JP4230364B2 - 新しい方法 - Google Patents
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Description
一態様において、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法において;
a)該核酸分子の一本鎖型を提供し;
b)該核酸分子の該一本鎖型にプライマーをハイブリダイズして鋳型/プライマー複合体を形成し;
c)ポリメラーゼと、少なくとも一つのヌクレオチド及びその少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物とを加えることにより、酵素的にプライマーを伸長するものであって、
その少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体は切断可能な連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、
少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の混合物中において少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が1‐50モル%、1‐40モル%、1‐30モル%、又は1‐20モル%の範囲内であり、望ましくは5‐50モル%、5‐40モル%、5‐30モル%、又は5‐20モル%の範囲であり、より望ましくは10‐50モル%、10‐40モル%、10‐30モル%、又は10‐20モル%の範囲である、混合物を加えることにより、酵素的にプライマーを伸長し;
d)プライマーに付加されたヌクレオチドのタイプを決定する;
段階を含み、
上記段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す、同方法に関する。
本明細書で使用されている用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む天然若しくは修飾されたモノマー又は連鎖からなる線状オリゴマーを含み、ワトソン‐クリック型塩基対、塩基スタッキング、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型塩基対、などのようなモノマー対モノマー間相互作用の一定のパターンによりポリヌクレオチドに特異的に結合することが出来る。通常モノマーは、ホスホジエステル結合又はその類似物により連結して、モノマーの数単位、例えば3−4、からモノマーの数十単位、例えば40−60の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが"ATGCCTGG"のような文字列により示される場合は、必ず、ヌクレオチドは左から右へ5’→3'の順であり、そして"A"はデオキシアデノシン、"C"はデオキシシトシン、"G"はデオキシグアノシン、"T"はデオキシチミジンを示すと理解されている。
本発明は、既述の合成的塩基配列決定法の持つ問題を解決し、他の方法において遭遇する欠点を除いた塩基配列決定を実施することを可能にする。67%標識dCTPを使用するWO 00/53812による合成的塩基配列決定法の再現を試みる間に、取り込まれた色素標識dCTPの数とシグナルとの間の関係が、1−3塩基の範囲において直線でないことを見出した。これは、取り込まれた標識ヌクレオチドの数が増えるに従い蛍光が強くなるはずであるという予想に反するものである。さらに、色素標識され且つ切断されたdNTPに近接した標識dNTPの取り込みは、予想よりもかなり低い第二回目取り込みの信号を生じた。本発明者らは、非標識に対する標識ヌクレオチドの比率を下げることにより、標識ヌクレオチドの数の増加にしたがって増加するシグナルを得ることが可能であることを示すことができた。上記欠陥を説明するには二つの異なる方法があるように思われる、すなわち、クエンチングの問題とジスルフィド化学の問題である。
二個の色素標識分子(蛍光団のような)が極めて近接して存在する場合には、これ等の分子は相互作用して、放射光を減弱する。この現象はクエンチングと呼ばれる。全ての天然に存在する核酸では「ホモポリマー的伸長」の頻度は高い。このようなホモポリマー的伸長は、互いに短い距離の中に二つの蛍光団を配置するために、信号の減弱を生じるであろう。このように、WO 00/53812に開示された方法の大きな問題は、ホモポリマー的伸長を含むポリヌクレオチドの配列を決定する場合には、再現が困難であるという点である。
この方法は、蛍光団の除去の間におけるS-S結合の形成と切断に依拠している。C(又はA、G、U、T)は、非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を示し(及びNはこれ等の塩基のいずれかを示す)、C-SS-label(又はA-SS-label、G-SS-label、U-SS-label)は、修飾デオキシヌクレオシド三リン酸(標識-SS-dCTP)を示し、C-SH(又はA-SH、G-SH、U-SH)は、還元剤により切断された修飾デオキシヌクレオシドであり、HS-dCp(又はHS-dAp、HS-dGp、HS-dUp)を生成する。
2. デオキシヌクレオシド三リン酸の型‐異なる塩基は異なる選択性を示す。
3. 蛍光団の性質。
4. 標識及び非標識デオキシヌクレオシド三リン酸の合計濃度‐使用するポリメラーゼによっては、低い合計濃度ではDNAポリメラーゼの選択性が減少するように思われる。
5. 反応混合物中のその他の変動又はポリメラーゼが作動する近傍の環境、例えば、鋳型/プライマーが固定されている担体の性質。
1)配列決定すべきポリヌクレオチドからなる一本鎖鋳型を準備する;
2)鋳型にプライマーをハイブリダイズすることによりプライマー/鋳型複合体を形成する;
3)DNA又はRNAポリメラーゼのようなポリメラーゼの助けにより、一つの標識ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長する;
4)標識ヌクレオチドの型を決定する、或いは、標識ヌクレオチドの取り込みを検出する;
5)標識を除去又は無効化(neutraliized)する;
6)段階3‐5を反復し、それによってヌクレオチドの順序を決定する。
隣接して取り込まれたCy5−SS−dCTPを未熟切断から保護するためのチオール基のキャッピング
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型E3PN10b(配列番号4)及びE3PN22b(配列番号5)をプライマー(下記のNUSPT−フルオレッセイン(配列番号3))にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込みの2箇所の位置が含まれる。
50 pモルの鋳型を全量250 μLのアニーリング緩衝液(20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6)(ABと命名)中で30 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを250 μLのビーズスラリー及び500 μLの結合緩衝液(10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20)(BBと命名)と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ(Amersham Biosciences)上に固定した。フィルターチューブ(Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall)中でビーズを洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを500μLの2xAB(40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6)に再懸濁し、フィルタープレート(Multiscreen、Millipore)のウエルに50μLずつ分配した。
Cy5‐SS‐dCTP/dCTP混合物を使用するホモポリマー的伸長における蛍光シグナルと取り込んだ塩基の数の間の直線関係の達成
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型をプライマー(上記NUSPT-フルオレッセイン)にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込み位置が含まれる。
