KR20110048734A

KR20110048734A - 5―미스매치 프로브 타겟 검출

Info

Publication number: KR20110048734A
Application number: KR1020090105428A
Authority: KR
Inventors: 천종윤; 황인택
Original assignee: 주식회사 씨젠
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2011-05-12

Abstract

본 발명은 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명은 프로브의 5’말단에 일정수의 미스매치 서열이 존재하는 경우 핵산 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 효율이 향상되는 것을 밝혀내고, 상기 프로브를 이용하여 실시간으로 보다 빠르게 효율적으로 타겟 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다. 본 발명의 5'-미스매치 프로브를 사용하여, 반복적 뉴클레아제 반응과정에 의해 프로브의 형광 시그널을 증폭하는 경우에는 본 발명의 미스매칭 프로브를 사용하지 않는 경우에 비하여 (i) 감소된 Ct 값 또는 (ii) 동일 사이클에서 보다 높은 fluorescence intensity가 얻어지므로 보다 효율적으로 형광 시그널을 증폭할 수 있다. 본 발명은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 mDSO 형태의 프로브에 상기 미스매칭 프로브의 원리를 적용하여 사용함으로써, 형광 시그널의 발생 효율을 증대시킬 뿐만 아니라 기존 형태의 프로브 (TaqMan probe 등)의 비-타겟 핵산 서열과의 혼성화에 의한 위양성 (false positive) 시그널을 획기적으로 제거할 수 있다.

실시간, 타겟, 서열, 검출, 프라이머, 프로브, 미스매치

Description

5―미스매치 프로브 타겟 검출{5―Mismatch Probe Target Detection}

본 발명은 5’―미스매치 프로브를 이용한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.

타겟 핵산을 검출하기 위한 대부분의 기술들은 타겟 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 필수적인 과정이고, 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등 (WO 89/06700)은, 프로모터/프라이머 서열을 타깃 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화 시킨 다음, 상기 서열의 많은 RNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 다른 공지의 핵산 증폭 방법들은 전사 증폭 시스템을 포함한다(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); 및 Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).

중합효소 연쇄반응(이하,“PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

PCR-관련 기술들은 생물학과 의학의 연구 분야에서 다양한 응용과 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 타겟 서열의 검출, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이 (Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR-관여 게놈 분석(McPherson and Moller, 2000)이 있다.

핵산 증폭은 상술한 바와 같이 널리 이용되고 있기 때문에, 핵산 증폭 방법을 개선하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다.

이러한 연구들 중에서, Real-time PCR은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 cross-contamination을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다는 측면에서 크게 주목을 받고 있다. Real-time PCR 방법들 중에서 현재 가장 많이 이용되고 있는 TaqMan probe법은 프로브의 한 쪽 끝에 리포터 분자를 붙이고 다른 한 끝에는 퀀처 분자를 붙여, PCR이 진행될 때 리포터 분자가 퀀처 분자와 떨어지면서 발산되는 고유의 형광을 검출하는 방식이다. Real-time PCR에 관한 종래 특허문헌으로는, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145가 있다.

그러나 TaqMan probe 방식은 TaqMan probe의 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생되는 문제점이 있다.

한편, 미합중국 특허 No. 5,210,015는 probe의 5’말단 부위에 타겟 핵산 서열과 비상보적인 3개 또는 10개의 뉴클레오타이드로 구성된 테일(tail)이 존재하는 경우에도, probe의 절단이 발생한다는 것을 개시하고 있다. 상기 특허 문헌에 개 시된 내용은 real-time PCR 과정의 미스매치 tolerance를 개시하고 있을 뿐이다. 즉, 상기 특허 문헌은 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제(technical problem to be solved)인 프로브의 절단 반응성 개선에 의한 타겟 핵산서열에 대한 시그널 증폭 효율성 개선을 개시, 교시 또는 암시하고 있지 않으며, probe의 5’말단 부위에 있는 미스매치 서열이 프로브의 절단 반응의 효율성에 영향을 미칠 수 있다는 사실 및 절단 반응성을 증가시킬 수 있는 점에 대해서는 개시하고 있지 않다.

