)的每一种的4种单独的反应混合物，使得4种修饰的核苷酸的每一种通过模板所指导的加入到引物的3′端。例如，在一些实施方案中，提供引物/模板以测试修饰的dATP(例如3′-O-炔丙基-dATP)的掺入：
其中N为任何核苷酸，“|”表示在示例性引物(上链)和示例性模板(下链)之间的互补碱基配对。在一些实施方案中，提供引物/模板以测试修饰的dCTP(例如3′-O-炔丙基-dCTP)的掺入：
其中N为任何核苷酸，“|”表示在示例性引物(上链)和示例性模板(下链)之间的互补碱基配对。在一些实施方案中，提供引物/模板以测试修饰的dGTP(例如3′-O-炔丙基-dGTP)的掺入：
其中N为任何核苷酸，“|”表示在示例性引物(上链)和示例性模板(下链)之间的互补碱基配对。在一些实施方案中，提供引物/模板以测试修饰的dTTP(例如3′-O-炔丙基-dTTP)的掺入：
其中N为任何核苷酸，“|”表示在示例性引物(上链)和示例性模板(下链)之间的互补碱基配对。引物和模板可为用于测定的任何合适的长度，单一碱基延伸的位置可通过模板的任何合适的核苷酸(通常在模板的中心部分内)指导。
在适于聚合酶的温度下测试反应混合物中的聚合酶。例如，嗜温聚合酶在20℃-60℃的温度下测试，嗜热聚合酶在80℃-97℃或更高(例如100℃或更高)的温度下测试。市售供应的聚合酶随附的印刷品指明合适的温度；可由本领域技术人员通过在某一温度范围内用标准核苷酸测试聚合酶活性，来确定其它(例如任何)聚合酶的合适温度。
在一些测定法中，温度在以下温度间循环：约85℃-97℃(例如约95℃)的变性核酸的温度(例如解链温度)1-5分钟(例如2分钟)、约40℃-70℃(例如55℃)的退火温度5-60秒钟(例如15-20秒钟)和约60-75℃(例如70-75℃)的延伸温度15-60秒钟(例如20-45秒钟)，例如20-50个循环。
通过许多方法测定修饰的核苷酸(例如3′-O-炔丙基dNTP)的成功掺入。在一些具体的测定法中，量化反应产物的大小以测定修饰的核苷酸(例如3′-O-炔丙基dNTP)是否加到引物中。具体地说，成功掺入的产物比已知的引物长度长一个碱基对。可测定作为阴性对照样品的引物用于比较。同样，可评价具有预期来自成功掺入的反应产物的长度和结构的合成阳性对照寡核苷酸。区分以一个碱基而不同的核酸的任何方法均适于测定，例如凝胶电泳(例如AgilentBioanalyzer)、质谱法、HPLC等。
实施例3-聚合酶筛选
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行了实验以鉴定可有效掺入作为底物的3′-O-炔丙基-dNTP的聚合酶。具体地说，采用实施例2所述示例性核苷酸延伸测定法的实施方案以测试多种聚合酶，包括以商品名Ampli-Taq(LifeTechnologies)、KAPAHiFi(KAPABiosystems)、KAPA2G(KAPABiosystems)、HerculaseIIFusionDNA聚合酶(Agilent)、PfuUltraIIFusionHSDNA聚合酶(Agilent)、PhireHSIIDNA聚合酶(ThermoScientific)、M-MuLV反转录酶(NEB)、rTthDNA聚合酶、9°NDNA聚合酶(NEB)、THERMINATORIDNA聚合酶(NEB)、THERMINATORIIDNA聚合酶(NEB)销售的聚合酶和来自NEB的5种另外的定制非目录聚合酶。对测试的所有聚合酶，遵循供应商建议的反应条件。使用Mg2+和Mn2+两者作为反应混合物中的辅因子，进行各聚合酶的试验。
所收集的数据表明，来源于热球菌属物种的聚合酶(例如热球菌属物种9°N(例如THERMINATORI和THERMINATORII))将本文提供的3′-O-炔丙基dNTP掺入核酸中(表1)。
表1中，负号(“-“)表示聚合酶不产生掺入3′-O-炔丙基dNTP的可检测产物，单一正号(“+“)表示聚合酶产生掺入3′-O-炔丙基dNTP的可检测产物，3个正号(“+++”)表示聚合酶产生大量的3′-O-炔丙基dNTP掺入产物。NEB1、NEB2、NEB3、NEB4和NEB5各自表示所测的5种非商品化的NewEnglandBioLabs聚合酶。
要了解，可获得测定法(例如本文所述、别处所述和本领域已知的测定法)以鉴定将修饰的核苷酸(例如本文提供的3′-O-炔丙基dNTP)掺入核酸中的任何聚合酶。因此，该技术不受热球菌属物种9°N(THERMINATORI和THERMINATORII)聚合酶的使用的限制，并且考虑了将修饰的核苷酸(例如本文提供的3′-O-炔丙基dNTP)掺入核酸中的任何适当存在的或尚待发现的聚合酶的使用。使用热球菌属物种9°N(THERMINATORII)聚合酶的本文所述实验是示例性的，并不将该技术限于任何特定聚合酶的使用。
