JP5619702B2 - 二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した方法 - Google Patents
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本発明の一様態によると、本発明は、下記の一般式1で示されて、鋳型依存的伸長反応により核酸分子を合成するための二重特異性オリゴヌクレオチドを提供する:
[式1]
5’−Xp−Yq−Zr−3’
Xpは、混成化される鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する5’−高Tm特異性部位を示して、Yqは、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Zrは、鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する3’−低Tm特異性部位を示して、p、q、及びrは、ヌクレオチドの個数であり、X、Y、及びZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであって、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記鋳型核酸に対するアニーリング特異性側面において、前記5’−高Tm特異性部位が3’−低Tm特異性部位から分離されるようにして、前記オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、5’−高Tm特異性部位及び3’−低Tm特異性部位の両方ともにより決定され、前記オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加される。
有利にするためには、5’−高Tm特異性部位のTmは、3’−低Tm特異性部位のTmより5〜70℃高く、好ましくは、10〜70℃、より好ましくは、10〜60℃、さらに好ましくは、10〜50℃、よりさらに好ましくは、10〜40℃、最も好ましくは、20〜40℃高い。
(a)DS oligoの分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、これはDS oligoにおいて最も低いTmを生成するようにして、5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成するようにする。このような非塩基対バブル構造は、アニーリング特異性側面で5’−高Tm特異性部位が3’−低Tm特異性部位から分離されるようにして;
(b)5’−高Tm特異性部位のTmが3’−低Tm特異性部位のTmより高く、分割部位は、最も低いTmを有して、この特徴は、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが発生しない厳格条件を設定することを可能にして;
(c)したがって、DS oligoの全体的アニーリング特異性は、5’−高Tm特異性部位及び3’−低Tm特異性部位により二重に決定されて;
(d)結局、DS oligoの全体アニーリング特異性は、大いに増加される。
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供する:
(a)前記二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位(5’−high Tm specificity portion)、3’−低Tm特異性部位(3’−low Tm specificity portion)、及び分割部位(separation portion)の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
(b)前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段階。
本発明のまた他の様態によると、本発明は、プライマーとして一対の二重特異性オリゴヌクレオチドを使用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも2サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記ターゲット核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記増幅反応におけるアニーリングは、前記3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、プライマーとして2つ以上の二重特異性オリゴヌクレオチド対を利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも2サイクル実施し、ターゲットヌクレオチド配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記ヌクレオチド配列の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記ターゲットヌクレオチド配列の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、同一な反応において、2つ以上のプライマー対を同時に使用し、2つ以上のターゲットヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。
上述の改善された特異性は、溶液相(solution−phase)シーケンシング(特に、サイクリング)のプライマーとして、または固相シーケンシング(特に、オリゴヌクレオチドチップシーケンシング)のプローブとして、DS oligoが直接シーケンシング(direct sequencing)に使用されるようにする。
(a)前記二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも2サイクル実施し、シーケンシングする前記核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段であって;前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記ターゲット核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、製造反応におけるアニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
(b)前記製造された相補的な核酸分子のヌクレオチド配列を決定する段階。
(a)鋳型誘導の酵素的デオキシリボヌクレイン酸合成が発生するに十分な条件で、mRNAsのポピュレーションを、mRNAのポリA末端に混成化されるオリゴヌクレオチドdTプライマーと接触させる段階;