한편, Self-quenching fluorescence probe 방식(U.S. Pat. No. 5,723,591)은 형광 리포터와 퀀처가 표지된 Self-quenching fluorescence probe가 단일가닥 상태 일 때는 퀀칭이 되어, 형광이 검출이 되지 않지만, Self-quenching fluorescence probe가 주형 DNA에 결합만 하면, 주형과 이중가닥이 되면서, 형광 리포터분자가 퀀처 분자에 의하여 탈형광 (unquench) 되지 않아 형광이 검출된다. 즉, Self-quenching fluorescence probe가 단일가닥 상태인지 혹은 이중가닥 상태인지 유무에 따라, 형광이 검출이 되기 때문에, 특이적-결합 또는 비-특이적 결합 상관없이, 주형에 결합만 하면 형광이 검출이 되기 때문에 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생한다.

한편, DNA-기반 마이크로어레이 기술은 특정 유전자 또는 유전자군의 존재, 양 또는 발현패턴을 분석할 수 있는 간단한 방법으로서 큰 각광을 받고 있다(Schena et al., Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science, 270:467-470(1995); DeRisi et al., Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patterns in Human Cancer, Nature Genetics 14:457-460(1996)).

현재까지 개발된 DNA 마이크로어레이 기술들은, 특정 유전자 또는 변이를 검출하거나 발현 패턴을 분석하는 것과 관련이 되어 있다.

그러나, 종래의 DNA 마이크로어레이는 단지 혼성화 방식에 의해서 타겟 서열을 검출하기 때문에 cross reaction에 의한 false positives 문제가 발생되어, 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다. 또한, 종래의 마이크로어레이의 경우 혼성화 방식에 의해서 검출을 하기 때문에 혼성화 후 까다로운 세척 과정이 요구되는 문제점이 있으며, 혼성화 전에 타겟 서열을 단일가닥으로 만드는 과정이 필수적으로 요구된다.

한편, 최근에 발표된 on-chip PCR은 혼성화 또는 probe extension 방식에 의해 검출하기 때문에, 기존 마이크로어레이와 같이 heterogenous assay system이며, 실시간 검출이 불가능 하고 정확한 정량이 어렵다는 문제점이 있다.

따라서, 상술한 종래의 타겟 서열을 검출하기 위한 기술들의 문제점을 극복하여, 타겟 서열, 바람직하게는 다수의 타겟 서열을 보다 개선된 효율성 및 민감도로 실시간 검출할 수 있는 기술에 대한 요구가 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 실시간으로 보다 빠르면서 효율적으로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출방법에서 5’-말단에 미스매치 서열이 있는 프로브를 이용하면 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성(cleavage processivity)이 증가되며 이에 의해 형광 시그널이 증가하여 보다 빠르면서 보다 개선된 민감도로 타겟 핵산서열을 검출할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 프로브의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출방법에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 5’-미스매치 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공한다:

(a) 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머는 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 5’-미스매치 프로브는 (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말 단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하며;

(b) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프로브는 5’-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며; 그리고,

(c) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공한다:

(a) 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머는 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 5’-미스매치 프로브는 (i) 상 기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하며;

(b) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프로브는 5‘-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며;

(c) 상기 단계 (b)의 반응 결과물을 변성시키는 단계;

(d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 그리고

(e) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.

본 발명자들은 타겟 핵산서열의 검출의 효율을 높이기 위한 방안으로서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 높이기 위해서는 이 활성의 기질인 프로브와 타겟 핵산서열의 이합체를 조절(adjust)할 필요가 있을 것이라는 가설을 정립하였다. 이에 따라 프로브의 타겟 핵산서열에 대한 특이성을 해치지 않는 범위에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성이 처음 작용하는 프로브의 5’-말단에 미스매치 서열을 부여하여 프로브의 5’-말단이 타겟 핵산서열에 결합되지 않도록 하였다. 그 결과, 5’-말단에 미스매치 서열을 부여한 프로브의 경우 5’-말단에 미스매치 서열을 부여하지 않은 프로브에 비하여 향상된 형광 시그널을 제공하였다. 이러한 현상은 5’-말단에 존재하는 미스매치 부위가 주형 의존성 핵산 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응에 영향을 미쳐 프로브의 절단 반응성이 증가하였다고 해석될 수 있으며, 이러한 발견에 기초하여 본 발명이 구상되었다.

