KR20110040545A

KR20110040545A - 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출

Info

Publication number: KR20110040545A
Application number: KR1020090097861A
Authority: KR
Inventors: 천종윤; 황인택
Original assignee: 주식회사 씨젠
Priority date: 2009-10-14
Filing date: 2009-10-14
Publication date: 2011-04-20

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산서열을 실시간 멀티플렉싱 검출하는 기술에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 Real-time PCR 기술들이 가지고 있는 문제점, 즉 분석 비용의 고가, 다량의 시료를 검사하기 위해서는 여러 대의 고가 장비의 요구 및 시간이 많이 요구되어 high-throughput 에의 한계, 그리고 multiple detection의 한계와 같은 문제점 등을 획기적으로 극복하여, 형광 이중-표지된 프로브의 사용량을 감소시켜 분석 비용을 크게 줄일 수 있으며, 이용되는 시료의 양과 분석 시간도 줄일 수 있고, 검출 민감도, multiple detection 및 고가 장비의 이용 효율성을 크게 개선할 수 있다.

멀티플렉스, 네스티드, 시그널, 증폭, 엑소뉴클레아제, 타겟, 핵산, 검출

Description

멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출{Real－Time Multiplexing Detection of Target Nucleic Acid Sequences by Multiplex Target Amplification and Nested Signal Amplification}

본 발명은 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산서열을 실시간 멀티플렉싱 검출하는 기술이다.

타겟 핵산을 검출하기 위한 대부분의 기술들은 타겟 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 필수적인 과정이고, 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등 (WO 89/06700)은, 프로모터/프라이머 서열을 타깃 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화 시킨 다음, 상기 서열의 많은 RNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 다른 공지의 핵산 증폭 방법들은 전사 증폭 시스템을 포함한다(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); 및 Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).

중합효소 연쇄반응(이하,“PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

PCR-관련 기술들은 생물학과 의학의 연구 분야에서 다양한 응용과 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 타겟 서열의 검출, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이 (Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR-관여 게놈 분석(McPherson and Moller, 2000)이 있다.

핵산 증폭은 상술한 바와 같이 널리 이용되고 있기 때문에, 핵산 증폭 방법을 개선하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다.

이러한 연구들 중에서, Real-time PCR은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 cross-contamination을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다. Real-time PCR에 관한 종래 특허문헌으로는, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145가 있다.

기존의 Real-time PCR 방법은 증폭과 검출이 동시에 수행되는 homogeneous assay 방식의 장점을 가지고 있지만, 형광 리포터 분자 종류의 한계로 인하여 동시에 검출할 수 있는 타겟 핵산서열 수가 제한적인 multiplicity 문제점 및 high-throughput에 있어서 가장 큰 단점을 가지고 있다. 실시간 타겟 핵산서열을 검출 할 수 있는 현존의 thermocycler는 최대 5-plex 까지 동시 검출이 가능하기 때문에, 동시에 검출할 수 있는 타겟 핵산서열의 수가 제한적이며, 또한 대용량의 시료를 분석하기 위하여 많은 시간과 추가적인 고가의 실시간 모니터링 장비가 요구된다.

Real-time PCR의 대표적인 TaqMan probe 방식(U.S. Pat. No. 5,210,015)과 Self-quenching fluorescence probe 방식(U.S. Pat. No. 5,723,591)은 dual-labeled probe의 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생되는 문제가 있기 때문에, 현실적으로 (practically) 5-plex도 어렵고, 숙련된 기술 및 노하우가 필수적으로 요구된다. 기존의 Real-time PCR 방식은 증폭과 검출을 동시해야 하기 때문에, Real-time PCR 장비의 High Throughput에 한계가 있다. 예를 들면, 기존의 Real-time PCR은 증폭과 검출을 동시에 수행하기 때문에 검출에 소요되는 시간이 약 2시간 걸리는 반면, 본 발명은 증폭과 검출을 분리해서 수행하기 때문에 검출만 하는데 Real-time PCR 장비를 이용해서 30분에 안에 결과를 얻을 수 있다. 따라서 증폭과 검출을 동시에 적용하는 방식이 본 발명의 분리 적용 방식에 비해 고가의 Real-time PCR 장비 활용이 최소 4배로 적은 한계를 갖는다.

한편, DNA-기반 마이크로어레이 기술은 특정 유전자 또는 유전자군의 존재, 양 또는 발현패턴을 분석할 수 있는 간단한 방법으로서 큰 각광을 받고 있다(Schena et al., Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science, 270:467-470(1995); DeRisi et al., Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patterns in Human Cancer, Nature Genetics 14:457-460(1996)).

현재까지 개발된 DNA 마이크로어레이 기술들은, 특정 유전자 또는 변이를 검출하거나 발현 패턴을 분석하는 것과 관련이 되어 있다.

그러나, 종래의 DNA 마이크로어레이는 단지 혼성화 방식에 의해서 타겟 서열을 검출하기 때문에 cross reaction에 의한 false positives 문제가 발생되어, 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다. 또한, 종래의 마이크로어레이의 경우 혼성화 방식에 의해서 검출을 하기 때문에 혼성화 후 까다로운 세척 과정이 요구되는 문제점이 있으며, 혼성화 전에 타겟 서열을 단일가닥으로 만드는 과정이 필수적으로 요구된다.

한편, 최근에 발표된 on-chip PCR은 혼성화 또는 probe extension 방식에 의해 검출하기 때문에, 기존 마이크로어레이와 같이 heterogenous assay system이며, 실시간 검출이 불가능 하고 정확한 정량이 어렵다는 문제점이 있다.

따라서, 상술한 종래의 다수의 타겟 서열 검출과 Real-time PCR장비의 High Throughput 적용을 위한 기술들의 문제점을 획기적으로 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 이중-표지된 프로브의 사용량을 감소시켜 분석 비용을 크게 줄일 수 있고, 또한 이용되는 시료의 양과 분석 시간도 줄일 수 있고, 검출 민감도를 크게 개선할 수 있는 기술에 대한 요구가 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다수의 타겟 핵산서열들을 멀티플렉싱 방식으로 동시에 검출하되, 분석의 목적에 따라 다수의 타겟 핵산서열들을 분류(classifying or screening)하고 개별구별(identification) 할 수 있으며 종래의 실시간-PCR 방식 보다 훨씬 적은 양의 프로브 및 시료를 이용하여도 보다 개선된 민감도로 다수의 타겟 핵산서열들을 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 멀티플렉스 타겟 증폭을 우선적으로 실시하여 증폭 master template를 확보한 다음 네스티드 시그널 증폭 반응을 반복적으로 실시하여, 상기 장점들을 가지는 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출 기술을 개발하였다.