实施例4–将3′-O-炔丙基-dNTP掺入核酸中
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行了实验以评价通过聚合酶将3′-O-炔丙基-dNTP掺入核酸中。具体地说，进行了实验以评价将3′-O-炔丙基-dNTP正确掺入核酸中，并评价终止3′-O-炔丙基-dNTP的活性。为了评价本文提供的核苷酸类似物的这些特性，用具有来自人KRAS的序列(例如KRAS外显子2和侧翼内含子序列)的模板核酸和互补引物，进行了聚合酶延伸测定法(表2)。
表2-用于测试3′-O-炔丙基-dNTP掺入的模板和引物序列
在表2中，“b”表示生物素修饰，“U”表示脱氧尿苷修饰。将引物掺入延伸产物中产生包含尿嘧啶的延伸产物。尿嘧啶可用于例如在许多分子生物学操作(例如从固相支持体中切割产物)中切割产物(例如使用尿嘧啶切割试剂)。
为了测试3′-O-炔丙基-dTTP掺入核酸中，在25-μl最终反应体积中装配包含20mMTris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mMKCl、2mMMnCl2、0.1%TritonX-100、200pmol3′-O-炔丙基-dTTP、6.25pmol引物R_ke2_trP1_T_bio(SEQIDNO:2)和2个单位的TherminatorIIDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)的聚合酶延伸反应混合物。一定体积的0.5pmolKRAS模板(SEQIDNO:1)用作模板(表2)。使用包括将反应物暴露于95℃的温度2分钟，接着95℃15秒钟、55℃25秒钟和65℃35秒钟的35个循环的温度循环特征，进行聚合酶延伸反应。
在聚合酶延伸反应之后，通过凝胶电泳(例如使用Agilent2100生物分析仪和高灵敏度DNA测定芯片(HighSensitivityDNAAssayChip))，将1μl反应混合物直接用于核酸大小分析。从大小分析收集的数据显示存在具有相当于用于反应的引物长度(例如48个碱基)的长度的核酸群和具有相当于引物加一个碱基的长度(例如49碱基)的长度的核酸群。因此，所收集的数据表明3′-O-炔丙基-dTTP成功掺入到引物的3′端。另外，2个核酸群的量大致相等，因此表明3′-O-炔丙基-dTTP稳固掺入引物的3′端形成延伸产物。
采用上述反应条件，用3′-O-炔丙基-dATP和引物R_ke2_trP1_A_bio(SEQIDNO:3)；3′-O-炔丙基-dCTP和引物R_ke2_trP1_C_bio(SEQIDNO:5)；和3′-O-炔丙基dGTP和引物R_ke2_trP1_G_bio(SEQIDNO:4)替换3′-O-炔丙基-dTTP和引物R_ke2_trP1_T_bio，进行了其它聚合酶延伸实验。从这些实验收集的数据同样表明3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP和3′-O-炔丙基-dGTP分别成功掺入引物的3′端。
实施例5-阶梯片段产生
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行了实验以评价使用本发明技术的核苷酸类似物产生在碱基特异性位置上终止的核酸片段。具体地说，产生分别包括天然dNTP和各3′-O-炔丙基-dNTP两者的反应混合物，并进行了测试。
为了测试通过3′-O-炔丙基-dTTP的片段产生，在25-μl最终反应体积中，制备包含20mMTris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mMKCl、2mMMnCl2、0.1%TritonX-100、1000pmoldATP、1000pmoldCTP、1000pmoldGTP、1000pmoldTTP、200pmol3′-O-炔丙基-dTTP、6.25pmol引物R_ke2_trP1_T_bio(SEQIDNO:2)和2单位THERMINATORIIDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)的DNA片段产生反应混合物。使用一定体积的0.5pmolKRAS模板(SEQIDNO:1)作为模板。使用包括将反应物暴露于95℃的温度2分钟，接着95℃15秒钟、55℃25秒钟和65℃35秒钟的50个循环的温度循环特征，进行了聚合酶延伸反应。
