CN102762745A - 排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测 - Google Patents

排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测 Download PDF

Info

Publication number
CN102762745A
CN102762745A CN2010800643557A CN201080064355A CN102762745A CN 102762745 A CN102762745 A CN 102762745A CN 2010800643557 A CN2010800643557 A CN 2010800643557A CN 201080064355 A CN201080064355 A CN 201080064355A CN 102762745 A CN102762745 A CN 102762745A
Authority
CN
China
Prior art keywords
time
mentioned
real
nucleic acid
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800643557A
Other languages
English (en)
Inventor
千钟润
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seegene Inc
Original Assignee
Seegene Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seegene Inc filed Critical Seegene Inc
Publication of CN102762745A publication Critical patent/CN102762745A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测。与以往实时多重PCR方法不同地，本发明在互不相同的反应容器包含两个不同的扩增反应。即为用于获取扩增子的第一次多重PCR及利用上述扩增子的第二次套式实时多重PCR。本发明用于排除由于形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号、基于非特异性杂交的假阳性信号以及假阴性信号。

Description

排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测
【技术领域】
本发明涉及一种排除错误信号（false signals）的靶核酸序列的检测。
【背景技术】
用于检测靶核酸的大部分技术包括靶核酸的扩增过程。核酸扩增是在分子生物学领域中所利用的必须的过程，并对此提出了多种扩增方法。例如，密勒（Miller）、H.I.等（WO89/06700）公开了包括将助催化剂/引物序列与靶单链DNA（"ssDNA"）杂交之后，转录上述序列的许多RNA复制过程的核酸序列扩增方法。
公知为聚合酶连锁反应（以下简称为“PCR”）的最为广泛利用的核酸扩增方法包括双链DNA的变性、向DNA模板进行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延长的反复的循环过程（Mullis等，美国专利第4，683，195号，第4，683，202号以及第4，800，159号；Saiki等，（1985）Science 230，1350-1354）。
基于聚合酶链式反应（PCR）的技术不仅利用在靶DNA序列的扩增，还广泛地利用在生物学和医学研究领域中的科学应用或方法中，例如，反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）、分别表示（DifferentialDisplay）-聚合酶链式反应（DD-PCR）、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、cDNA末端的高速扩增（RACE）、任意的引发-聚合酶链式反应（AP-PCR）、多重PCR、单核苷酸多态性（SNP）基因组分型以及基于PCR的基因组分析等（McPherson and Moller，2000）PCR.BIOS Scientific Publishers，Springer-Verlag New York BerlinHeidelberg，NY）。
另一方面，作为基于核酸扩增检测靶核酸的方法，正在开发出多种实时PCR方法。实时PCR方法能够实时检测靶的扩增产物，或者可实现更加正确的定量分析，在不存在污染问题的层面上备受瞩目。实时PCR方法，通常在扩增反应期间，使用可产生用于表示靶核酸序列存在的信号的、标记的寡核苷酸或DNA-结合染料（dye）。
作为代表性DNA-结合染料的荧光染料（SYBR Green）插入到双链DNA之间呈现荧光。但是，由于SYBR Green以非特异性插入到DNA链之间的可能性高，因而不适合做特异性靶检测。更严重的问题在于，当将SYBR Green技术应用于实时多重检测时，需要通过解链曲线分析（melting curve analysis）来鉴定扩增产物，因此被视为在时间及效率分析层面上不适合应用。
大部分的实时PCR方法使用标记寡核苷酸。以往的实时PCR方法在如下方面具有固有的特征：（i）标记寡核苷酸（引物或探针）的使用，（ii）标记寡核苷酸的特定形态或结构的形成（例如，发夹环结构）（iii）与寡核苷酸结合的标记的数量，（iv）信号的产生原理，或者（v）所利用的核酸聚合酶的性质。作为代表性的例子包括：拖慢探针（TaqManTM probe）方法（美国专利第5,210,015号）、分子信标（Molecular Beacon）方法（Tyagi等，Nature Biotechnology v.14MARCH 1996）、蝎形引物（Scorpion）方法（Whitcombe等，NatureBiotechnology 17:804-807（1999））、发卡式引物（Sunrise或Amplifluor）方法（Nazarenko等，2516-2521 Nucleic Acids Research,25（12）:2516-2521（1997）,及美国专利第6,117,635号）、力士（Lux）方法（美国专利第7,537,886号）、CPT（Duck P,等，Biotechniques,9:142-148（1990））、LNA方法（美国专利第6,977,295号）及叩诊槌（Plexor）方法（Sherrill CB,等，Journal of the American ChemicalSociety,126:4550-4556（2004））。
随着实时PCR方法的开发，公开一种能够同时检测多个靶核酸序列的实时多重PCR方法。实时多重PCR方法在如下的观点具有合理的优点：时间-有效性、比体积-有效性、方便性及高速-大量的动作性（R.N.Gunson,等,Journal of Clinical Virology,43:372-375（2008））。
尽管如此，以往的实时多重PCR方法的引物或探针产生非特异性杂交的可能性高（R.N.Gunson,等,Journal of Clinical Virology,43:372-375（2008））。就基于标记引物的实时多重PCR而言，由于标记引物形成二聚物（dimer），导致产生假阳性信号，因而被视为主要问题。
与实时多重PCR过程的动作相关而产生的假阳性信号实质性地被去除或者完全被去除的情况下，实时多重PCR方法将会成为同时检测多个靶核酸序列的最有发展前景的技术。
在本说明书全文中，参照多篇专利及文献，并用括号来标记其引用。这些专利及文献作为参照整体包括在本说明书中，有助于更加明确地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。
【发明概述】
本发明者为了开发出用于实时检测基于以往标记的实时多重PCR（polymerase chain reaction）方法期间，彻底排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，由此能够对多个靶核酸序列进行实时多重检测的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明者公开了通过实施对至少三种的核酸序列进行第一次多重-扩增来获取扩增子，并借助利用标记套式引物的套式实时多重PCR来扩增上述扩增子的方式，检测至少三种靶核酸序列的方法。本发明者确认了，上述新颖的方法彻底排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，并且通过更加改善的灵敏度及特异度，以实时多重方式检测多个靶核酸序列。
因此，本发明的目的在于，提供一种对于在实时多重PCR中排除错误信号（false signals）的至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法。
本发明的再一目的在于，提供一种用于在实时多重PCR中排除错误信号（false signals）的至少三种靶核酸序列的实时多重PCR检测的试剂盒。
本发明的其他目的及优点，通过所附的权利要求及附图，以及下面的详细说明将变得更加明确。
【附图说明】
图1表示关于第一次多重PCR及第二次套式实时多重PCR的本发明。图案A表示第一次多重PCR。正向引物及反向引物与靶核酸序列杂交而延长。通过反复进行包括变性、退火及延长的PCR循环，来扩增多个靶核酸序列。第一次多重PCR用引物均可具有本技术领域中公知的任何类型或结构（例如，DPO（dual priming olgionucleotide）结构及以往结构）。图案B表示利用标记套式引物的第二次套式实时多重PCR。具有至少一个标记的正向引物及反向引物中，至少一个引物是与通过第一次多重PCR获得的相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。作为在第二次套式实时多重PCR中可利用的代表性引物，包含具有单一标记或者双重标记系统的TSG引物、THD引物、蝎形引物、发卡式引物、勒克司、叩诊槌以及反引物。利用标记套式引物的第二次套式实时多重PCR，在产生靶信号但不产生假阳性信号的条件下实施反应循环，以排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，由此可提供表示靶核酸序列存在的充足的信号。并且，本发明的方法提高PCR靶特异性及灵敏度。
图2表示利用用于检测C.trachomatis、N.gonorrhoeae及T.vaginalis的三种一对引物来实施的以往实时多重PCR方法的结果。以往方法因形成标记引物的二聚物而产生假阳性信号。
图3表示利用用于检测C.trachomatis、N.gonorrhoeae及T.vaginalis的三种一对引物来实施的本发明的套式实时多重PCR方法的结果。该结果显示，第二次套式实时多重PCR实施30循环，来获得排除假阳性信号的、用于表示靶核酸存在的阳性信号。
图4表示利用用于检测H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplex virus 2的三种一对引物来实施以往实时多重PCR方法的结果。以往方法因形成标记引物的二聚物而产生假阳性信号。
图5表示利用用于检测H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplex virus 2的三种一对引物来实施的套式实时多重PCR方法的结果。该结果显示，第二次套式实时多重PCR实施30循环，来获得排除假阳性信号的、用于表示靶核酸存在的阳性信号。
图6是表示本发明的套式实时多重PCR方法的灵敏度及特异性的结果。以30循环实施的第二次套式实时多重PCR利用用于检测H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplex virus 2的三种一对引物来实施。将依次稀释到10-倍的H.ducreyi的基因组DNA（从1000fg稀释到1fg）用作模板。
图7是表示本发明的套式实时多重PCR方法的灵敏度及特异性的结果。以30循环实施的第二次套式实时多重PCR利用用于检测H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplex virus 2的三种一对引物来实施。将依次稀释到10-倍的Herpes simplex virus 1的基因组DNA（从1000fg稀释到1fg）用作模板。
图8表示为了检测H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpessimplex virus 2而实施的本发明的套式实时多重PCR方法的结果。将H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplex virus 2的基因组DNA用作模板。
【发明详述】
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种在实时多重PCR（real-time multiplex Polymerase Chain Reaction）排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多路检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），在反应容器实施用于扩增上述靶核酸序列的第一次多重PCR，为了在上述试样中获取上述靶核酸序列的扩增子，在能够扩增至少三种的靶核酸序列的条件下，利用至少三种的一对引物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施上述第一次多重PCR；