따라서 본 발명은 "5'-Mismatch Probe Target Detection Assay"로 명명된다.

본 발명에 따르면, 우선 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시킨다.

본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 핵산”은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 증폭 조건 및 혼성화 조건에서 본 발명의 프라이머 및 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드 (dNTPs)와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다.

본 명세서에서 용어 “연장 프라이머(extension primer)"는 타겟 핵산서열에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산서열에 상보적인 서열을 형성하는 프라이머를 의미한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명의 프로브는 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 연장 프라이머에 의해 지정되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다(참조: 도면). 따라서 본 발명의 방법에 따르면 타겟 핵산서열은 프로브 및 연장 프라이머 두 개에 의해 프로빙 된다.

한편, 프로브와 연장 프라이머가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 프로브 의 5’-말단은 상기 연장 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 연장 프라이머는 하기 일반식 I 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다:

5’-X_p-Y_q-Z_r-3’ (I)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상 시킨다.

본 명세서에서 용어 “이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO)”는 본 발명자들에 의해 처음 제시된 것이다(WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6 e40(2007)). DPO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5'-고 Tm 특이성 부위(또는 5'-제1차 프라이밍 부위) 및 3'-저 Tm 특이성 부위(또는 3'-제2차 프라이밍 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 매우 놀라운 특이성을 나타낸다(see WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim, et . al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii et . al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, DPO는 서로 다른 어닐링 특성을 가지는 두 개의 프라이머 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5'-제1차 프라이밍 부위; 및 타겟-특이적 연장반응을 결정하는 3'-제2차 프 라이밍 부위. 이 DPO는 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.

이러한 DPO 구조를 갖는 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열을 증폭(특히, 멀티플렉스 증폭)하는 경우에는 위양성 또는 위음성 결과 없이 성공적으로 앰플리콘을 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드(바람직하게는 3-10, 보다 바람직하게는 3-7, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드)를 포함한다.

바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

본 발명에서 이용되는 5’-미스매치 프로브는 (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부 위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1-5개, 보다 바람직하게는 1-4개, 보다 더 바람직하게는 1-3개, 보다 더욱 더 바람직하게는 1-2개, 가장 바람직하게는 1개 (바람직하게는 5‘-말단에 위치)의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 의하면, 5’-말단에 미스매치 서열을 부여한 프로브의 경우 5’-말단에 미스매치 서열을 부여하지 않은 프로브에 비하여 프로브의 절단 반응성이 증가하며, 일정 수 이상의 미스매치 뉴클레오타이드가 부여되는 경우에는 프로브의 절단 반응성의 증가 효과가가 미미해지거나 소멸한다.

이러한 미스매치 뉴클레오타이드는 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위에서 연속적(continuous) 또는 간헐적(intermittent)으로 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 형광 리포터 분자는 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위 또는 혼성화 뉴클레오타이드 서열에 상기 퀀처 분자는 혼성화 뉴클레오타이드 서열 또는 미스매치 부위에 위치한다. 예를 들어, 형광 리포터 분자는 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위에 위치하고 퀀처 분자는 혼성화 뉴클레오타이드 서열에 위치하며, 주형-의존성 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 미스매치 부위가 절단되어 형광 리포터 분자가 해리되면 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 5’-미스매치 프로브는 하기 일반식 Ⅱ의 5’-미스매치 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(5’-mismatch mDSO) 구조를 갖는다:

5’-M’_b-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (Ⅱ)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, M’_b는 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지는 미스매치 부위, p, q, r 및 b는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’, Z’및 M’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 5’-mismatch mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고, 상기 미스매치 부위는 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시킨다.