(b)オリゴヌクレオチドdTプライマーが混成化された前記mRNAを逆転写する段階であって、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーが混成化されたmRNAに相補的な第1次cDNA鎖を生成する段階;
(c)二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも2サイクル実施し、シーケンシングする第1次cDNA鎖に相補的な核酸分子を合成する段階であって;前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記ターゲット核酸分子にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記合成反応におけるアニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
(d)前記製造された第1次cDNA鎖のヌクレオチド配列を決定する段階。
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドの鋳型依存的伸長反応により、遺伝的多様性を有する核酸分子を検出する方法を提供する:
(a)二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記鋳型核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じなく、前記5’−高Tm特異性部位及び/または前記3’−低Tm特異性部位がそのターゲット位置に対し1つ以上のミスマッチ塩基を有する場合に発生する条件でアニーリングが発生し、
(b)前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型に相補的な前記核酸分子を製造する段階と、
(c)前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記鋳型依存的伸長反応の発生有無を検出する段階。
本応用は、DS oligo固定されたマイクロアレイ上で、鋳型依存的反応を繰り返し実施してターゲットヌクレオチド配列を検出する新規な方法である。
(a)混成化、鋳型依存的伸長、及び変性過程を少なくとも1サイクル含む、基質上に固定されたプローブとしての二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長する段階であって、前記混成化は、二重特異性オリゴヌクレオチドを核酸試料に接触させることにより行われて、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、5’−高Tm特異性部位、3’−低Tm特異性部位、及び分割部位の、3つの部位を含み、前記5’−高Tm特異性部位は、混成化される前記ターゲットヌクレオチド配列の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも2つのユニバーサル塩基を含み、前記3’−低Tm特異性部位は、前記ターゲット核酸の1位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有して、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、3’−低Tm特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
(b)鋳型依存的伸長反応の発生有無を分析する段階。
マウスサイトカインファミリー遺伝子であるIL−19とIL−1ベータのターゲットヌクレオチド配列を増幅するために、本発明により開発されたDSオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。DSプライマーを利用したIL−19とIL−1ベータのターゲットヌクレオチド配列の増幅過程と結果が記載されている。
実施例で使用されたIL−19特異的従来プライマーは、次のようである(500bp):
IL19−5’−0 5’−GTCTCATCTGCTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT−3’(第1配列);及び
IL19−3’−0 5’−CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG−3’(第2配列)。
実施例で使用されたIL−1ベータ特異的従来プライマーは、次のようである(550bp):
IL1b−5’−0 5’−GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG−3’(第3配列);及び
IL1b−3’−0 5’−AGACCTCAGTGCAGGCTATGACCAATTCATCCC−3’(第4配列)。
IL19−5’ 5’−GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT−3’(第5配列);及び
IL19−3’ 5’−CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG−3’(第6配列)である。ここでIは、デオキシイノシンである。
実施例で使用されたIL−1ベータに対するDSプライマーは、次のようである(550bp):
IL1b−5’ 5’−GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG−3’(第7配列);及び
IL1b−3’ 5’−AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC−3’(第8配列)である。ここでIは、デオキシイノシンである。
本発明の二重特異性オリゴヌクレオチドは、その独特な構造により高い混成特異性及びミスマッチ許容性(tolerance)を示すことを特徴とし、これは、混成化厳格性(stringency)に依存する。DSオリゴヌクレオチドの高い混成特異性は、5’−と3’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる高い厳格条件下でなされる。その反面、DSオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容性は、制限されない一つ以上の塩基対ミスマッチが存在するにも拘らず、5’−と3’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる厳格条件下でなされる。
DEG10−5’−108: 5’−TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCGATG−3’(第9配列);
