JP7485483B2 - 自家発光に基づく単一チャネルシーケンシング法 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸シーケンシングの分野に関する。特に、本発明は、自家発光シグナルを使用して種々のヌクレオチドの逐次的組入れを識別し、それによってポリヌクレオチド配列の決定を実現する、自家発光に基づく単一チャネルシーケンシング法を提供する。
ＤＮＡシーケンシング技術は、サンガーシーケンシング法によって代表される第１世代ＤＮＡシーケンシング技術、及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００、Ｒｏｃｈｅ ４５４、ＡＢＩ Ｓｏｌｉｄ、ＢＧＩＳＥＱ－５００等によって代表される第２世代ＤＮＡシーケンシング技術を含む。１９７７年に、サンガーは、ジデオキシ末端終結シーケンシング法を発明し、第１世代のシーケンシング技術の代表になった。２００１年に、第１世代のシーケンシング技術に頼って、ヒトゲノムドラフトが完了した。サンガーシーケンシングは、単純な実験作業、直感で理解でき且つ精確な結果、及び短い実験期間という特徴を有する。サンガーシーケンシングは、検出結果の高い適時性を要する臨床的な遺伝子変異検出及び遺伝子型判定における広範な適用を有する。しかしながら、サンガーシーケンシング法の欠点は、低い処理能力及び高い費用であり、このことが大規模遺伝子シーケンシングにおけるサンガーシーケンシング法の適用を制限する。サンガーシーケンシング法の欠点を克服するために、第２世代シーケンシング技術が生まれた。第１世代ＤＮＡシーケンシング技術と比較して、第２世代ＤＮＡシーケンシング技術は、高いシーケンシング処理能力、低い費用、高度の自動化、及び単一分子シーケンシングという特徴を有する。Ｈｉｓｅｑ２５００Ｖ２のシーケンシング技術を例に取ると、１つの実験工程は１０～２００Ｇ塩基のデータを生み出し得、１塩基あたりの平均シーケンシング費用は、サンガーシーケンシング法のシーケンシング費用の１／１０００未満であり、獲得されたシーケンシング結果は、コンピューターによって直接処理され得且つ解析され得る。それ故、第２世代ＤＮＡシーケンシング技術は、大規模シーケンシングに非常に適切である。
開発されている第２世代ＤＮＡシーケンシング技術は、現在、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）技術及び合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）技術を主に伴う。これらのシーケンシング技術の典型的な例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発されたＳＯＬｉＤシーケンシング法、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって独立して開発された組合せプローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）法、並びにＢｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＧＩ）によって開発された組合せプローブアンカー合成（ｃＰＡＳ）法、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＳｏｌｅｘａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって合同で開発されたＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング法等を含む。これらのシーケンシング法において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓは、光シグナルを検出する方法を採用しており、４種類の塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、及びＧ）の同定及び区別を実現するためには、これら４種の塩基をそれぞれ標識する４種類の蛍光色素を使用することが通常では必要である。この場合、各塩基によって運ばれる蛍光シグナルを読み取るために、シーケンシング装置は、少なくとも２つの単色励起光源及び少なくとも２つのカメラを備えなければならず、このことが高額な製造費用及び膨大な体積のシーケンシング装置をもたらす。
過去１０年間で、第２世代遺伝子シーケンシング技術は、新興技術から主流のシーケンシング法に徐々に成長しており、臨床分野において重要な試験ツールに徐々になっており、それによって、感染性疾患の予防及び制御、遺伝性疾患の診断、並びに非侵襲的出生前スクリーニングにおいてますます増加する役割を担っている。シーケンシング市場をさらに拡大し且つシーケンサーを一般向けにするために、低費用且つ小型のシーケンサーの開発が、シーケンシング分野における開発傾向に徐々になっている。第２世代シーケンシング技術の古典的な方法として、４チャネル、２チャネル、及び単一チャネルに基づく３つのシーケンシング法は、シーケンシング法独自の利点を有し；シーケンシング法の比較において、単一チャネルシーケンシングは、より少ない消耗品、より低い費用、小型化をより達成しやすいこと、及び携帯可能な計器類という利点を有し、シーケンシング分野における開発傾向に徐々になっている。現在、市場に出ている単色チャネルに基づく製品は、イオントレントシリーズシーケンサー、４５４シーケンサー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ製の最新のＩｓｅｑ１００を主に含む。
単一チャネルに基づく現在のシーケンシング技術の中で、イオントレントシリーズの計器は、ポリマー構造シーケンシングの高いエラー率に起因して、イオントレントシリーズの計器の使用を制限している。同様に、Ｒｏｃｈｅ製の４５４計器も、不十分なシーケンシング精度及び高いシーケンシング費用に起因して、シーケンシング市場から徐々に撤退している。Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＩｓｅｑ１００は、シーケンサーの小型化を実現し且つ高いシーケンシング品質を維持する単色蛍光技術及び半導体技術に基づく。しかしながら、光学シグナルはレーザーによって励起されるため、計器は付加的なレーザーを備え、このことが計器の体積を増加させる。加えて、励起光によって生み出されるバックグラウンド値を回避するために、特別な処理を半導体チップに実施して、励起光によって生み出されるバックグラウンドをフィルターにかけて取り除かなければならず、この処理は、高い費用及びシーケンシング費用の増加を引き起こすであろう。
それ故、外部光源励起を要せず、且つレーザー光源によって生み出されるバックグラウンドをフィルターにかける付加的な設計を採用する必要がない、低費用のシーケンシング法の必要性が当技術分野にある。
上記の技術的問題を解決するために、本出願の発明者は、自家発光系のシグナルを使用してＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧという４種の塩基を識別する新たなシーケンシング法を開発した。それ故、本発明のシーケンシング法を実施するために使用される発光シグナルは、生物発光又は化学発光に由来し、そのため付加的なレーザーを構成する必要がなく、且つレーザー光源によって生み出されるバックグラウンドをフィルターにかける付加的な設計を採用する必要がなく、このことがシーケンシング費用を低下させる。本発明のシーケンシング法において使用されるシーケンシング装置は、即時の／現場での検出のために好都合に持ち運ばれることさえできる。加えて、本発明のシーケンシング法において使用されるデオキシリボヌクレオチドの３’－末端ヒドロキシルは、修飾され、ブロックされる。シーケンシング工程の間、各反応において１個のみのデオキシリボヌクレオチドが合成され得、各反応において１個のみのデオキシリボヌクレオチドが結合されることを確実にし、それによってシーケンシングの精度を向上させている。
１つの態様において、本発明は、核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップの二重鎖が２種の異なるルシフェラーゼと接触し、ライゲーション反応を実施することを可能にし、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得；次いで、基質の存在下でルシフェラーゼが発光反応を触媒し、発せられた発光シグナルを検出するステップ；
（６）各ヌクレオチドの分子標識を除去するステップ；
（７）任意選択で、ステップ（３）～（７）を繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップの二重鎖が２種の異なるルシフェラーゼと接触し、ライゲーション反応を実施することを可能にし、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得；次いで、基質の存在下でルシフェラーゼが発光反応を触媒し、発せられた発光シグナルを検出するステップ；
（６）各ヌクレオチドの分子標識を除去するステップ；
（７）任意選択で、ステップ（３）～（７）を繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
本発明の実施形態において、シーケンシングされるヌクレオチドの自家発光検出は、ルシフェラーゼとヌクレオチド誘導体とのライゲーションを通じて実現され、それにより付加的な励起光源は必要とされない。具体的な実施形態において、ルシフェラーゼとヌクレオチドとのライゲーションは、ルシフェラーゼ上の標識とヌクレオチド誘導体上の対応する標識との特異的結合を通じて達成される。具体的な実施形態において、第１のヌクレオチドは第１のルシフェラーゼとライゲーションされ、第２のヌクレオチドは第２のルシフェラーゼとライゲーションされ、第３のヌクレオチドは第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼとライゲーションされ、第４のヌクレオチドはいかなるルシフェラーゼともライゲーションされない。次いで、２種のルシフェラーゼの対応する基質を通すことによって、４種の塩基の発光シグナルが検出され；第１のルシフェラーゼの基質を通した場合、第１及び第３のヌクレオチドが光を発し、第２のルシフェラーゼの基質を通した場合、第２及び第３のヌクレオチドが光を発し、そのため塩基は、４種のヌクレオチドの発光に従って同定され得る。
それ故、例示的な実施形態において、本発明の核酸分子をシーケンシングするための方法は、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、２種の異なるルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を行うステップであって、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していないルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１２）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、ステップ（３）～（１２）を繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む。
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、２種の異なるルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を行うステップであって、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していないルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１２）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、ステップ（３）～（１２）を繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む。
具体的な実施形態において、２種のルシフェラーゼとヌクレオチドとのライゲーションは、別個でも行われ得る。例えば、最初に標識される第１のルシフェラーゼをまず添加して、第１のルシフェラーゼが、第１の分子で標識されたヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることを可能にし得、次いで、溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去し、第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出する；次いで、２番目に標識される第２のルシフェラーゼを添加して、第２のルシフェラーゼが、第２の分子で標識されたヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることを可能にし得、次いで、溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去し、第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出する。具体的には、本発明は、核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第１のルシフェラーゼは第１の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第２のルシフェラーゼは第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１０）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１２）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１４）任意選択で、ステップ（３）～（１３）又は（３）～（１１）を１回又は複数回繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第１のルシフェラーゼは第１の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第２のルシフェラーゼは第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１０）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１２）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１４）任意選択で、ステップ（３）～（１３）又は（３）～（１１）を１回又は複数回繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態において、２種のルシフェラーゼは同じであり得、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得、つまり１種のみのルシフェラーゼ及び基質が使用され、最初に標識される第１のルシフェラーゼ及び２番目に標識される第２のルシフェラーゼは、ヌクレオチドに別個にライゲーションされる。例えば、最初に標識される第１のルシフェラーゼを最初に添加し、第１のルシフェラーゼが、第１の分子で標識されたヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることを可能にし、次いで溶出バッファーを用いて、結合していない第１のルシフェラーゼを除去し、ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出する；次いで、２番目に標識される第２のルシフェラーゼを添加し、第２のルシフェラーゼが、第２の分子で標識されたヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることを可能にし、次いで溶出バッファーを用いて、結合していない第２のルシフェラーゼを除去し、ルシフェラーゼの基質を添加し、発光シグナルは同時である。