본 명세서에서 용어 “5’-mismatch 변형 DSO(5’-mismatch mDSO) 구조”는 DSO(dual specificity oligonucleotide) 구조에서 유래된다. 5’-mismatch mDSO의 상세한 설명은 상술한 DPO 구조를 인용하여 설명될 수 있다.

바람직하게는, 상기 3'-제1차 혼성화 부위의 길이는 5'-제2차 혼성화 부위보다 길다. 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 부위는 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.

상기 미스매치 부위는 바람직하게는 1-5개, 보다 바람직하게는 1-4개, 보다 더 바람직하게는 1-3개, 보다 더욱 더 바람직하게는 1-2개, 가장 바람직하게는 1개(바람직하게는 5‘-말단에 위치)의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는 3- 15℃의 Tm을 갖는다.

5’-mismatch 변형 DSO 구조는 상기 DPO 구조의 5'-제1차 혼성화 부위 및 3'-제2차 혼성화 부위가 서로 역전된 것으로서, 5’-mismatch 변형 DSO 구조에서 초기의 안정된 혼성화는 3'-제1차 혼성화 부위가 담당하고 추가적인 타겟-특이성의 결정은 5'-제2차 혼성화 부위가 담당하게 된다.

프로브를 이용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 종래 기술에 따르면, 프로브가 가지고 있는 내재적인 한계 때문에 false signals를 완벽하게 제거할 수 없다. 그러나 본 발명에 따르면 5’-mismatch mDSO 프로브의 독특한 구조에 의해 타겟 핵산서열의 검출을 위양성 데이터 없이 실시할 수 있다.

본 발명에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서 false signals 없이 실시할 수 있는 이유 중 하나는 프로브가 가지고 있는 5’-mismatch mDSO 구조에 의한 혼성화 특이성이다.

상술한 바와 같이, 5’-mismatch mDSO 구조를 가지는 프로브의 intriguing design에 의해 타겟 핵산서열에 매우 특이적으로 혼성화 되어 검출 정확도를 크게 개선시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계는 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시되며 이에 의해 상기 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 역방향 프라이머의 주형-의존성 연장반응으로 주형이 합성된다. 보다 바람직하게는, 상기 역방향 프라이머는 상기 DPO 구조를 갖는다.

5’-mismatch 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다):

Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5 (694).

또한, 자체 형광 없이 광범위한 파장 또는 특정 범위의 파장을 퀀칭할 수 있는 블랙 퀀처가 퀀처 분자로 사용될 수 있다.

적합한 리포터-퀀처 pairs는 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명에서 리포터 및 퀀처로 이루어진 signalling system에서, 리포터는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 donor를 포괄하는 의미를 가지며, 퀀처는 FRET의 acceptor를 포괄하는 의미를 갖는다.

예컨대, 상기 리포터 분자는 플루오레세인 색소 (fluorescein dyes)로부터 선택되며, 상기 퀀처 분자는 로다민 색소 (rhodamine dyes)로부터 선택된다.

상기 혼성화 과정에 이어, 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 연장 프라이머가 연장되고 5’-미스매치 프로브가 절단되어 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프 로브는 5’-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 Taq 중합효소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광 시그널 발생 과정에 이어, 단계 (b)의 반응 결과물을 변성시킨다. 변성 과정은 통상적으로 온도의 상승을 통해 실시된다. 이중 DNA 가닥을 변성시키는 온도 범위, 예컨대 80-97℃의 온도 범위에서 변성 과정을 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(c) 즉, 혼성화-접촉-변성의 단계를 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시킬 수 있으며, 역방향 프라이머의 존재 시에는 타겟 핵산 서열의 증폭도 가능하다. 반복 회수는 특별하게 제한되지 않으며, 최소 2회, 바람직하게는 최소 5회, 보다 바람직 하게는 최소 10회이다.