DEG10−5’−103: 5’−TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTGCCATC−3’(第10配列);
DEG10−5’−102: 5’−TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATC−3’(第11配列);
DEG10−5’−101: 5’−TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATG−3’(第12配列);
DEG10−5’−158: 5’−TGTACTTATGCGTATCGTCCIIIIICTCCGATG−3’(第13配列);
DEG10−5’−138: 5’−TGTACTTTTGCGTTTCGTCCIIIIICTCCGATG−3’(第14配列);及び
DEG10−5’−128: 5’−TGTAGTTATGGGTATCCTCCIIIIICTCCGATG−3’(第15配列)である。
ここで、置換されたヌクレオチドは、下線とボールド体で表示して、Iは、デオキシイノシンを示す。
上記説明した通り、逆転写酵素により第1次cDNA鎖を合成するために、ICRマウスの17.5−dpc(E17.5)胎盤組織から総RNAを分離及び利用した(Hwang,I.T.,et al.,(2003)Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques 35:1180−1184)。総RNAを、次のように組成された反応容量20μlで、42℃で1.5時間逆転写反応を実施した:総RNA3μl、5×緩衝液(Promega, USA)4μl、dNTPs 5μl(それぞれ2mM)、10μM cDNA合成プライマー2μl(oligo(dT)20−Adapter)、RNase阻害剤(40units/μl,Promega)、及び逆転写酵素1μl(200 units/μl, Promega)。超精製されたH2O 180μlを入れて、第1次cDNA鎖を希釈した。cDNA合成プライマーのオリゴ(dT)18 −ACP1は、5’−CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)18−3’であり、ここで、Iはデオキシイノシンである。
DEG10の3’−RACEを実施するためのサンプルDSプライマー、鋳型及びPCR条件を実施例2Aと同一にして、アニーリング温度は異ならせた。次の条件でPCR増幅を実施した:94℃で5分、60℃で3分、及び72℃で3分の過程を1回実施;その後94℃で40秒、65℃で1分、及び72℃で40秒の過程を29回繰り返して実施、及び72℃で7分間最終伸長サイクル。
1)アニーリングが5’−高Tm特異性部位と3’−低Tm特異性部位との両側部分で発生する場合でのみ、DSプライマーは、鋳型と相補的な核酸分子を合成するために伸長されて(レーン1);しかしながら、
2)アニーリングが3’−低Tm特異性部位ではなく、ただ5’−高Tm特異性部位で発生する場合は、DSプライマーは、鋳型に相補的な核酸分子を合成するために伸長されず(レーン2〜4);そして、
3)3’−低Tm特異性部位の配列が鋳型と完璧にマッチされる場合でさえも、高い厳格条件下では、3’−低Tm特異性部位のみではアニーリングが発生しない(レーン5〜7)。アニーリング部位と関連し、DSプライマーは、初期PCR段階で3’−末端部位のみがアニーリングされる場合に伸長されるアニーリング調節プライマー(ACP)と明らかに違う(Hwang,I.T.,et al.,(2003)Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification.BioTechniques 35:1180−1184)。
単一塩基区別に対するDSオリゴヌクレオチドの二重特異性を証明するために、マウス胎盤特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるPsx1とPsx2のcDNAsを、従来のプライマーまたはDSプライマーのいずれか一つを使用して増幅した。2つのPsx cDNAs間の全体配列相同性は、ヌクレオチド水準で91%であった(Han,Y.J.,et al.,(2000)Identification and characterization of Psx2,a novel member of the Psx(placenta−specific homeobox)family.Gene 241:149−155)。一つまたは二つの塩基差によりPsx1とPsx2が区別されるように、5’−プライマーをデザインした(図7A)。しかし、3’−プライマーは、2つのPsx cDNAsの保存された配列を有するようにデザインした。Psx1−とPsx2−特異的従来及びDSプライマー配列は次のようである:
Psx1−5’−10: 5’−AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTAGCT−3’ (第16配列);
Psx2−5’−10: 5’−AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTGGCC−3’ (第17配列);
Psx1−5’−11: 5’−AAGGAAGACATGCTGGTGATIIIIITTCTAGCT−3’ (第18配列);
Psx2−5’−11: 5’−AAGGAAGACATGCTGGTGATIIIIITTCTGGCC−3’ (第19配列);
Psx1−5’−40: 5’−TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATGTGA−3’ (第20配列);
Psx2−5’−40: 5’−TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATCTGA−3’ (第21配列);
Psx1−5’−41: 5’−TCTTGCACGATGGATGGGTGIIIIIGAAIGIGA−3’ (第22配列);
Psx2−5’−41: 5’−TCTTGCACGATGGATGGGTGIIIIIGAAICIGA−3’ (第23配列);及び
Psx−3’−2: 5’−TTCATCCACACCCATCCATCIIIIIAGATCCCT−3’ (第24配列)、
ここで、Psx1−またはPsx2−特異的ヌクレオチドは、下線とボールド体で示した。
3’−RACEとPsx cDNAのターゲットPCRの出発物質として、実施例2で合成されたマウス胎盤の第1次cDNA鎖を使用した。