具体的には、本発明は、核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第１のルシフェラーゼは第１の分子標識に特異的に結合し得る、ライゲーション反応を実施するステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）ルシフェラーゼを変性させるための試薬を添加するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第２のルシフェラーゼは第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１２）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１３）ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１４）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１５）任意選択で、各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１６）任意選択で、ステップ（３）～（１５）又は（３）～（１３）を１回又は複数回繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる核酸分子にプライマーをアニールし、シーケンシングされる核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖としてプライマーを使用することによって、支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼを使用してヌクレオチド重合反応を行い、それによって、成長核酸鎖の３’末端に４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第１のルシフェラーゼは第１の分子標識に特異的に結合し得る、ライゲーション反応を実施するステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）ルシフェラーゼを変性させるための試薬を添加するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであり、第２のルシフェラーゼは第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１２）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１３）ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１４）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１５）任意選択で、各ヌクレオチドの分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１６）任意選択で、ステップ（３）～（１５）又は（３）～（１３）を１回又は複数回繰り返して、核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットであって、
（ａ）４種の化合物であり、４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、４種の化合物；並びに
（ｂ）２種のルシフェラーゼであり、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得、２種のルシフェラーゼは同じであり得る又は異なり得る、２種のルシフェラーゼ
を含むキットにも関する。
（ａ）４種の化合物であり、４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、４種の化合物；並びに
（ｂ）２種のルシフェラーゼであり、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得、２種のルシフェラーゼは同じであり得る又は異なり得る、２種のルシフェラーゼ
を含むキットにも関する。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置；核酸分子を前処理するための試薬；シーケンシングされる核酸分子を連結するための支持体；シーケンシングされる核酸分子を支持体に連結する（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に連結する）ための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ；１種又は複数のバッファー溶液；１種又は複数の洗浄溶液；或いはその任意の組合せをさらに含む。
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において言及されるすべての特許、出願、及び他の刊行物は、参照によりすべての特許、出願、及び他の刊行物の全体が組み入れられる。本明細書に示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、及び他の刊行物に記載される定義と矛盾する又は一貫性がない場合、本明細書に記載される定義が優先するものとする。
本明細書において使用するとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はデオキシリボ核酸、リボ核酸の類似体を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖であり得るか、二本鎖であり得るか、又は一本鎖及び二本鎖配列の両方を含み得る。ポリヌクレオチド分子は、二本鎖形態のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ及び増幅産物等）に由来し得るか、又は一本鎖形態のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）若しくはＲＮＡに由来し得、ｄｓＤＮＡに変換され得る、逆もまた同様である。ポリヌクレオチド分子の正確な配列は、公知であり得る又は未知であり得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの例示的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡフラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、及び上記配列のいずれかの核酸プローブ、プライマー、又は増幅コピー。
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、通常、サッカリド（すなわち、リボース又はデオキシリボース）、塩基、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドは無塩基性（すなわち、塩基を含んでいない）であり得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾リン酸サッカリド骨格ヌクレオシド、及びこれらの混合物を含む。ヌクレオチドの例は、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含む。修飾塩基を含有するヌクレオチド類似体も、本明細書に記載される方法において使用され得る。修飾塩基が天然の骨格又は同様の構造を有するかどうかにかかわらず、ポリヌクレオチドに含まれ得る例示的な修飾塩基は、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロゲン化ウラシル、１５－ハロゲン化シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロゲン化アデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又は８－アミノグアニン、８－チオアデニン又は８－チオグアニン、８－チオアルキルアデニン又は８－チオアルキルグアニン、８－ヒドロキシアデニン又は８－ヒドロキシグアニン、５－ハロゲン化ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン等を含む。当技術分野において公知のように、ある特定のヌクレオチド類似体、例えばアデノシン５’－ホスホリルサルフェート等のヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドに組み入れられ得ない。
一般的に言うと、ヌクレオチドは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵを含む。本明細書において使用するとき、「ヌクレオチドＡ」という用語は、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ等、アデニン（Ａ）を含有するヌクレオチド又はその修飾体若しくは類似体を指す。「ヌクレオチドＧ」とは、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ等、グアニン（Ｇ）を含有するヌクレオチド又はその修飾体若しくは類似体を指す。「ヌクレオチドＣ」とは、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ等、シトシン（Ｃ）を含有するヌクレオチド又はその修飾体若しくは類似体を指す。「ヌクレオチドＴ」とは、ＴＴＰ、ｄＴＴＰ等、チミン（Ｔ）を含有するヌクレオチド又はその修飾体若しくは類似体を指す。「ヌクレオチドＵ」とは、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ等、ウラシル（Ｕ）を含有するヌクレオチド又はその修飾体若しくは類似体を指す。
ヌクレオチドの標識化
本発明は、種々のルシフェラーゼがヌクレオチドにライゲーションされ得るように、ヌクレオチドを種々の標識で個々に又は組合せで標識することに関する。本明細書において使用するとき、ヌクレオチドを標識するための分子標識、及び分子標識に特異的に結合する標識は、互いに特異的に結合し得る任意の対合分子であってもよい。対合メンバー間での特異的結合は、ルシフェラーゼへのヌクレオチドのライゲーションを実現する。例示的な対合メンバーは、（ａ）ジゴキシゲニン－ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ－Ｎ３Ｇ抗体、ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣ抗体等、対応する抗体又はその結合部分若しくはフラグメントと組み合わされたハプテン又は抗原化合物；（ｂ）核酸アプタマー及びタンパク質；（ｃ）非免疫結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ニュートラアビジン）；（ｄ）ホルモン－ホルモン結合タンパク質；（ｅ）受容体－受容体アゴニスト又はアンタゴニスト；（ｆ）レクチン－炭水化物；（ｇ）酵素－酵素補因子；（ｈ）酵素－酵素阻害剤；並びに（ｉ）核酸二重鎖を形成し得る相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのペアを含むが、核酸二重鎖を形成し得る相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのペアに限定されるわけではない。
本発明は、種々のルシフェラーゼがヌクレオチドにライゲーションされ得るように、ヌクレオチドを種々の標識で個々に又は組合せで標識することに関する。本明細書において使用するとき、ヌクレオチドを標識するための分子標識、及び分子標識に特異的に結合する標識は、互いに特異的に結合し得る任意の対合分子であってもよい。対合メンバー間での特異的結合は、ルシフェラーゼへのヌクレオチドのライゲーションを実現する。例示的な対合メンバーは、（ａ）ジゴキシゲニン－ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ－Ｎ３Ｇ抗体、ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣ抗体等、対応する抗体又はその結合部分若しくはフラグメントと組み合わされたハプテン又は抗原化合物；（ｂ）核酸アプタマー及びタンパク質；（ｃ）非免疫結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ニュートラアビジン）；（ｄ）ホルモン－ホルモン結合タンパク質；（ｅ）受容体－受容体アゴニスト又はアンタゴニスト；（ｆ）レクチン－炭水化物；（ｇ）酵素－酵素補因子；（ｈ）酵素－酵素阻害剤；並びに（ｉ）核酸二重鎖を形成し得る相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのペアを含むが、核酸二重鎖を形成し得る相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのペアに限定されるわけではない。
具体的な実施形態において、第１の分子標識及び第２の分子標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｎ３Ｇ、又はＦＩＴＣから選択される小分子標識である。２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得る。例えば、具体的な実施形態において、第１の分子標識はビオチンであり、次いで第１のルシフェラーゼはストレプトアビジン標識されたルシフェラーゼであり得；第２の分子標識はジゴキシゲニンであり、第２のルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼとは異なるジゴキシゲニン抗体標識されたルシフェラーゼであり得、第２のルシフェラーゼはまた、第１のルシフェラーゼと同じであるジゴキシゲニン抗体標識されたルシフェラーゼであってもよい。ルシフェラーゼの供給源は、ホタル、ガウシア（ｇａｕｓｓｉａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、及び他の生物を含むが、ホタル、ガウシア（ｇａｕｓｓｉａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、及び他の生物に限定されるわけではない。例えば、ストレプトアビジン標識されたルシフェラーゼは、Ａｄｉｖｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ製のＳＡ－Ｇｌｕｃ：ストレプトアビジン－ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼであってもよい。ジゴキシゲニン抗体標識されたルシフェラーゼは、ジゴキシゲニン抗体－Ｇｌｕｃ又はジゴキシゲニン抗体－Ｎｌｕｃであってもよい。
本明細書において使用するとき、「第１の化合物は第１の分子標識と連結されている」という表現は、第１の化合物のすべてが第１の分子標識と連結されているか、又は第１の化合物の一部が第１の分子標識と連結されており、一方で第１の化合物の残りは分子標識と連結されていないことを意味する。同じように、「第２の化合物は第２の分子標識と連結されている」という表現は、第２の化合物のすべてが第２の分子標識と連結されているか、又は第２の化合物の一部が第２の分子標識と連結されており、一方で第２の化合物の残りは分子標識と連結されていないことを意味する。「第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されている」という表現は、第３の化合物のすべてが第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部が第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されており、一方で第３の化合物の残りは分子標識と連結されていないことを意味する。