최종적으로, 형광 시그널을 검출한다. 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출은 단계 (d)의 반복의 매 사이클마다 실시하여 실시간으로 형광 시그널을 검출하여 실시한다. 단계 (d)의 반복이 종료된 후, 즉 엔드포인트에서 형광 시그널을 검출할 수 있으나, 바람직하게는 실시간으로 매 사이클마다 형광 시그널을 검출하여, 검출의 정확도를 개선시킨다.

본 발명에서 이용되는 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함한다.

mRNA가 타겟 핵산서열인 경우에는, 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머를 사용하거나, 랜덤 프라이머 혹은 타겟 특정적인 프라이머가 이용된다.

타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.

주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단되고 리포터 분자의 형광이 발생하게 되며, 이 형광 시그널은 당업계의 통상적인 방법, 예컨대 형광측정기를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 결국, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 형광 시그널을 검출할 수 있다.

본 발명의 장점이 잘 나타나는 경우는 2개 이상의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하는 멀티플렉스 검출이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 핵산서열을 포함하고, 상기 연장 프라이머는 최소 2종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머, 상기 5‘-미스매치 프로브는 최소 2종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프로브를 포함한다. 예를 들어, 하나의 반응 튜브에 5종의 연장 프라이머 및 5종의 5‘-미스매치 프로브(각각의 다른 발광 파장을 갖는 형광 리포터 분자가 결합되어 있다)를 포함시키고 여기에 분석하고자 하는 핵산서열을 첨가하여 반응시킨 경우, 5종의 연장 프라이머 및/또는 5종의 5‘-미스매치는 타겟 핵산서열에 혼성화 되고 본 발명의 과정에 의해 5종의 형광 시그널을 발생시켜, 5개의 타겟 핵산서열을 실시간으로 동시에 검출할 수 있다.

본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 유전자 분석(genetic analysis)에서도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 서열이다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 의미한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서 뉴클레오타이드 변이의 검출은, 지노타이핑 또는 대립유전자형의 검출로 표현될 수 있다.

뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입 및 트랜스로케이션 등 모든 변이를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 프로브의 제조방법을 제공한다:

(a) 타겟 핵산서열을 선택하는 단계;

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하도록 5’-미스매치 프로 브를 디자인하는 단계(designing the probe to comprise (i) a hybridizing nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid sequence, (ii) a mismatch portion for increasing the probe cleavage processivity of the 5' to 3' nuclease activity compared with probes without the mismatch portion containing at least one mismatch nucleotide sequence to the target nucleic acid sequence at its 5'-end and (iii) a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule capable for quenching the fluorescence of the fluorescent reporter molecule); 및

(c) 상기 디자인된 5’-미스매치 프로브를 제조하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출방법에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 방법을 제공한다:

(a) 타겟 핵산서열을 선택하는 단계;

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5’-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하도록 5’-미스매치 프로 브를 디자인하는 단계(designing the probe to comprise (i) a hybridizing nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid sequence, (ii) a mismatch portion for increasing the probe cleavage processivity of the 5' to 3' nuclease activity compared with probes without the mismatch portion containing at least one mismatch nucleotide sequence to the target nucleic acid sequence at its 5'-end and (iii) a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule capable for quenching the fluorescence of the fluorescent reporter molecule);

(c) 상기 타겟 핵산서열을 상기 디자인으로 제조된 5’-미스매치 프로브 및 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 연장 프라이머에 혼성화시키는 단계;

(d) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프로브는 5’-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며; 그리고,

(e) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.

상기 디자인된 5‘-미스매치 프로브는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 빌딩 블록(예컨대, 천연 또는 변형 뉴클레오사이드의 phosphoramidites)을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다(Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)).