步骤（b），在与上述步骤（a）中所使用的反应容器不同的反应容器准备第二次套式实时多重PCR反应混合物，上述第二次套式实时多重PCR反应混合物包含：（i）在上述步骤（a）中获取的扩增子，（ii）用于上述扩增子的第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物，在上述至少三种的各个一对引物中，至少一个引物是与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，以及（iii）模板-依赖性核酸聚合酶，上述至少三种的各个一对引物包含至少一个套式引物，上述至少一个套式引物具有在上述第二次套式实时多重PCR期间产生用于表示靶核酸序列的存在的信号的标记；
步骤（c），利用上述步骤（b）的上述反应混合物，并通过至少2循环来实施引物退火、引物延长及变性，由此实施上述第二次套式实时多重PCR，用于表示上述靶核酸序列存在的上述信号在循环期间从上述各个标记引物中产生，上述第二次套式实时多重PCR能够以产生用于表示靶核酸序列的信号，而不产生错误信号的循环数来实施；以及
步骤（d），检测用于表示靶核酸序列的存在的信号，上述检测在步骤（c）的上述反复的各循环中，在步骤（c）的上述反复的终点或者步骤（c）的上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，据此表示上述靶核酸序列的上述信号通过实时方式得到获取，且不产生错误信号。
一般而言，当实施为了同时检测多个靶序列而利用标记探针或引物的以往实时PCR技术时，会引发严重的问题。例如，利用标记探针（labeled probe）的方法，为了实现扩增及检测，分别需要引物及探针等多个寡核苷酸。因此，十分难以决定作为引物及探针的寡核苷酸的合适的序列，并且，也难以实现实时多重PCR的反应条件的最优化。况且，这种方法因形成寡核苷酸的二聚物或者因非特异性杂交而产生假阳性信号的可能性较高。因此，基于探针的实时PCR方法被视为不适合同时检测多个靶序列。
并且，利用标记引物（labeled primer）的以往的实时PCR接近法在靶序列的实时检测中，出现与引发假阳性信号产生的标记引物的二聚物形成相关的不可避免的缺点。尤其是，这种问题在用于同时检测多个靶序列的实时多重PCR中变得更加严重。由于实时多重PCR需要多个标记引物，因而因形成这种标记引物的二聚物而产生假阳性信号的可能性较高。
进而，当靶核酸序列以非常少的量存在或者不存在时，非常难以决定从基于标记引物的实时多重PCR中获得的信号是否为因存在靶核酸序列而产生的假阳性信号或者因形成标记引物的二聚物而产生的错误信号。
另一方面，标记引物的序列选择通常作为用于避免二聚物形成问题的战略而被利用。然而，这种战略在彻底排除二聚物问题的方面上依然具有局限性。
本发明者为了开发出在实施基于以往标记引物的实时多重PCR（polymerase chain reaction）方法期间，彻底排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，能够对多个靶核酸序列进行实时多重检测的新颖的接近法而锐意努力研究。其结果，本发明者公开了通过实施对至少三种的核酸序列进行第一次多重-扩增来获取扩增子，并借助利用标记套式引物（labeled nested primer）的套式实时多重PCR来扩增上述扩增子的方式，检测至少三种靶核酸序列的方法。本发明者确认了，新颖的方法彻底排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，以实时多重方式检测多个靶核酸序列。
本发明者首次公开了，可通过排除或区分因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号的套式实时方式，利用至少三种标记套式引物来同时检测至少三种靶核酸序列。
排除（或者去除）因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号是基于以下三种战略的绝妙的组合。第一战略是多个靶核酸序列的预-扩增，这应当与实时产生信号的过程分开实施。第二战略利用与通过预-扩增来产生的相关扩增子的内部序列杂交的标记套式引物。第三战略限制实时多重PCR反应的循环数，直至产生靶信号但不产生基于二聚物形成的假阳性信号。
在本发明中，靶核酸序列首先通过第一次多重PCR来进行预-扩增，随后，扩增子在第二次套式实时多重PCR中用作模板。由于预-扩增增加靶核酸序列的量，相对于第二次套式实时多重PCR期间的靶核酸序列的信号的循环阈值（threshold cycle,Ct）比无预-扩增的条件下获取的Ct值更低。相反，因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号的Ct值与预-扩增的利用无关地不发生变化。因此，这种现象致使用于表示靶核酸序列的存在的信号在产生假阳性信号之前产生，结果，用于区分阳性靶信号和假阳性信号。
当第一次多重PCR用引物用作第二次实时多重PCR用标记引物时，借助在第一次多重PCR期间产生的非特异产物或二聚物产物和标记引物之间的相互作用来产生假阳性信号的可能性较高。相反，当第二次实时多重PCR用标记引物为与通过第一次多重PCR产生的相关扩增子的内部序列杂交的套式引物时，避免第一次多重PCR的非特异产物或二聚物产物和标记套式引物之间的相互作用，由此从根本上防止这种假阳性信号。
最终，本发明的第二次套式实时多重PCR的循环数被限制成虽然产生多个靶信号但不产生基于二聚物形成的假阳性信号。因此，通过限制循环数，排除因形成二聚物而产生的假阳性信号，结果检测用于表示靶核酸序列的存在的阳性信号。
并且，本发明者发现了，假阳性信号，例如在以往实时多重PCR中基于标记引物的二聚物形成的假阳性信号在30循环之后产生的可能性较高。因此，本发明者确认了，通过以最大30循环来实施第二次套式实时多重PCR来防止因形成二聚物而产生的假阳性信号。由于本发明的第二次套式实时多重PCR通过利用预-扩增的靶核酸序列来实施，因而，本发明者发现了，用于表示靶核酸序列的存在的信号在30循环以内获取。
根据本发明，第二次套式实时多重PCR通过利用至少三种的一对引物来实施，在至少三种的各个一对引物中，至少一个引物是与通过第一次多重扩增来获得的相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，这将带来提高特异性及灵敏度等套式PCR效果。第二次套式实时多重PCR产生与以往套式PCR的第二轮PCR类似的效果。即，本发明的第一次多重PCR相当于以往套式PCR的第一轮PCR，本发明的第二次套式实时多重PCR相当于以往套式PCR的第二轮PCR。
尤其是，本方法的特征在于，在第二次套式实时多重PCR，将套式引物指定为标记引物。因此，本发明在实时PCR中，检测多个靶核酸序列时，借助套式扩增效果来显著提高靶特异性，这排除或者减少与试样的非-靶序列的非特异杂交引起的假阳性信号。
并且，本发明方法的套式效果与以往实时多重PCR方法相比时，戏剧性地提高了灵敏度。即，当多个靶序列模板以非常少的量存在时，由于以往实时多重PCR方法在检测时受到限制，因而有可能无法检测靶信号。相反，本发明的方法借助套式扩增效果来戏剧性地提高的灵敏度能够正确地检测以非常少量存在的靶序列。
因此，本发明被命名为“基于第一次多重PCR及第二次套式实时多重PCR的连续组合的套式实时多重PCR方法（Nested real-timeMultiple PCR Method by a Sequential Combination of PrimaryMultiplex PCR and Secondary Nested Real-time Multiplex PCR）”。
为了呈现本发明的特征而使用的术语“第一次多重PCR（PrimaryMultiplex PCR）”意味着为了从试样中获取靶核酸序列的扩增子而利用至少三种的一对引物来实施的多重PCR反应。
为了呈现本发明的特征而使用的术语“第二次套式实时多重PCR（Secondary Nested Real-time Multiplex PCR）”意味着作为模板利用通过第一次多重PCR获取的扩增子及各个一对引物中的至少一个引物为与相关扩增子的内部序列杂交的标记套式引物的至少三种的一对引物来实施，并以实时方式产生用于表示靶核酸序列的存在的信号的实时多重PCR反应。
在本说明书中所使用的术语“假阳性信号的排除（elimination）（或者去除（removal））”或者“假阳性数据的排除（elimination）（或者去除（removal））”意味着与靶核酸序列未经过预-扩增的以往实时多重PCR反应相比时假阳性信号被减少的情况。优选地，上述术语意味着假阳性信号的实质性排除（substantial elimination），更优选为假阳性信号的完全排除（complete elimination）。
在本发明中使用的试样包含任何试样。优选地，利用本发明的方法来分析生物试样（biosample）。能够分析来源于植物、动物、人、菌类、细菌及病毒的生物试样。当分析来源于哺乳类或者人的试样时，上述试样可来源于特定组织或器官。作为组织的代表性例子，包含结合、皮肤、肌肉或神经组织。作为器官的代表性例子，包含眼睛、脑、肺、肝、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、膵脏、肾脏、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、腺及内部血管。所分析的生物试样均能包含来自生物学根源的任何一种细胞、组织、流体（fluid），或者可通过本发明分析的任何一种介质（medium），这将包含人、动物、从人或动物所消耗的饮食中获得的试样。并且，所分析的生物试样包含体液试样，这将包含血液、血清、血浆、淋巴、母乳、小便、粪便、眼球乳液、唾液、精液、脑萃取物（例如，脑粉碎物）、脊髓液、阑尾、脾脏及扁桃腺组织萃取物。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链（模板）互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。优选地，引物在扩增中作为具有最大有效性的单链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。在本发明中利用的引物可包含自然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷（dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、dGMP（脱氧鸟苷酸）、dCMP（脱氧胞苷酸）及dTMP（脱氧胸苷酸））、变形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，探针还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于多个因素，例如，温度、应用领域及引物的根源（source）。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核糖核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配（perfectmatch）时发生杂交，或者即使存在一部分错配（mismatch）碱基也能发生杂交。杂交时所需的互补性的程度可随着杂交条件而不同，尤其是可通过温度来进行调节。在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有差异，因而在本说明书中混用。
在本说明书中使用的术语“多重检测或者多路检测（multiplexdetection or multiplexing detection）”意味着在反应容器（例如，反应管）中同时检测多个靶核酸序列。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着要检测的核酸序列，在杂交、退火或者扩增条件下，与引物或探针进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“多重PCR（multiplex PCR）”意味着在反应容器中通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）同时扩增多个靶。
根据本发明，在反应容器中利用可对至少三种的靶核酸序列进行扩增的至少三种的一对引物来实施多重PCR，由此从试样中获得靶核酸序列的扩增子。
靶核酸序列的多重PCR可根据本技术领域中公知的PCR方法来实施。优选地，多重PCR反应根据美国专利第4,683,195号、第4,683,202号及第4,800,159号中公开的过程来实施。
根据本发明的优选实例，本发明的第一次多重PCR以最大50循环来实施，更优选为最大40循环，进而优选为最大30循环，最优选为最大20循环。
根据本发明的优选实例，本发明的第一次多重PCR以至少2循环来实施，更优选为至少5循环，进而优选为至少10循环，进而优选为至少15循环。
根据本发明的优选实例，在第二次套式实时多重PCR期间，决定第一次多重PCR的循环数，以提供产生用于表示靶核酸序列的存在的信号时所需的扩增子的量。