따라서 본 발명의 목적은 액상에서 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭(multiplex target amplification and nested signal amplification)을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 액상에서 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭(multiplex target amplification and nested signal amplification)을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 멀티플렉싱 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명 확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 액상에서 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭(multiplex target amplification and nested signal amplification)을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출방법을 제공한다:

(a) 멀티플렉스 타겟 증폭을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 생물학적 시료 내의 DNA 또는 핵산 혼합물 및 최소 5종의 타겟 핵산서열을 증폭할 수 있는 멀티플렉스 증폭반응을 수행하여 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻으며;

(b) 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 상기 앰플리콘, 프로브 및 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 nested signal amplification 및 검출을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 다음의 소단계를 포함한다:

(b-1) 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 최소 3종의 프로브에 상기 앰플리콘을 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 3종의 프로브 및 상기 앰플리콘의 혼성화는 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 실시되고;

(b-2) 상기 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로 상기 혼성화된 프로브를 절단하여, 상기 절단에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 프로브로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되도록 실시하며;

(b-3) 상기 프로브-앰플리콘의 이합체(duplex) 또는 상기 앰플리콘의 이합체를 변성시키는 단계;

(b-4) 상기 단계 (b-1)-(b-3)을 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 및

(b-5) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 우선적으로 멀티플렉스 증폭 반응을 통하여 타겟 핵산서 열의 증폭산물을 얻고 이어 엑소뉴클레오아제 활성과 프로브(형광 리포터 분자 및 퀀처 분자로 이중 표지됨)를 사용하여 엑소뉴클레아제 활성의 절단반응을 반복적으로 실시함으로써 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 형광 시그널을 증폭한다. 따라서 종래 기술들과 비교하여 본 발명의 가장 큰 특징은 다음과 같다: (a) 멀티플렉스 증폭 반응 후, 증폭된 산물 즉 앰플리콘 및 네스티드 효과를 나타내는 프로브를 이용한 타겟 핵산서열 특이적 시그널 발생; (b) 엑소뉴클레오아제 활성에 의한 프로브 절단반응을 연속적으로 반복하여 타겟 시그널 증폭; (c) 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자로 이중 표지된 프로브의 이용하여 타겟 핵산서열의 실시간 모니터링 가능.

따라서 본 발명은 "Real-Time Multiplexing Target Detection by Nested Signal Amplification(NSA)"로 명명되며, 줄여서 "Real-Time NSA"로 명명된다.

본 발명의 특징을 표현하기 위하여 사용되는 용어 “nested signal amplification(NSA)”은 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 엑소뉴클레아제 활성에 의한 절단반응을 연속적으로 반복함으로써 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭하는 것을 의미한다. 이러한 NSA에 의해 타겟 핵산서열에 대한 민감도가 증가된다.

NSA 과정에 의한 민감도 증가는 다음의 3가지 전략을 절묘하게 결합하여 나온 것이다. 첫 번째 전략은, 시그널 발생 과정과 분리되어 실시되는 타겟 핵산서열의 증폭 과정이다. 두 번째 전략은, 상기 증폭 과정 산물인 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 프로브의 이용이다. 세 번째 전략은, 엑소뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단반응을 연속적으로 반복 실시하는 것이다.

본 발명에 따르면, 타겟 핵산서열의 증폭과정과 시그널 발생 과정이 서로 분리되어 있고 증폭 산물인 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 절단반응을 연속적으로 반복 실시하여 시그널을 증폭하기 때문에, 네스티드 PCR과 유사한 효과가 발생된다. 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 절단반응을 연속적으로 반복 실시하여 시그널을 증폭하는 과정은, first round PCR과 nested primer를 이용한 second round PCR로 구성된 네스티드 PCR에서 second round PCR과 유사한 효과를 나타내는 것이다. 즉, 본 발명에서 멀티플렉스 타겟 증폭 과정은 네스티드 PCR의 first round PCR에 대응되며, nested signal amplification 과정은 네스티드 PCR의 second round PCR에 대응된다. 한편, 종래의 real-time PCR은 타겟 핵산서열의 증폭과 시그널 발생 과정이 동시에 일어나기 때문에, 본 발명의 네스티드 효과가 발생될 수 없다.

본 발명에 따르면, 우선 생물학적 시료 내의 최소 5종의 타겟 핵산서열을 증폭할 수 있는 멀티플렉스 증폭반응을 수행하여 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻는다. 최소 5종의 타겟 핵산서열을 멀티플렉스 증폭하기 위하여 일반적으로 5쌍의 프라이머가 이용될 수 있다.

본 명세서 용어 “멀티플렉싱 검출”은 하나의 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에 멀티플렉스 증폭된 앰플리콘을 첨가하고 다수의 프로브와 함께 반응시켜 다수의 핵산서열을 동시에 분석하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 핵산”은 최종적으로 검 출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 증폭 조건 및 혼성화 조건에서 본 발명의 프라이머 및 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. 용어 "멀티플렉스 증폭"은 단일의 중합효소 반응 혼합물내의 멀티플렉스 DNA 타겟들을 동시에 증폭하는 것을 의미한다.

타겟 핵산서열의 멀티플렉스 증폭은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관여 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다. 바람직하게는, 타겟 핵산의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되며, PCR 방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시되어 있다.

멀티플렉스 증폭되는 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.

mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머, 랜덤 헥사머, 혹은 타겟 핵산서열의 상보적인 올리고뉴크레오타이드가 이용된다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMPs 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 멀티플렉스 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 핵산서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 (즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 멀피플렉스 증폭은 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 증폭 프라이머를 이용하여 실시된다:

5’-X_p-Y_q-Z_r-3’ (I)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.

본 명세서에서 용어 “이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO)”는 본 발명자들에 의해 처음 제시된 것이다(WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)). DPO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5'-고 Tm 특이성 부위(또는 5'-제1차 프라이밍 부위) 및 3'-저 Tm 특이성 부위(또는 3'-제2차 프라이밍 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 매우 놀라운 특이성을 나타낸다(see WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim, et. al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii et. al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, DPO는 서로 다른 어닐링 특성을 가지는 두 개의 프로브 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5'-제1차 혼성화 부위; 및 타겟-특이적 연장반응을 결정하는 3'-제2차 혼성화 부위. 이 DPO는 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.