希釈された1次cDNA鎖2μl(30ng)、15mM MgCl2を含む10×PCR緩衝溶液(Roche)2μl、dNTP(dATP, dCTP, dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)2μl、5’−Psx1−と5’−Psx2−特異的DSまたは従来プライマー(10μM)1μl 、オリゴ(dT)15−ACP2(10μM)1μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl; Roche)0.5μlを含む最終容量20μlでPsx1及びPsx2の3’−RACEを行って;反応混合物を含むチューブを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置して;サンプルを94℃で5分間変性させて、94℃で1分、60〜65℃で1分、72℃で1分の過程を30回繰り返した後、72℃で7分間恒温処理した。
希釈された1次cDNA鎖2μl(30ng)、15mM MgCl2を含む10×PCR緩衝溶液(Roche)2μl、dNTP(dATP, dCTP, dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)2μl、5’−Psx1−または5’−Psx2−特異的DSプライマーまたは従来プライマー(10μM)1μl 、Psx−3’−2(10μM)1μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl; Roche)0.5μlを含む最終容量20μlでPsx1及びPsx2のターゲットPCR増幅を行って;反応混合物を含むチューブを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置して;サンプルを94℃で5分間変性させて、94℃で1分、60〜65℃で1分、72℃で1分の過程を30回繰り返した後、72℃で7分間恒温処理した。
新しいcDNAを同定して分離しようとする殆どの試みは、mRNA配列の一部分だけを代表するクローンを得るような結果を招来する。一応部分配列を確認したら、転写体の残りの部分は、典型的なcDNAライブラリースクリーニングまたはRACE(cDNA末端高速増幅)のようなPCRに基づいた方法によりしばしば得るようになり、その後、その得られたcDNAをシーケンシングするようになる。したがって、現在の全ての方法は、転写体の残りの部分に対する配列情報を得るための必須段階である。もしミッシング(missing)配列情報を、ターゲット細胞から得たcDNAポピュレーションから直接得れば、このような時間消費的な必須過程を完全に回避するようになり、かつ粗生物試料(crude biological sample)からターゲットcDNA配列を直接的に決定することができる。
Psx cDNAsを直接シーケンシングするために、鋳型として実施例2で合成されたマウス胎盤の第1次cDNA鎖を使用した。
希釈した第1次cDNA鎖13μl(150ng)、ABI PRISM Big Dye Terminator反応混合物(Applied Biosystems,USA)2μl、5×シーケンス緩衝液(Appled Biosystems)2μl、及び5’−Psx1−または5’−Psx2−特異的DSプライマー(1μM)1.6μlを含む最終容量20μlでサイクルシーケンシング反応を実施し;反応混合物を含むチューブを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置して;サンプルを94℃で5分間変性させて、94℃で10秒、50〜60℃で3分、及び60〜65℃で4分の過程を40〜50回繰り返した。シーケンシング産物を次のように精製した。1)3Mのアセト酸ナトリウム(pH4.6)2μlと、新鮮で且つ冷たい100%EtOH 50μlを添加、2)30分間75℃に維持、3)13,000gで15〜30分間遠心分離及び上清液の除去、4)70%EtOH 200μlで洗浄、5)13,000gで15〜30分間遠心分離及び上清液を除去及び乾燥。シーケンシング産物をABI PRISM 3100遺伝分析器で分析する直前にHiDiホルムアミド10μlでペレットを再懸濁した。
マルチプレックスPCRにおいて、DSオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、9個の異なるサイトカインファミリー遺伝子をDSプライマーで増幅した。DSプライマーを利用したマルチプレックスPCR増幅の方法及び結果をここに説明した。各サイトカイン遺伝子の最も長いエキソン配列を利用して、50bpラダー(ladder)を生成するようにサイトカインファミリー遺伝子特異的DSプライマーをデザインした。
IL3−5’ 5’−GCTGCCAGGGGTCTTCATTCIIIIICTGGATGA−3’ (第25配列);及び
IL3−3’ 5’−GGCCATGAGGAACATTCAGAIIIIIGGTGCTCT−3’ (第26配列)。
実施例で使用されたIL−15に対するDSプライマーは、次のようである(250bp):
IL15−5’ 5’−ATGTAGCAGAATCTGGCTGCIIIIIATGTGAGG−3’ (第27配列); 及び
IL15−3’ 5’−ATGTGATCCAAGTGGCTCATIIIIICCTTGTTAGG−3’ (第28配列)。
実施例で使用されたIL−18に対するDSプライマーは、次のようである(300bp):
IL18−5’ 5’−AGGAAATGGATCCACCTGAAIIIIITGATGATATA−3’ (第29配列); 及び
IL18−3’ 5’−ATGGAAATACAGGCGAGGTCIIIIIAAGGCGCA−3’ (第30配列)。
実施例で使用されたIL−25に対するDSプライマーは、次のようである(350bp):
IL25−5’ 5’−AGCTCTCCAAGCTGGTGATCIIIIICAAGGCGG−3’ (第31配列) ; 及び
IL25−3’ 5’−GAGCTGCCCTGGATGGGGTTIIIIIGTGGTCCT−3’ (第32配列)。
実施例で使用されたIL−2に対するDSプライマーは、次のようである(400bp):
IL2−5’ 5’−CTCTGACAACACATTTGAGTGCIIIIICGATGATGAG−3’ (第33配列); 及び
IL2−3’ 5’−GTGCTGTCCTAAAAATGACAGAIIIIIGAGCTTATTT−3’ (第34配列)。
実施例で使用されたIL−6に対するDSプライマーは、次のようである(450bp):
IL6−5’ 5’−CCAATGCTCTCCTAACAGATAAIIIIIAGTCACAGAA−3’ (第35配列); 及び
IL6−3’ 5’−AGGTAAACTTATACATTCCAAGAAAIIIIITGGCTAGG−3’ (第36配列)。