试样的靶核酸序列为DNA或者RNA。上述分子可以是双链或者单链形态。当作为初期物质的核酸为双链时，优选地将双链制成单链，或者制成一部分单链形态。作为用于分离链的公知的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法（例，解旋酶作用）及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，链的分离可以通过以80℃-105℃的温度进行加热而达成。用于达成这种处理的常规方法公开在JosephSambrook等、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）。
当mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需要进行反转录步骤，以上详细的内容公开在Joseph Sambrook等、MolecularCloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）；以及Noonan、K.F等，Nucleic Acids Res.16:10366（1988）。为了反转录反应，利用与随机六聚体或者mRNA的聚腺苷酸尾巴（poly A tail）杂交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs构成，且在dT引物可以起到引物作用的范围内其dTMPs的一个或者一个以上可由脱氧单磷酸核苷（dNMP）来代替。反转录可以由具有核糖核酸酶（RNase H：Ribonuclease H）活性的反转录酶来实施。利用具有核糖核酸酶（RNaseH：Ribonuclease H）活性的酶时，慎重地选择反应条件，从而可以省略核糖核酸酶（RNase H：Ribonuclease H）切割过程。
在本发明中使用的引物在靶核酸序列（模板）的一个位点（site）杂交或者退火，从而形成双链结构。适合于形成这种双链结构的核酸杂交或者退火的条件公开在Joseph Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.（2001）及Haymes,B.D.,等,Nucleic AcidHybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.（1985）。
多种DNA聚合酶可利用于本发明的第一次多重PCR步骤，该多种DNA聚合酶包含E.coli DNA聚合酶I的“克列诺（Klenow）”片段、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，聚合酶为可从多种细菌种获得的热稳定性DNA聚合酶，该聚合酶包含Thermusaquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis以及Pyrococcus furiosus（Pfu）。
在实施聚合反应时，优选地向反应容器过量提供进行这种反应时所需的组成成分。所谓的延长反应所需的组成成分的过量意味着要实现的延长实质上未受到组成成分浓度的限制时的各组成成分的量。优选地，在反应混合物提供充分量的如Mg2+等所需的辅因子，即为dATP、dCTP、dGTP及dTTP，以实现延长。
利用于第一次多重PCR或者第二次套式实时多重PCR的所有酶在相同的反应条件下可处于活性状态。实际上，缓冲液使所有酶接近于最佳的反应条件。因此，本发明的多重PCR过程在不改变添加反应物等条件下可在单一反应物中实施。
在本发明的方法中，用于多重PCR的退火或杂交在可实现核苷酸序列与引物之间的特异性结合的严格条件（stringent condition）下实施。用于退火的严格条件为序列-依赖性，并可随着周围环境变量而各不相同。优选地，退火温度为40℃至75℃，更优选为45℃至68℃，最优选为50℃至65℃。
根据本发明的优选实例，用于上述第一次多重PCR或第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物中，至少一个引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
在上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位（5’-first priming portion）；Yq为包含至少三个通用碱基的分离部位（separation portion）；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位（3’-second priming portion）；p、q及r表示核苷酸的数量，X、Y及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使得上述上游引物的整体退火特异性得到提高。
DPO结构呈双重特异性寡核苷酸（DSO，dual specificityoligonucleotide）的引物形态，由本发明者首次公开（WO 2006/095981;Chun等,Dual priming oligonucleotide system for the multiplexdetection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene,Nucleic Acid Research,35:6e40（2007））。DPO体现了借助通过分离区域相互分离杂交或退火的5’-高Tm特异性部位（或者5’-第一次引发部位）及3’-低Tm特异性部位（或者3’-第二次引发部位）来双重性地决定的新概念，并表示显著提高的杂交特异性（参照WO2006/095981;Kim等,Direct detection of lamivudine-resistanthepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-primingoligonucleotide primers,Journal of Virological Methods,149:76-84（2008）;Kim等,Rapid detection and identification of 12 respiratoryviruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplexPCR assay,Journal of Virological Methods,doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007（2008）;Horii等,Use of dualpriming oligonucleotide system to detect multiplex sexuallytransmitted pathogens in clinical specimens,Letters in AppliedMicrobiology,doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x（2009）））。如上所述，DPO最终包含具有相互不同杂交特性的两个引物片段：导致初期稳定杂交的5’-第一次引发部位及决定靶特异性的3’-第二次引发部位。
向已排除假阳性信号的成功的多重扩增反应提供具有DPO结构的一部分引物。
根据本发明的优选实例，位于分离部位的通用碱基选自包含脱氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、7-去氮-2’-脱氧肌苷（7-deaza-2’-deoxyinosine）、2-氮杂-2’-脱氧肌苷（2-aza-2’-deoxyinosine）、2’-甲氧基肌苷（2’-OMe inosine）、2’-F肌苷（2’-F inosine）、脱氧3-硝基吡咯（deoxy 3-nitropyrrole）、3-硝基吡咯（3-nitropyrrole）、2’-甲氧基3-硝基吡咯（2’-OMe3-nitropyrrole）、2’-F3-硝基吡咯（2’-F 3-nitropyrrole）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）、脱氧5-硝基吡咯（deoxy 5-nitroindole）、5-硝基吲哚（5-nitroindole）、2’-甲氧基5-硝基吲哚（2’-OMe 5-nitroindole）、2’-F5-硝基吲哚（2’-F 5-nitroindole）、脱氧4-硝基苯并咪唑（deoxy4-nitrobenzimidazole）、4-硝基苯并咪唑（4-nitrobenzimidazole）、脱氧4-氨基苯并咪唑（deoxy 4-aminobenzimidazole）、4-氨基苯并咪唑（4-aminobenzimidazole）、脱氧水粉蕈素（deoxy nebularine）、2’-F水粉蕈素（2’-F nebularine）、2’-F 4-硝基苯并咪唑（2’-F4-nitrobenzimidazole）、肽核酸-5-硝基吲哚（PNA-5-nitroindole）、肽核酸-水粉蕈素（PNA-nebularine）、肽核酸-肌苷（PNA-inosine）、肽核酸-4-硝基苯并咪唑（PNA-4-nitrobenzimidazole）、肽核酸-3-硝基吡咯（PNA-3-nitropyrrole）、吗啉基-5硝基吲哚（morpholino-5-nitroindole）、吗啉基-水粉蕈素（morpholino-nebularine）、吗啉基-肌苷（morpholino-inosine）、吗啉基-4-硝基苯并咪唑（morpholino-4-nitrobenzimidazole）、吗啉基-3-硝基吡咯（morpholino-3-nitropyrrole）、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚（phosphoramidate-5-nitroindole）、氨基磷酸酯-水粉蕈素（phosphoramidate-nebularine）、氨基磷酸酯-肌苷（phosphoramidate-inosine）、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑（phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole）、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯（phosphoramidate-3-nitropyrrole）、2’-0-甲氧基乙基肌苷（2’-0-methoxyethyl inosine）、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素（2’0-methoxyethyl nebularine）、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚（2’-0-methoxyethyl 5-nitroindole）、2’-0-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑（2’-0-methoxyethyl 4-nitro-benzimidazole）、2’-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯（2’-0-methoxyethyl 3-nitropyrrole）及上述碱基的组合的群。更优选地，通用碱基为脱氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）或者5-硝基吲哚（5-nitroindole），最优选为脱氧肌苷（deoxyinosine）。
优选地，上述分离部位包含具有至少三个通用碱基的连续的核苷酸，更优选为至少四个通用碱基，最优选为至少五个通用碱基。选择性地，上述分离部位包含3-10、3-7或5-7个连续的核苷酸。
优选地，双重引发寡核苷酸（DPO）的结构的5’-第一次引发部位的长度比3’-第二次引发部位的长度更长。上述5’-第一次引发部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，最优选地具有15-25核苷酸的长度。优选地，上述3’-第二次引发部位具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，最优选地具有6-13核苷酸的长度。优选地，上述分离部位具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。根据本发明的优选实例，上述5’-第一次引发部位具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-65℃的Tm。上述3’-第二次引发部位优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有3℃-15℃的Tm。
在用于第一次多重PCR的步骤（a）中，利用至少三种的一对引物，优选地利用至少四种的一对引物，更优选地利用至少五种的一对引物。