ポリヌクレオチドのシーケンシング
好ましくは、本発明の種々のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは、合成によるシーケンシングに適切である。本明細書において使用される合成によるシーケンシング法は、当技術分野において周知の合成による様々なシーケンシングである。基本的には、合成によるシーケンシングは、シーケンシングされる核酸分子とシーケンシングプライマーとをまずハイブリダイズするステップ、次いで、ポリメラーゼの存在下で、シーケンシングされる核酸分子を鋳型として使用することによって、シーケンシングプライマーの３’末端で、本明細書に記載される種々のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドを重合するステップを伴う。重合の後、ルシフェラーゼによって発せられた発光シグナルを検出することによって、ヌクレオチドが同定される。標識されたヌクレオチドからルシフェラーゼを除去した後、次のポリマーシーケンシングサイクルが実施される。
好ましくは、本発明の種々のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは、合成によるシーケンシングに適切である。本明細書において使用される合成によるシーケンシング法は、当技術分野において周知の合成による様々なシーケンシングである。基本的には、合成によるシーケンシングは、シーケンシングされる核酸分子とシーケンシングプライマーとをまずハイブリダイズするステップ、次いで、ポリメラーゼの存在下で、シーケンシングされる核酸分子を鋳型として使用することによって、シーケンシングプライマーの３’末端で、本明細書に記載される種々のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドを重合するステップを伴う。重合の後、ルシフェラーゼによって発せられた発光シグナルを検出することによって、ヌクレオチドが同定される。標識されたヌクレオチドからルシフェラーゼを除去した後、次のポリマーシーケンシングサイクルが実施される。
標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法は、以下のように行われ得る：標的ポリヌクレオチド配列を変性させ、標的ポリヌクレオチドと種々のヌクレオチドとをそれぞれ接触させて、標的ヌクレオチドの相補体を形成し、且つ組み入れられたヌクレオチドを検出するようにする。方法は、標的に相補的な正しいヌクレオチドを組み入れることによって、ポリメラーゼが相補鎖を伸長することを可能にする重合を利用する。重合反応は、重合を開始する特別なプライマーも要する。
反応の各ラウンドに関して、ヌクレオチドの組入れはポリメラーゼによって行われ、次いで組入れ事象が測定される。多くの異なるポリメラーゼが存在し、当業者が最も適切なポリメラーゼを決定することは容易である。好ましい酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４若しくはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、又はｖｅｎｔポリメラーゼを含む。特異的な特性を有するように操作されたポリメラーゼを使用することも可能である。
シーケンシング法は、固体支持体に配置された標的ポリヌクレオチドに対して好ましくは実施される。リンカー分子を通じて、複数の標的ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化され得るか、又はミクロスフェア等の粒子に付着され得、粒子は固体支持体材料にも付着され得る。
ポリヌクレオチドは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用の使用を含めた多様な方法によって、固体支持体に付着され得る。ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化するための方法は当技術分野において周知であり、リソグラフィー技法、及び固体支持体の特異的位置に各ポリヌクレオチドをスポットすることを含む。適切な固体支持体は当技術分野において公知であり、ガラススライド及びビーズ、セラミック及びシリコン表面、並びにプラスチック材料を含む。支持体は通常では平坦であり、但しマイクロビーズ（ミクロスフェア）も使用され得、後者は公知の方法によって他の固体支持体にも付着され得る。ミクロスフェアは任意の適切なサイズを有し得、ミクロスフェアの直径は通常では１０～１００ナノメートルである。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、平坦な表面に、好ましくは平坦なガラス表面に直接付着される。連結は、好ましくは共有結合の形態で行われる。使用されるアレイは、例えば国際公開第００／０６７７０号に記載されるように、一意的な光学的に分析可能な領域に置かれたポリヌクレオチドを含む、好ましくは単分子アレイである。
重合のための必要な条件は当業者に周知である。重合反応を実施するために、通常ではプライマー配列が標的ポリヌクレオチドに最初にアニールされるべきである。プライマー配列はポリメラーゼによって認識され、相補鎖の後続の伸長のための開始部位として働く。プライマー配列は、標的ポリヌクレオチドに対して独立の構成要素として添加されてもよい。加えて、プライマー及び標的ポリヌクレオチドはそれぞれ、一本鎖分子の一部であってもよく、プライマー部分及び標的の一部は、分子内二重鎖、つまりヘアピンループ構造を形成する。構造体は、分子の任意の位置を通じて固体支持体に固定化され得る。ポリメラーゼ反応に必要な他の条件は当業者に周知であり、これらの条件は、温度、ｐＨ、及びバッファー組成物を含む。
その後、本発明の標識されたヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと接触させて、重合を可能にする。ヌクレオチドは逐次的に添加され得、つまり各タイプのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ／Ｕ）は別個に添加される又は同時に添加される。
１個のヌクレオチドを組み入れるのに十分な時間の間、重合ステップの進行が可能になる。
次いで、例えば前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に付着したままにしておくことによって、組み入れられていないヌクレオチドが除去される。
その後、異なるルシフェラーゼを含有する２種のルシフェラーゼを添加して、ライゲーション反応を行い得る。２種のルシフェラーゼは、ヌクレオチドを標識するための分子標識にそれぞれ特異的に結合し得、それによって、組み入れられたヌクレオチドへのルシフェラーゼのライゲーションを実現する。次いで、ルシフェラーゼの対応する基質を添加し、発光シグナルを検出することによって、組み入れられたヌクレオチドの同定が達成される。同じルシフェラーゼを含有する２種類のルシフェラーゼを添加して、ライゲーション反応を行うことも可能である。ルシフェラーゼは、ヌクレオチドを標識するための分子標識にそれぞれ特異的に結合し得、それによって、組み入れられたヌクレオチドへのルシフェラーゼのライゲーションを実現する。次いで、ルシフェラーゼの対応する基質を添加し、発光シグナルを検出することによって、組み入れられたヌクレオチドの同定が実現される。
具体的な実施形態において、４種のデオキシリボヌクレオチド類似体は、異なる小分子標識、すなわちビオチン（Ｂと略される）及びジゴキシゲニン（Ｄと略される）で標識されており、例えばヌクレオチドＡはＢで標識されており、ヌクレオチドＣはＢ及びＤで標識されており、ヌクレオチドＴはＤで標識されており、ヌクレオチドＧは標識されていない。異なる小分子で標識された４種のデオキシリボヌクレオチド類似体の３’末端ヒドロキシル基はすべてブロックされて、各シーケンシング反応の間に１個のみのデオキシリボヌクレオチドが結合されることを確実にする。シーケンシング反応の間、４種の標識されたデオキシリボヌクレオチド類似体とシーケンシングポリメラーゼとの混合物が、ポリメラーゼの作用下でまず導入され、塩基相補的対合の原理に従って、１個のデオキシリボヌクレオチド類似体が成長核酸鎖の３’末端に組み入れられる。前のステップにおける反応系の溶液相を除去し、二重鎖を支持体に付着したままにしておくことによって、結合していないデオキシリボヌクレオチド類似体が除去され得る。次いで、異なるルシフェラーゼを含有する２種のルシフェラーゼが添加され、第１のルシフェラーゼはストレプトアビジンで標識されており、ストレプトアビジンで標識された第１のルシフェラーゼは、小分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡ又はヌクレオチドＣに結合し、第２のルシフェラーゼはジゴキシゲニン抗体で標識されており、ジゴキシゲニン抗体で標識された第２のルシフェラーゼは、小分子Ｄで標識されたヌクレオチドＣ又はヌクレオチドＴに結合する。溶出バッファーを用いて、結合していないルシフェラーゼを除去した後、第１のルシフェラーゼの基質が添加され、第１のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは光を発し、シグナルは検出器によって検出される；第２のルシフェラーゼの基質が添加され、第２のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは光を発し、シグナルは検出器によって検出され、それにより、以下の表に示される発光が獲得され、塩基が同定され得る。
具体的な実施形態において、標識されたヌクレオチドへの異なるルシフェラーゼを含有する２種のルシフェラーゼのライゲーション、及びシグナル検出は別個に実施され得る。まず、第１のルシフェラーゼが添加され、第１のルシフェラーゼはストレプトアビジンで標識されており、小分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡ又はヌクレオチドＣに結合する。溶出バッファーを用いて、結合していない第１のルシフェラーゼを除去した後、第１のルシフェラーゼの基質が添加され、第１のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは光を発し、シグナルは検出器によって検出される。反応溶液を除去した後、ジゴキシゲニン抗体で標識された第２のルシフェラーゼが添加され、ジゴキシゲニン抗体で標識された第２のルシフェラーゼは、小分子Ｄで標識されたヌクレオチドＣ又はヌクレオチドＴに結合し、次いで溶出バッファーを用いて、結合していない第２のルシフェラーゼは除去され、第２のルシフェラーゼの基質が添加され、第２のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは光を発し、シグナルは検出器によって検出される。故に、上の表に示される発光が獲得され、塩基の同定が実施され得る。
別の具体的な実施形態において、標識されたヌクレオチドへの同じルシフェラーゼを含有する２種のルシフェラーゼのライゲーション、及びシグナル検出は別個に実施される。まず、第１のルシフェラーゼが添加され、第１のルシフェラーゼはストレプトアビジンで標識されており、小分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡ又はヌクレオチドＣに結合する。溶出バッファーを用いて、結合していない第１のルシフェラーゼを除去した後、ルシフェラーゼの基質が添加され、第１のルシフェラーゼとライゲーションされたヌクレオチドは光を発し、シグナルは検出器によって検出される。次いで、第１のルシフェラーゼを変性させる試薬が添加され；反応溶液を除去した後、第２のルシフェラーゼが添加され、第２のルシフェラーゼはジゴキシゲニン抗体で標識されており、小分子Ｄで標識されたヌクレオチドＣ又はヌクレオチドＴに結合し、次いで、溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼが除去され、ルシフェラーゼの基質が添加され、第２のルシフェラーゼとライゲーションされた塩基は光を発し、シグナルは検出器によって検出される。故に、上の表に示される発光が獲得され、塩基の同定が実施され得る。
蛍光シグナルの検出
蛍光シグナルを検出する手段は当技術分野において周知である。例えば、蛍光シグナルを検出することは、蛍光の波長を検出する装置によって実現され得る。そのような装置は当技術分野において周知である。例えば、そのような装置は、固体支持体の表面をレーザーでスキャンして、シーケンシングされる核酸分子に直接結合しているフルオロフォアを撮像するための共焦点走査型顕微鏡であってもよい。加えて、例えば、電荷結合検出器（ＣＣＤ）等の高感度２－Ｄ検出器を使用して、生み出された各シグナルを観察し得る。例えば、走査型近接場光顕微鏡（ＳＮＯＭ）等の他の技法も使用され得る。
蛍光シグナルを検出する手段は当技術分野において周知である。例えば、蛍光シグナルを検出することは、蛍光の波長を検出する装置によって実現され得る。そのような装置は当技術分野において周知である。例えば、そのような装置は、固体支持体の表面をレーザーでスキャンして、シーケンシングされる核酸分子に直接結合しているフルオロフォアを撮像するための共焦点走査型顕微鏡であってもよい。加えて、例えば、電荷結合検出器（ＣＣＤ）等の高感度２－Ｄ検出器を使用して、生み出された各シグナルを観察し得る。例えば、走査型近接場光顕微鏡（ＳＮＯＭ）等の他の技法も使用され得る。
標識の除去
検出後、適切な条件を使用して、ヌクレオチドに付着した標識を除去し得る。
検出後、適切な条件を使用して、ヌクレオチドに付着した標識を除去し得る。
具体的な実施形態において、本発明の標識ヌクレオチドは３’保護基も有する。本発明の一部の実施形態において、保護基及び標識は、通常、３’ブロックされた標識ヌクレオチド上の２つの異なる基であるが、他の実施形態において、保護基及び標識はまた、同じ基であってもよい。
本明細書において使用するとき、「保護基」という用語は、該基を含有するヌクレオチドが、合成されているポリヌクレオチド鎖に組み入れられた後に、ポリメラーゼ（該基を含有するヌクレオチドを、合成されているポリヌクレオチド鎖に組み入れる）が、ヌクレオチドの別のものの組入れを絶え間なく触媒することを阻止する基を指す。そのような保護基は、本明細書において３’－ＯＨ保護基とも称される。そのような保護基を含有するヌクレオチドは、本明細書において３’ブロックされたヌクレオチドとも称される。保護基が、ポリヌクレオチド鎖に付加的なヌクレオチド分子が組み入れられるのを阻止し得、且つポリヌクレオチド鎖に損傷を与えることなくヌクレオチドのサッカリド部分から容易に除去され得る限りにおいて、保護基は、ヌクレオチドに付加され得る任意の適切な基であり得る。加えて、保護基で修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に組み入れるためのポリメラーゼ又は他の適切な酵素に抵抗性である必要がある。それ故、理想的な保護基は、長期の安定性を呈し、ポリメラーゼによって効率的に組み入れられ得、ヌクレオチドの二次的な又はさらなる組入れを阻止し、且つポリヌクレオチドの構造に損傷を与えない穏やかな条件下で、好ましくは水性条件下で除去され得る。