在聚合酶延伸反应后，通过凝胶电泳(例如使用Agilent2100生物分析仪和高灵敏度DNA测定芯片)，将1μl反应混合物直接用于核酸大小分析。从大小分析收集的数据显示反应产生具有相当于与模板互补的核酸的预期长度的大小范围且在其中预期终止的各位置被3′-O-炔丙基-dT终止的核酸片段群。
采用上述反应条件，用3′-O-炔丙基-dATP、3′-O-炔丙基-dCTP或3′-O-炔丙基dGTP替换3′-O-炔丙基-dTTP，进行了其它聚合酶延伸实验。从这些实验收集的数据同样表明反应产生具有相当于与模板互补的核酸的预期长度的大小范围且在其中预期终止的各位置处被3′-O-炔丙基-dA、3′-O-炔丙基-dC或3′-O-炔丙基-dG终止的核酸片段群。
实施例6-5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸的合成
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，合成并表征了包含5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸。采用亚磷酸酰胺化学合成，进行了修饰的寡核苷酸的合成。在最后一个合成步骤中，采用亚磷酸酰胺化学合成以将5′-碘-dT亚磷酸酰胺掺入末端5′位置。然后如下处理在反应柱中与固相支持体连接的寡核苷酸。
首先，将钠叠氮化物(30mg)重新悬浮于无水DMF(1ml)中，在55℃下加热3小时，冷却至室温。用1-ml注射器吸取上清液，来回通过包含5′-碘修饰的寡核苷酸的反应柱，在环境温度(室温)下温育。在温育后，将柱用无水DMF洗涤，用乙腈洗涤，然后通过氩气干燥。将所得5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸从固相支持体上切割，并在55℃下在氨水中加热5小时脱保护。最终产物为具有以下序列的寡核苷酸：
Az-TCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGT(SEQIDNO:6)
“Az”表示5′端处的叠氮基-甲基修饰(例如5′-叠氮基-甲基修饰)，例如以提供具有以下结构的寡核苷酸：
，
其中B为核苷酸的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或天然或合成的核碱基，例如修饰的嘌呤例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤；修饰的嘧啶例如5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶等)。
实施例7-5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸和3′-O-炔丙基修饰的核酸片段的缀合
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行了实验，以测试5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸(例如参见实施例6)与3′-O-炔丙基修饰的核酸片段(例如参见实施例5)通过点击化学的缀合。具体地说，进行了实验，其中采用铜(I)催化的1,3-偶极炔-叠氮化物环加成化学(“点击化学”)，使5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸与3′-O-炔丙基修饰的DNA片段化学缀合。
按照生产商说明书，使用市购可获得的试剂(baseclickGmbH，Oligo-Click-MReload试剂盒)进行点击化学。简单地说，使用点击化学试剂，在10μl的总体积中，使约0.1pmol包含5′-生物素修饰的3′-O-炔丙基修饰的DNA片段与约500pmol5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸(参见例如实施例6，例如SEQIDNO:6)反应。将反应混合物在45℃下温育30分钟。在温育后，将上清液转移到新的微量离心管中，加入40-μl体积的市售供应的结合与洗涤缓冲液(例如1MNaCl、10mMTris-HCl、1mMEDTA，pH7.5)。通过将点击化学反应混合物与链霉抗生物素包被的磁珠(Dynabeads,MyOneStreptavidinC1,LifeTechnologies)在环境温度(室温)下温育15分钟，从过量的5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸中分离缀合的反应产物。使用磁体将珠粒从上清液中分离，除去上清液。随后，使用结合与洗涤缓冲液洗涤珠粒两次，然后重新悬浮于25μlTE缓冲液(10mMTris-HCl，0.1mMEDTA，pH约8)中。