实施靶核酸序列的第一次多重PCR之后，接着在与第一次多重PCR的步骤（a）的反应容器不同的反应容器中实施第二次套式实时多重PCR。利用各个一对引物中的至少一个引物为与通过步骤（a）所获得的相关扩增子的各个内部序列杂交的套式引物的至少三种的一对引物来实施第二次套式实时多重PCR。通过第二次套式实时多重PCR，能够以实时方式检测至少三种的靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，第二次套式多重PCR用正向及反向引物中的至少一个是与通过步骤（a）所获得的相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。
在本说明书中使用的术语“套式引物（nested primer）"意味着与通过步骤（a）所获得的相关扩增子的内部序列杂交的引物。即，套式引物来源于经过第一次靶向的核苷酸序列内的核苷酸序列，并位于（flanking）包含在经过上述第一次靶向的核苷酸序列内的更窄的、经过第二次靶向的核苷酸序列的侧面。
在本说明书中使用的术语“扩增子的内部序列”意味着作为扩增子的序列使至少一个核苷酸位于内部的序列。
实施用于第二次套式实时多重PCR的步骤（c）时，在第二次套式实时多重PCR期间，至少三种的一对引物中的各个一对引物包含具有产生用于表示靶核酸序列存在信号的标记的至少一个套式引物。
根据本发明的优选实例，在第二次套式实时多重PCR中所使用的引物具有产生用于表示靶核酸序列存在信号的标记时，上述引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。
在本发明中，由于第二次套式实时多重PCR利用预-扩增的产物，因而在无因形成标记套式引物的二聚物而产生的假阳性信号的状态下产生用于表示靶核酸序列的存在的信号。
根据本发明的优选实例，在第二次套式实时多重PCR中表示靶核酸序列的存在的信号在30循环以内产生，更优选为25循环以内，最优选为20循环以内。
在本发明中，步骤（c）的第二次套式实时多重PCR以不产生错误信号，而产生用于表示靶核酸序列存在信号的循环数来实施。
根据本发明的优选实例，步骤（c）的第二次套式实时多重PCR以最大30循环来实施，更优选为最大25循环，最优选为最大20循环。第二次套式实时多重PCR通常以至少2循环来实施，优选为至少3循环来实施，最优选为至少5循环。
根据本发明，基于标记套式引物的二聚物形成的假阳性信号产生的循环数（或者Ct值）可在第二次套式实时多重PCR中，无模板地利用标记套式引物来决定。
根据本发明的一实例，第一次多重扩增PCR的产物可分注到至少一个独立的容器，各个容器在第二次套式多重PCR中利用于至少三种的不同靶核酸的检测。例如，为了利用10对引物来扩增10种的不同靶核酸，实施第一次10-普思（plex）PCR，将扩增产物分注到三个不同容器之后，各个容器以实时方式利用于至少三种的靶核酸序列的子类型化（subtyping）、分组（grouping）或者鉴定（identification）。
根据本发明的优选实例，至少三种的一对引物的标记相异或者相同。
根据本发明的更优选的实例，至少三种的一对引物中的各一对引物的标记相异或者相同。
在本说明书中使用的“引物的标记相异”内容意味着（i）与引物连接的标记的数量、种类、吸收波长或释放波长之间的差异；或者（ii）与引物连接的标记的信号产生机制的差异（例如，酶切割、具有标记的引物的三维结构变化、或者因在双链PCR产物插入标记引物而引发的信号产生）。
在本说明书中使用的“引物的标记相同”内容意味着（i）与引物连接的标记的数量、种类、吸收波长或者释放波长之间的同一性；以及（ii）与引物连接的标记的信号产生机制的同一性（例如，酶切割、具有标记的引物的三维结构变化、或者因在双链PCR产物插入标记引物而引发的信号产生）。
根据本发明的优选实例，术语“标记”意味着至少一个标记。
根据本发明的优选实例，标记引物包含单一标记或者相互作用性双重标记。
优选地，标记位于与靶核酸序列互补的位置（site）。
根据本发明的优选实例，标记引物在与靶核酸序列的杂交之前具有线性（linear）结构或者分子间（intermolecular）结构。作为分子间结构的例子可举例发夹环或者G-四联体（quartet）结构。
在本发明中有用的标记均包含本技术领域中公知的所有标记。大部分标记包含单分子或者单原子（atom）；但是，部分标记（例如，相互作用性标记系统）包含至少两个或者其以上的标记分子或者原子。根据本发明的优选实例，与引物连接的标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记（例如，金）。
根据本发明的优选实例，标记为荧光标记，优选为单一（mono）荧光标记，更优选为相互作用性标记系统，最优选为荧光共振能量转移（FRET）标记系统。
上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地（non-radioacively）传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术（FRET，fluorescenceresonance energy transfer）标记系统包含荧光报道分子（供体分子）及猝灭分子（受体分子）。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。
在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团（chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。
更优选地，用于表示靶核酸序列的信号借助相互作用性标记系统来产生，进而优选为荧光共振能量转移标记系统。
当利用FRET标记时，在猝灭分子对报道分子的荧光进行猝灭的范围内，荧光报道分子及猝灭分子的位置可以各不相同。例如，荧光报道分子及猝灭分子能够隔开5-50核苷酸，优选地隔开5-40核苷酸，最优选地隔开5-30核苷酸。
根据本发明的优选实例，标记引物的荧光报道分子或猝灭分子位于标记引物的5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位置。例如，荧光报道分子位于标记引物的5’-末端，猝灭分子位于从报道分子隔开5-50核苷酸的位置。
根据本发明的优选实例，标记引物的荧光报道分子位于标记引物的5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，最优选为标记引物的5’-末端。
有利于本发明的报道分子以及猝灭分子可利用本发明所属技术领域中公知的任何标记，例如：Cy2TM（506）、YOPROTM-1（509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518）、FluorXTM（519）、AlexaTM（520）、Rhodamine 110（520）、5-FAM（522）、OregonGreenTM500（522）、Oregon 25 GreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、MagnesiumGreenTM（531）、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1（533）、JOE（548）、BODIPY530/550（550）、Dil（565）、BODIPY TMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、MagnesiumOrangeTM（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、Calcium OrangeTM（576）、PyroninY（580）、RhodamineB（580）、TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX（608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、TexasRed（615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、Rphycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine（671）以及Cy5.5（694）。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。
在本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在如下的许多文献中：Pesce等，editors，FLUORESCENCE SPECTROSCOPY（Marcel Dekker,NewYork,1971）；White等，FLUORESCENCE ANALYSIS：APRACTICAL APPROACH（MarcelDekker,NewYork,1970）；Berlman，HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OFAROMATIC MOLECULES，2nd EDITION（Academic Press,NewYork,1971）；Griffiths，COLOUR AND CONSTITUTION OFORGANIC MOLECULES（AcademicPress,New York,1976）；Bishop，editor，INDICATORS（Pergamon Press,Oxford,1972）；Haugland，HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS（Molecular Probes,Eugene,1992）；Pringsheim，FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE（IntersciencePublishers,New York,1949）；Haugland，R.P.,HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS，SixthEdition，Molecular Probes，Eugene，Oreg.,1996；美国专利第3，996，345号以及第4，351，760号。
在应用于标记引物的荧光共振能量转移标记中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye）被利用为报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）被利用为猝灭分子。
第二次套式实时多重PCR用至少三种的一对引物即使包含与靶核酸序列互补的序列，也能具有任何形态（form）或者结构。
根据一实例，如上所述，第二次套式实时多重PCR用至少三种的一对引物中的各个一对引物中，至少一个引物具有DPO结构。
在本发明中有用的标记引物在以往实时PCR过程中，为了产生信号，也能包含在本技术领域中公知的任何标记引物。这根据标记引物的种类包含追加的结构特征或者有可能需要特异性聚合条件。
作为标记引物的例子包含以下内容，并不局限于此：PlexorTM（Sherrill CB,等,Journal of the American Chemical Society126:4550-4556（2004））,Antiprimer（Jin Li等,Clinical Chemistry52:4 624–633（2006））,Individual dye-labeled oligonucleotides（美国专利第6,593,091号）,LUXTM（I.A.Nazarenko,等,Nucleic AcidsRes,30:2089-2095（2002）;美国专利第7,537,886号）,TSG primer（韩国专利第10-2009-0127880号）,THD primer（国际专利第PCT/KR2009/007064号）,Lion（美国专利第6,248,526号）,Self-quenching signal primer（美国专利第5,846,726号及第6,054,279号）,Sunrise（I.A.Nazarenko,等,Nucleic acids Research,125（12）:2516-2521（1997）;Hernandez M et,al.J.cereal Sci,39:99-107（2004）,美国专利第5,866,336号,第6,090,552号及第6,117,635号）以及Scorpions（David Whitcombe,等,Nature Biotechnology,17:804-807（1999）以及欧美专利第1,088,102号）。
作为标记引物利用PlexorTM（Sherrill CB等,Journal of theAmerican Chemical Society 126:4550-4556（2004））时，为了实现猝灭，优选使用Dabcyl-iso-dGTP。
作为标记引物利用反引物（antiprimer）（Jin Li等,ClinicalChemistry 52:4 624–633（2006））时，优选地追加使用能够对游离（free）引物进行猝灭的反引物。
作为标记引物利用Individual dye-labeled oligonucleotides（美国专利第6,593,091号）时，优选地使用具有单一标记的两个引物。
例示的标记引物中，THD引物及TSG引物是由本发明者发明的。根据本发明者所发现的上述引物，在实时多重PCR扩增中，THD引物或者TSG引物成功地产生用于检测至少三种的靶核酸序列的信号。并且，本发明者还发现了如下惊奇的事实：从THD引物或者TSG引物发出的信号通过引物的结构性变化或者5’-末端的切割而产生。