先行技術は、上の記載を満たす多様な保護基を記載している。例えば、国際公開第９１／０６６７８号は、３’－ＯＨ保護基が、エステル及びエーテル、－Ｆ、－ＮＨ２、－ＯＣＨ３、－Ｎ３、－ＯＰＯ３、－ＮＨＣＯＣＨ３、２－ニトロフェニルカーボネート、２，４－ヒポスルホニルジニトロ、及びテトラヒドロフランエーテルを含むことを開示する。Ｍｅｔｚｋｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（２０）：４２５９～４２６７、１９９４）は、８つの３’修飾２－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸（３’修飾ｄＮＴＰ）の合成及び適用を開示する。国際公開第２００２／０２９００３号は、ポリメラーゼ反応において成長ＤＮＡ鎖の３’－ＯＨ基をキャップするアリル保護基の使用を記載する。好ましくは、国際公開第２０１４１３９５９６号及び国際公開第２００４／０１８４９７号に報告される様々な保護基が使用され得、例えば国際公開第２０１４１３９５９６号の図１Ａに例示されるそうした保護基及び特許請求の範囲に規定されるそうした３’－ヒドロキシル保護基（すなわち、保護基）、並びに例えば、国際公開第２００４／０１８４９７号の図３と４に例示されるそうした保護基、及び特許請求の範囲に規定されるものを含む。上記参考文献はすべて、参照により参考文献の全体が本明細書に組み入れられる。
当業者であれば、適切な保護基をリボース環に付着させて、３’－ＯＨとの相互作用をブロックする方法を理解するであろう。保護基は、３’位に直接付着され得るか、又は２’位に付着され得る（保護基は、３’位における相互作用をブロックするのに十分なサイズ又は電荷を有する）。加えて、保護基は、３’及び２’位で付着され得、切断されて３’－ＯＨ基を曝露し得る。
３’ブロックされたヌクレオチドを成長核酸鎖に組み入れることに成功した後、シーケンシングプロトコールは、連続的な鎖合成のために使用可能な３’－ＯＨ部位を生み出すために、保護基の除去を要する。本明細書において使用される、修飾されたヌクレオチドから保護基を除去し得る試薬は、使用される保護基に大きく依存する。例えば、３’－ヒドロキシル基からエステル保護基を除去することは、通常ではアルカリ加水分解によって達成される。保護基の除去の容易さは大幅に変動し；一般的に、カルボニル炭素上の置換基の電気陰性度が大きければ大きいほど、除去の容易さは大きくなる。例えば、高度に電気陰性のトリフルオロ酢酸基は、メタノール中にてｐＨ７で３’－ヒドロキシル基から迅速に切断され得（Ｃｒａｍｅｒら、１９６３）、そのためトリフルオロ酢酸基は、このｐＨでの重合の間不安定である。フェノキシアセテート基は１分未満以内に切断されるが、例えばＮＨ－／メタノールを使用することにより、有意により高いｐＨが要される（Ｒｅｅｓｅ及びＳｔｅｗａｒｄ、１９６８）。様々なヒドロキシ保護基が、アルカリ加水分解以外の化学的方法を使用して選択的に切断され得る。２，４－ジニトロフェニルチオ基は、チオフェノール及びチオサルフェート等の求核剤を用いた処理によって迅速に切断され得る（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９６４）。アリルエーテルは、アセトン／水中でのＨｇ（ＩＩ）を用いた処理によって切断され得る（Ｇｉｇｇ及びＷａｒｒｅｎ、１９６８）。テトラヒドロチアニル（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉａｎｙｌ）エーテルは、Ａｇ（Ｉ）又はＨｇ（ＩＩ）を用いた中性条件下で除去され得る（Ｃｏｈｅｎ及びＳｔｅｅｌｅ、１９６６；Ｃｒｕｓｅら、１９７８）。光化学デブロッキングは、光化学的に切断可能な保護基とともに使用され得る。この方法において使用され得るいくつかの保護基がある。リボヌクレオシドの２’－ヒドロキシル官能性のための保護基としてのｏ－ニトロベンジルエーテルの使用は公知であり且つ立証されており（Ｏｈｔｓｕｋａら、１９７８）；ｏ－ニトロベンジルエーテルは、２６０ｎｍにおける照射によって除去される。アルキルカーボネートｏ－ニトロベンジルカーボネートの保護基も、ｐＨ７における照射によって除去される（Ｃａｍａ及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、１９７８）。３’－ＯＨ保護基の酵素的デブロッキングも可能である。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは、３’－リン酸末端を３’－ヒドロキシル末端に変換し得、次いで３’－ヒドロキシル末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩに対するプライマーとして使用され得ることが実証されている（Ｈｅｎｎｅｒら、１９８３）。この３’－ホスファターゼ活性を使用して、保護基としてリン酸を含有するそうしたｄＮＴＰ類似体の３’保護基を除去する。
３’ブロックされたヌクレオチドから保護基を除去し得る他の試薬は、例えばヌクレオチドからアジドを含有する３’－ＯＨ保護基を除去し得るホスフィン（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ））を例えば含む（ホスフィンのこの適用に関しては、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１４１３９５９６号における記載を参照されたい）。３’ブロックされたヌクレオチドから保護基を除去し得る他の試薬は、例えば、３’－ＯＨ保護基として使用される３’－アリル、３，４－ジメトキシベンジルオキシメチル、又はフルオロメトキシメチルを除去するための、国際公開第２００４／０１８４９７号の記載における１１４～１１６頁に記載される対応する試薬も含む。
本発明の実施形態において、ヌクレオチドの標識は、好ましくは、検出後に保護基と一緒に除去される。
ある特定の実施形態において、標識は保護基に組み入れられてもよく、それによって、３’ブロックされたヌクレオチドが核酸鎖に組み入れられた後、標識が保護基とともに除去されるのを可能にする。
他の実施形態において、標識は、連結基及び保護基を別個に使用してヌクレオチドに付着され得る。そのような標識は、例えば、ヌクレオチドのプリン又はピリミジン塩基に付着されてもよい。ある特定の実施形態において、使用される連結基は切断可能である。切断可能な連結基の使用は、検出後に標識が除去され得ることを確実にし、標識が除去されることは、その後に組み入れられた任意の標識されたヌクレオチドとの任意のシグナル干渉を回避する。他の実施形態において、標識されたヌクレオチドが核酸鎖に組み入れられた後、その後のヌクレオチド組入れは必要とされず、そのためヌクレオチドから標識を除去する必要がないため、切断不能な連結基が使用され得る。
他の実施形態において、標識及び／又は連結基は、ポリヌクレオチド鎖への他のヌクレオチドの組入れをブロックするのに十分なサイズ又は構造を有してもよい（つまり、標識自体が保護基として働き得る）。ブロッキングは立体障害に起因するものであってもよいか、又はブロッキングは、サイズ、電荷、及び構造の組合せに起因するものであってもよい。
切断可能な連結基は当技術分野において周知であり、従来の化学的方法を使用して、ヌクレオチド塩基及び標識に連結基を連結し得る。ワトソン・クリック塩基対合が依然として実施され得るという条件で、連結基は、ヌクレオチド塩基の任意の位置に付着され得る。プリン塩基に関しては、連結基は、プリン又は好ましいデアザプリン類似体の７位を通じて、８－修飾プリンを通じて、Ｎ－６修飾アデニン又はＮ－２修飾グアニンを通じて付着されることが好ましい。ピリミジンに関しては、シトシン、チミン、及びウラシルの５位、並びにシチジンのＮ－４位を通じて連結することが好ましい。
「切断可能な連結基」という用語の使用は、連結基全体が、（例えば、ヌクレオチド塩基から）除去される必要があることを意味するわけではない。標識が塩基に付着される場合、ヌクレオシド切断部位は連結基上の位置に置かれ得、その位置は、切断後に連結基の一部がヌクレオチド塩基に付着したままであることを確実にし得る。
適切な連結基は、ジスルフィド連結基、酸不安定連結基（ジアルコキシベンジル連結基、シーベル連結基、インドール連結基、ｔｅｒｔ－ブチルシーバー連結基を含む）、求電子性の切断可能な連結基、求核性の切断可能な連結基、光切断可能な連結基、還元及び酸化条件下で切断され得る連結基、セーフティ・キャッチ連結基、並びに脱離メカニズムを通じて切断され得る連結基を含むが、それらに限定されるわけではない。以下の文書：Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｕｔｓ、ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに開示されるように、適切な連結基は、標準的な化学的保護基で修飾され得る。Ｇｕｉｌｌｉｅｒらは、固相合成のための他の適切な切断可能な連結基を開示した（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９２～２１５７、２０００）。
連結基は、酸、塩基、求核剤、求電子剤、フリーラジカル、金属、還元又は酸化試薬、光、温度、酵素等への曝露を含めた、任意の適切な方法によって切断され得、様々な切断可能な連結基を切断するための適切な方法は、下で例示的に記載されるであろう。一般的に、切断可能な連結基は、保護基のものと同じ条件下で切断され得、それにより、標識及び保護基を除去するために１つのみの処理が要される。
求電子性切断に対する連結基は、典型的にはプロトンによって切断され、プロトンによる切断は酸感受性切断を含む。適切な求電子性の切断可能な連結基は、トリチル、ｐ－ヒドロカルボニルオキシベンジルエステル、及びｐ－ヒドロカルボニルオキシベンジルアミド等の修飾ベンジル系を含む。他の適切な連結基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基及びアセタール系を含む。適切な連結分子を調製するために、チオアセタール又は他の硫黄含有保護基の切断におけるニッケル、銀、又は水銀等の求硫黄性金属の使用を考慮することも可能である。求核性切断に対する連結基は、エステル等、水中で不安定である基（すなわち、アルカリ性ｐＨで簡単に切断され得る）、及び非水性求核剤に不安定である基を含む。フッ化物イオンを使用して、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）等の基におけるケイ素－酸素結合を切断し得る。光分解可能な連結基は、サッカリド化学において広く使用されている。好ましくは、切断を活性化するために要される光は、修飾ヌクレオチドにおける他の構成要素に影響を及ぼさない。例えば、フルオロフォアが標識として使用される場合、フルオロフォアは、連結分子を切断するために要される光とは異なる波長の光を吸収することが好ましい。適切な連結基は、Ｏ－ニトロベンジル化合物及びニトロベラトリル化合物に基づくものを含む。ベンゾイン化学に基づく連結基も使用され得る（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３４５４～３４６０、１９９９）。還元的切断に感受性である多様な連結基が公知である。ベンジル及びベンジルオキシカルボニル基を切断するために、パラジウムに基づく触媒を使用した触媒的水素化が使用されている。ジスルフィド結合還元も当技術分野において公知である。酸化に基づく方法は当技術分野において周知である。これらの方法は、ヒドロカルボニルオキシベンジル基の酸化、並びに硫黄及びセレンに基づく連結基の酸化を含む。水性ヨウ素を使用して、ジスルフィド及び他の硫黄又はセレンに基づく連結基を切断することも、本発明の範囲内にある。セーフティ・キャッチリンカーは、２つのステップで切断されるものである。好ましい系において、第１のステップは、反応性の求核性中心の生成であり、後続の第２のステップは、切断をもたらす分子内環化を伴う。例えば、レブリネート連結を、ヒドラジン又は光化学的方法で処理して活性アミンを放出し得、次いでアミンを環化して、分子内の他の場所にあるエステルを切断する（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５～５１６８、１９９７）。脱離反応を使用しても、連結基を切断し得る。フルオレニルメトキシカルボニル及びシアノエチル等の基の塩基触媒による脱離、並びにアリル系のパラジウム触媒による還元的脱離が使用され得る。
ある特定の実施形態において、連結基はスペーサー単位を含んでもよい。標識及びヌクレオチドが、ヌクレオチドと酵素との間の相互作用を干渉しない程度に十分な距離で保たれる限りにおいて、連結基の長さは重要ではない。
ある特定の実施形態において、連結基は３’－ＯＨ保護基と同様の官能基からなってもよい。このことは、標識及び保護基を除去するために単一のみの処理が要されることを可能にするであろう。特に好ましい連結基は、ホスフィンによって切断され得るアジド含有連結基である。
本明細書において使用される修飾ヌクレオチドから標識を除去し得る試薬は、使用される標識に大きく依存する。例えば、保護基が標識に組み入れられる場合、上で記載される保護基を除去するための試薬を使用して標識を除去する。或いは、切断可能な連結基を通じて標識がヌクレオチドの塩基に付着される場合、標識は、上で記載される連結基を切断する試薬を使用して除去される。好ましい実施形態において、例えば連結基が３’－ＯＨ保護基と同様の官能基からなる場合、同じ試薬を使用して、修飾ヌクレオチドから標識及び保護基を除去する。
キット
本発明は、
（ａ）４種の化合物であって、４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、化合物；並びに
（ｂ）２種の異なるルシフェラーゼであって、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得る、２種の異なるルシフェラーゼ、
を含む、ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットも提供する。
本発明は、
（ａ）４種の化合物であって、４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、化合物；並びに
（ｂ）２種の異なるルシフェラーゼであって、２種のルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識及び第２の分子標識に特異的に結合し得る、２種の異なるルシフェラーゼ、
を含む、ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットも提供する。
具体的な実施形態において、４種の化合物を標識するために使用される分子標識、及び２種のルシフェラーゼを標識するために使用される標識は、上で規定されるとおりである。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置；シーケンシングされる核酸分子を前処理するための試薬；シーケンシングされる核酸分子を連結するための支持体；シーケンシングされる核酸分子を支持体に連結する（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に連結する）ための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ；１種又は複数のバッファー溶液；１種又は複数の洗浄溶液；或いはその任意の組合せをさらに含む。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置をさらに含む。サンプルから核酸分子を抽出するための方法は当技術分野において周知である。それ故、細胞を分断させるための試薬、ＤＮＡを沈殿させるための試薬、ＤＮＡを洗浄するための試薬、ＤＮＡを溶解するための試薬、ＲＮＡを沈殿させるための試薬、ＲＮＡを洗浄するための試薬、ＲＮＡを溶解するための試薬、タンパク質を除去するための試薬、ＤＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＲＮＡの場合）、ＲＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＤＮＡの場合）、及びその任意の組合せ等、核酸分子を抽出するための様々な試薬及び／又は装置が、必要に応じて、本発明のキットにおいて構成され得る。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、核酸分子を前処理するための試薬をさらに含む。本発明のキットにおいて、核酸分子を前処理するために使用される試薬は、付加的な制約を受けず、実際の必要性に従って選択され得る。核酸分子の前処理に使用される試薬は、例えば、核酸分子を断片化するための試薬（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、核酸分子の末端を補足するための試薬（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼ）、リンカー分子、タグ分子、リンカー分子と標的核酸分子とを連結するための試薬（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼ）、核酸ニックを修復するための試薬（例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を喪失しているが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼ）、核酸分子を増幅するための試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ）、核酸分子を分離する及び精製するための試薬（例えば、クロマトグラフィーカラム）、並びにその任意の組合せを含む。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、シーケンシングされる核酸分子を連結するための支持体をさらに含む。支持体は、支持体に関して上で詳細に記載される任意の技術的特質及びその任意の組合せを有してもよい。
