CN110691854B - 一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种核酸测序方法和一种核酸测序试剂盒，所述试剂盒包含核酸探针，连接酶，3'端连接有阻断基团的dNTP，聚合酶，用于切除连接在dNTP的3'端的阻断基团的试剂1，和用于切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸的试剂2。
Description
技术领域
本发明属于基因测序领域，涉及一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒。具体地，所述核酸测序方法为DNA测序方法。具体地，所述核酸测序试剂盒为DNA测序试剂盒。
背景技术
连接测序法由Complete Genomics和ABI两家公司分别开发出来，采用不同的形式展现，基本原理都是通过连接酶连接上荧光修饰的DNA探针。该DNA探针在某些位置为特定碱基以识别待测序列，其余位置为随机序列可以和其它待测位置形成互补链。连接反应之后，去掉未连接的探针，之后通过光学手段检测连接上的探针信号而确定该位置的序列。
Complete Genomics采用以不同的荧光基团分别标记4个不同碱基的探针。第一组探针的5’端的第1个位置分别为4个不同的碱基，之后的碱基为随机序列从而可以结合到待测的随机序列上，通过连接酶连接到引物序列之后，检测荧光获得该位置的碱基信息。去掉加上的序列，加入新的测序引物之后进行第二组探针的杂交和连接，第二组探针的5’端第2个位置分别为4个不同的碱基，其它位置为随机序列，在这之后进行检测第2个位置的荧光分子从而确定第2位置的序列。类似地，分别确定第3-8位置的碱基序列。一共使用8组探针，确定前八个碱基序列，之后加入更长的新的测序引物开展后面8个碱基的测序。
ABI的连接测序法被称为Sequencing by Oligonucleotide Ligation andDetection(SOLiD)，采用16组不同的探针，每组探针的前面2个为固定序列，后面三个碱基为随机序列，之后三个碱基为通用碱基，在随机碱基和通用碱基(第5和第6)连接的方法为O-P-S，以上序列既可以从5’端开始排序也可以从3’端开始排序。如下面的式I所示，如果从5’端排序，随机碱基3’端为氧原子，第一个通用碱基5’端为硫原子。从3’端排序则相同，第3个随机碱基的5’端为氧原子，第一个通用碱基的3’端为硫原子。
测序从3’端向5’端方向，加上测序引物，使用测序探针连接检测，连接反应体系中，模板与引物互补配对，引物连接在磁珠上，直接进行拍照。用银离子切除(银离子可以特异性的和硫元素结合，从而切断S-P键，断裂之后P接氢氧离子，S接上银离子)，如此所有通用碱基被切掉，5’端方向留下磷酸基团，下一个循环连接在5个碱基后面的位置。多次重复之后，去掉测序链重新杂交新的引物，新的引物比之前多一个碱基，再重新循环多次之后，去掉测序链杂交第3次的引物。这样重复多次可以使整个序列连接起来，并通过信号的交叉对比，确定每个位置的序列信息。
连接测序法有如下几方面的不足：(1)探针数量或种类多，导致成本较高；(2)SOLiD方法每次加入5个碱基，在一个循环或者几个循环之后要重新加载测序引物，增加测序成本和时间成本；(3)切除方法对测序体系并不友好。作为测序中的生化反应，很多酶对过渡金属非常敏感，另外，使用银离子容易有残留，难以避免对后续实验的影响，例如，反应的缓冲液中可能有氯离子，银离子易于与之生成沉淀；另外，银离子还可以和T碱基形成T-Ag-T结构的错误配对(mismatch)。
Illumina的边合成边测序方法则采用可逆阻断基团的修饰3’端羟基并且碱基上可逆连接荧光染料(如图1所示)，在每个循环聚合上一个碱基，检测该位置的荧光信号确定碱基信息，在确定碱基信息之后，对3’端阻断基团和碱基上的荧光染料进行切除，3’端阻断和碱基上连接荧光染料的基团为同一类型基团，因此可以被同时切除。
然而，Illumina的阻断采用叠氮亚甲基的方式，切除采用有机膦化物(如图2所示)，而染料和碱基之间有长链连接，长链中设计了叠氮亚甲基的衍生物。在切除之后连接基团和3’端一样也是有一个羟基生成，并且除了羟基之外还有数十个原子(如图3所示)。
虽然边合成边测序目前应用非常成功，但是由于碱基上连接的荧光基团切除后还有部分连接接团留在碱基上，被称为疤原子(scar)。疤原子一方面可能影响测序的读长，另一方面可能影响测序下一个碱基的信号；此外，由于过度修饰(3端和碱基上)导致dNTP不易被聚合酶识别，需要做大量的工作改造聚合酶以达到可以使用的标准(The history andadvances of reversible terminators used in new generations of sequencingtechnology.Genomics Proteomics Bioinformatics.2013 Feb；11(1)：34-40.)。
边合成边测序的方法由于疤原子和碱基过度修饰的原因导致测序读长不够长。此外，过度修饰的dNTP是导致测序成本提高的最大因素之一。
因此，尚需要开发新的核酸测序方法，特别是新的效率更高、测序读长更长、准确度更高、成本更低的核酸测序方法。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，巧妙地设计了一种核酸测序方法。本发明人创造性地将连接测序法与可逆阻断dNTP聚合反应结合，能够有效地去除疤原子，有利于提高测序的读长，显著降低测序的成本，缩短测序的时间。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种核酸测序方法，包括如下步骤：
(1)将测序引物杂交至待测核酸分子；
(2-1)将核酸探针连接至测序引物；
(3)检测结合于待测核酸分子的核酸探针上的可检测的标记物，得到被测碱基的信息；