使用尿嘧啶切割(尿嘧啶糖基化酶和内切核酸酶VIII，Enzymatics)，将产物从固相支持体(珠粒)上切下。具体地说，使用尿嘧啶切割试剂从位于接近缀合产物5′端位置的脱氧尿苷修饰处切下反应产物(参见SEQIDNO:2-5)。最后，按照生产商的方案，使用AmpureXP(BeckmanCoulter)纯化包含缀合产物的上清液，并在20μlTE缓冲液中洗脱。
实施例8-缀合产物的扩增
在本文所述技术的实施方案的开发期间，进行了实验，以表征5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸与3′-O-炔丙基修饰的核酸片段的化学缀合，并评价三唑连接作为核酸骨架中天然磷酸二酯键的模拟物。为了测试聚合酶识别缀合产物作为模板并且在合成期间越过(traverse)三唑连接的能力，设计PCR引物以产生跨过缀合产物的三唑连接的扩增子：
引物1CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATSEQIDNO:7
引物2CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCSEQIDNO:8
使用市购可获得的PCR预混合物(KAPA2GHS，KAPABiosystems)以提供除混合物提供的组分(例如缓冲液、聚合酶、dNTP)以外包含0.25μM引物1(SEQIDNO:7)、0.25μM引物2(SEQIDNO:8)和2μl纯化的缀合产物(参见实施例7)作为扩增模板的25-μl反应混合物。通过使样品在95℃下温育5分钟，接着98℃20秒钟、60℃30秒钟和72℃20秒钟30个循环，对反应混合物进行热循环。通过凝胶电泳(例如使用Agilent生物分析仪2100系统和高灵敏度DNA芯片)，分析扩增产物以确定反应产物的大小分布。
扩增产物的分析表明，使用点击化学反应的缀合产物(参见实施例7)作为扩增模板，扩增反应成功地产生扩增子。具体地说，扩增产物的分析表明聚合酶沿模板加工，并通过三唑连接以从模板中产生扩增子。另外，扩增产生具有相当于通过掺入3′-O-炔丙基-dNTP经碱基特异性终止DNA片段扩增产生的预期大小的大小范围的异质扩增子群。片段分析还显示自缀合的5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸起相当于三十一(31)个额外碱基的适当的片段大小增加。
实施例9-使用3′-O-炔丙基dNTP终止的阶梯产生
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，在包含3′-O-炔丙基-dNTP和天然(标准)dNTP的混合物的反应中进行了实验，以评价终止的核酸片段的产生。具体地说，进行了实验以评价在合成期间通过DNA聚合酶掺入终止链的3′-O-炔丙基-dNTP，在靶区域内各位置处终止的片段的产生。
在单一反应中使用天然dNTP和所有4种3′-O-炔丙基-dNTP的混合物进行实验。DNA片段产生反应混合物在25-μl反应体积中包含20mMTris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mMKCl、2mMMnCl2、0.1%TritonX-100、1000pmoldATP、1000pmoldCTP、1000pmoldGTP、1000pmoldTTP、100pmol3′-O-炔丙基-dATP、100pmol3′-O-炔丙基-dCTP、100pmol3′-O-炔丙基-dGTP、100pmol3′-O-炔丙基-dTTP、6.25pmol引物R_ke2_trP1_T_bio(SEQIDNO:2)和2单位TherminatorIIDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)。0.5pmol对应于KRAS外显子2(SEQIDNO:1)中的区域的纯化的扩增子用作模板。通过加热至95℃2分钟，接着95℃15秒钟、55℃25秒钟和65℃35秒钟的45个循环，使聚合酶延伸反应热循环。
在聚合酶延伸反应后，使用凝胶电泳(Agilent2100生物分析仪和高灵敏度DNA测定芯片)，将1μl反应混合物直接用于DNA片段大小分析。反应产物的片段大小分析表明，片段产生反应成功地产生具有预期大小的核酸片段的阶梯。