実施例で使用されたIL−19に対するDSプライマーは、次のようである(500bp):
IL19−5’ 5’−GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT−3’ (第5配列); 及び
IL19−3’ 5’−CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG−3’ (第6配列)。
実施例で使用されたIL−1ベータに対するDSプライマーは、次のようである(550bp):
IL1b−5’ 5’−GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG−3’ (第7配列); 及び
IL1b−3’ 5’−AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC−3’ (第8配列)。
実施例で使用されたIL−10に対するDSプライマーは、次のようである(600bp):
IL10−5’ 5’−AAGGCCATGAATGAATTTGAIIIIITCATCAACTG−3’ (第37配列); 及び
IL10−3’ 5’−TGACAGTAGGGGAACCCTCTIIIIIGCTGCAGG−3’ (第38配列)。
マウスゲノムDNA2μl(50ng)、15mM MgCl2を含む10×PCR緩衝液(Roche)2μl、dNTP(dATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)2μl、各サイトカインファミリー遺伝子特異的5’DSプライマー(10μM)1μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl;Roche)0.5μlを含む最終容量20μlで、それぞれのサイトカインファミリー遺伝子に対する単一ターゲットPCR増幅を行って;反応混合物を含むチューブを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置して;サンプルを94℃で5分間変性させて、94℃で1分、60〜65℃で1分、72℃で1分の過程を30回繰り返した後、72℃で7分間恒温処理した。
サイトカインファミリー遺伝子特異的DSプライマー9セットを利用して単一のチューブでマルチプレックスPCR増幅を実施し:マウスゲノムDNA 100ng、15mM MgCl2を含む10×PCR緩衝液(Roche)5μl、dNTP(dATP, dCTP, dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)5μl、各サイトカインファミリー遺伝子特異的5’DSプライマー(0.2〜5μM)1μl、各サイトカインファミリー遺伝子特異的3’DSプライマー(0.2〜5μM)1μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl; Roche)0.5μlを含む最終容量50μlで反応混合物を製造し;反応混合物を含むチューブを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置して;PCR条件は、94℃で5分、50℃で3分、及び72℃で3分の過程を1回行った後;94℃で40秒、60℃で1分、及び72℃で40秒の過程を29回繰り返し、72℃で5分間最終伸長サイクル。
ミスマッチ許容において、DSオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、診断試料内のヒトメタニューモウイルス(hMPV)を検出するために、DSプライマーを利用した。DSプライマーを利用してヒトメタニューモウイルスを検出する方法と結果をここに説明した。本実施例は、特定の一つのウイルスを検出するに本発明の適用が限定されるように解釈されてはならない。
hMPV 5’−585 5’−AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIIIICTAAATGTTG−3’ (第39配列);
hMPV 3’−698 5’−AACATCAITTTTATITGTCCTGCAIIIIITGGCATGT−3’ (第40配列);及び
hMPV 3’−1007 5’−TTGAITGCTCAGCIACATTGATIIIIICWGCTGTGTC−3’ (第41配列)。
ここで、Wは、AまたはTであり、Iは、デオキシイノシンである。
DNA合成機(Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI))を利用して、標準プロトコールにしたがって、ターゲット核酸分子の一領域に相補的なDSオリゴを合成する。マイクロアレイのために、ガラススライドに、合成されたDSオリゴを固定する。その後、DNA試料50〜200ng、10×PCR緩衝液(Promega)5μl、15mM MgCl25μl、蛍光標識されたdNTP(dATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)5μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl;Promega)0.5μlを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する:94℃で5分間変性させた後、94℃で1分、50〜65℃で1〜3分、及び60〜72℃で1〜4分の過程を15〜50回繰り返した後、72℃で5分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたDSオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
DNA合成機(Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI))を利用して、標準プロトコールにしたがって、3’−低Tm特異性部位の中央に多形性塩基(疑問位置)が位置したDSオリゴを合成する。マイクロアレイを行うために、合成されたオリゴヌクレオチドをガラススライドに固定する。その後、DNA試料50〜200ng、10×PCR緩衝液(Promega)5μl、15mM MgCl25μl、蛍光標識されたdNTP(dATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ2mM)5μl、及びTaq重合酵素(5unit/μl;Promega)0.5μlを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された(94℃)熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する:94℃で5分間変性させた後、94℃で1分、50〜65℃で1〜3分、及び60〜72℃で1〜4分の過程を15〜50回繰り返した後、72℃で5分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたDSオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