(4-1)将3’端连接有阻断基团的dNTP连接至未连接核酸探针的测序引物；
(5)检测结合于待测核酸分子的核酸探针上的可检测的标记物，得到被测碱基的信息；
(6-1)切除连接在dNTP的3’端的阻断基团；优选地，还切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸；
其中，
当步骤(3)存在时，步骤(5)不存在；或者
当步骤(5)存在时，步骤(3)不存在；
优选地，重复上述步骤(2-1)-步骤(5)，或重复上述步骤(2-1)-(6-1)。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2-1)和步骤(3)之间，还包括下述步骤：
(2-2)洗脱未与待测核酸分子结合的核酸探针。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(4-1)和步骤(5)之间，还包括下述步骤：
(4-2)洗脱未与待测核酸分子结合的dNTP。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(6-1)之后，还包括下述步骤：
(6-2)洗脱步骤(6-1)中被切除的部分；
优选地，重复上述步骤(2-1)-(6-2)。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2-1)中，对于杂交至待测核酸分子的测序引物，只有其中的一部分测序引物与核酸探针连接，所述“一部分”可以是，例如10％-90％、10％-80％、10％-70％、10％-60％、10％-50％、10％-40％、10％-30％、10％-20％、20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-50％、40％-60％、40％-70％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2-1)中，连接的时间按照如下方法确定：连接至测序引物核酸探针上的可检测的标记物的信号强度足够强，使得能够被检测到。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2-1)中，连接的时间为0.5-30分钟，优选1-10分钟，更优选2-6分钟，特别优选为4分钟。
在一些情况下，连接时间多于10分钟会增加测序的时间成本。
在一些情况下，连接时间少于1分钟可能导致连接效率不足，核酸探针上的可检测的标记物信号强度不能够被充分地检测到，影响测序质量。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2-1)中，连接的温度为适合所用的连接酶工作的温度，例如16℃-37℃；优选为连接酶的最适温度，例如25℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2-2)、(4-2)、(6-2)中的任意两个步骤的洗脱条件相同，或者这三个步骤的洗脱条件相同。
在本发明的一些实施方式中，步骤(4-1)中，使用的dNTP不带有可检测的标记物。
在本发明的一些实施方式中，步骤(4-1)中，所述dNTP通过聚合酶催化的聚合反应连接至未连接核酸探针的测序引物；优选地，聚合反应完全。在本发明的一些实施方式中，优选地，聚合反应的时间为0.5-10分钟，优选为2分钟；聚合反应在45℃-60℃下进行；优选为55℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤(6-1)中，切除连接在dNTP的3’端的阻断基团与切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸在相同条件下进行。
在本发明的一些实施方式中，所述的核酸探针，包含第一部分、第二部分、连接体和可检测的标记物，其中：
第一部分的碱基为一个测序碱基，其选自A、T、U、C和G中的一种或多种，
第二部分的碱基为随机碱基和/或通用碱基，并且至少为3个碱基，
所述第一部分和第二部分通过连接体连接，并且第一部分和连接体之间的连接能够被切断，
所述可检测的标记物连接在第二部分或者连接体上。
在本发明的一些实施方式中，所述第一部分位于5’端或3’端。
本发明中，如果没有特别说明，
核酸探针也简称为探针。
本发明中，所称第一部分和第二部分仅仅是为了指代清楚，并不具有次序的含义。
本发明中，所述第一部分为测序碱基。
在本发明的一个实施方案中，其中，所述第一部分位于5’端或3’端；优选地，所述第一部分位于5’端。如果探针3’端第一个碱基为测序碱基，则可以把可检测的标记物和/或所述化学基团设计在5’端；反之，如果5’端第一个碱基为测序碱基则可检测的标记物和/或所述化学基团在3’端。
在本发明的一个实施方案中，其中，第二部分的碱基为随机碱基。
在本发明的一个实施方案中，其中，第二部分的碱基为通用碱基。
在本发明的一个实施方案中，其中，第二部分的碱基为随机碱基和通用碱基兼有之。
在本发明的一些实施方式中，所述第二部分的碱基为3-15个碱基，优选为5-12个碱基，进一步优选为5-10个碱基(例如5、6、7、8、9或10个碱基)，特别优选为6-9个碱基。不拘于理论的限制，优选的探针长度考虑到探针与模板杂交的稳定性，以及合成探针的成本。
所述第二部分的末端是阻断的，是指第二部分末端没有游离的3’-OH，因而不能够形成新的3’，5’-磷酸二酯键，即不能够再连接其它探针。
在本发明的一个实施方案中，当第一部分和连接体之间的连接被切断时，第一部分的3’端OH或者5’端磷酸基团暴露出来。
在本发明的一个实施方案中，当第一部分和连接体之间的连接被切断时，第二部分和连接体被切除。
在本发明的一个实施方案中，优选地，所述可检测的标记物连接在第二部分；
优选地，所述可检测的标记物连接在第二部分末端的3’-OH上；