随后，如上文实施例6和实施例7所述采用点击化学，使5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸(参见例如实施例6，例如SEQIDNO:6)与包含3′-O-炔丙基-dN的终止DNA片段化学缀合。在缀合后，按实施例8所述进行扩增反应以扩增缀合产物。由缀合产物产生的扩增子的DNA片段大小分析显示由5′-叠氮基修饰的寡核苷酸与自片段阶梯产生的扩增子的缀合引起的大小的预期变化。
实施例10-片段大小的控制
在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行了实验，通过调节3′-O-炔丙基-dNTP与天然(标准)dNTP的比率，控制在包含3′-O-炔丙基-dNTP和天然(标准)dNTP的混合物的反应中产生的终止的核酸片段的大小分布。预期由于通过聚合酶掺入合成核酸中的3′-O-炔丙基-dNTP(其终止延伸)和天然dNTP(其延伸聚合酶产物)的竞争所致，3′-O-炔丙基-dNTP和天然dNTP的摩尔比率影响片段大小分布。
因此，进行了实验，其中在3′-O-炔丙基-dNTP与天然dNTP的不同摩尔比率下，评价了片段阶梯产生反应的产物。使用天然dNTP与3′-O-炔丙基-dNTP的2:1、10:1和100:1摩尔比率，进行了片段阶梯产生反应。用于这些实验的片段产生反应混合物在25-μl最终反应体积中包含20mMTris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mMKCl、2mMMnCl2、0.1%TritonX-100、1000pmoldATP、1000pmoldCTP、1000pmoldGTP、1000pmoldTTP、6.25pmol引物R_ke2_trP1_T_bio(SEQIDNO:2)、2单位TherminatorIIDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs)和0.5pmol对应于KRAS外显子2(SEQIDNO:1)区域的纯化的扩增子作为模板。
另外，测试2:1比率的天然dNTP与3′-O-炔丙基-dNTP的反应物包含500pmol3′-O-炔丙基-dATP、500pmol3′-O-炔丙基-dCTP、500pmol3′-O-炔丙基-dGTP和500pmol3′-O-炔丙基-dTTP。测试10:1比率的天然dNTP与3′-O-炔丙基-dNTP的反应物包含100pmol3′-O-炔丙基-dATP、100pmol3′-O-炔丙基-dCTP、100pmol3′-O-炔丙基-dGTP和100pmol3′-O-炔丙基-dTTP。测试100:1比率的天然dNTP与3′-O-炔丙基-dNTP的反应物包含10pmol3′-O-炔丙基-dATP、10pmol3′-O-炔丙基-dCTP、10pmol3′-O-炔丙基-dGTP和10pmol3′-O-炔丙基-dTTP。
通过在95℃下温育2分钟，接着95℃15秒钟、55℃25秒钟和65℃35秒钟45个循环，使聚合酶延伸反应热循环。在聚合酶延伸反应后，如实施例6和实施例7所述采用点击化学，使5′-叠氮基-甲基修饰的寡核苷酸(参见例如实施例6，例如SEQIDNO:6)与以3′-O-炔丙基-dN终止的核酸片段化学缀合。在缀合后，如实施例8所述，将缀合产物作为扩增模板以产生对应于缀合产物的扩增子。对缀合产物进行了片段大小分析。
从3种不同摩尔比率条件的产物产生的扩增缀合产物的片段大小分析表明，片段大小取决于3′-O-炔丙基-dNTP与天然dNTP的比率。片段大小的分析显示片段大小分布随dNTP与3′-O-炔丙基-dNTP的摩尔比率而变化。在2:1摩尔比率下，与其它2个摩尔比率条件相比，检测到较大的较短片段群。在10:1摩尔比率下，相对于2:1摩尔比率，存在较大部分的较长片段。在100:1摩尔比率下，相对于2个其它摩尔比率，片段的主要群包含较长的DNA片段。
上文说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。在不偏离本文所述技术的范围和精神的情况下，该技术的所述组合物、方法和用途的各种修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然结合具体的示例性实施方案描述了该技术，但应了解，所要求保护的本发明不应过度限于具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员是显然的用于实施本发明的所述方式的各种修改欲落入随附权利要求书的范围内。