Claims (13)
- 下記一般式1で示されアニーリング特異性を増加させる2つの二重特異性オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも2サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含むことを特徴とする、DNA又は核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
[式1]
5’−Xp−Yq−Zr−3’
Xpは、アニーリングされる鋳型核酸配列の1位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する5’−高Tm特異性部位を示し、Yqは、少なくとも3つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Zrは、前記鋳型核酸配列の1位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する3’−低Tm特異性部位を示し、p、q、及びrは、ヌクレオチドの個数であり、前記pは15乃至40の整数であり、前記qは少なくとも3の整数であり、rは3乃至15の整数であり、X、Y、及びZは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記5’−高Tm特異性部位のTmは、前記3’−低Tm特異性部位のTmより高く、前記分割部位は、3つの部位のうち、最も低いTmを有し、前記5’−高Tm特異性部位は、前記3’−低Tm特異性部位より長さが長く、前記分割部位は、前記5’−高Tm特異性部位と前記3’−低Tm特異性部位が前記鋳型核酸配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対構造を形成し、前記鋳型核酸配列に対するアニーリング特異性の観点において、前記5’−高Tm特異性部位が前記3’−低Tm特異性部位から分離されるようにして、前記二重特異性オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、前記5’−高Tm特異性部位及び前記3’−低Tm特異性部位の両方ともにより決定され、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加され、
前記増幅させる段階中のアニーリングが、前記3’−低Tm特異性部位のみでアニーリングが起こらない条件下で行われ、前記増幅させる段階の1サイクル目及び2サイクル目が、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記5’−高Tm特異性部位と前記3’−低Tm特異性部位の前記ターゲット核酸配列へのアニーリングを引き起こす。 - アニーリングが、45℃〜68℃の温度で実施される請求項1に記載の方法。
- 分割部位の前記ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、イノシン、7−デアザ−2’−デオキシイノシン、2−アザ−2’−デオキシイノシン、2’−OMeイノシン、2’−Fイノシン、デオキシ3−ニトロピロール、3−ニトロピロール、2’−OMe3−ニトロピロール、2’−F3−ニトロピロール、1−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール、デオキシ5−ニトロインドール、5−ニトロインドール、2’−OMe5−ニトロインドール、2’−F5−ニトロインドール、デオキシ4−ニトロベンズイミダゾール、4−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ4−アミノベンズイミダゾール、4−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2’−Fネブラリン、2’−F4−ニトロベンズイミダゾール、PNA−5−イントロインドール、PNA−ネブラリン、PNA−イノシン、PNA−4−ニトロベンズイミダゾール、PNA−3−ニトロピロール、モルフォリノ−5−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−4−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−3−ニトロピロール、ホスホルアミデート−5−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−4−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−3−ニトロピロール、2’−O−メトキシエチルイノシン、2’−O−メトキシエチルネブラリン、2’−O−メトキシエチル5−ニトロインドール、2’−O−メトキシエチル4−ニトロ−ベンズイミダゾール、2’−O−メトキシエチル3−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、1−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−3−ニトロピロール、又は5−ニトロインドールである請求項3に記載の方法。
- ユニバーサル塩基が、デオキシイノシンである請求項4に記載の方法。
- 3’−低Tm特異性部位は、アニーリングされる鋳型核酸の前記位置に対し、完璧に相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する請求項1に記載の方法。
- pが、15乃至25の整数である請求項1に記載の方法。
- qが、3乃至10の整数である請求項1に記載の方法。
- pが、15乃至25の整数であり、qが、3乃至10の整数であり、rが、3乃至15の整数である請求項1に記載の方法。
- 5’−高Tm特異性部位のTmが、40℃〜80℃である請求項1に記載の方法。
- 3’−低Tm特異性部位のTmが、10℃〜40℃である請求項1に記載の方法。
- 分割部位のTmが、3℃〜15℃である請求項1に記載の方法。
- ターゲット核酸配列が、2以上のターゲット核酸配列を含み、プライマーセットが、2以上のプライマーセットを含み、マルチプレックス増幅に用いられる請求項1に記載の方法。
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