例えば、本発明において、支持体は、様々な適切な材料から作製され得る。そのような材料は、例えば無機材料、天然ポリマー、合成ポリマー、及び無機材料、天然ポリマー、合成ポリマーの任意の組合せを含む。具体的な例は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース）、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、及び例えばジビニルベンゼンと架橋したポリスチレン（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４、３、１３８５～１３９０を参照されたい）、ポリアクリルアミド、ラテックス、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、天然スポンジ、金属性プラスチック、架橋デキストラン（例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（商標））、アガロースゲル（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標））、並びに当業者に公知の他の支持体を含むが、それらに限定されるわけではない。
一部の好ましい実施形態において、シーケンシングされる核酸分子を連結するために使用される支持体は、不活性基板又はマトリックスを含めた固体支持体であってもよい（例えば、ガラススライド、ポリマービーズ等）。不活性基板又はマトリックスは、例えば、ポリヌクレオチド等の生体分子の共有結合性付着を可能にする反応基を含有する中間材料を適用することによって官能化されている。そのような支持体の例は、ガラス等の不活性基板に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲル、特に、特許出願の内容が参照により特許出願の内容全体が本明細書に組み入れられる国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されるポリアクリルアミドヒドロゲルを含むが、それらに限定されるわけではない。そのような実施形態において、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に共有結合的に直接付着され得、中間材料自体は、基板又はマトリックス（例えば、ガラス基板）に非共有結合的に付着され得る。一部の好ましい実施形態において、支持体は、表面が、アビジン、アミノ、アクリルアミドシラン、又はアルデヒドに基づく化学基で修飾されているガラススライド又はシリコンウェハーである。
本発明において、支持体又は固体支持体は、そのサイズ、形状、及び構成に限定されない。一部の実施形態において、支持体又は固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ、及び／又はアレイ等、平面構造のものである。そのような支持体の表面は、平面層の形態にあってもよい。一部の実施形態において、支持体又はその表面、例えばチューブ又は容器の内面又は外面は非平面状である。一部の実施形態において、支持体又は固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。ある特定の好ましい実施形態において、シーケンシングされる核酸分子を連結するために使用される支持体は、ビーズ又はウェルのアレイである。
一部の好ましい実施形態において、本発明のキットは、シーケンシングされる核酸分子を支持体に連結する（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に連結する）ための試薬をさらに含む。そのような試薬は、例えば、リン酸、チオール、アミン、カルボン酸、又はアルデヒド等、核酸分子（例えば、その５’末端）を活性化する又は修飾する試薬；アミノアルコキシシラン（例えば、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、４－アミノブチルトリエトキシシラン等）等、支持体の表面を活性化する又は修飾する試薬；無水コハク酸、フェニルジイソチオシアネート（Ｇｕｏら、１９９４）、無水マレイン酸（Ｙａｎｇら、１９９８）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ｍｅｔａ－マレイミド安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－スクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシ－スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）等の架橋剤；及びその任意の組合せを含む。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のキットは、ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマーをさらに含む。本発明において、プライマーが標的核酸分子の領域に特異的にアニールし得る限りにおいて、プライマーは付加的な制約を受けない。一部の例示的な実施形態において、プライマーの長さは、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０ｂｐ等、５～５０ｂｐであってもよい。一部の例示的な実施形態において、プライマーは、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでもよい。一部の例示的な実施形態において、プライマーは、天然に存在するヌクレオチドを含む又は天然に存在するヌクレオチドからなる。一部の例示的な実施形態において、プライマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）等の修飾ヌクレオチドを含む。ある特定の好ましい実施形態において、プライマーはユニバーサルプライマー配列を含む。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のキットは、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼをさらに含む。本発明において、様々な適切なポリメラーゼが使用され得る。一部の例示的な実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型として使用して、新たなＤＮＡ鎖を合成し得る（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）。一部の例示的な実施形態において、ポリメラーゼは、ＲＮＡを鋳型として使用して、新たなＤＮＡ鎖を合成し得る（例えば、逆転写酵素）。一部の例示的な実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として使用して、新たなＲＮＡ鎖を合成し得る（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）。それ故、ある特定の好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素からなる群から選択される。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のキットは、１種又は複数のバッファー溶液をさらに含む。そのようなバッファーは、ＤＮａｓｅＩに対するバッファー溶液、ＤＮＡポリメラーゼに対するバッファー溶液、リガーゼに対するバッファー溶液、核酸分子を溶出するためのバッファー溶液、核酸分子を溶解するためのバッファー溶液、ヌクレオチド重合反応（例えば、ＰＣＲ）を行うためのバッファー溶液、及びライゲーション反応のためのバッファー溶液を含むが、それらに限定されるわけではない。本発明のキットは、上記のバッファー溶液のうちのいずれか１種又は複数を含んでもよい。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のキットは、１種又は複数の洗浄溶液をさらに含む。そのような洗浄溶液の例は、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、酢酸バッファー、炭酸バッファー等を含むが、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、酢酸バッファー、炭酸バッファー等に限定されるわけではない。本発明のキットは、上記の洗浄溶液のうちのいずれか１種又は複数を含んでもよい。
［発明の効果］
［発明の効果］
先行技術と比較して、本発明の技術的解決策は、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の方法は、２種のみの分子標識を使用して、４種のヌクレオチドの標識化を実現し、ルシフェラーゼを使用することによって自家発光を実現する。それ故、本発明のシーケンシング法において使用されるシーケンシング装置は、励起光源を備える必要がなく、シーケンシング装置は、レーザー光源によって生み出されるバックグラウンドをフィルターにかける付加的な設計を採用する必要もない。一方では、シーケンシング装置の製造費用は大幅に低下し、このことはシーケンシング装置及びシーケンシング法の促進及び適用に有用であり；他方では、シーケンシング装置の体積は有意に低下し、シーケンシング装置をより軽く且つより運びやすくする。
（２）本発明のシーケンシング法において使用されるデオキシリボヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基は、修飾され、ブロックされる。シーケンシング工程の間、反応あたり１個のみのデオキシリボヌクレオチドが合成され得、反応あたり１個のみのデオキシリボヌクレオチドが組み入れられ得ることを確実にし、それによってシーケンシングの精度を向上させる。
（１）本発明の方法は、２種のみの分子標識を使用して、４種のヌクレオチドの標識化を実現し、ルシフェラーゼを使用することによって自家発光を実現する。それ故、本発明のシーケンシング法において使用されるシーケンシング装置は、励起光源を備える必要がなく、シーケンシング装置は、レーザー光源によって生み出されるバックグラウンドをフィルターにかける付加的な設計を採用する必要もない。一方では、シーケンシング装置の製造費用は大幅に低下し、このことはシーケンシング装置及びシーケンシング法の促進及び適用に有用であり；他方では、シーケンシング装置の体積は有意に低下し、シーケンシング装置をより軽く且つより運びやすくする。
（２）本発明のシーケンシング法において使用されるデオキシリボヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基は、修飾され、ブロックされる。シーケンシング工程の間、反応あたり１個のみのデオキシリボヌクレオチドが合成され得、反応あたり１個のみのデオキシリボヌクレオチドが組み入れられ得ることを確実にし、それによってシーケンシングの精度を向上させる。
本発明の具体的な実施形態が詳細に記載されているものの、当業者であれば、様々な改変及び変化が、開示されているすべての教示に従って細部まで加えられ得、これらの変化は本発明の保護範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物によって与えられる。
実施例１
１．シーケンシングライブラリーの構築
（１）以下のＤＮＡ配列（配列番号１）を設計した。
１．シーケンシングライブラリーの構築
（１）以下のＤＮＡ配列（配列番号１）を設計した。
ライブラリー構築の都合上、オリゴ配列（太字フォント）を配列の２つの末端に付加し、ＢＧＩＳＥＱ－５００のリンカー配列（網掛け部分）を中央部分に挿入し、イタリック体の太字部分は、シーケンシングされる配列の最初の１０ｂｐ塩基を示した。上記配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって合成され、配列の限定されない使用のために、合成された配列をｐＵＣ５７ベクターに挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。
（２）既知のライブラリーを含有する適切な量の大腸菌を培養し、プラスミドを抽出し、プライマーの以下のペア：ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ（配列番号２、プライマー１）、ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ（配列番号３、プライマー２）を設計し、既知の配列を以下の系（表１）及び工程（表２）に従って増幅し、ＰＣＲ産物を磁気ビーズを用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物を、後の使用のために、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ５０環状化ライブラリー構築キット（ＭＧＩ）の使用説明書及び工程に従って、スプリットオリゴ（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ、配列番号４）とともに添加し、環状化及びライブラリー構築に供した。
２．ライブラリー配列の増幅
ストレプトアビジンでコートされた９６ウェルプレートをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ（配列番号５）を、ウェルの１つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応液を捨て、上の第１節において構築された６ｎｇのライブラリー、及びＢＧＩＳＥＱ－５００キットにおける２０μｌのＤＮＢ調製バッファーＩ（ＭＧＩによって作製された）を添加し、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションを６０℃で５分間実施し、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンシングキットにおける４０μｌのＤＮＢポリメラーゼＩ（ＭＧＩによって作製された）及び４μｌのＤＮＢポリメラーゼＩＩを添加し、反応を３０℃で６０分間実施し、６５℃に加熱した後に反応を終結させ、反応溶液を慎重に捨てた。１００μｌの５μＭシーケンシングプライマーＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴ（配列番号６）を添加し、ハイブリダイゼーションを室温で３０分間実施し、反応溶液を慎重に捨てた。