Claims (73)

1.一种包含具有下列结构的核苷酸类似物的组合物：
，
其中B为碱基，P包含磷酸部分。
2.权利要求1的组合物，其中P包含四磷酸、三磷酸、二磷酸、一磷酸、修饰的四磷酸、修饰的三磷酸、修饰的二磷酸或修饰的一磷酸。
3.权利要求1的组合物，其中B选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
4.权利要求1的组合物，其中B包含嘌呤、嘧啶、修饰的嘌呤或修饰的嘧啶。
5.权利要求1的组合物，其中所述核苷酸类似物包含硫代-炔基、硫代-炔丙基、3′-S-炔丙基、硫代呋喃糖、硫代核糖、硫代脱氧核糖、阿拉伯糖或修饰糖。
6.权利要求1的组合物，其中P包含5′羟基、α硫代磷酸、β硫代磷酸、γ硫代磷酸、α甲基膦酸、β甲基膦酸或γ甲基膦酸。
7.权利要求1的组合物，其进一步包含聚合酶、核酸或核苷酸。
8.权利要求1的组合物，其中所述核苷酸类似物用硫修饰。
9.权利要求1的组合物，其进一步含有包含碱基B的核苷酸，其中所述核苷酸类似物与核苷酸的数目比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:50、1:75、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:5000或1:10000。
10.一种组合物，其含有包含权利要求1的核苷酸类似物的核酸。
11.权利要求10的组合物，其中所述核苷酸类似物位于核酸的3′端。
12.权利要求10的组合物，其中所述核酸通过聚合酶产生。
13.权利要求10的组合物，其进一步包含叠氮化物。
14.权利要求10的组合物，其进一步包含第二核酸。
15.权利要求10的组合物，其进一步含有包含叠氮化物部分的第二核酸。
16.权利要求10的组合物，其进一步含有在第二核酸的5′端处包含叠氮化物部分的第二核酸。
17.权利要求10的组合物，其进一步含有包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸、包含叠氮化物的生物素或包含叠氮化物的蛋白质。
18.权利要求10的组合物，其进一步包含基于铜的催化试剂。
19.权利要求10的组合物，其进一步含有包含三唑的核酸。
20.权利要求10的组合物，其进一步含有包含1′,4′取代的三唑的核酸。
21.权利要求10的组合物，其进一步包含衔接寡核苷酸、包含条码的衔接寡核苷酸或条码寡核苷酸。
22.权利要求10的组合物，其进一步含有包含以下结构的核酸或。
23.一种用于合成修饰的核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含炔基的核苷酸类似物；
b)使核酸与核苷酸类似物连接以产生包含核苷酸类似物的修饰的核酸。
24.权利要求23的方法，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
，
其中B为碱基，P包含三磷酸部分。
25.权利要求23的方法，其中B选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
26.权利要求23的方法，其进一步包括提供模板。
27.权利要求23的方法，其进一步包括提供引物。
28.权利要求23的方法，其进一步包括提供核苷酸。
29.权利要求23的方法，其进一步包括提供聚合酶。
30.权利要求23的方法，其中所述聚合酶催化连接。
31.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与叠氮化物部分反应。
32.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与包含叠氮化物部分的第二核酸反应。
33.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与在第二核酸的5′端包含叠氮化物部分的第二核酸反应。
34.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与包含叠氮化物的标记、包含叠氮化物的标签、包含叠氮化物的固相支持体、包含叠氮化物的核苷酸、包含叠氮化物的生物素或包含叠氮化物的蛋白质反应。
35.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸、包含条码和包含叠氮化物部分的衔接寡核苷酸或包含叠氮化物部分的条码寡核苷酸反应以产生核酸-寡核苷酸缀合物。
36.权利要求23的方法，其进一步包括使修饰的核酸与叠氮化物部分和基于铜的催化试剂反应。