이러한 DPO 구조를 갖는 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열을 멀티플렉스 증폭하는 경우에는 위양성 또는 위음성 결과 없이 성공적으로 멀티플렉스 앰플리콘 을 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드(바람직하게는 3-10, 보다 바람직하게는 3-7, 가장 바 람직하게는 5-7 뉴클레오타이드)를 포함한다.

바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

타겟 핵산서열의 멀티플렉스 증폭에 이어, 증폭 반응과는 다른 반응 용기에서 상기 과정에서 얻은 앰플리콘, 프로브 및 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 nested signal amplification 및 검출과정을 실시한다.

Nested signal amplification 및 검출과정에서, 우선 앰플리콘을 프로브에 혼성화 시킨다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 한, 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명은 크게 4 가지 방식으로 실시될 수 있다: (a) 5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소를 이용한 연장반응이 수반되지 않는 반응; (b) 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 연장반응이 수반되는 반응; (c) 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 연장반응이 수반되지 않는 반응; 및 (d) 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 연장반응이 수반되는 반응

5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 연장반응이 수반되지 않는 반응

본 발명은 연장반응 없이 프로브 및 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 타겟 핵산서열에 대한 형광 시그널을 증폭할 수 있다. 즉, 업스트림 프라이머 및/또는 다운스트림 프라이머 없이 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성 을 갖는 효소를 이용하여 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 형광 시그널이 증폭된다.

5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 특히 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 반응에 있어 프라이머의 도움 없이도 타겟 핵산서열에 결합된 프로브의 5’-말단부위가 절단된다는 본 발명자들의 발견은 매우 흥미로운 것이다. 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 될 경우에는 프라이머의 연장반응 없이도 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브의 5‘-말단부위에서 절단반응이 일어나며, 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화되어 프로브의 5‘-말단부위가 혼성화되지 않고 단일가닥으로 존재하는 경우에는 프로브는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되지 않는다. 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 액상반응은 이러한 본 발명자들의 발견을 타겟 핵산서열의 검출에 적용하여 구축된 것이다.

5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 바람직하게, 프로브는 그의 5’-말단에 타겟 핵산서열에 대한 매치 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대부분의 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 특히 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소는 타겟 핵산서열에 결합되어 이중가닥을 형성하는 프로브의 5’-말단을 절단한다.

프로브에 이중 표지되는 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자 위치는 바람직하게는, 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 프로브의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 결합되며, 가장 바람직하게는 프로브의 5’-말단에 결합된다.

프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 프로브의 5’-말단을 절단하여 여기에 결합된 형광 리포터 분자 또는 처 분자를 프로브로부터 해리시키고 결국 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생된다.

5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 반응을 실시하는 경우, 본 발명에서 이용되는 프로브는, 바람직하게는, 상기 일반식 II의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다.

5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소를 이용한 연장반응이 수반되는 반응

5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한 연장반응이 수반되는 반응은 종래의 real-time PCR과 거의 동일하게 실시될 수 있다. 상기 단계 (b)는 연장 프라이머의 연장반응을 추가적으로 포함하여 실시된다.

보다 상세하게는, 첫 번째 반응 타입에서 상기 단계 (b)는 다음의 소단계를 포함한다:

(b-1) 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 최소 3종의 프로브 및 상기 타겟 핵산 서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 상기 프로브의 5‘-말단 방향 쪽에 위치한 최소 3종의 연장 프라이머에 상기 앰플리콘을 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 3종의 프로브, 최소 3종의 연장 프라이머 및 상기 앰플리콘의 혼성화는 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 실시되고;

(b-2) 5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 주형-의존성 연장반응을 실시하여 상기 연장 프라이머를 연장시키고 상기 프로브를 절단하는 단계로서, 상기 절단에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 프로브로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되도록 실시하며;

(b-3) 상기 앰플리콘의 이합체를 변성시키는 단계;

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 첫 번째 반응 타입에서 이용되는 프로브는 하기 일반식 II의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 갖는다:

5’-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (II)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.

본 명세서에서 용어 “변형 DSO(mDSO) 구조”는 DSO(dual specificity oligonucleotide) 구조에서 유래된다. mDSO의 상세한 설명은 상술한 DPO 구조를 인용하여 설명될 수 있다. DPO 구조가 프로브로 이용되는 경우에는 DSO 구조로 명명되며, DSO 구조가 변형된 것이 mDSO이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드(바람직하게는 3-10, 보다 바람직하게는 3-7, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드)를 포함한다.

바람직하게는, 상기 3'-제1차 혼성화 부위의 길이는 5'-제2차 혼성화 부위보다 길다. 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 부위는 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

변형 DSO 구조는 상기 DSO 구조의 5'-제1차 혼성화 부위 및 3'-제2차 혼성화 부위가 서로 역전된 것으로서, 변형 DSO 구조에서 초기의 안정된 혼성화는 3'-제1차 혼성화 부위가 담당하고 추가적인 타겟-특이성의 결정은 5'-제2차 혼성화 부위가 담당하게 된다. 5‘-제2차 혼성화 부위가 핵산서열과 혼성화되지 않고 단일가닥을 형성하는 경우에는 5’to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 프로브는 절단되지 않으며, 5'-제2차 혼성화 부위가 타겟 서열에 혼성화 되는 경우에만, 5’to 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 활성에 의해 프로브의 5'-말단 부위가 절단되기 시작하며, 이는 5'-제2차 혼성화 부위가 타겟-특이성을 더욱 증가시키는 역할을 담당할 수 있도록 한다.

프로브를 이용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 종래 기술에 따르면, 프로브가 가지고 있는 내재적인 한계 때문에 false signals를 완벽하게 제거할 수 없다. 그러나 본 발명에 따르면 프로브를 기반으로 한 타겟 핵산서열의 검출을 위양성 데이터 없이 실시할 수 있다.

본 발명에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서 false signals 없이 실시할 수 있는 이유 중 하나는 프로브가 가지고 있는 mDSO 구조에 의한 혼성화 특이성이다.

mDSO 구조를 가지는 프로브는 타겟 핵산과 비-타겟 핵산에 혼성화 되는 경우 서로 다른 패턴으로 혼성화 된다. 프로브가 타겟 핵산에 혼성화 되는 경우에는 프로브 전체 서열에 걸쳐 타겟 핵산과 이중가닥을 형성하지만, 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화(비-특이적 결합) 되는 경우에는 3’-제1차 혼성화 부위를 통하여 우세적으로 혼성화 되며 5’-제2차 혼성화 부위 또는 5’-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 그의 낮은 Tm 값 때문에 비-타겟 핵산에 혼성화 되지 못하고 단일가닥을 형성하게 된다.