根据本发明的优选实例，在步骤（c）中使用的模板-依赖性核酸聚合酶是不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者其组合。优选地，模板-依赖性核酸聚合酶是不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶或者其组合。
在引物信号化过程中，最终检测的信号优选地，通过向双链PCR产物插入标记引物、标记引物的形态变化或者标记引物的5’-末端的切割而产生。
例如，在标记引物具有单一标记的情况下，该标记引物插入于双链PCR产物时，标记借助荧光强度增加来提供信号。
标记引物具有由报道分子及猝灭分子构成的相互作用性双重标记系统且不与靶核酸序列杂交的情况下，猝灭分子与报道分子三维地相互相邻而猝灭从报道分子发出的信号。相互作用性双重标记引物与靶核酸序列杂交的情况下，猝灭分子与报道分子三维地隔开，由此不能再猝灭从报道分子发出的信号。通过相互作用性双重标记引物的形态变化可获得用于表示靶核酸序列的存在的信号。
在这种信号产生过程中，标记引物系统不仅产生靶扩增而且还产生信号，这与标记探针系统不同。
利用由于向双链PCR产物插入标记引物或者基于标记引物发生形态变化而产生的信号来检测靶核酸序列的情况下，可利用不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶。
作为不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶的例子包含E.coliDNA聚合酶I的克列诺（Klenow）片段、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7 DNA聚合酶。
选择性地，根据本发明者的以往发现的内容，标记引物具有由报道分子及猝灭分子组成的相互作用性标记系统的情况下，随着与具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶接触，其3’-末端随之延长，其5’-末端被切割，随后释放报道分子或者猝灭分子并产生用于表示靶核酸序列存在的信号。这种标记引物被命名为“THD（Target hybridizationDetection”引物。在上述信号产生战略中，THD引物具有伴随着靶扩增及信号产生的双重功能。
利用通过标记引物（例如，THD引物）5’-末端的切割而产生的信号来检测用于检测靶核酸序列的存在时，需要具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，具有5’→3’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶为热稳定性DNA聚合酶，该聚合物可从多种细菌种种获得，例如包含Thermus aquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Pyrococcus furiosus（Pfu）、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermusspecies Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana及Thermosiphoafricanus。最优选地，具有5’→3’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶。
使用具有3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶时，标记引物在其3’-末端部位包含人为的错配核苷酸序列。
多个错配核苷酸可位于3’-末端部位的多种位置。根据本发明的优选实例，错配核苷酸位于从引物的3’-末端或者引物的3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，更优选地，从引物的3’-末端或者引物的3’-末端隔开1-2核苷酸的位置，更优选地，从引物的3’-末端或者引物的3’-末端隔开1核苷酸的位置，最优选为引物的3’-末端。
错配核苷酸的数为1-5个，优选为1-4个，更优选为1-3个，进而优选为1-2个，最优选为1个。引物具有至少两个错配核苷酸的情况下，错配核苷酸可连续或者不连续地定位。
根据本发明的优选实例，引物的荧光报道分子或者猝灭分子位于引物的3’-末端或者从引物的3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，最优选为引物的3’-末端。引物与靶核酸序列杂交的情况下，具有荧光报道分子或者猝灭分子的引物的3’-末端由具有3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶所切割，释放荧光分子或者猝灭分子，由此使从报道分子发出的荧光信号不猝灭，从而获得用于表示靶核酸序列的荧光信号。
根据本发明的优选实例，具有3’→5’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为热稳定性DNA聚合酶，该聚合酶可从多种细菌种获得，并包含Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcusliteralis、Pyrococcus furiosus（Pfu）、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermusspecies Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana以及Thermosiphoafricanus的DNA聚合酶。最优选地，具有3’→5’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶为Pfu DNA聚合酶。
最终，检测出表示靶核酸序列存在的信号。信号检测可在反复的各循环中，在反复的终点或者在反复过程期间的各个预定时间间隔内实施。优选地，信号检测在反复的各循环中实施，这能够提高检测的准确度。
对各标记的信号可通过以往方法进行检测或测定。例如荧光信号可通过以往方法，例如利用荧光强度测定仪进行检测或测定。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种排除假阳性信号的至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，包括：
（a）为了从试样中获取上述靶核酸序列的扩增子，利用于上述至少三种的靶核酸序列的第一次多重PCR的至少三种的一对引物；以及
（b）用于上述扩增子的第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物，上述至少三种的各个一对引物中，至少一个引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，在上述第二次套式实时多重PCR期间，上述至少三种的各个一对引物包含具有产生用于表示靶核酸序列存在信号的标记的至少一个套式引物，上述第二次套式实时多重PCR能够以产生用于表示靶核酸序列的信号，而不产生错误信号的循环数来实施。
本发明的试剂盒是为了能够实施本发明的上述套式多重实时PCR方法而构成的，为了避免本说明书的过度复杂性，故省略共同的内容。
根据本发明的优选实例，试剂盒还包含模板-依赖性核酸聚合酶。
优选地，第二次套式实时多重PCR以最大30循环来实施，更优选为25循环，最优选为20循环。
根据本发明的优选实例，在第二次套式实时多重PCR中使用的引物具有产生用于表示靶核酸序列存在信号的标记时，引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。
本发明的试剂盒可选择性地包含在实施靶扩增聚合酶链式反应（PCR）（例如，聚合酶链式反应）中所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。
并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本技术领域的普通技术人员能够容易地决定在任意一个特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装体或者组分（compartment）所制备。
对本发明的特征及优点如下进行概括：
（a）排除因形成标记引物（labeled primer）的二聚物而产生的假阳性信号
以往实时多重PCR方法需要多个标记引物，形成引发假阳性信号的产生的二聚物可能性较高，这将被视为以往实时多重PCR方法的严重的缺点及限制。相反，本发明的方法通过利用预-扩增的产物、标记套式引物（labeled nested priemr）并通过调节循环数，从根本上排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号。
（b）在阴性对照组中的假阳性信号的排除
由于以往实时多重PCR方法形成多个标记引物的二聚物，因而即使在没有模板的阴性对照组中也出现假阳性信号伴随的问题。但是，本发明通过彻底排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号，由此防止在没有模板的阴性对照组中出现的这种假阳性信号问题。
（c）排除通过非-靶序列和标记引物的非特异性杂交来产生的假阳性信号
根据本技术领域中公知的常规知识，在多重靶检测中，由于标记引物与非-靶核酸序列进行非-特异性杂交的可能性较高，因而产生假阳性信号。在本发明的方法中，由于在第二次套式实时多重PCR中利用标记引物用作套式引物，因而出现与以往套式PCR类似的效果，以使本发明的靶特异性显著增加，由此防止因非特异性杂交引起的假阳性信号的产生。
（d）在非常少量的靶序列检测中的假阳性信号的排除
在以往实时多重PCR方法中，可通过阴性方式分析非常少量的靶序列的存在。但是，由于本发明的第二次套式实时多重PCR利用预-扩增的产物来实施，因而通过本发明的方法可检测出非常少量的靶序列，并且可防止假阴性信号。
（e）如上所述，具有在本发明中使用的DPO结构的引物提高了结合特异性，由此去除在多重PCR反应中关于引物的非-靶结合的假阳性信号。
下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的宗旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：用于排除在针对沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）以及阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）进行实时多重PCR期间，由于形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号的套式实时多重PCR的效果】
为了确认排除由于形成已标记的引物的二聚物而产生的假阳性信号的效果，对本发明的套式实时多重PCR方法和以往的实时多重PCR方法进行比较来做实验。
在本实验中，为了检测沙眼衣原体（C.trachomatis）、淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）以及阴道毛滴虫（T.vaginalis）这三种不同类型的靶核酸，对第一次多重PCR用一对引物及第二次套式实时多重PCR用标记的套式引物进行设计。
第一次多重PCR用一对引物为了提高靶特异性，设计成具有双重引发寡核苷酸（DPO）结构。
为了实现第二次套式实时多重PCR，本实施例中利用双重标记引物用作靶信号产生用标记引物。双重标记引物在其5’-末端具有FAM、Alexa 532或Alexa 647等荧光报道分子，并具有黑洞猝灭剂（BHQI，Block Hole Quencher 1）或BHQ2（Block Hole Quencher 2）等猝灭分子。荧光报道分子及猝灭分子隔开18或19核苷酸。双重标记引物为能够与通过第一次多重PCR而产生的相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。与双重标记套式引物的靶核酸序列进行的退火及延长导致荧光信号的产生。为了实现第二次（secondary）套式实时多重PCR，一起利用第一次多重PCR中所利用的一对引物中的一个引物和双重标记套式引物。
为了对本发明的方法是否能够排除由于形成标记套式引物的二聚物而产生的假阳性信号的情况做实验，利用了具有以往的结构或DPO结构的已标记的套式引物的组合。
在第二次套式实时多重PCR及以往的实时多重PCR中均利用相同的一对引物。
为了说明实现假阳性信号的排除的本发明的特征，仅利用一种模板（淋病奈瑟菌的基因组DNA）。
本实施例中所利用的引物序列如下。
针对沙眼衣原体（C.trachomatis）的引物对
CT_F：5’-TGCAACGGGTTATTCACTCCCIIIIICATTGAAACT-3（SEQID NO:1）
CT_R：5’-ACCCATACCACACCGCTTTCTIIIIIGCCTACACGT-3’（SEQ IDNO:2）
CT_DLP（18）：5’-[AminoC6+Alexa532]CACCTTCTCGTACCAAAGC[BHQ1-dT]AGAA-3’（SEQ ID NO：3）
针对淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）的引物对
NG_F：5’-CTATTTTTATGAGCCGGAACCGIIIIIAAGCGTGGGA-3’（SEQID NO:4）