优选地，所述可检测的标记物通过磷酸酯键连接在第二部分末端的3’-OH上。
在本发明的一些实施方案中，其中，所述可检测的标记物为荧光基团，优选为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAMTM、AF532、AF647和AF688中的至少一种；优选地，所述荧光基团连接在第二部分末端的3’-OH上；优选地，所述荧光基团通过磷酸酯键连接在第二部分末端的3’-OH上。此时探针是阻断的。例如下面的式II或式III所示：
式II中，5’是测序碱基，3’是荧光基团。
下面的式III中，3’是测序碱基，5’为荧光基团。
第一部分和连接体之间的连接可以被不同的方式切断，从而使可以连接的3’端OH或者5’端磷酸基团露出来，以进行下一个循环的测序反应。
在本发明的一些实施方式中，所述连接体不含有硫原子；优选地，所述连接体选自如下的式IV-式IX所示的基团：
其中，式IV中，R1选自H、OH、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基；R2选自H、OH、F、Cl和Br。
上述式IV-式IX所示的基团所代表的连接方式分别简称为AP位点、叠氮、叠氮、烯丙基、氰乙烯基和inosine位点。切除方式依次分别为Endonuclease IV、有机膦化物、有机膦化物、钯催化试剂、有机膦化物和hAAG酶+endonuclease IV酶。
上述式IV-式IX所示的基团的连接和切除方法可以参考本领域技术人员知悉的方法，也可以参考下面的描述。
(1)AP位点连接方式
测序碱基和第二个碱基(N1)的连接采用一个环状脱氧核糖或脱氧核糖衍生物连接，具体连接方法可以参考Xipeng Liu，Jianhua Liu.The mechanism of base excisionrepair in Chlamydiophila pneumoniae.DNA Repair 4(2005)1295-1305。上面的式X为5’端测序碱基的结构式，其中R1选自H、OH、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基；R2选自H、OH、F、Cl和Br。
式XI为聚合反应中使用的可逆阻断非荧光修饰dNTP。
(2)叠氮连接方式
式XII、式XIII或式XIV中化学基团与测序碱基的连接方法可以参考现有技术，例如美国专利US8084590B2。
式XII、式XIII或式XIV中化学基团与测序碱基的连接可被有机膦化物(例如THPP，TCEP)切除。切除的条件可以是，例如，100mM TCEP，pH＝7，1M氯化钠，50℃下5分钟。
式XV为聚合反应中使用的可逆阻断非荧光修饰dNTP。
在本发明的一些实施方式中，步骤(4-1)中，所述阻断基团选自如下的式A-式D：
其中：
式A中，R1和R2独立地选自H、F、CF3、CHF2、CH2F、CH2R烷烃、COOR和CONHR，其中R独立地为C1-C6烷基；
式B中，R3-R7独立地选自H和C1-C6烷基；
式C中，R8和R9独立地选自H、F、Cl、CF3、硝基、氰基、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基；
式D中，R10选自C1-C6烷基。
在本发明的一个实施方案中，步骤(1)中所述待测核酸分子连接在固相支持物上。
所述固相支持物包括但不限于：芯片、槽道(Flowcell)、磁珠等。所述固相支持物上固定有接头序列，该接头序列与待测核酸分子能够结合。例如，当待测核酸分子是以DNA文库的形式时，该接头序列与构建文库的接头序列通过碱基配对结合。所述DNA文库的构建方法可以是本领域技术人员知悉的方法。
优选地，所述核酸测序方法还包括将连接在固相支持物上的待测核酸分子进行扩增的步骤。
不拘于理论的限制，扩增的目的是获得足够数量的样本，将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。扩增产物仍然连接在固相上，形成局部富集。
扩增的手段可以是聚合酶链式反应(PCR)，例如通过乳液PCR(Emulsion PCR)或桥式PCR。所述乳液PCR可以参考，例如，ABI公司的Solid测序方法中的乳液PCR操作，或者参考Roche 454测序方法中的乳液PCR操作。所述桥式PCR可以参考illumina公司的Solexa测序方法中的桥式PCR操作。
在本发明的一个实施方案中，步骤(2-1)中探针的连接和其它连接法测序一样，为通用的T4 DNA连接酶连接反应。
在本发明的一个实施方案中，步骤(2-2)、(4-2)和/或(6-2)中，洗脱所用的试剂可以是本领域技术人员知悉的试剂，例如5X SSC+0.05％tween20。
在本发明的一个实施方案中，步骤(6-1)中，切断核酸探针第一部分与连接体之间的连接之后，暴露出3’端OH，可进行下一循环连接测序(如图4所示)。
通常情况下，重复前述步骤(2-1)-(6-1)或者步骤(2-1)-(6-2)；在已经完成一轮测序的情况下，可以仅重复前述步骤(2-1)-(5)。
本发明的另一方面涉及一种用于核酸测序的试剂盒，包含：
核酸探针、连接酶、3’端连接有阻断基团的dNTP、聚合酶；
用于切除连接在dNTP的3’端的阻断基团的试剂1；以及
用于切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸的试剂2；
优选地，试剂1和试剂2是相同的；
优选地，所述试剂盒还包含适当的缓冲液，例如用于溶解核酸探针的缓冲液；
优选地，所述试剂盒还包含适当的洗脱液；例如，洗脱核酸探针的洗脱液1；例如，洗脱dNTP的洗脱液2；优选地，洗脱液1和洗脱液2相同。
在本发明的一些实施方式中，所述的核酸探针包含第一部分、第二部分、连接体和可检测的标记物，其中：
第一部分的碱基为一个测序碱基，其选自A、T、U、C和G中的一种或多种，