결국, 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우에는 5’to 3’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 예컨대 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브의 5’-말단으로부터 절단반응이 발생되어 퀀처 분자로부터 형광분자(예컨대, 리포터 분자)가 해리되어 형광시그널이 발생하게 된다.

상술한 바와 같이, mDSO 구조를 가지는 프로브의 intriguing design에 의해 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 본 발명에서 완벽하게 구별하여 검출할 수 있다.

본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 “주형-의존성 연장반응”은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.

주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 프로 브로부터 해리되면 리포터 분자의 형광이 발생하게 되며, 이 형광 시그널은 당업계의 통상적인 방법, 예컨대 형광측정기를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 결국, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 형광 시그널을 검출할 수 있다.

주형-의존성 핵산중합효소의 5‘ to 3'-엑소뉴클레아제 활성을 이용한 연장반응이 수반되는 반응에서 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시될 수 있다. 이러한 경우에는 연장 프라이머 및 역방향 프라이머의 연장반응으로 인하여 nested signal amplification 단계에서 앰플리콘의 증폭이 발생된다.

3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용한 연장반응이 수반되지 않는 반응

본 발명은 방향성을 반대로 하여, 즉 3’to 5’방향의 절단반응을 이용하여 실시할 수 있다. 이 경우, 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 이용된다.

3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 프로브는 그의 3’-말단 부위에 타겟 핵산서열에 대한 인위적 미스매치 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

미스매치 뉴클레오타이드는 프로브의 다양한 위치에 있을 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프로브의 미스매치 뉴클레오타이드는 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 보다 바람직하게는 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격된 위치, 보다 더 바 람직하게는 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1 뉴클레오타이드 이격된 위치, 가장 바람직하게는 3’-말단에 있다.

한편, 미스매치 뉴클레오타이드는 1-5개 미스매치 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1-4개 미스매치 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1-3개 미스매치 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 1-2개 미스매치 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 단일 미스매치 뉴클레오타이드이다. 미스매치 뉴클레오타이드가 2개 이상인 경우에는, 미스매치 뉴클레오타이드는 연속적 또는 단속적으로 존재할 수 있다.

프로브에 이중 표지되는 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자 위치는 바람직하게는, 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 프로브의 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 결합되며, 가장 바람직하게는 프로브의 3’-말단에 결합된다. 프로브가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 프로브의 3’-말단을 절단하여 여기에 결합된 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자를 프로브로부터 해리시키고 결국 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생된다.

3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 반응을 실시하는 경우, 본 발명에서 이용되는 프로브는, 바람직하게는, 하기 일반식 III의 미스매치-운반 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 구조를 갖는다:

5’-X_p-Y_q-Z_r-D_a-3’ (III)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 상보적인 혼성화 서열을 가 지는 5’-제1차 혼성화 부위(5’-first hybridization portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 혼성화 부위(3’-second hybridization portion)이고, D_a는 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단부위이고 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하고, p, q, r 및 a는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y, Z 및 D는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제2차 혼성화 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 혼성화 부위가 3’-제2차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 프로브 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 혼성화 부위와 3’-제2차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.

미스매치 운반 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 상세한 설명은 상술한 변형 DSO 구조를 인용하여 설명될 수 있다.

바람직하게는, 상기 5'-제1차 혼성화 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보 다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 3’to 5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 3’to 5’뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 중합효소이다. 보다 바람직하게는, 3’to 5’뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 Pfu DNA 중합효소이다.

3‘ to 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소를 이용한 연장 반응이 수반되는 반응

또한, 본 발명은 3‘ to 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 연장반응과 수반되어 수행되어질 수 있다. 이 경우, 이용되는 프로브는 상기 3‘ to 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 연장반응이 수반되지 않는 반응에서 상술한 바와 같이 3’ to 5'-엑소뉴클레아제 활성에 적합한 프로브를 포함한다. 또한 이 경우, 본 발명의 프로브는 프라이머의 역할을 할 수도 있다.

본 발명의 구현예로 본 발명은 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성 갖는 효소 및 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 동시에 이용하여 실시할 수 있다. 이 경우, 이용되는 프로브는 상술한 바와 같이 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성 및 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성에 적합한 프로브 2종을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장반응이 수반되지 않는 단계 (b)는 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시될 수 있다. 역방향 프라이머에 의해 프로브로부터 나오는 형광 시그널을 증가시킬 수 있다는 것은 매우 흥미로운 발견이다. 프로브만을 이용한 반응보다는 프로브와 역방향 프라이머를 동시에 이용하면 프로브가 결합할 단일가닥의 타겟 핵산서열이 보다 많이 확보되며 결국 최종적인 형광 시그널이 더욱 강하고 명확하게 나온다.

엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 프로브가 절단되고 리포터 분자의 형광이 발생하게 되며, 이 형광 시그널은 당업계의 통상적인 방법, 예컨대 형광측정기를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 결국, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 형광 시그널이 검출될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (b-1)-(b-3)를 최소 3회 이상 반복한다. 반복 회수는 특별하게 제한되지 않으며, 최소 2회, 바람직하게는 최소 3회, 보다 바람직하게는 최소 5회, 보다 더 바람직하게는 최소 10회이다. 단계 (b-1)-(b-3)을 반복하면 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 기회가 증가하며, 이에 반복 횟수에 의존적으로 형광이 증가하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b-5)의 검출은 단계 (b-4)의 반복의 매 사이클마다 실시하여 실시간으로 형광 시그널을 검출하여 실시할 수 있다.

단계 (b-4)의 반복이 종료된 후, 즉 엔드포인트에서 형광 시그널을 검출할 수 있으나, 바람직하게는 실시간으로 매 사이클마다 형광 시그널을 검출하여, 검출의 정확도를 개선시킨다.

최종 시그널을 발생시키는 본 발명의 형광 표지 시스템은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5 (694).

적합한 리포터-퀀처 pairs는 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명에서 리포터 및 퀀처로 이루어진 signalling system에서, 리포터는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 donor를 포괄하는 의미를 가지며, 퀀처는 FRET의 acceptor를 포괄하는 의미를 갖는다. 예컨대, 상기 리포터 분자는 플루오레세인 색소 (fluorescein dyes)로부터 선택되며, 상기 퀀처 분자는 로다민 색소 (rhodamine dyes)로부터 선택된다.

본 발명에서 이용되는 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함한다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다. 타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체를 특정 군으로 분류하기 위하여 실시하거나, 개별 암, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체를 개별구별 하기 위하여 실시하거나, 또는 상기 특정 군으로 분류 및 상기 개별구별을 동시에 실시한다.