37.权利要求35的方法，其中所述核酸-寡核苷酸缀合物是生物酶的底物。
38.权利要求35的方法，其中所述核酸-寡核苷酸缀合物是聚合酶的底物。
39.权利要求35的方法，其中所述核酸-寡核苷酸缀合物是测序反应的底物。
40.权利要求23的方法，其包括终止与核苷酸类似物的聚合。
41.一种用于核酸测序的方法，所述方法包括：
a)使引物与核酸模板杂交形成杂交的引物/核酸模板复合物；
b)提供多种核苷酸类似物，各核苷酸类似物包含炔部分；
c)使杂交的引物/核酸模板复合物和核苷酸类似物与聚合酶反应以通过聚合酶反应将核苷酸类似物添加至引物中形成包含掺入的核苷酸类似物的延伸产物；和
d)使延伸产物与含叠氮化物的化合物反应以形成包含三唑环的结构。
42.权利要求41的方法，其中所述核苷酸类似物是3′-O-炔丙基-dNTP核苷酸类似物，N选自A、C、G、T和U。
43.权利要求41的方法，其中将包含三唑环的结构用于后续酶促反应中。
44.权利要求43的方法，其中所述后续酶促反应是聚合酶链式反应。
45.权利要求41的方法，其包括提供常规核苷酸。
46.一种用于合成修饰的核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)包含炔基的核苷酸类似物；和
b)基于铜的催化试剂。
47.权利要求46的试剂盒，其进一步包含聚合酶。
48.权利要求46的试剂盒，其进一步包含含有叠氮化物部分的衔接寡核苷酸。
49.权利要求46的试剂盒，其进一步包含核苷酸。
50.权利要求46的试剂盒，其中所述核苷酸类似物是3′-O-炔丙基核苷酸。
51.权利要求46的试剂盒，其包含一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物和标准dNTP的混合物。
52.权利要求46的试剂盒，其包含一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物和标准dNTP的混合物，它们的比率为1:500-500:1。
53.权利要求46的试剂盒，其包含5′-叠氮基-甲基寡核苷酸。
54.权利要求46的试剂盒，其包含获自、来源于、分离自和/或克隆自热球菌(Thermococcus)物种的聚合酶。
55.权利要求46的试剂盒，其包含获自、来源于、分离自和/或克隆自热球菌物种9°N-7的聚合酶。
56.权利要求46的试剂盒，其包含克隆自热球菌物种9°N-7并包含选自D141A、E143A、Y409V和A485L的一个或多个突变的聚合酶。
57.权利要求46的试剂盒，其进一步包含计算机可读介质中的用于处理序列数据的软件。
58.权利要求46的试剂盒，其进一步包含扩增引物。
59.权利要求46的试剂盒，其进一步包含测序引物。
60.一种NGS测序文库，其包含多种3′-O-炔丙基-dN终止的核酸。
61.一种包含多种核酸的NGS测序文库，其中各核酸包含3′-O-炔丙基-核苷酸。
62.权利要求61的NGS测序文库，其中多种核酸的每一种核酸包含靶核酸序列的亚序列。
63.权利要求61的NGS测序文库，其中多种核酸的每一种核酸通过三唑连键与寡核苷酸缀合。
64.一种通过包括使用dNTP的混合物和一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物合成多种核酸的方法产生的NGS测序文库。
65.权利要求64的NGS测序文库，其中dNTP与3′-O-炔丙基核苷酸类似物的摩尔比率为1:500-500:1。
66.权利要求64的NGS测序文库，其中通过热球菌物种9°N-7进行合成，并包含选自D141A、E143A、Y409V和A485L的一个或多个突变。
67.一种反应混合物，其包含dNTP的混合物和一种或多种3′-O-炔丙基核苷酸类似物。
68.权利要求67的反应混合物，其进一步包含靶核酸。
69.权利要求67的反应混合物，其中dNTP与3′-O-炔丙基核苷酸类似物的比率为1:500-500:1。
70.权利要求67的反应混合物，其进一步包含用于使用dNTP和一种或多种3′-O封闭的核苷酸类似物合成核酸的聚合酶。
71.权利要求67的反应混合物，其包含是扩增子的靶核酸。
72.权利要求67的反应混合物，其包含来自热球菌物种9°N-7并包含选自D141A、E143A、Y409V和A485L的一个或多个突变的聚合酶。
73.一种反应混合物，其含有包含3′-O-炔丙基核苷酸和5′-叠氮基-甲基寡核苷酸的核酸。
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