第二部分的碱基为随机碱基和/或通用碱基，并且至少为3个碱基，
所述第一部分和第二部分通过连接体连接，并且第一部分和连接体之间的连接能够被切断，
所述可检测的标记物连接在第二部分或者连接体上。
在本发明的一些实施方式中，所述第一部分位于5’端或3’端。
在本发明的一些实施方式中，所述第二部分的碱基为3-15个碱基，优选为5-12个碱基，进一步优选为5-10个碱基(例如5、6、7、8、9或10个碱基)，特别优选为6-9个碱基。
在本发明的一些实施方式中，所述可检测的标记物为荧光基团；优选为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAMTM、AF532、AF647和AF688中的至少一种；
优选地，所述可检测的标记物连接在第二部分；
优选地，所述可检测的标记物连接在第二部分末端的3’-OH上；
优选地，所述可检测的标记物通过磷酸酯键连接在第二部分末端的3’-OH上。
在本发明的一些实施方式中，所述连接体不含有硫原子；优选地，所述连接体选自如下的式IV-式IX所示的基团：
其中，式IV中，R1选自H、OH、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基；R2选自H、OH、F、Cl和Br。
在本发明的一些实施方式中，所述连接酶为DNA连接酶，所述聚合酶为DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方式中，所述的试剂盒，其特征在于如下的1)至4)项中的任意一项或者多项：
1)所述DNA连接酶为选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶和T3 DNA连接酶中的一种或多种；
2)所述核酸探针的浓度为0.1μM-5μM，优选为1μM；
3)所述DNA连接酶的浓度为0.01μM-2μM，优选为0.5μM。
4)所述试剂盒中的试剂不含有银离子。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂1或试剂2为内切酶(例如内切酶IV或内切酶V)、有机膦化物(例如THPP或TCEP)或者PdCl2与磺化三苯基膦配合物的组合物。
在本发明的一个实施方案中，利用特别设计的探针，达到快速的连接和聚合，缩短切除时间，降低时间成本，减少对测序体系的伤害，消除了疤原子，使测序链为自然的4种碱基，最终提高读长，称为联合测序法(combination sequencing)。
本发明人还在研究中进一步发现，特别是当疤原子所在的碱基为G时，影响G碱基下一个碱基的准确率，如实验例1的实验结果所显示。
本发明中，所述待测核酸分子可以是单链或双链的DNA分子，或者单链或双链的RNA分子。所述DNA分子可以是来自于动物、植物或者微生物的DNA分子。优选地，所述DNA分子是以DNA文库的形式，所述DNA文库可以是利用文库构建试剂盒构建的DNA文库。
本发明中，Nx是指有x个N碱基，x可以是正整数，例如3、4、5、6、7、8、9......14、15等。
术语“随机碱基”是指该位置为4种碱基各占25％，
术语“通用碱基”是指该碱基可以和AGTC四种中的任何一个形成碱基配对结构。例如，5-硝基吲哚环、2-硝基吡咯环等。
术语“测序碱基”是指该位置的碱基为固定碱基，例如，如果该位置的碱基为T，则该探针负责检测碱基A。
在本发明中，术语“C1-C6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基等；C1-C4烷基和C1-C3烷基也可做类似理解。优选的烷基是C1-C4烷基，更优选的烷基是C1-C3烷基。
术语“C2-C6烯基”是指具有2-6个碳原子以及至少一个双键的烯基，并且包括乙烯基、丙烯基、1-丁-3-烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等；C3-C5烯基也可做类似理解。优选的是C3-C5烯基。
术语“C2-C6炔基”是指具有2-6个碳原子以及至少一个叁键的烃基，并且包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔-2-基等；C3-C5炔基也可做类似理解。优选的是C3-C5炔基。
发明的有益效果
本发明或其优选的实施方案具有下述技术效果中的至少一项：
(1)避免了测序过程中疤原子的产生；
(2)有利于提高测序读长；
(3)有利于提高测序的准确度；
(4)有利于缩短测序时间；
(5)由于无需对dNTP进行标记物例如染料的修饰，显著降低了成本；
(6)优选的实施方案中，由于减少了测序中的探针数量或种类，亦显著降低了成本。
(7)优选的实施方案中，由于通过核酸探针连接一次添加一个碱基，不需要重复加引物，也降低了成本。
(8)优选的实施方案中，还采用了对测序反应体系友好的切除方法。
附图说明
图1：合成测序法中使用的可逆阻断dNTP的结构示意图。
图2：合成测序法中切除化学反应的示意图。
图3：合成测序法中切除反应之后，可逆阻断dNTP在测序链上留下的疤原子。
图4：含有AP位点的探针在内切酶IV作用下被去除的示意图。
图5：带有scar的64个NNN序列之后的第4个碱基(4种)的荧光信号值。其中：纵坐标代表荧光信号值，图中的4组信号峰群，由左至右分别代表第4个碱基为A、C、G或T的荧光信号值的集合，每组信号峰群包含64个荧光信号值；横坐标表示第4个碱基为A、C、G或T时64个NNN序列的排列组合，一共有64×4＝256种排列组合，其中64个NNN序列如后文中的表2所示。