본 발명의 특징 중 하나는, 한 번의 핵산서열 시료 확보에 의해 얻은 핵산서 열을 다양하게 이용하는 것으로서, 대표적으로 핵산서열을 특정 군으로 분류하거나 또는 개별구별 하는 데 이용한다.

본 명세서에서 용어 “군(group)"은 일정한 특성을 공유하는 일련의 핵산서열들을 의미한다. 예를 들어, Influenza A 바이러스, 2009 pandemic FluA H1N1, Human seasonal FluA H1 및 Human seasonal FluA H3로부터 유래된 핵산서열을 하나의 군(FluA 군)으로 분류하는 것이다. 본 명세서에서 개별구별(identification)은 특정 핵산서열의 유래를 정확하게 규명하는 것이다. 예를 들어, 핵산서열가 2009 pandemic FluA H1N1의 핵산서열임을 분석하는 것으로 개별구별이라 한다.

보다 바람직하게는, 상기 단계 (b)에 의해 분류되는 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체의 군은 최소 2개 이상, 보다 더 바람직하게는 최소 4개 이상이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체의 동일 군에 포함되는 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체를 검출하기 위하여 이용되는 프로브들은 동일한 방출 파장(emission wavelength)에서 검출될 수 있는 형광 리포터 분자가 결합되어 있다.

예를 들어, 본 발명에 따라 Influenza A 바이러스, 2009 pandemic FluA H1N1, Human seasonal FluA H1 및 Human seasonal FluA H3를 FluA 군으로 분류하는 경우, 상기 4 가지 바이러스에 특이적인 4종의 프로브에는 동일한 방출 파장(emission wavelength)에서 검출될 수 있는 형광 리포터 분자가 결합되어 있다. 따라서, 최종적으로 검출되는 형광의 파장을 분석하여 predetermined wavelength 가 검출되면 FluA에 감염된 것으로 판정 내릴 수 있다. 더 구체적으로, 어떠한 FluA 바이러스에 의해 감염되었는지는 추가적인 개별구별을 실시함으로써 이를 밝힐 수 있다.

동일한 방출 파장에서 검출될 수 있다는 것은, 현재의 형광 검출기의 분석능 하에서 동일 파장으로 인식될 수 있는 파장 범위를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체의 각각의 군을 분류하기 위하여 이용되는 각 군의 프로브는 서로 상이한 방출 파장에서 검출될 수 있는 형광 리포터 분자가 결합되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 개별구별 되는 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체는 최소 3종, 보다 바람직하게는 최소 4종의 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체를 포함한다.

본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 유전자 분석(genetic analysis)에서도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 서열이다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 의미한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서 뉴클레오타이드 변이의 검출은, 지노타이핑 또는 대립유전자형의 검출로 표현될 수 있다.

뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입 및 트랜스로케이션 등 모든 변이를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 액상에서 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭(multiplex target amplification and nested signal amplification)을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 멀티플렉싱 검출하기 위한 키트를 제공한다: (a) 최소 5종의 타겟 핵산서열을 멀티플렉스 증폭하기 위한 프라이머; (b) 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 최소 3종의 프로브; 및 (c) 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소.

본 발명의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

1. 이중-표지된 프로브(dual-labeled probe)의 사용량 감소로 인한 원가 절 감

본 발명은 기존의 Real-time PCR방식과는 달리, 멀티 타겟 핵산서열을 증폭한 후 증폭된 핵산 산물을 이용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 방법으로서, 기존의 방식보다는 수십 혹은 수백 배 이하의 농도의 프로브를 사용하여 효과적인 타겟 핵산서열 검출이 가능하다. 따라서 기존의 Real-time PCR 제품의 주요 문제점 중 하나인 고가인 문제점을 해결 할 수 있다.

2. 소량의 시료를 이용하여 다양한 검사 가능

기존의 검사 방법에서는 바이러스 혹은 박테리아와 같은 병원체 감염 여부를 검사하기 위해서는 각각의 검사에 따른 시료가 별도로 요구된다. 즉, 바이러스 감염 검사를 위한 시료, 박테리아 감염 여부를 검사하기 위한 시료 및 곰팡이 감염 검사를 위한 시료가 각각 필요하다. 이와 반대로 본 발명에서는 하나의 반응 튜브에서 15종 혹은 30여 종 이상의 바이러스, 박테리아 및 곰팡이와 같은 병원체의 타겟 핵산서열을 동시에 증폭한 후, 이 증폭 산물을 이용하여 바이러스, 박테리아, 곰팡이 각각 검사 혹은 바이러스/박테리아, 바이러스/박테리아/곰팡이 등의 다양한 조합에 의하여 타겟 핵산서열 검출이 가능하다. 즉, 한 번의 시료 채취 및 소량의 시료를 이용하여 여러 가지 검사가 가능하다.

3. 증폭된 산물을 이용한 검출 방법으로 민감도가 뛰어나다

기존의 Real-time PCR의 경우에는 소량의 타겟 핵산서열을 이용하여 증폭과 동시에 검출하는 방법으로서 초기 타겟 핵산서열의 농도에 의존적이다. 이와 반면에 본 발명은 1차 증폭된 산물을 이용하여, 제2차 검출과정에서 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭하는 과정이 추가됨으로써 기존 방법 보다 뛰어난 민감도를 갖는다. 즉, 본 발명에 따르면 nested PCR과 유사한 민감도 개선 효과를 달성할 수 있다.

4. 검사 비용 절감 및 검사 시간 단축

본 발명에서는 하나의 반응 튜브에서 다종의 바이러스, 박테리아 및 곰팡이와 같은 병원체의 타겟 핵산서열을 동시에 증폭한 후, 이 증폭된 산물을 이용하여 1차적으로 screening(분류) 검사를 수행하고, 동일한 증폭된 산물을 이용하여 감염 양성으로 확인된 병원체를 2차적으로 동정감별(개별구별) 검사를 수행 할 수 있다. 즉, 제 1차 검사에서는 바이러스, 박테리아 혹은 곰팡이의 감염 여부를 검사하는 screening 검사를 수행하고, 만약에 바이러스에 감염 양성 판정이 나오면 어떠한 바이러스가 감염되었는지 추가적인 증폭 반응 없이 간단하고 빠르게 동정 할 수 있다. 이와 반면에 기존의 방법에서는 screening 하여 바이러스 양성 결과를 얻었더라도, 별도로 바이러스 핵산서열을 증폭하는 과정을 반복하여야 한다. 이에 한 번의 증폭과정을 통하여, 이 증폭된 산물을 이용하여 다양한 검사가 가능함으로 별도의 증폭에 필요한 검사 시간 및 비용이 불필요하다.