50 pモルの鋳型を全量250 μLのアニーリング緩衝液(20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6)中で30 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを50 μLのビーズスラリー及び500 μLの結合緩衝液(10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20)と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ(Amersham Biosciences)上に固定した。フィルターチューブ(Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall)中でビーズを洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを500μLの2xAB(40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6)に再懸濁し、フィルタープレート(Multiscreen、Millipore)のウエルに50μLずつ分配した。
5 pモルの鋳型を全量25 μLのアニーリング緩衝液(20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6)中で3 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを25 μLのビーズスラリー及び50 μLの結合緩衝液(10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1% Tween 20)と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ(Amersham Biosciences)上に固定した。フィルターチューブ(Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall)中でビーズを2xAB(40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6)で洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを50μLの2xABに再懸濁し、フィルタープレート(Multiscreen、Millipore)のウエルに移した。
Claims (18)
- a)核酸分子の一本鎖型を用意し;
b)該核酸分子の該一本鎖型に、プライマーをハイブリダイズして、鋳型/プライマー複合体を形成し;
c)ポリメラーゼと、
少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物であって、該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体が、切断しうる連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル%、1−40モル%、1−30モル%、又は1−20モル%の範囲内である該混合物と
を加えることにより、プライマーを酵素的に伸長し;
d)該プライマーに付加されたヌクレオチドの型を決定し:
e)段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す
段階を含む、核酸分子の塩基配列の決定方法。 - 該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、5‐50モル%、5−40モル%、5−30モル%、又は5−20モル%の範囲内である、請求項1に記載の方法。
- 該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、10‐50モル%、10−40モル%、10−30モル%、又は10−20モル%の範囲内である、請求項1に記載の方法。
- 該核酸分子の一本鎖型が、担体に結合されている、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
- 該結合の手段が、a)疎水性化合物、オリゴヌクレオチド、抗体又はそのフラグメント、蛋白質、ペプチド、挿入試薬、ビオチン、ストレプトアビジン又はアビジン;或いはb)アミノ‐リンカー及びエポキシ処理担体を使用する共有結合、の群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該担体が、ゲル、固形若しくは多孔性ビーズ、表面又は繊維の群から選択される請求項4に記載の方法。
- 該標識が、段階d)の後に標識と相互作用する試薬又は漂白により無効化される、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
- 該漂白が光漂白によって行われる、請求項7に記載の方法。
- 該取り込まれたヌクレオチドと該標識の間の連結が、段階d)の後に切断される、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 該蛍光団とヌクレオチドの間の連結がジスルフィド結合である、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 該切断が、還元剤を加えることにより行われ、それによりチオール基を露出する、請求項10に記載の方法。
- 該露出したチオール基が、ヨードアセトアミド又はN-エチルマレインイミドのような適当な試薬によりキャッピングされる、請求項10又は11に記載の方法。
- 該ジスルフィド架橋と塩基の間のリンカーが8原子より短い、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 段階c)がpH 7未満で、望ましくはpH 6.5未満で、より望ましくはpH 6未満で行われる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 該ヌクレオチドの誘導体が、ジデオキシヌクレオチド又は非環状ヌクレオチド類似体である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、アピラーゼ、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、スペルミジン;NP-40、Tween 20及び Triton X-100のような界面活性剤、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)又は遺伝子32のタンパク質を含むDNAの二次構造に影響する種々のタンパク質からなる群から選択される試薬が添加される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体及び少なくとも一つのヌクレオチドの混合物であって、
該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体は、切断し得る連結を介して該ヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、
該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物中において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル%、1−40モル%、1−30モル%、又は1−20モル%の範囲内であり、望ましくは5‐20モル%、5−30モル%、5−40モル%、又は5−50モル%の範囲内であり、さらに望ましくは10‐20モル%、10−30モル%、10−40モル%、又は10−50モル%の範囲内である、上記混合物と、
還元剤とを、
分離した容器中に含む、キット。 - さらに、請求項1−14のいずれかに記載の方法を実施するための、DNAポリメラーゼ、担体、キャッピング試薬、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、一本鎖結合タンパク質又は遺伝子32のタンパク質の少なくとも一つの成分を含む、請求項17に記載のキット。
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