ストレプトアビジンでコートされた９６ウェルプレートをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ（配列番号５）を、ウェルの１つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応液を捨て、上の第１節において構築された６ｎｇのライブラリー、及びＢＧＩＳＥＱ－５００キットにおける２０μｌのＤＮＢ調製バッファーＩ（ＭＧＩによって作製された）を添加し、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションを６０℃で５分間実施し、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンシングキットにおける４０μｌのＤＮＢポリメラーゼＩ（ＭＧＩによって作製された）及び４μｌのＤＮＢポリメラーゼＩＩを添加し、反応を３０℃で６０分間実施し、６５℃に加熱した後に反応を終結させ、反応溶液を慎重に捨てた。１００μｌの５μＭシーケンシングプライマーＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴ（配列番号６）を添加し、ハイブリダイゼーションを室温で３０分間実施し、反応溶液を慎重に捨てた。
３．シーケンシング
（１）下で示される４種のｄＮＴＰは、外部委託会社としてのＡｃｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された。
（１）下で示される４種のｄＮＴＰは、外部委託会社としてのＡｃｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された。
（２）２種のルシフェラーゼの調製：
ａ．ＳＡ－Ｇｌｕｃ（ａｄｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｎｙから購入した）
ｂ．Ａｂ－Ｎｌｕｃを調製するための、Ｎｌｕｃ（ａｖｉｄｉｔｙから購入した）とコンジュゲートした抗体（Ａｂｃａｍから購入した）
ａ．ＳＡ－Ｇｌｕｃ（ａｄｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｎｙから購入した）
ｂ．Ａｂ－Ｎｌｕｃを調製するための、Ｎｌｕｃ（ａｖｉｄｉｔｙから購入した）とコンジュゲートした抗体（Ａｂｃａｍから購入した）
タンパク質カップリングキットをＴｈｅｒｍｏから購入し、抗体とＮｌｕｃとのコンジュゲーションを、使用説明書及び図１に示される手順に従って実施した。
（３）試薬の調製：
シーケンシング反応において必要とされる他の試薬の調製
重合反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ９（ＢＧＩ）、３ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ 上記４種のｄＮＴＰのそれぞれ
溶出バッファー：５×ＳＳＣ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０；
酵素結合反応溶液：上記２種の酵素をＴＢＳＴバッファーに希釈し、２種の酵素のそれぞれの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった；
基質１反応溶液：５０ｍＭ ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ０．５ｍＭ Ｎａｃｌバッファーを調製し、５０×セレンテラジン（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
基質２反応溶液：５０ｍＭ ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ０．５ｍＭ Ｎａｃｌバッファーを調製し、５０×ＮＬｕｃ ＦＬＡＳＨ基質（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
切取バッファー：２０ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０；
シーケンシング反応において必要とされる他の試薬の調製
重合反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ９（ＢＧＩ）、３ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ 上記４種のｄＮＴＰのそれぞれ
溶出バッファー：５×ＳＳＣ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０；
酵素結合反応溶液：上記２種の酵素をＴＢＳＴバッファーに希釈し、２種の酵素のそれぞれの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった；
基質１反応溶液：５０ｍＭ ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ０．５ｍＭ Ｎａｃｌバッファーを調製し、５０×セレンテラジン（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
基質２反応溶液：５０ｍＭ ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ０．５ｍＭ Ｎａｃｌバッファーを調製し、５０×ＮＬｕｃ ＦＬＡＳＨ基質（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
切取バッファー：２０ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０；
（４）シーケンシング反応：
シーケンシング工程：
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を、増幅したライブラリーの各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５℃に上昇させ、４種のｄＮＴＰが、増幅したライブラリー上に重合されるように、反応を３分間実施した。反応溶液を慎重に捨てた後、１００μｌの溶出反応溶液を添加し、数回静かにピペッティングして溶出反応溶液を除去した；
ｂ．ルシフェラーゼのライゲーション：１００μｌの酵素結合反応溶液を添加し、ＳＡ－ｇｌｕｃがビオチン標識ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ誘導体にライゲーションし、Ａｂ－Ｎｌｕｃがジゴキシゲニン標識ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を捨て、溶出溶液を添加し、数回静かにピペッティングして溶出溶液を除去した；
ｃ．酵素１シグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質１反応溶液を添加し、酵素１シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｄ．酵素２シグナル検出：基質反応溶液１を除去し、適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質２反応溶液を添加し、酵素２シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｅ．切除；基質２反応溶液を除去し、２００μｌの溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングした後に溶出バッファーを捨て、１００μｌの切除反応溶液を添加し、反応を５５℃で３分間実施し、切除反応溶液を捨て；洗浄のために２００μｌの溶出バッファーを添加し、洗浄を３回繰り返した；
ｆ．シーケンシングの次のサイクルに対してステップａ～ｅを繰り返し；合計１０ｂｐのシーケンシングを実施した。
シーケンシング工程：
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を、増幅したライブラリーの各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５℃に上昇させ、４種のｄＮＴＰが、増幅したライブラリー上に重合されるように、反応を３分間実施した。反応溶液を慎重に捨てた後、１００μｌの溶出反応溶液を添加し、数回静かにピペッティングして溶出反応溶液を除去した；
ｂ．ルシフェラーゼのライゲーション：１００μｌの酵素結合反応溶液を添加し、ＳＡ－ｇｌｕｃがビオチン標識ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ誘導体にライゲーションし、Ａｂ－Ｎｌｕｃがジゴキシゲニン標識ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を捨て、溶出溶液を添加し、数回静かにピペッティングして溶出溶液を除去した；
ｃ．酵素１シグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質１反応溶液を添加し、酵素１シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｄ．酵素２シグナル検出：基質反応溶液１を除去し、適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質２反応溶液を添加し、酵素２シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｅ．切除；基質２反応溶液を除去し、２００μｌの溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングした後に溶出バッファーを捨て、１００μｌの切除反応溶液を添加し、反応を５５℃で３分間実施し、切除反応溶液を捨て；洗浄のために２００μｌの溶出バッファーを添加し、洗浄を３回繰り返した；
ｆ．シーケンシングの次のサイクルに対してステップａ～ｅを繰り返し；合計１０ｂｐのシーケンシングを実施した。
（５）シーケンシング結果
ａ．２種の発光のシグナル値は以下のとおりであった。
ａ．２種の発光のシグナル値は以下のとおりであった。
ｂ．シーケンシング結果の解析：
発光シグナル値に従って、サイクル１及びサイクル７のみが、基質２を導入した場合にシグナルを有し、それにより、ビオチン－ｄＴＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第１及び第７の塩基はＴ塩基であると結論付けることができた；
サイクル２、サイクル４、サイクル５、及びサイクル８に関しては、基質１を導入した場合にのみシグナルが観察され、それにより、ジゴキシゲニンｄＡＴＰがこれら４つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第２、第４、第５、及び第８の塩基はＡ塩基であると結論付けることができた；
サイクル３、サイクル６、及びサイクル９に関しては、基質１及び基質２を導入した場合にシグナルが観察され、それにより、ビオチン－ジゴキシゲニンｄＣＴＰがこれら３つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第３、第６、及び第９の塩基はＣ塩基であると結論付けることができた；
サイクル１０に関しては、２種の基質を導入した場合に発光は観察されず、それにより、コールドＧがこのサイクルにおいて重合し、ライブラリーの第１０の塩基はＧ塩基であると結論付けることができた。
発光シグナル値に従って、サイクル１及びサイクル７のみが、基質２を導入した場合にシグナルを有し、それにより、ビオチン－ｄＴＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第１及び第７の塩基はＴ塩基であると結論付けることができた；
サイクル２、サイクル４、サイクル５、及びサイクル８に関しては、基質１を導入した場合にのみシグナルが観察され、それにより、ジゴキシゲニンｄＡＴＰがこれら４つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第２、第４、第５、及び第８の塩基はＡ塩基であると結論付けることができた；
サイクル３、サイクル６、及びサイクル９に関しては、基質１及び基質２を導入した場合にシグナルが観察され、それにより、ビオチン－ジゴキシゲニンｄＣＴＰがこれら３つのサイクルにおいて重合し、試験されるライブラリーの第３、第６、及び第９の塩基はＣ塩基であると結論付けることができた；
サイクル１０に関しては、２種の基質を導入した場合に発光は観察されず、それにより、コールドＧがこのサイクルにおいて重合し、ライブラリーの第１０の塩基はＧ塩基であると結論付けることができた。
要約すると、試験される配列の最初の１０塩基は：ＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧ（配列番号７）であり、この配列は、試験されるライブラリーの最初の１０ｂｐ塩基配列ＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧ（配列番号７）と１００％合致した。
実施例２
シーケンシングライブラリーの構築及びライブラリー配列の増幅は、実施例１に示されるのと同じであった。
シーケンシングライブラリーの構築及びライブラリー配列の増幅は、実施例１に示されるのと同じであった。
シーケンシング：
（１）４種のｄＮＴＰ：実施例１に示されるとおり
（２）ルシフェラーゼ及び関連タンパク質の調製
ａ．ＳＡ－Ｇｌｕｃ（ａｄｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｎｙから購入した）
ｂ．抗体（Ａｂｃａｍから購入した）、ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ＮＨＳ－ｓ－ｓ－ビオチンの使用説明書に従って、抗体をビオチン標識で標識して抗体－ｓ－ｓ－ビオチンを獲得した。
（１）４種のｄＮＴＰ：実施例１に示されるとおり
（２）ルシフェラーゼ及び関連タンパク質の調製
ａ．ＳＡ－Ｇｌｕｃ（ａｄｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｎｙから購入した）
ｂ．抗体（Ａｂｃａｍから購入した）、ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ＮＨＳ－ｓ－ｓ－ビオチンの使用説明書に従って、抗体をビオチン標識で標識して抗体－ｓ－ｓ－ビオチンを獲得した。
（３）試薬の調製
シーケンシング反応において必要とされる他の試薬の調製
重合反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ９（ＢＧＩ）、３ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ 上記４種のｄＮＴＰのそれぞれ
溶出バッファー：５×ＳＳＣ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０；
酵素結合反応溶液：上記２種のタンパク質ＳＡ－Ｇｌｕｃ及び抗体－ｓ－ｓ－ビオチンを、それぞれＴＢＳＴバッファーに希釈し、２種のタンパク質のそれぞれの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった；
基質反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ０．５ｍＭ ＮａＣｌバッファーを調製し、５０×セレンテラジン（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
酵素不活性化バッファー：５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０；
切除バッファー：２０ｍＭ ＴＨＰＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０；
シーケンシング反応において必要とされる他の試薬の調製