5. 장비 효율

본 발명에서는 타겟 핵산서열의 증폭 반응은 일반적인 증폭장비를 이용하여 수행되며, 검출과정은 실시간 검출 장비를 통하여 30분 안에 이루어진다. 따라서 일반적인 증폭장비를 이용하여 증폭된 산물들이 준비가 되면, 30분마다 96개(실시간 검출 장비가96 well인 경우)의 시료를 검사 할 수 있다. 이와 반면에 기존의 Real-time PCR 방법은 96개 시료 검출마다 최소 2시간 30분이 필요하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: Design of primers and probes

본 발명의 타겟 핵산서열 검출을 구현하기 위하여, 표 1과 같이 프라이머 및 프로브를 제조한다. 본 발명에 있어서 사용되는 프라이머는 DPO 구조를 가지며, 프로브는 변형 DSO 구조를 갖는다. 본 발명에서 비고정화 프로브의 5’-말단에 FAM, HEX, ROX or Cy5를 리포터로, 3’-방향 쪽에 Iowa Black FQ(IBFQ) or Iowa Black RQ(IBRQ)를 퀀처로 사용하였다.

명칭	타입		서열	서열번호
Nmen_F510	프라이머		GTGCGYTTGGTGCAGAATAATGIIIIIAATGTRTCGG	SEQ ID NO:1
Nmen_R921	프라이머		TATAGCGGAACACAAACACACCAIIIIIATCAGAACGG	SEQ ID NO:2
Nmen_PF1	비고정화 프로브		/56-FAM/ATACGAATGTI/iIAbFQ/IIIITGACACGTGGCAATGTAGTACGAAC/3Phos/	SEQ ID NO:3
GBS_cfb_F1	프라이머		AGATCCATTTGCTTCAGTTGATTCIIIIIAAGCTCAAGT	SEQ ID NO:4
GBS_cfb_R2	프라이머		GCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATIIIIIAATCTCTTGAT	SEQ ID NO:5
GBS_PF1_SC	비고정화 프로브		/56-FAM/CAATCACACAI/iIAbFQ/IIIITTGGAGTTCAGTTGAATCCAAATGTTA/3Phos/	SEQ ID NO:6
GBS_PF1_ID	비고정화 프로브		/5HEX/CAATCACACAI/iIAbFQ/IIIITTGGAGTTCAGTTGAATCCAAATGTTA/3Phos/	SEQ ID NO:7
SP(g)_F20	프라이머		ATCTGCAGGCACAGGATTATGIIIIIAGTCAAATTC	SEQ ID NO:8
SP(g)_R688	프라이머		CACCTTCATAATGATAATGCTTGGIIIIITCCAAACCTT	SEQ ID NO:9
SP(g)_PF1_SC	비고정화 프로브		/56-FAM/ACCATCTAGTI/iIAbFQ/IIIIAAATTGTTGATAACTCAATTGACGAGG/3Phos/	SEQ ID NO:10
SP(g)_PF1_ID	비고정화 프로브		/5Cy5/ACCATCTAGTI/iIAbRQ/IIIIAAATTGTTGATAACTCAATTGACGAGG/3Phos/	SEQ ID NO:11
Lmon_hly_F3	프라이머		CAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAIIIIIAAATATGCTC	SEQ ID NO:12
Lmon_hly_R3	프라이머		TAAAACTAATGACTTCTTCTTGCATTTTIIIIICACTGATTGC	SEQ ID NO:13
Lmon_PF1_SC	비고정화 프로브		/56-FAM/TTGATTATGAI/iIAbFQ/IIIIAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATT/3Phos/	SEQ ID NO:14
Lmon_PF1_ID	비고정화 프로브		/5ROXN/TTGATTATGAI/iIAbRQ/IIIIAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATT/3Phos/	SEQ ID NO:15
CMV_IE_F1	프라이머		TGGATGAGGAGAGAGACAAGGTGIIIIIGCACATTGAT	SEQ ID NO:16
CMV_IE_R2	프라이머		GCTCAGACTTGACAGACACAGTGTCIIIIIGCTCCTCCTG	SEQ ID NO:17
CMV_PF1	비고정화 프로브		/5HEX/TCTGATAACCI/iIAbFQ/IIIITGAGGTTATCAGTGTAATGAAGCGC/3Phos/	SEQ ID NO:18
HSV2_gD_F3	프라이머		GTCGTCTGCGCCAAATACGIIIIIGCAGACCCCT	SEQ ID NO:19
HSV2_gD_R2	프라이머		CAGGCGATGGTCAGGTTGTIIIIITGCTTTCGGG	SEQ ID NO:20
HSV2_PF1_SC	비고정화 프로브		/5HEX/AGCATCCCGAI/iIAbFQ/IIIIGTGTACTACGCAGTGCTGGAACGT/3Phos/	SEQ ID NO:21
HSV2_PF1_ID	비고정화 프로브	/56-FAM/AGCATCCCGAI/iIAbFQ/IIIIGTGTACTACGCAGTGCTGGAACGT/3Phos/		SEQ ID NO:22

VZV_ORF66_F2	프라이머	CCTGCCGTGGACATATGGAGIIIIIGGATTGTATT	SEQ ID NO:23
VZV (324)-R	프라이머	AGATTTGTCCACAATGGCCTGIIIIIGGGTTTTCGAG	SEQ ID NO:24
VZV_PF1-SC	비고정화 프로브	/5HEX/CTACAGGACAI/iIAbFQ/IIIICGTTATTTGAACGAGACGGTTTAGAT/3Phos/	SEQ ID NO:25
VZV_PF1-ID	비고정화 프로브	/5ROXN/CTACAGGACAI/iIAbRQ/IIIICGTTATTTGAACGAGACGGTTTAGAT/3Phos/	SEQ ID NO:26
HSV1_UL30_F2	프라이머	CGGGATTATAACCGACAAGATCAAIIIIICGAGCTACAA	SEQ ID NO:27
HSV1_UL30_R1	프라이머	AACAGCTGGCCCACCAGCIIIIIATCCTGTATG	SEQ ID NO:28
HSV1_PF1_SC	비고정화 프로브	/5HEX/TCCTGAAGGAI/iIAbFQ/IIIIAGAAGGACCTGAGCTATCGCGAC/3Phos/	SEQ ID NO:29
HSV1_PF1_ID	비고정화 프로브	/5Cy5/TCCTGAAGGAI/iIAbRQ/IIIIAGAAGGACCTGAGCTATCGCGAC/3Phos/	SEQ ID NO:30

I : Deoxyinosine

3Phos : 3'-phosphorylation

5IAbFQ and iIAbFQ : 5'-end and internal Quencher (Iowa Black FQ)

5IAbRQ and iIAbrQ : 5'-end and internal Quencher (Iowa Black RQ)

3AmM : 3' Amino modifier C6

실시예 2: Preparation of template DNA

박테리아 DNA의 준비

뇌수막염 (Meningitis)원인 bacteria인 Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Listeria monocytogenes 그리고 Group B Streptococcus를 감별하기 위하여 동정된 분리주로부터 박테리아 genomic DNA를 분리하여 본 발명의 핵산서열 증폭 반응에 주형으로 사용한다.