NG_R：5’-TTGAAGTTGTCGGGAAAGCCIIIIITTCTTGCAAC-3’（SEQ IDNO:5）
NG_DLP（18）：5’-[6-FAM]CCCCGTGCTTTTCCATCTT[BHQ1-dT]IIIIITTGCGGGT-3’（SEQ ID NO：6）
针对阴道毛滴虫（T.vaginalis）的引物对
TV_F：5’-CCCAAAGGCTAACCGTGAGAIIIIIATCTCCCTCA-3’（SEQ IDNO:7）
TV_R：5’-TCGGCTGTTGTGTTGAAAGCIIIIICACGCTCT-3’（SEQ ID NO:8）
TV_DLP（19）：5’-[AminoC6+Alexa647]TGATCTCACAGCCTGGATGG[BHQ2-dT]CA-3’（SEQ ID NO：9）
（I：脱氧肌苷）
【以往实时多重PCR方法】
以含有包含模板N.gonorrhoeae的基因组DNA 1000fg或者不包含的2X QuantiTect多重PCR主混合液（凯杰公司：Qiagen）[11mM氯化镁（MgCl2）、QuantiTect多重PCR缓冲液、HotstarTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液]10μl以及各个引物（SEQ ID：1、3、4、6、8及9）5pmole的20μl的最终体积实施了以往实时多重PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司Bio-Rad）；在95℃下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94℃下30秒、在55℃下60秒以及在72℃下10秒的过程实施了40次。由此检测了在各循环的退火步骤（55℃）中产生的信号。
如图2的画面A所示，以往实时多重PCR方法将N.gonorrhoeae的基因组DNA用作模板，不仅产生N.gonorrhoeae（NG）的信号（Ct值：33.31）还产生C.trachomatis（CT）的信号（Ct值：32.89），这表示CT的信号为假阳性。
如图2的画面B所示，在无需任何模板实施的以往实时多重PCR中，均从NG（Ct值：33.43）及CT（Ct值：32.94）产生信号。这种结果显示，因形成标记引物的二聚物而产生假阳性信号。因此确认了，画面A的假阳性信号（CT）是通过形成标记引物的二聚物而产生的信号。
并且，虽然在画面A及B中观察到了信号以类似的模式生成，但是画面A中的NG信号为阳性，画面B中的NG信号为假阳性。这种结果显示，阳性信号及错误信号不可能通过以往实时多重PCR方法来区分。
用于检测靶序列的以往实时多重PCR方法，伴随着因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号的可能性十分高，这将导致难以获得不存在错误问题的靶序列的检测结果。
【本发明的套式实时多重PCR方法】
【第一次多重PCR】
以含有包含模板N.gonorrhoeae的基因组DNA 1000fg或者不包含的2X多重主混合液（凯杰公司：Qiagen）[6mM氯化镁（MgCl2）、HotstarTaq PCR缓冲液、HotstarTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液]10μl以及各个引物（SEQ ID：1、2、4、5、7及8）5pmole的20μl的最终体积实施了第一次多重PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（ABI9700，美国应用生物系统公司：AppliedBioSystems）；在95℃下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94℃下30秒、在55℃下60秒以及在72℃下60秒的过程实施了35次。
【第二次套式实时多重PCR】
以含有第一次多重PCR产物1μl、2X QuantiTect多重PCR主混合液（凯杰公司：Qiagen）[11mM氯化镁（MgCl2）、QuantiTect多重PCR缓冲液、HotstarTaq DNA聚合酶及dNTP混合物]10μl及各个引物（SEQ ID：1、3、4、6、8及9）5pmole的20μl的最终体积实施了第二次套式实时多重PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；在95℃下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94℃下30秒、在55℃下60秒以及在72℃下10秒的过程实施了30次。由此检测了在各循环的退火步骤（55℃）中产生的信号。
如图3的画面A所示，将淋病奈瑟球菌（NG，N.gonorrhoeae）用作模板时，本发明的方法在没有任何假阳性信号的状态下，仅表示N.gonorrhoeae（NG）的靶信号（Ct值：9.14）。并且，在没有模板的阴性对照组中，本发明的方法如图3的画面B所示，未表示任何假阳性信号。
这种结果举证了，本发明的方法在实时多重PCR方式中，排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号来正确地检测靶核酸序列。
【实施例2：在实施针对Haemophilus ducreyi、Herpes simplexvirus1及Herpes simplex virus2的实时多重PCR期间，用于排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号的套式实时多重PCR的效果】
作为用于确认本发明的重现性的实验，利用杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）、单纯疱疹病毒1（Herpes simplex virus 1）及单纯疱疹病毒2（Herpes simplex virus 2）的三种靶核酸序列。除了引物序列及标记以外，引物的设计及实验条件是与实施例1相同。双重标记引物在其5’-末端具有Alexa 532、Alexa 594或Alexa 647等荧光报道分子，并具有BHQI（Block Hole Quencher 1）或BHQ2（BlockHole Quencher 2）等猝灭分子。荧光报道分子及猝灭分子隔开18、20或21核苷酸。将Herpes simplex virus 1的基因组DNA 1000fg用作模板。
在第二次套式实时多重PCR及以往实时多重PCR中均利用相同的一对引物。
本实施例中所利用的引物序列如下：
针对杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）的引物对
HD_F：5’-AAAGAACGTGAAAAAGCCGACCIIIIIAAAATTACTA-3’（SEQID NO:10）
HD_R：5’-ATAGCCCAGAAGGGTTAGCAATIIIIIGACAATCAAT-3’（SEQID NO:11）
HD_DLP（20）:5’-[AminoC6+Alexa532]CCTCGGCTGGTATTACGACTA[BHQ1-dT]CIIIIIAGCCTAGG-3’（SEQ ID NO:12）
针对单纯疱疹病毒1（Herpes simplex virus 1）的引物对
HSV1_F：5’-GTCCTGGTGGTGCAACCGIIIIIAGTTCCGA-3’（SEQ ID NO：13）
HSV1_R：5’-ATACGCACGGTCACCCCACIIIIITGTGAGACT-3’（SEQ IDNO：14）
HSV1_DLP（18）:5-[AminoC6+Alexa594]CAGCCGATTACGACGAGGA[BHQ2-dT]IIIIITGACGAGG-3’（SEQ ID NO：15）
针对单纯疱疹病毒2（Herpes simplex virus 2）的引物对
HSV2_F：5’-GTCGTCTGCGCCAAATACGIIIIIGCAGACCC-3’（SEQ ID NO：16）
HSV2_R：5’-CAGGCGATGGTCAGGTTGTIIIIITGCTTTCG-3’（SEQ ID NO：17）
HSV2_DLP（21）：5’-[AminoC6+Alexa647]CCGATCACTGTGTACTACGCAG[BHQ2-dT]IIIIIAACGTGCC-3’（SEQ ID NO：18）
（I：脱氧肌苷）
【以往实时多重PCR方法】
除了引物（SEQ ID NO：10、12、14、15、17及18）以及模板（单纯疱疹病毒1，Herpes simplex virus 1）以外，以与实施例1相同的方式实施了以往实时多重PCR。
如图4的画面A所示，以往实时多重PCR方法仅将单纯疱疹病毒1（HSV1，Herpes simplex virus 1）的基因组DNA用作模板，不仅产生单纯疱疹病毒1（HSV1，Herpes simplex virus 1）的信号（Ct值：33.50）还产生杜克雷嗜血杆菌（HD，Haemophilus ducreyi）（Ct值：38.24）及单纯疱疹病毒2（HSV2，Herpes simplex virus 1）的信号（Ct值：32.79），这将表示HD及HSV2的信号为假阳性。
如图4的画面B所示，在无任何模板的条件下实施的以往实时多重PCR，从HSV1（Ct值：34.52）及HSV2（Ct值：34.52）均产生信号。这种结果显示，因形成标记引物的二聚物而产生假阳性信号（HSV1及HSV2）。
因此，画面A的HSV2假阳性信号表示因形成标记引物的二聚物而产生的信号，画面A的HD假阳性信号表示借助标记引物的非特异性杂交来产生的信号。
并且，画面A及B的HSV1及HSV2信号与靶模板的存在与否无关地产生。这种结果显示，阳性信号及错误信号无法通过以往实时多重PCR方法来区别。
【本发明的套式实时多重PCR方法】
【第一次多重PCR】
除了引物（SEQ ID NO：10、11、13、14、16及17）以及模板（Herpes simplex virus 1），与实施例1相同地实施第一次多重PCR。
【第二次套式实时多重PCR】
除了引物（SEQ ID NO：10、12、14、15、17及18）以外，以与实施例1相同的方式实施了第二次套式实时多重PCR。
如图5的画面A所示，当HSV1（Herpes simplex virus 1）用作模板时，本发明的方法在无任何假阳性信号的状态下仅表示HSV1（Herpes simplex virus 1）的靶信号（Ct值：7.99）。并且，在无模板的阴性对照组中，本发明的方法如图5的画面B所示，未表示任何假阳性信号。
这种结果举证了，本发明的方法在实时多重PCR方式中，排除因形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号来正确地检测靶核酸序列。
【实施例3：在本发明的套式实时多重PCR方法中的灵敏度及特异性】
在用于检测杜克雷嗜血杆菌（HD，Haemophilus ducreyi）、单纯疱疹病毒1（HSV1，Herpes simplex virus 1）及单纯疱疹病毒2（HSV2，Herpes simplex virus 2）的三种的一对引物的存在之下，检测杜克雷嗜血杆菌（HD，Haemophilus ducreyi）、单纯疱疹病毒1（HSV1，Herpes simplex virus 1）的基因组DNA，由此确认了在本发明的套式实时多重PCR方法中的灵敏度及特异性。
利用与实施例2中所述的引物相同的一对引物，并将依次稀释的杜克雷嗜血杆菌（HD，Haemophilus ducreyi）或单纯疱疹病毒1（HSV1，Herpes simplex virus 1）的基因组DNA用作模板。
【第一次多重PCR】
以含有依次稀释的杜克雷嗜血杆菌或单纯疱疹病毒1的基因组DNA（1000fg、100fg、10fg或1fg）、2X多重PCR主混合液（凯杰公司：Qiagen）[6mM氯化镁（MgCl2）、HotstarTaq PCR缓冲液、HotstarTaq DNA聚合酶及dNTP混合物]10μl及各个引物（SEQID：10、11、13、14、16及17）5pmole的20μl的最终体积实施了第一次多重PCR；将含有上述反应混合物的管位于热循环仪（ABI9700,Applied BioSystems）；在95℃下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94℃下30秒、在55℃下60秒以及在72℃下60秒的过程实施了35次。
【第二次套式实时多重PCR】
以含有第一次多重PCR产物1μl、2X QuantiTect多重PCR主混合液（凯杰公司：Qiagen）[11mM氯化镁（MgCl2）、QuantiTect多重PCR缓冲液、HotstarTaq DNA聚合酶及dNTP混合物]10μl及各个引物（SEQ ID：10、12、14、15、17及18）5pmole的20μl的最终体积实施了第二次套式实时多重PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；在95℃下对上述反应混合物进行15分钟变性后，将在94℃下30秒、在55℃下60秒以及在72℃下10秒的过程实施了30次。由此检测了在各循环的退火步骤（55℃）中产生的信号。
如图6所示，成功检测杜克雷嗜血杆菌（H.ducreyi）的靶核酸序列来确认本方法的特异性及灵敏度。
即使为了同时检测H.ducreyi（HD）、HSV1（Herpes simplex virus1）及HSV2（Herpes simplex virus 2）而在第二次实时多重PCR反应混合物利用三种不同标记引物，在没有任何HSV1及HSV2的条件下仅检测HD的靶信号，这将表示本方法的靶特异性。