重合反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ９（ＢＧＩ）、３ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ 上記４種のｄＮＴＰのそれぞれ
溶出バッファー：５×ＳＳＣ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０；
酵素結合反応溶液：上記２種のタンパク質ＳＡ－Ｇｌｕｃ及び抗体－ｓ－ｓ－ビオチンを、それぞれＴＢＳＴバッファーに希釈し、２種のタンパク質のそれぞれの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった；
基質反応溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ０．５ｍＭ ＮａＣｌバッファーを調製し、５０×セレンテラジン（ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を１×に希釈した；
酵素不活性化バッファー：５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０；
切除バッファー：２０ｍＭ ＴＨＰＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０；
（４）シーケンシング反応
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を、増幅したライブラリーの各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５℃に上昇させ、反応を３分間実施して、４種のｄＮＴＰを、増幅したライブラリー上に重合させ、反応溶液を慎重に除去し、１００μｌの溶出反応溶液を添加し、数回静かにピペッティングし、溶出反応溶液を除去した；
ｂ．ルシフェラーゼのライゲーション：１００μｌのルシフェラーゼＳＡ－Ｇｌｕｃ結合反応溶液を添加し、ＳＡ－ｇｌｕｃがビオチン標識ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、溶出溶液を添加し、数回静かにピペッティングし、溶出溶液を除去した；
ｃ．第１のシグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質反応溶液を添加し、シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｄ．酵素の不活性化：基質反応溶液を除去し、酵素不活性化バッファーを添加し、３５℃で１０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、次いで溶出のために溶出バッファーを添加した；
ｅ．ルシフェラーゼの第２のライゲーション：抗体－ｓ－ｓ－ビオチン反応溶液を添加し、抗体－ｓ－ｓ－ビオチンがジゴキシゲニン標識ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングし、溶出溶液を除去し、１００μｌのＳＡ－Ｇｌｕｃ結合反応溶液を添加し、３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した後に溶出バッファーを添加し、溶出が完了した後に溶出バッファーを除去した；
ｆ．第２のシグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質反応溶液を添加し、シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｇ．切除：基質２反応溶液を除去し、２００μｌの溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングし、溶出バッファーを除去し、１００μｌの切除反応溶液を添加し、反応を５５℃で３分間実施し、切除反応溶液を除去し；洗浄のために２００μｌの溶出バッファーを添加し、洗浄を３回繰り返した；
ｈ．シーケンシングの次のサイクルに対してステップａ～ｇを繰り返し；合計１０ｂｐのシーケンシングを実施した。
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を、増幅したライブラリーの各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５℃に上昇させ、反応を３分間実施して、４種のｄＮＴＰを、増幅したライブラリー上に重合させ、反応溶液を慎重に除去し、１００μｌの溶出反応溶液を添加し、数回静かにピペッティングし、溶出反応溶液を除去した；
ｂ．ルシフェラーゼのライゲーション：１００μｌのルシフェラーゼＳＡ－Ｇｌｕｃ結合反応溶液を添加し、ＳＡ－ｇｌｕｃがビオチン標識ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、溶出溶液を添加し、数回静かにピペッティングし、溶出溶液を除去した；
ｃ．第１のシグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質反応溶液を添加し、シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｄ．酵素の不活性化：基質反応溶液を除去し、酵素不活性化バッファーを添加し、３５℃で１０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、次いで溶出のために溶出バッファーを添加した；
ｅ．ルシフェラーゼの第２のライゲーション：抗体－ｓ－ｓ－ビオチン反応溶液を添加し、抗体－ｓ－ｓ－ビオチンがジゴキシゲニン標識ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ誘導体にライゲーションするように３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去し、溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングし、溶出溶液を除去し、１００μｌのＳＡ－Ｇｌｕｃ結合反応溶液を添加し、３５℃で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した後に溶出バッファーを添加し、溶出が完了した後に溶出バッファーを除去した；
ｆ．第２のシグナル検出：適当なマイクロプレートリーダーパラメーターを設定し、基質反応溶液を添加し、シグナル検出を実施し、最も高いシグナル値を記録した；
ｇ．切除：基質２反応溶液を除去し、２００μｌの溶出バッファーを添加し、数回静かにピペッティングし、溶出バッファーを除去し、１００μｌの切除反応溶液を添加し、反応を５５℃で３分間実施し、切除反応溶液を除去し；洗浄のために２００μｌの溶出バッファーを添加し、洗浄を３回繰り返した；
ｈ．シーケンシングの次のサイクルに対してステップａ～ｇを繰り返し；合計１０ｂｐのシーケンシングを実施した。
（５）シーケンシング結果
ａ．１０ｂｐのシグナル検出の結果は以下のとおりであった。
ａ．１０ｂｐのシグナル検出の結果は以下のとおりであった。
ｂ．シーケンシング結果の解析：
サイクル１及びサイクル７に関しては、第２の検出においてのみシグナル値が獲得され、それにより、ビオチン－ｄＴＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第１及び第７の塩基はＴであると結論付けることができた；
サイクル２、サイクル４、サイクル５、及びサイクル８に関しては、第１の検出においてのみシグナルが観察され、それにより、ジゴキシゲニンｄＡＴＰがこれら４つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第２、第４、第５、及び第８の塩基はＡ塩基であると結論付けることができた；
サイクル３、サイクル６、及びサイクル９に関しては、第１の検出及び第２の検出の両方においてシグナルが生み出され、それにより、ビオチン－ジゴキシゲニンｄＣＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第３、第６、及び第９はＣ塩基であると結論付けることができた；
サイクル１０に関しては、２つのシグナル検出において光は発せられず、それにより、コールドＧがこのサイクルにおいて重合し、故に、このライブラリーの第１０の塩基はＧ塩基であると結論付けることができた。
サイクル１及びサイクル７に関しては、第２の検出においてのみシグナル値が獲得され、それにより、ビオチン－ｄＴＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第１及び第７の塩基はＴであると結論付けることができた；
サイクル２、サイクル４、サイクル５、及びサイクル８に関しては、第１の検出においてのみシグナルが観察され、それにより、ジゴキシゲニンｄＡＴＰがこれら４つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第２、第４、第５、及び第８の塩基はＡ塩基であると結論付けることができた；
サイクル３、サイクル６、及びサイクル９に関しては、第１の検出及び第２の検出の両方においてシグナルが生み出され、それにより、ビオチン－ジゴキシゲニンｄＣＴＰがこれら２つのサイクルにおいて重合し、故に、試験されるライブラリーの第３、第６、及び第９はＣ塩基であると結論付けることができた；
サイクル１０に関しては、２つのシグナル検出において光は発せられず、それにより、コールドＧがこのサイクルにおいて重合し、故に、このライブラリーの第１０の塩基はＧ塩基であると結論付けることができた。
要約すると、試験される配列の最初の１０塩基は：ＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧ（配列番号７）であり、この配列は、試験されるライブラリーの最初の１０ｂｐ塩基配列ＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧ（配列番号７）と１００％合致した。
さらなる実施形態は、以下のとおりである。
［実施形態１］
核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップの前記二重鎖が２種の異なるルシフェラーゼと接触し、ライゲーション反応を実施することを可能にし、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得；次いで、基質の存在下で前記ルシフェラーゼが発光反応を触媒し、発せられた発光シグナルを検出するステップ；
（６）各ヌクレオチドの前記分子標識を除去するステップ；
（７）任意選択で、ステップ（３）～（６）又は（３）～（５）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、方法。
［実施形態２］
ステップ（５）において、前記二重鎖が、１ステップ反応で前記２種の異なるルシフェラーゼと接触し、前記ライゲーション反応を受けるか；又はステップ（５）において、前記二重鎖が、前記２種のルシフェラーゼと逐次的に接触し、前記ライゲーション反応を受ける、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、２種の異なるルシフェラーゼを添加して前記ライゲーション反応を行うステップであって、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していないルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）各ヌクレオチドの前記分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１２）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、ステップ（３）～（１２）又は（３）～（９）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態４］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）前記第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１０）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１１）前記第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１２）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、各ヌクレオチドの前記分子標識を除去するステップ；
（１４）任意選択で、ステップ（３）～（１３）又は（３）～（１１）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態５］
前記第１のルシフェラーゼ及び前記第２のルシフェラーゼが、異なるルシフェラーゼを含有する、実施形態３又は４に記載の方法。
［実施形態６］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識に特異的に結合し得る、ライゲーション反応を実施するステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）前記ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）前記ルシフェラーゼを変性させるための試薬を添加するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１２）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１３）前記ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１４）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１５）任意選択で、各ヌクレオチドの前記分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１６）任意選択で、ステップ（３）～（１５）又は（３）～（１３）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態７］
前記第１のルシフェラーゼ及び前記第２のルシフェラーゼが、同じルシフェラーゼを含有してもよい、実施形態６に記載の方法。
［実施形態８］
前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｎ３Ｇ、又はＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ抗体、又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態９］
ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットであって、
（ａ）４種の化合物であり、前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、４種の化合物；並びに
（ｂ）２種の異なるルシフェラーゼであり、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、２種の異なるルシフェラーゼ
を含むキット。
［実施形態１０］
前記２種の異なるルシフェラーゼが、同じルシフェラーゼ又は異なるルシフェラーゼを含有し得る、実施形態９に記載のキット。
［実施形態１１］
前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｎ３Ｇ、又はＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ抗体、又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、実施形態９又は１０に記載のキット。