바이러스 DNA의 준비

뇌수막염 (Meningitis)원인 virus인 HSV1, HSV2, VZV 그리고 CMV를 감별하기 위하여 동정된 분리주로부터 virus DNA를 분리하여 본 발명의 핵산서열 증폭 반응에 주형으로 사용한다.

실시예 3: 다중 타겟 핵산서열 증폭

박테리아 DNA, virus DNA 및 프라이머 준비

실시예 2에서의 동정 분리한 박테리아 및 바이러스 DNA를 주형(template)로 이용하며, 실시예 1에 의해 준비한 프라이머를 이용한다.

다중 타겟 핵산 서열 증폭

본 발명의 구현을 위하여 뇌수막염 원인균 및 바이러스 증폭산물을 생성하기 위하여 중합효소연쇄반응을 수행한다. DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 200 μM dNTPs, 각각 500 nM 전방향 프라이머(SEQ ID NO: 1, 5, 10, 15, 20, 24, 29 and 34), 각각 500 nM 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 2, 6, 11, 16, 21, 25, 30 and 35), 3.5 mM MgCl₂, 1 U Taq 중합효소, 박테리아 혹은 바이러스 DNA를 포함한 시료 20 ㎕를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한다. 중합효소연쇄반응은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems)을 이용하여 94°C에서 15분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 40회 반복한 후, 72°C에서 10분간 반응한다. 중합효소연쇄반응 완료 후, 3 ㎕의 중합효소연쇄반응물을 2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하여 증폭산물의 생성을 확인할 수 있었다. 증폭산물은 중합효소연쇄반응에 사용되지 않고 남은 프라이머와 dNTPs을 제거하기 위하여 정제하였다.

실시예 4: Screening using amplified target nucleic acids in liquid phase

증폭산물 및 프로브 준비

실시예 3에서 정제한 증폭산물을 본 발명의 액상에서의 박테리아 혹은 바이러스 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 screening 반응에 이용하였으며, 실시예 1에 의해 준비한 프로브를 이용한다. 비고정화 프로브의 5’-말단에 FAM or HEX을 리포터로, 3’-방향 쪽에 Iowa Black FQ(IBFQ)를 퀀처로 사용하였다.

Screening of viruses and bacteria using amplified target nucleic acids

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각각 800 nM 비고정화 프로브 (SEQ ID NO: 3, 7, 12, 17, 22, 26, 31 and 36), 3.5 mM MgCl₂, 1 U의 5’→3’ 엑소뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 2 ㎕의 정제한 증폭산물을 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 타겟 시그널 증폭반응을 수행한다. 실시간 타겟 시그널 증폭반응은 94°C에서 15분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 30회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다. 바이러스 혹은 박테리아 타겟 핵산서열에 대한 형광의 강도 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명이 실시예로 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: Identification of bacteria using amplified target nucleic acids in liquid phase

증폭산물 및 프로브 준비

실시예 3에서 정제한 증폭산물을 본 발명의 액상에서의 박테리아 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 identification 반응에 이용하였으며, 실시예 1에 의해 준비한 프로브를 이용한다. 비고정화 프로브의 5’-말단에 FAM, HEX, ROX or Cy5을 리포터로, 3’-방향 쪽에 Iowa Black FQ(IBFQ) or Iowa Black RQ(IBRQ)를 퀀처로 사용하였다.

Identification of bacteria using amplified target nucleic acids

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각각 800 nM 비고정화 프로브 (SEQ ID NO: 3, 8, 13 and 18), 3.5 mM MgCl₂, 1 U의 5’→3’ 엑소뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 2 ㎕의 정제한 증폭산물를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 시그널 증폭반응을 수행한다. 실시간 시그널 증폭반응은 94°C에서 15분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 30회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다. 각각의 박테리아 타겟 핵산서열에 대한 형광의 강도 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명이 실시예로 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: Identification of viruses using amplified target nucleic acids in liquid phase

증폭산물 및 프로브 준비

실시예 3에서 정제한 증폭산물을 본 발명의 액상에서의 바이러스 타겟 핵산서열의 검출을 위한 identification 반응에 이용하였으며, 실시예 1에 의해 준비한 프로브를 이용한다. 비고정화 프로브의 5’-말단에 FAM, HEX, ROX or Cy5을 리포터로, 3’-방향 쪽에 Iowa Black FQ(IBFQ) or Iowa Black RQ(IBRQ)를 퀀처로 사용하였다.

Identification of viruses using amplified target nucleic acids

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각각 800 nM 비고정화 프로브 (SEQ ID NO: 22, 27, 32 and 37), 3.5 mM MgCl₂, 1 U의 5’→3’ 엑소뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 2 ㎕의 정제한 증폭산물를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 시그널 증폭반응을 수행한다. 실시간 시그널 증폭반응은 94°C에서 15분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 30회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다. 각각의 바이러스 타겟 핵산서열에 대한 형광의 강도 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명이 실시예로 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 모식도이다. 최소 2개 이상의 타겟 핵산서열을 포함하는 각각의 그룹들이 존재하며, 이 그룹들은 질병 관련 마커, 유전자 변이 혹은 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 등과 같은 감염 병원체들로 구성되어질 수 있다. 본 모식도에서는 3개로 나누어진 그룹을 보여주며 그룹 #1 과 #2는 바이러스, 그룹 #3에는 박테리아가 포함되어져 있다.

첫 번째 단계에서는 각 그룹에 포함되는 바이러스 및 박테리아 핵산서열은 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 의하여 증폭되며, 증폭된 다중 핵산산물들은 여러 가지 조합에 의해 검출이 가능하게 하는 master template(amplified multiple products)로써 역할을 한다.