并且，如图6所示，本发明的方法可检测到10fg的H.ducreyi基因组DNA。
图7表示通过检测Herpes simplex virus 1的靶核酸序列来确认本发明的特异性及灵敏度的其他实施例。
即使为了同时检测H.ducreyi（HD）、HSV1（Herpes simplex virus1）及HSV2（Herpes simplex virus 2）而在第二次实时多重PCR反应混合物中利用三种不同标记引物，在无任何HD及HSV2的信号的状态下仅检测HSV1的靶信号，这将表示本方法的靶特异性。
并且，如图7所示，本实施例表示，本发明的方法检测到10fg的Herpes simplex virus 1基因组DNA。
终上所述，本发明的方法在实时多重方式中，能够以提高的灵敏度及特异性来检测靶序列。
【实施例4：利用本发明的套式实时多重PCR方法的多个靶检测】
为了对是否能够通过本发明的方法，并以实时方式同时检测至少三种不同靶核酸序列的情况做实验，将H.ducreyi、Herpes simplexvirus 1及Herpes simplex virus 2的混合基因组DNA用作模板，并利用与实施例2中所利用的引物相同的一对引物。
【第一次多重PCR】
除了模板（H.ducreyi、Herpes simplex virus 1及Herpes simplexvirus 2的基因组DNA分别是1000fg），如同实施例2实施了第一次多重PCR。
【第二次套式实时多重PCR】
如同实施例2实施了第二次套式实时多重PCR。
如图8所示，本发明的套式实时多重PCR同时检测了对于H.ducreyi（HD）（Ct;4.61）、Herpes simplex virus 1（HSV1）（Ct;2.80）及Herpes simplex virus 2（HSV2）（Ct;7.39）的存在的三种不同靶信号。在无模板的阴性对照组中，未出现任何假阳性信号。
因此，本发明举证了，本发明的方法在实时多重PCR方式中，排除假阳性信号来同时检测至少三种其他靶核酸序列。
对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修正，本发明的范围借助所附的权利要求和与其均等的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
Figure IDA00002035285600011
Figure IDA00002035285600021
Figure IDA00002035285600031
Figure IDA00002035285600041
Figure IDA00002035285600051

Claims (27)

1.一种在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多路检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（a），在反应容器实施用于扩增上述靶核酸序列的第一次多重PCR，为了在上述试样中获取上述靶核酸序列的扩增子，在能够扩增至少三种的靶核酸序列的条件下，利用至少三种的一对引物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施上述第一次多重PCR；
步骤（b），在与上述步骤（a）中所使用的反应容器不同的反应容器准备第二次套式实时多重PCR反应混合物，上述第二次套式实时多重PCR反应混合物包含：（i）在上述步骤（a）中获取的扩增子，（ii）用于上述扩增子的第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物，在上述至少三种的各个一对引物中，至少一个引物是与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，以及（iii）模板-依赖性核酸聚合酶，上述至少三种的各个一对引物包含至少一个套式引物，上述至少一个套式引物具有在上述第二次套式实时多重PCR期间产生用于表示靶核酸序列的存在的信号的标记；
步骤（c），利用上述步骤（b）的上述反应混合物，并通过至少2循环来实施引物退火、引物延长及变性，由此实施上述第二次套式实时多重PCR，用于表示上述靶核酸序列的存在的上述信号在循环期间从上述各个标记引物中产生，上述第二次套式实时多重PCR能够以产生用于表示靶核酸序列的信号，而不产生错误信号的循环数来实施；以及
步骤（d），检测用于表示靶核酸序列的存在的信号，上述检测在步骤（c）的上述反复的各循环中，在步骤（c）的上述反复的终点或者步骤（c）的上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，据此表示上述靶核酸序列的上述信号通过实时方式得到获取，且不产生错误信号。
2.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大30循环来实施。
3.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大25循环来实施。
4.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大20循环来实施。
5.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，用于上述第二次套式实时多重PCR的上述引物具有上述标记的情况下，上述引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。
6.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述至少三种的一对引物的上述标记相异或者相同。
7.根据权利要求6所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述至少三种的各个一对引物的上述标记相异或者相同。
8.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述标记引物包含单一标记或者相互作用性双重标记。
9.根据权利要求8所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述标记位于与上述靶核酸序列互补的上述引物的序列。
10.根据权利要求8所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或金属标记。
11.根据权利要求8所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，上述相互作用性双重标记包含荧光报道分子及猝灭分子。
12.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，用于上述第一次多重PCR或第二次套式实时多重PCR的上述至少三种的一对引物中，至少一个引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DOP）结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高。
13.根据权利要求1所述的在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重检测方法，其特征在于，步骤（b）的上述模板-依赖性核酸聚合酶为不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者均具有5’→3’核苷酸活性和3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶。
14.一种排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，
包括：
（a）为了从试样中获取上述靶核酸序列的扩增子，利用于上述至少三种的靶核酸序列的第一次多重PCR的至少三种的一对引物；以及
（b）用于上述扩增子的第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物，上述至少三种的各个一对引物中，至少一个引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，在上述第二次套式实时多重PCR期间，上述至少三种的各个一对引物包含具有产生用于表示靶核酸序列的存在的信号的标记的至少一个套式引物，上述第二次套式实时多重PCR能够以产生用于表示靶核酸序列的信号，而不产生错误信号的循环数来实施。
15.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含模板-依赖性核酸聚合酶。
16.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大30循环来实施。
17.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大25循环来实施。
18.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述第二次套式实时多重PCR通过最大20循环来实施。
19.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，用于上述第二次套式实时多重PCR的上述引物具有上述标记的情况下，上述引物为与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物。
20.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述至少三种的一对引物的上述标记相异或者相同。
21.根据权利要求20所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述至少三种的各个一对引物的上述标记相异或者相同。
22.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述标记引物为单一标记或者相互作用性双重标记。
23.根据权利要求22所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述标记位于与上述靶核酸序列互补的上述引物的序列。
24.根据权利要求22所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或金属标记。
25.根据权利要求22所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述相互作用性双重标记包含光报道分子及猝灭分子。
26.根据权利要求14所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，用于上述第一次多重PCR或第二次套式实时多重PCR的上述至少三种的一对引物中，至少一个引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高。
27.根据权利要求15所述的排除假阳性信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多重PCR检测试剂盒，其特征在于，上述模板-依赖性核酸聚合酶为不具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’→3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者均具有5’→3’核苷酸活性和3’→5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶。
CN2010800643557A 2009-12-24 2010-03-15 排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测 Pending CN102762745A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20090130604 2009-12-24
KR10-2009-0130604 2009-12-24
PCT/KR2010/001592 WO2011078439A1 (en) 2009-12-24 2010-03-15 Real-time multiplexing detection of target nucleic acid sequences with elimination of false signals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102762745A true CN102762745A (zh) 2012-10-31

Family

ID=44195944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800643557A Pending CN102762745A (zh) 2009-12-24 2010-03-15 排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20120258447A1 (zh)
EP (1) EP2516678A4 (zh)