图6：天然状态DNA不带scar的64个NNN序列之后的第4个碱基(4种)的荧光信号值。其中：纵坐标代表荧光信号值，图中的4组信号峰群，由左至右分别代表第4个碱基为A、C、G或T的荧光信号值的集合，每组信号峰群包含64个荧光信号值；横坐标表示第4个碱基为A、C、G或T时64个NNN序列的排列组合，一共有64×4＝256种排列组合，其中64个NNN序列如后文中的表2所示。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下面实施例所用的核酸探针或者修饰的核苷酸可以按照本领域已知的方法合成，如果没有特别说明，可以委托商业上的公司例如合亚医药科技(上海)有限公司或者生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。
实施例1：AP位点可逆连接核酸探针(3个随机碱基+3个通用碱基)与磷酸阻断核苷
酸结合的测序应用(1)
1.仪器和试剂
仪器基于BGISEQ-500平台。理论上，其它测序平台(例如illumina的hiseq平台等)经过适当调整，也可以进行与本实施例相同或类似的实验。
另外，为了能够在BGISEQ-500平台上使用，所选用的修饰染料与BGISEQ-500试剂所使用的染料吸收发射波长接近，因此可以很好的被BGISEQ-500光学系统检测。
本实验使用的部分试剂和BGISEQ-500完全一致，例如本实验所使用的拍照缓冲试剂、洗脱缓冲液2。
本实验使用的部分试剂和BGISEQ-500不同，包括：包含“本实施例的探针、酶和缓冲液”的连接液，用本实验的切除缓冲液取代BGISEQ-500的切除缓冲液；具体成分如后面第2部分所示。
切除试剂缓冲液：包括50mM的Tris-HCl，0.1M的NaCl、2mM的MgSO4、2mM的DTT、1质量％的Tween-80、0.5质量％的叔丁醇，pH为7.5，0.5μM的endo IV(NEB：M0304S)。
磷酸阻断核苷酸的聚合反应缓冲液如下：pH7.8，包含20mM氯化钠、3mM硫酸镁、50mM Tris、5％DMSO、0.05％吐温-20，0.2μM KOD156 DNA聚合酶。
实验样品是大肠杆菌的基因组DNA，其为BGISEQ-500所携带的标准样品。
根据制造商的说明书，采用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA制备用于测序的文库，加载到测序芯片上。
2.探针以及磷酸阻断核苷酸的合成
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成如下的4组AP位点可逆连接探针(3个随机碱基+3个通用碱基)，4种磷酸阻断核苷酸委托mychemlab合成。
第1组探针(A probe)：第一部分即测序碱基为A，第二部分为3个随机碱基+3个通用碱基。
第2组探针(T probe)：第一部分即测序碱基为T，第二部分为3个随机碱基+3个通用碱基。
第3组探针(C probe)：第一部分即测序碱基为C，第二部分为3个随机碱基+3个通用碱基。
第4组探针(G probe)：第一部分即测序碱基为G，第二部分为3个随机碱基+3个通用碱基。
4种磷酸阻断核苷酸如下：
将以上4组探针和T4 DNA连接酶溶解在如下的缓冲液中：
50mM CH3COOK，20mM Tris，10mM Mg(CH3COO)2，100μg/ml BSA，1mM ATP，10％PEG6000；得到连接液。该连接液中探针的浓度是1μM，其中摩尔比A probe∶T probe∶Cprobe∶G probe约为1∶4∶4∶1。连接液中DNA连接酶的浓度时0.5μM。
3.测序步骤
(1)参照BGISEQ-500说明书完成如下的前期准备工作：文库构建，DNA单链环扩增成DNA纳米球，DNA纳米球装载至BGISEQ-500携带的芯片上和测序引物加载到DNA纳米球上。
(2)利用仪器加入包含上述4种探针、T4 DNA连接酶和缓冲液的连接液，在25℃下连接反应4分钟；
(3)用洗脱试剂2，洗脱未连接的探针；
(4)加入含有上述磷酸阻断核苷酸、聚合酶和缓冲液的聚合反应液，在55℃下聚合反应2分钟；
(5)用洗脱试剂2洗脱未反应的可逆阻断核苷酸；
(6)加入拍照缓冲液进行图像采集(拍照)；利用软件分析每个DNA纳米球位点的碱基信息；
(7)加入内切酶IV(New England Biolabs，货号M0304L)及其缓冲液，在37℃下反应5分钟，以切除AP位点和可逆阻断基团，
(8)加入洗脱试剂2洗脱被切除的部分探针和可逆阻断基团；
可重复加入4组探针进行下一循环的测序。
4.实验结果
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例2：AP位点可逆连接核酸探针(3个随机碱基+3个通用碱基)与磷酸阻断核苷
酸结合的测序应用(2)
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于如下：测序步骤
(1)参照BGISEQ-500说明书完成如下的前期准备工作：文库构建，DNA单链环扩增成DNA纳米球，DNA纳米球装载至BGISEQ-500携带的芯片上和测序引物加载到DNA纳米球上。
(2)利用仪器加入包含上述4种探针、T4 DNA连接酶和缓冲液的连接液，在25℃下连接反应4分钟；
(3)用洗脱试剂2，洗脱未连接的探针；
(4)加入拍照缓冲液进行图像采集(拍照)；利用软件分析每个DNA纳米球位点的碱基信息；
(5)加入含有上述磷酸阻断核苷酸、聚合酶和缓冲液的聚合反应液，在55℃下聚合反应2分钟；
(6)用洗脱试剂2洗脱未反应的可逆阻断核苷酸；
(7)加入内切酶IV(New England Biolabs，货号M0304L)及其缓冲液，在37℃下反应5分钟，以切除AP位点和可逆阻断基团，
(8)加入洗脱试剂2洗脱被切除的部分探针和可逆阻断基团；
可重复加入4组探针进行下一循环的测序。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例3：AP位点可逆连接核酸探针(3个随机碱基+3个通用碱基)与磷酸阻断核苷
酸结合的测序应用(3)
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于步骤(2)的操作如下：
利用仪器加入包含上述4种探针、T4 DNA连接酶和缓冲液的连接液，在25℃下连接反应1分钟。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例4：AP位点可逆连接核酸探针(3个随机碱基+3个通用碱基)与磷酸阻断核苷
酸结合的测序应用(4)
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于步骤(2)的操作如下：
利用仪器加入包含上述4种探针、T4 DNA连接酶和缓冲液的连接液，在25℃下连接反应10分钟。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例5：叠氮连接的核酸探针与叠氮亚甲基阻断核苷酸结合的测序应用
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于使用如下的叠氮连接的核酸探针和叠氮亚甲基阻断核苷酸：
4组叠氮基团连接的核酸探针：
第1组(A probe)：第一部分即测序碱基为A，第二部分为6个随机碱基。
第2组(T probe)：第一部分即测序碱基为T，第二部分为6个随机碱基。
第3组(C probe)：第一部分即测序碱基为C，第二部分为6个随机碱基。
第4组(G probe)：第一部分即测序碱基为G，第二部分为6个随机碱基。
4种叠氮亚甲基阻断核苷酸：
/>
叠氮阻断核苷酸的聚合反应缓冲液包含20mM氯化钠、60mM硫酸铵、3mM硫酸镁、50mM Tris、5％DMSO、0.05％吐温-20，反应温度为55℃，0.2μM 9°N DNA聚合酶；pH为9.0。
切除试剂缓冲液包含50mM的Tris-HCl、1M的NaCl、10mM THPP；pH为9.0。
采用BGISEQ-500的测序分析软件进行了结果分析，如下面的表1所示。
表1：测序结果分析
| 参考基因组(Reference) | 大肠杆菌 |
| 循环数(Cycle Number) | 50 |
| 拍照区域(区域数目) | 384个 |
| 全部读数(Total Reads) | 184.72M |
| 比对度数(Mapped Reads) | 160.15M |
| aQ30 | 80.84％ |
| 滞后相(Lag) | 0.34％ |
| 超前相(Runon) | 0.36％ |
| 有效读数比例(ESR) | 79.51％ |
| 比对率(Mapping Rate) | 86.7％ |
| b错误率 | 1.13％ |
a，Q30表示碱基被测错的概率为0.1％，即准确率为99.9％；Q30为80.84％是指80.84％的碱基响应(base call)的准确率达到99.9％。
b，是指平均错误率。
从上表可以看出，利用本发明的方法Q30达到80.84％，错误率只有1.13％，读长至少可达到50，优于现有的连接测序法。
实施例6：AP位点可逆连接探针(6个随机碱基)与磷酸阻断核苷酸结合的测序应用
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于使用如下的4组核酸探针：
4组AP位点可逆连接探针如下(x＝6)：
第1组(A probe)：第一部分即测序碱基为A，第二部分为6个随机碱基。
第2组(T probe)：第一部分即测序碱基为T，第二部分为6个随机碱基。
第3组(C probe)：第一部分即测序碱基为C，第二部分为6个随机碱基。
第4组(G probe)：第一部分即测序碱基为G，第二部分为6个随机碱基。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例7：AP位点可逆连接探针(7个随机碱基)与磷酸阻断核苷酸结合的测序应用
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于使用的4组AP位点可逆连接探针，其中x＝7。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例8：AP位点可逆连接探针(8个随机碱基)与磷酸阻断核苷酸结合的测序应用
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于使用的4组AP位点可逆连接探针，其中x＝8。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实施例9：AP位点可逆连接探针(9个随机碱基)与磷酸阻断核苷酸结合的测序应用
按照与实施例1相同的方法进行，不同之处在于使用的4组AP位点可逆连接探针，其中x＝9。
结果与BGISEQ-500所携带的标准样品的序列完全一致，说明本发明的测序方法准确。
实验例1：Scar对测序的影响
1.实验仪器和试剂
4种叠氮亚甲基阻断核苷酸同实施例5。
4种可逆阻断非荧光核苷酸如下(购自mychem)：
实验样品是大肠杆菌的基因组DNA，其为BGISEQ-500所携带的标准样品。
叠氮阻断核苷酸的聚合反应缓冲液包含20mM氯化钠、60mM硫酸铵、3mM硫酸镁、50mM Tris、5％DMSO、0.05％吐温-20，反应温度为55℃，0.2μM 9°N(一种DNA聚合酶的名称)DNA聚合酶；pH为9.0。
切除试剂缓冲液包含50mM的Tris-HCl、1M的NaCl、10mM THPP；pH为9.0。
2.实验方法
根据制造商的说明书，采用MGIEasyTM DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)以大肠杆菌标准菌株为原料提取DNA制备用于测序的文库，参考BGISEQ-500 DNB制备加载试剂盒(深圳华大智造科技有限公司，货号85-05531-00)，将制备好的DNB(DNAnanoball DNA纳米球)加载到BGISEQ-500平台的测序芯片上。利用BGISEQ-500测序试剂盒(SE50 V3.0，深圳华大智造科技有限公司，货号PF-UM-PEV30)进行测序。具体测序步骤如下：
利用BGISEQ-500平台，在芯片的两边装载相同DNB，对两边的DNA随机序列进行测序4个循环，并编号每个位置的序列和其相应的号码，之后利用100％甲酰胺洗脱测序链，重新加载测序引物，一边聚合和切除3个循环的荧光修饰可逆阻断核苷酸(切除之后有scar)，另外一边聚合和切除3个循环的非荧光可逆阻断核苷酸(切除之后无自然状态DNA)，之后都分别聚合一个循环的荧光修饰可逆阻断核苷酸。
结合之前4个循环的序列信息分析不同NNN序列之后第4个碱基荧光信号的分布：图5和图6分别示出了疤原子修饰碱基对下一碱基的信号影响，以及天然核酸对下一个碱基信号的影响。其中，NNN序列的64种排列组合如下面的表2所示。
表2：3个碱基的64种排列组合
/>
结果显示，天然状态的DNA与之前NNN序列的关系不大，没有特别强烈的波动，而带有scar的信号与NNN的序列关系非常大，特别是第4个碱基为A碱基时的信号，如图5中左起第1组信号峰群和图6中左起第1组信号峰群，部分NNN序列能导致70％左右的信号丢失。
结果还显示，scar对下一个碱基有影响，特别是NNN序列中第3个碱基为G碱基时的scar导致下一位碱基信号非常弱，从而导致下一个碱基在碱基识别时容易出错，尤其是G后面如果是A碱基更易出错。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (37)
1.一种核酸测序方法，包括如下步骤：
(1)将测序引物杂交至待测核酸分子；
(2-1)将核酸探针连接至测序引物；连接的时间按照如下方法确定：连接至测序引物的核酸探针上的可检测的标记物能够被检测到；
(3)检测结合于待测核酸分子的核酸探针上的可检测的标记物，得到被测碱基的信息；
(4-1)将3’端连接有阻断基团的dNTP连接至未连接核酸探针的测序引物；
(5)检测结合于待测核酸分子的核酸探针上的可检测的标记物，得到被测碱基的信息；
(6-1)切除连接在dNTP的3’端的阻断基团；
其中，
当步骤(3)存在时，步骤(5)不存在；或者
当步骤(5)存在时，步骤(3)不存在；
步骤(6-1)中，还切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸；
步骤(2-1)和步骤(3)之间，还包括步骤(2-2)洗脱未与待测核酸分子结合的核酸探针；
在步骤(4-1)和步骤(5)之间，还包括步骤(4-2)洗脱未与待测核酸分子结合的dNTP；
在步骤(6-1)之后，还包括步骤(6-2)洗脱步骤(6-1)中被切除的部分；
重复上述步骤(2-1)-步骤(5)，或重复上述步骤(2-1)-(6-1)；
其中，
所述的核酸探针，包含第一部分、第二部分、连接体和可检测的标记物，其中：
第一部分的碱基为一个测序碱基，其选自A、T、U、C和G中的一种或多种，并且所述第一部分位于5’端或3’端；
第二部分的碱基为随机碱基和/或通用碱基，并且为3－15个碱基；
所述第一部分和第二部分通过连接体连接，并且第一部分和连接体之间的连接能够被切断，
所述可检测的标记物为荧光基团，并且所述可检测的标记物通过磷酸酯键连接在第二部分末端的3’-OH上；
所述连接体选自如下的式IV-式IX所示的基团：
其中，式IV中，R1选自H、OH、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基；R2选自H、OH、F、Cl和Br。
2.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，重复上述步骤(2-1)-(6-2)。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的时间为1-10分钟。
4.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的时间为2-6分钟。
5.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的时间为4分钟。
6.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的温度为适合所用的连接酶工作的温度。
7.根据权利要求6所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的温度为16℃-37℃。
8.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的温度为连接酶的最适温度。
9.根据权利要求8所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-1)中，连接的温度为25℃。
10.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(2-2)、(4-2)、(6-2)中的任意两个步骤的洗脱条件相同，或者这三个步骤的洗脱条件相同。
11.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(4-1)中，使用的dNTP不带有可检测的标记物。
12.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(4-1)中，所述dNTP通过聚合酶催化的聚合反应连接至未连接核酸探针的测序引物。
13.根据权利要求12所述的核酸测序方法，其中，聚合反应的时间为0.5-10分钟。
14.根据权利要求12所述的核酸测序方法，其中，聚合反应的时间为2钟。
15.根据权利要求12所述的核酸测序方法，其中，聚合反应的温度为45℃-60℃。
16.根据权利要求12所述的核酸测序方法，其中，聚合反应的温度为55℃。
17.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的核酸测序方法，其中，步骤(6-1)中，切除连接在dNTP的3’端的阻断基团与切除核酸探针上未与被测碱基结合的其余核苷酸在相同条件下进行。
18.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，所述第二部分的碱基为5－12个碱基。
19.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，所述第二部分的碱基为5、6、7、8、9或10个碱基。
20.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，所述第二部分的碱基为6－9个碱基。
21.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，所述可检测的标记物为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAM、AF532、AF647和AF688中的至少一种。
22.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，所述连接体不含有硫原子。
23.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中，步骤(4-1)中，所述阻断基团选自如下的式A-式D：
其中：
式A中，R1和R2独立地选自H、F、CF3、CHF2、CH2F、CH2R烷烃、COOR和CONHR，其中R独立地为C1-C6烷基；
式B中，R3-R7独立地选自H和C1-C6烷基；
式C中，R8和R9独立地选自H、F、Cl、CF3、硝基、氰基、C1-C6烷氧基和C1-C6羧基；
式D中，R10选自C1-C6烷基。
24.一种用于核酸测序的试剂盒，包含：
核酸探针、连接酶、3’端连接有阻断基团的dNTP、聚合酶；
选自内切酶、THPP、TCEP、和PdCl2与磺化三苯基膦配合物的组合物中的一种或多种；以及
洗脱核酸探针的洗脱液和洗脱dNTP的洗脱液；
其中，
所述的核酸探针，包含第一部分、第二部分、连接体和可检测的标记物，其中：
第一部分的碱基为一个测序碱基，其选自A、T、U、C和G中的一种或多种，并且所述第一部分位于5’端或3’端；
第二部分的碱基为随机碱基和/或通用碱基，并且为3－15个碱基；
所述第一部分和第二部分通过连接体连接，并且第一部分和连接体之间的连接能够被切断；
所述可检测的标记物为荧光基团，并且所述可检测的标记物通过磷酸酯键连接在第二部分末端的3’-OH上；
所述连接体选自如下的式IV-式IX所示的基团：
其中，式IV中，R1选自H、OH、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基；R2选自H、OH、F、Cl和Br。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含适当的缓冲液。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述缓冲液为用于溶解核酸探针的缓冲液。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，洗脱核酸探针的洗脱液和洗脱dNTP的洗脱液相同。
28.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述第二部分的碱基为5－12个碱基。
29.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述第二部分的碱基为5、6、7、8、9或10个碱基。
30.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述第二部分的碱基为6－9个碱基。
31.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记物为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAM、AF532、AF647和AF688中的至少一种。
32.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述连接体不含有硫原子。
33.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的试剂盒，其中，所述连接酶为DNA连接酶，所述聚合酶为DNA聚合酶。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其特征在于如下的1)至4)项中的任意一项或者多项：
1)所述DNA连接酶为选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶和T3 DNA连接酶中的一种或多种；
2)所述核酸探针的浓度为0.1μM－5μM；
3)所述DNA连接酶的浓度为0.01μM－2μM；
4)所述试剂盒中的试剂不含有银离子。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，第2)项中，所述核酸探针的浓度为1μM。
36.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，第3)项中，所述DNA连接酶的浓度为0.5μM。
37.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述内切酶为内切酶IV或内切酶V。
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