두 번째 단계에서는 증폭된 master template를 이용하여 여러 조합으로 타겟 핵산서열을 검출한다. 예를들어, 그룹 #1 과 #2에 포함되는 바이러스 7종 및 그룹 #3에 포함된 박테리아 3종을 한 번의 반응으로 screening을 수행하여 바이러스 및 박테리아 감염을 확인할 수 있다. 만일 바이러스 감염이 확인되었을 경우에는 추가적인 바이러스 증폭반응 없이, 첫 번째 단계에서 증폭된 mater template를 이용하여 subtyping 혹은 identification 과정을 간단하고 신속하게 수행하여 어떠한 바이러스에 감염되었는지 확인이 가능하다. 박테리아가 감염되었을 경우에도 위와 같이 동일한 방법을 통하여 효율적으로 screening, subtyping 및 identification 과정을 수행할 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예를 보여주는 모식도이다. 뇌수막염을 유발하는 감염 병원체로써 바이러스, 엔테로바이러스 및 박테리아 3개의 그룹으로 나누어지며, 각 그룹에는 각각 6종 바이러스, 3종 바이러스, 5종 박테리아가 포함된다.

첫 번째 단계에서는 각 그룹에 포함되는 뇌수막염 유발 바이러스 및 박테리아 핵산서열은 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 의하여 증폭되며, 도1과 동일하게 master template(amplified multiple products)로써 역할을 한다.

두 번째 단계에서는 증폭된 master template를 이용하여 여러 조합으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 그룹과 엔테로바이러스 그룹에 포함되는 바이러스 9종 및 박테리아 그룹에 포함된 박테리아 5종을 한 번의 반응으로 screening을 수행하여 총 14종의 바이러스 및 박테리아 감염을 확인할 수 있다. 만일 바이러스 감염이 확인되었을 경우에는 추가적인 바이러스 증폭반응 없이, 첫 번째 단계에서 증폭된 mater template를 이용하여 subtyping 혹은 identification 과정을 간단하고 신속하게 수행하여 9종의 바이러스 중에 어떠한 바이러스에 감염되었는지 확인이 가능하다. 박테리아가 감염되었을 경우에도 위와 같이 동일한 방법을 통하여 효율적으로 screening, subtyping 및 identification 과정을 수행할 수 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 액상에서 멀티플렉스 타겟 증폭 및 네스티드 시그널 증폭(multiplex target amplification and nested signal amplification)을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 멀티플렉싱 검출방법:

(a) 멀티플렉스 타겟 증폭을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 생물학적 시료 내의 최소 5종의 타겟 핵산서열을 증폭할 수 있는 멀티플렉스 증폭반응을 수행하여 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻으며;

(b) 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 상기 앰플리콘, 프로브 및 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 nested signal amplification 및 검출을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 다음의 소단계를 포함한다:

(b-1) 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 최소 3종의 프로브에 상기 앰플리콘을 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 3종의 프로브 및 상기 앰플리콘의 혼성화는 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 실시되고;

(b-2) 상기 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로 상기 혼성화된 프로브를 절단하여, 상기 절단에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 프로브로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되도록 실시하며;

(b-3) 상기 프로브-앰플리콘의 이합체(duplex) 또는 상기 앰플리콘의 이합체를 변성시키는 단계;

(b-4) 상기 단계 (b-1)-(b-3)을 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 및

(b-5) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 생물학적 시료 내의 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체를 특정 군으로 분류하기 위하여 실시하거나, 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체를 개별구별 하기 위하여 실시하거나, 또는 상기 특정 군으로 분류 및 상기 개별구별을 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b)에 의해 분류되는 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체의 군은 최소 2개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에 의해 분류되는 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체의 군은 최소 4개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 또는 감염 병원체의 동일 군에 포함되는 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체를 검출하기 위하여 이용되는 프로브들은 동일한 방출 파장(emission wavelength)에서 검출될 수 있는 형광 리포터 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체의 각각의 군을 분류하기 위하여 이용되는 각 군의 프로브는 서로 상이한 방출 파장에서 검출될 수 있는 형광 리포터 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 개별구별 되는 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체는 최소 3종의 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 개별구별 되는 개별 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체는 최소 4종의 암 관련 유전자, 질병관련 유전자 혹은 감염 병원체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하거나, 3‘ to 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하거나, 혹은 5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 3‘ to 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 모두를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 멀피플렉스 증폭은 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 증폭 프라이머를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-X_p-Y_q-Z_r-3’ (I)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 연장 프라이머의 연장반응을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 다음의 소단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(b-1) 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 최소 3종의 프로브 및 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 상기 프로브의 5‘-말단 방향 쪽에 위치한 최소 3종의 연장 프라이머에 상기 앰플리콘을 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 3종의 프로브, 최소 3종의 연장 프라이머 및 상기 앰플리콘의 혼성화는 상기 단계 (a)와는 다른 반응 용기에서 실시되고;

(b-2) 5‘ to 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 주형-의존성 연장반응을 실시하여 상기 연장 프라이머를 연장시키고 상기 프로브를 절단하는 단계로서, 상기 절단에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 프로브로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되도록 실시하며;

(b-3) 상기 앰플리콘의 이합체를 변성시키는 단계;

(b-4) 상기 단계 (b-1)-(b-3)을 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 및

(b-5) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
제 12 항에 있어서, 상기 프로브는 하기 일반식 II의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (II)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 프라이머가 존재하지 않고 연장반응 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 프로브는 5’-말단에 타겟 핵산서열에 대하여 매치 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 프로브는 그의 3’-말단 부위에 상기 타겟 핵산서열에 대한 인위적 미스매치 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 프로브의 미스매치 뉴클레오타이드 서열은 3’-말단 또는 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 프로브의 미스매치 뉴클레오타이드 서열은 3’-말단에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 프로브의 미스매치 뉴클레오타이드 서열은 단일 미스매치 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소 및 5’to 3’-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 동시에 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 프로브는 하기 일반식 II의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (I)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’ 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
제 17 항에 있어서, 상기 프로브는 하기 일반식 III의 미스매치-운반 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-X_p-Y_q-Z_r-D_a-3’ (III)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5’-제1차 혼성화 부위(5’-first hybridization portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 혼성화 부위(3’-second hybridization portion)이고, D_a는 3’to 5’-엑소뉴클레아제 활성에 의한 절단부위이고 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하고, p, q, r 및 a는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y, Z 및 D는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제2차 혼성화 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 혼성화 부위가 3’-제2차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 프로브 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 혼성화 부위와 3’-제2차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.