JP (1) JP5709897B2 (zh)
KR (1) KR101552669B1 (zh)
CN (1) CN102762745A (zh)
WO (1) WO2011078439A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105256055A (zh) * 2015-11-13 2016-01-20 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局 基于dpo引物的实时荧光pcr检测植物乳杆菌的方法、引物及试剂盒

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102695806B (zh) * 2009-11-03 2014-11-05 瑞典国家兽医研究所 基因型分型
CN107532213B (zh) * 2015-04-23 2021-05-11 病理取景器控股有限责任公司 用于同时检测样品中多个核酸序列的方法
CN108368547B (zh) * 2015-12-15 2022-04-05 Seegene株式会社 与靶核酸序列有关的信号提取
CA3023256A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Integrated Nano-Technologies, Inc. Method for detection of a pcr product
KR101785687B1 (ko) * 2016-07-20 2017-10-17 (주)다이오진 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
IL302090A (en) * 2016-12-29 2023-06-01 Seegene Inc A method for reducing primer dimer formation and increasing amplification efficiency
KR102231876B1 (ko) * 2020-07-15 2021-03-29 다이아프로브(주) 위양성 발생을 방지하기 위한 양성대조군 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응
US20230332217A1 (en) * 2020-08-28 2023-10-19 Seegene, Inc. Method for positive control reaction using pre-positive control composition
WO2022054715A1 (ja) 2020-09-11 2022-03-17 富士フイルム株式会社 プライマーペアを反応容器に分割する設計方法、標的核酸の増幅方法、チューブセット、プライマーペアのリスト及びプライマーペアを反応容器に分割するプログラム

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008155599A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Taag-Genetics Sa Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001050A1 (en) * 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5652106A (en) * 1993-06-04 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Rapid amplification-based subtyping of mycobacterium tuberculosis
GB9514325D0 (en) * 1995-07-13 1995-09-13 Royal Free Hosp School Med Detection and quantification of human herpes virus 7 by enzymic amplification
US5770368A (en) * 1996-05-09 1998-06-23 Metropolitan Water District Of Southern California Cryptosporidium detection method
US5858673A (en) * 1996-06-24 1999-01-12 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method for detecting prostate cells
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
DE10164819A1 (de) * 2001-11-20 2005-05-19 Deml, Ludwig, Dr. Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
JP4377375B2 (ja) * 2002-12-06 2009-12-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 病原性生物の多重分析検出
EP1613771B1 (en) * 2003-04-04 2012-03-21 Roche Diagnostics GmbH Improved system for multi color real time pcr
US20050233314A1 (en) * 2003-06-30 2005-10-20 National Health Research Institutes Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR
EP1689764B1 (en) * 2003-11-19 2013-01-02 AlleLogic Biosciences Corporation Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores
DE602005015189D1 (de) * 2004-08-06 2009-08-13 Geno Madrid S A Verfahren zur in-vitro detektion und quantifizierung von hiv dna mittels quantitativer pcr
WO2006095981A1 (en) * 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
WO2008143367A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Seegene, Inc. Haplotyping method by multiplex amplification
WO2009035177A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Seegene, Inc. Genotyping of human papilloma viruses by multiplex amplification and size differentiation
CA2725239C (en) * 2008-05-27 2019-02-26 Trilink Biotechnologies Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated amplification of nucleic acid
KR20110050327A (ko) * 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008155599A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Taag-Genetics Sa Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105256055A (zh) * 2015-11-13 2016-01-20 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局 基于dpo引物的实时荧光pcr检测植物乳杆菌的方法、引物及试剂盒
CN105256055B (zh) * 2015-11-13 2019-02-05 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局 基于dpo引物的实时荧光pcr检测植物乳杆菌的方法、引物及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011078439A1 (en) 2011-06-30
JP2013515476A (ja) 2013-05-09
KR20120107501A (ko) 2012-10-02
EP2516678A4 (en) 2013-06-19
EP2516678A1 (en) 2012-10-31
KR101552669B1 (ko) 2015-09-11
JP5709897B2 (ja) 2015-04-30
US20120258447A1 (en) 2012-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102762744B (zh) 利用靶信号产生引物进行的靶检测
CN102762745A (zh) 排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测
CN102782150B (zh) 利用靶杂交及检测引物进行靶检测
CN104145029B (zh) 利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交的靶核酸序列的检测
WO2019228541A1 (zh) 一种定向聚合的荧光探针pcr及试剂盒
CN103534358B (zh) 基于pto切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测
JP7175326B2 (ja) 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物
CN103620056B (zh) 通过探测寡核苷酸切割及杂交的靶核酸序列的检测
EP2480689A1 (en) Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions
JP2012508571A (ja) Ｒｎａ検出法
WO2013157821A1 (en) Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide cleavage
CN108642165A (zh) 一种用于实时荧光pcr的探针及其使用方法
KR101785687B1 (ko) 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
CN113046420B (zh) 一种不对称扩增多个靶核酸的方法
KR20220078371A (ko) 왕게 속(Paralithodes genus) 및 대게 속(Chionoecetes genus) 검출용 조성물
EP4198143A1 (en) Modified primers for loop-mediated isothermal amplification and use thereof
KR101606530B1 (ko) Hla-b*27 및 hla-b*51의 동시 검출 방법 및 이의 용도
KR20240058021A (ko) 대장균의 o103, o121, o123, o136, o156, o168, o170, o174, o3, o40, o64, o66, o6, o78, o80, o82, o88, o8, o91, o181 또는 o111 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058019A (ko) 대장균의 O127, O128ac 또는 O86 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058024A (ko) 대장균의 o115 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058020A (ko) 대장균의 o146 또는 o51 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20230091008A (ko) 고리매개 등온 증폭용 변형된 프라이머 및 이의 용도
KR20230124697A (ko) SARS-CoV-2 변이를 검출하는 방법
KR20110040545A (ko) 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121031

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication