JP2005521422A5 - - Google Patents

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(実施例1)
隣接して取り込まれたCy5−SS−dCTPを未熟切断から保護するためのチオール基のキャッピング
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型E3PN10b(配列番号4)及びE3PN22b(配列番号5)をプライマー(下記のNUSPT−フルオレッセイン(配列番号3))にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込みの2箇所の位置が含まれる。
Figure 2005521422
(実施例2)
Cy5‐SS‐dCTP/dCTP混合物を使用するホモポリマー的伸長における蛍光シグナルと取り込んだ塩基の数の間の直線関係の達成
Figure 2005521422

5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型をプライマー(上記NUSPT-フルオレッセイン)にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込み位置が含まれる。
(実施例3)
例:「指定分配」を使用する、オリゴヌクレオチドE3PN19bの塩基配列決定
Figure 2005521422
(実施例4)
標識/非標識ヌクレオチドに対するクレノーエキソDNAポリメラーゼの選択性の測定
Figure 2005521422
(実施例5)
WO 00/53812によるCy5‐SS‐dGTP/dGTP混合物を使用してホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数と蛍光シグナルの間の関係の測定
Figure 2005521422
二番目のCy5‐SS‐dCTP取り込みの蛍光に及ぼすヨードアセトアミド(IAN)とのインキュベーションの影響。二個のCy5‐SS‐dCTPは二つのオリゴヌクレオチド10b(C TGAA C)(配列番号1)及び22b(C T C)(配列番号2)において二つの異なる位置(C1及びC2)に取り込まれた。最初の取り込みに続いて、緩衝液(対照)、1 mM IAN 又は10 mM IANで処理した。 100% Cy5‐SS‐dCTP又はCy5‐dCTPを使用したクエンチング効果。蛍光シグナルはホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数の関数としてプロットされている。 20% Cy5‐SS‐dCTP及び80%の天然ヌクレオチドの反応混合物を使用してホモポリマー伸長に1から5個のCy5‐SS‐dCTPを取り込んだ後の蛍光シグナル。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比はホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数の関数としてプロットされている。 最終ヌクレオチド濃度1 μMにおいて50% Cy5‐SS‐dUTP、20% Cy5‐SS‐dCTP、30% Cy5‐SS‐dGTP、および30% Cy5‐SS‐dATPを使用したオリゴヌクレオチドE3PN19bの塩基配列決定。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は各取り込みについてプロットされている。 Cy5‐SS‐dCTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dCTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。 Cy5‐SS‐dGTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dGTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。 Cy5‐SS‐dATPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dATPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。 Cy5‐SS‐dUTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dUTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。 6.5 U シークエナーゼバージョン2.0(USB)と共に0.2 μM Cy5‐SS‐dGTP及び0.1 μM dGTPを使用してWO 00/53812に従ってホモポリマー伸長に取り込んだ1から3個のCy5‐SS‐dGTPの蛍光シグナル。
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