［実施形態１２］
サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置；前記核酸分子を前処理するための試薬；シーケンシングされる前記核酸分子を連結するための支持体；シーケンシングされる前記核酸分子を前記支持体に連結する（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に連結する）ための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ；１種又は複数のバッファー溶液；１種又は複数の洗浄溶液；或いはその任意の組合せをさらに含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載のキット。
さらなる実施形態は、以下のとおりである。
［実施形態１］
核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップの前記二重鎖が２種の異なるルシフェラーゼと接触し、ライゲーション反応を実施することを可能にし、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得；次いで、基質の存在下で前記ルシフェラーゼが発光反応を触媒し、発せられた発光シグナルを検出するステップ；
（６）各ヌクレオチドの前記分子標識を除去するステップ；
（７）任意選択で、ステップ（３）～（６）又は（３）～（５）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、方法。
［実施形態２］
ステップ（５）において、前記二重鎖が、１ステップ反応で前記２種の異なるルシフェラーゼと接触し、前記ライゲーション反応を受けるか；又はステップ（５）において、前記二重鎖が、前記２種のルシフェラーゼと逐次的に接触し、前記ライゲーション反応を受ける、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、２種の異なるルシフェラーゼを添加して前記ライゲーション反応を行うステップであって、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識と特異的にライゲーションされ得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していないルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）各ヌクレオチドの前記分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１２）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、ステップ（３）～（１２）又は（３）～（９）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態４］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）前記第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１０）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１１）前記第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１２）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１３）任意選択で、各ヌクレオチドの前記分子標識を除去するステップ；
（１４）任意選択で、ステップ（３）～（１３）又は（３）～（１１）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態５］
前記第１のルシフェラーゼ及び前記第２のルシフェラーゼが、異なるルシフェラーゼを含有する、実施形態３又は４に記載の方法。
［実施形態６］
以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、第１のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識に特異的に結合し得る、ライゲーション反応を実施するステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第１のルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）前記ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）前記ルシフェラーゼを変性させるための試薬を添加するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）第２のルシフェラーゼを添加してライゲーション反応を実施するステップであって、前記第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、ステップ；
（１２）溶出バッファーを使用することによって、結合していない第２のルシフェラーゼを除去するステップ；
（１３）前記ルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１４）任意選択で、前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１５）任意選択で、各ヌクレオチドの前記分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１６）任意選択で、ステップ（３）～（１５）又は（３）～（１３）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態７］
前記第１のルシフェラーゼ及び前記第２のルシフェラーゼが、同じルシフェラーゼを含有してもよい、実施形態６に記載の方法。
［実施形態８］
前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｎ３Ｇ、又はＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ抗体、又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
［実施形態９］
ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットであって、
（ａ）４種の化合物であり、前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル（－ＯＨ）は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、４種の化合物；並びに
（ｂ）２種の異なるルシフェラーゼであり、前記２種のルシフェラーゼは、それぞれ前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識に特異的に結合し得る、２種の異なるルシフェラーゼ
を含むキット。
［実施形態１０］
前記２種の異なるルシフェラーゼが、同じルシフェラーゼ又は異なるルシフェラーゼを含有し得る、実施形態９に記載のキット。
［実施形態１１］
前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｎ３Ｇ、又はＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体、Ｎ３Ｇ抗体、又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、実施形態９又は１０に記載のキット。
［実施形態１２］
サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置；前記核酸分子を前処理するための試薬；シーケンシングされる前記核酸分子を連結するための支持体；シーケンシングされる前記核酸分子を前記支持体に連結する（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に連結する）ための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ；１種又は複数のバッファー溶液；１種又は複数の洗浄溶液；或いはその任意の組合せをさらに含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載のキット。
Claims (8)
- 核酸分子をシーケンシングするための方法であって、以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであり；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル基は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップの前記二重鎖を２種の異なるルシフェラーゼと接触させ、結合反応を実施し、前記２種の異なるルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼからなり、第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識と特異的に結合し、第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識と特異的に結合し；次いで、基質の存在下で前記２種の異なるルシフェラーゼが発光反応を触媒し、発せられた発光シグナルを検出するステップ；
（６）各ヌクレオチドの前記分子標識を除去するステップ；及び
（７）ステップ（３）～（６）又は（３）～（５）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含み、
前記核酸分子はＤＮＡであり、
前記第１の分子標識と前記第２の分子標識とは異なるものであり、
ステップ（５）において、前記二重鎖が、１ステップ反応で前記２種の異なるルシフェラーゼと接触し、前記結合反応を受ける、方法。 - 以下のステップ：
（１）支持体に連結されたシーケンシングされる核酸分子を用意するステップ、又はシーケンシングされる核酸分子を支持体に連結するステップ；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ、及び４種の化合物を添加して、溶液相及び固相を含有する反応系を形成するステップであって；前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル基は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、ステップ；
（３）シーケンシングされる前記核酸分子に前記プライマーをアニールし、シーケンシングされる前記核酸分子と一緒に初回成長核酸鎖として前記プライマーを使用することによって、前記支持体に連結された二重鎖を形成するステップ；
（４）前記ポリメラーゼが前記ヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、前記ポリメラーゼを使用して前記ヌクレオチド重合反応を行い、それによって、前記成長核酸鎖の３’末端に前記４種の化合物の１つを組み入れるステップ；
（５）前のステップにおける前記反応系の前記溶液相を除去し、前記二重鎖を前記支持体に連結された状態に保ち、２種の異なるルシフェラーゼを添加して前記結合反応を行うステップであって、前記２種の異なるルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼからなり、第１のルシフェラーゼが前記第１の分子標識と特異的に結合し、第２のルシフェラーゼが前記第２の分子標識と特異的に結合する、ステップ；
（６）溶出バッファーを使用することによって、結合していないルシフェラーゼを除去するステップ；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（８）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（９）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、同時に発光シグナルを検出するステップ；
（１０）前のステップの反応の溶液を除去するステップ；
（１１）各ヌクレオチドの前記分子標識及び３’保護基を除去するステップ；
（１２）ステップ（１１）の反応の溶液を除去するステップ；及び
（１３）ステップ（３）～（１２）又は（３）～（９）を１回又は複数回繰り返して、前記核酸分子の配列情報を獲得するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン及びＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記４種の化合物が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶで表される化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法
。 - ポリヌクレオチドをシーケンシングするためのキットであって、
（ａ）４種の化合物であり、前記４種の化合物は、それぞれヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの誘導体であり、塩基相補的対合の能力を有し；前記４種の化合物のリボース又はデオキシリボースの３’位におけるヒドロキシル基は保護基で保護されており；
第１の化合物は第１の分子標識と連結されており、
第２の化合物は第２の分子標識と連結されており、
第３の化合物は第１の分子標識及び第２の分子標識と連結されているか、又は第３の化合物の一部は第１の分子標識と連結されており、且つ第３の化合物の別の部分は第２の分子標識と連結されており、
第４の化合物はいかなる分子標識とも連結されていない、４種の化合物；並びに
（ｂ）２種の異なるルシフェラーゼであり、前記２種の異なるルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼからなり、第１のルシフェラーゼは前記第１の分子標識と特異的に結合し、第２のルシフェラーゼは前記第２の分子標識と特異的に結合する、２種の異なるルシフェラーゼ
を含み、
前記ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、
前記第１の分子標識と前記第２の分子標識とは異なるものである、
キット。 - 前記第１の分子標識及び前記第２の分子標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン及びＦＩＴＣからなる群から選択され、第１のルシフェラーゼ及び第２のルシフェラーゼが、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン抗体又はＦＩＴＣ抗体でそれぞれ標識されている、請求項５に記載のキット。
- サンプルから核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置；前記核酸分子を前処理するための試薬；シーケンシングされる前記核酸分子を連結するための支持体；シーケンシングされる前記核酸分子を前記支持体に連結するための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；前記ヌクレオチド重合反応を実施するためのポリメラーゼ；１種又は複数のバッファー溶液；１種又は複数の洗浄溶液；或いはその任意の組合せをさらに含む、請求項５又は６に記載のキット。
- 前記４種の化合物が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶで表される化合物である、請求項５～７のいずれか一項に記載のキット
。
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