본 발명의 절단 반응성을 증가시키는 프로브의 제조방법 및 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 방법과 상술한 타겟 핵산서열의 검출방법의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 개선된 반응성을 나타내는 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction)에 의한 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공한다:

(a) 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머 및 역방향 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프로브는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지는 실시간 PCR의 반응성(processivity of real time PCR) 을 증가시키기 위한 미스매치 뉴클레오타이드 서열 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭 할 수 있는 퀀처 분자를 포함하며;

(b) 상기 혼성화 결과물을 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 그리고,

(c) 상기 단계 (b)의 반응 결과물을 변성시키는 단계;

(f) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 타겟 핵산 서열 및 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 그리고

본 발명의 결과를 실시간 PCR에 적용하는 경우, 5’미스매치 프로브를 사용하여 형광시그널을 향상시키는 것은 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 것으로 해석될 수 있으며, 상기 형광시그널 향상 결과의 보다 일반적인 해석에 의하면 실시간 PCR의 반응성 (processivity of real time PCR)을 개선시키는 것으로 볼 수 있다.

본 발명의 개선된 반응성을 나타내는 실시간 PCR에 의한 타겟 핵산서열의 검출방법 및 상술한 타겟 핵산서열의 검출방법의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:

(a) 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 연장 프라이머; 및

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하는 5’-미스매치 프로브.

본 발명의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 하기 일반식 Ⅱ의 5’-미스매치 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(5’-mismatch mDSO) 구조를 가지는 5’-미스매치 프로브를 제공한다:

5’-M’_b-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (Ⅱ)

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 프로브의 5’말단에 일정수의 미스매치 서열이 존재하는 경우 핵산 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 효율이 향상되는 것을 밝혀내고, 상기 프로브를 이용하여 실시간으로 보다 빠르게 효율적으로 타겟 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다.

(b) 본 발명의 5'-미스매치 프로브를 사용하여, 반복적 뉴클레아제 반응과정에 의해 프로브의 형광 시그널을 증폭하는 경우에는 본 발명의 미스매칭 프로브를 사용하지 않는 경우에 비하여 (i) 감소된 Ct 값 또는 (ii) 동일 사이클에서 보다 높은 fluorescence intensity가 얻어지므로 보다 효율적으로 형광 시그널을 증폭할 수 있다.

(c) 본 발명의 5'-미스매치 프로브 사용 시의 효율적인 형광 시그널의 증폭은 검출 민감도를 높이므로 5'-미스매치 프로브를 사용하지 않는 경우에 비하여 상대적으로 더 소량의 타겟 핵산 서열의 검출이 가능하다.

(d) 본 발명은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 mDSO 형태의 프로브에 상기 미스매칭 프로브의 원리를 적용하여 사용함으로써, 형광 시그널의 발생 효율을 증대시킬 뿐만 아니라 기존 형태의 프로브 (TaqMan probe 등)의 비-타겟 핵산 서열과의 혼성화에 의한 위양성 (false positive) 시그널을 획기적으로 제거할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: Design of primers and probes

본 발명의 5‘-미스매치 프로브를 이용한 실시간 타겟 핵산서열 검출을 구현하기 위하여, 표 1과 같이 프라이머 및 프로브를 제조한다. 프라이머는 DPO(dual priming oligonucleotide) 구조를 갖는다. 이중-표지된 프로브의 5’-말단 부위는 타겟 핵산서열과 상보적인 혹은 비상보적인 뉴클레오타이드를 가지며, 프로브의 5’-말단에 6-FAM을 리포터로, 3’-방향 쪽에 Black Hole Quencher 1 (BHQ1)를 퀀처로 사용하였다.

명칭	타입	서열 (5' → 3')	서열번호
Staur_ftsZ_F1	프라이머	TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT	SEQ ID NO:1
Staur_ftsZ_R1	프라이머	GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT	SEQ ID NO:2
Staur_con	프로브	/56-FAM/CATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:3
Staur_m1	프로브	/56-FAM/aCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:4
Staur_m2	프로브	/56-FAM/acCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:5
Staur_m3	프로브	/56-FAM/tacCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:6
Staur_m4	프로브	/56-FAM/ctacCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:7
Staur_m5	프로브	/56-FAM/actacCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:8
Staur_m6	프로브	/56-FAM/cactacCATTCCG/BHQ1-dT/GGTCAATCATTCGGTT/3Phos/	SEQ ID NO:9

BHQ1 : Quencher (Black Hole Quencher)

Phos : Posphorylation

a, t, c : mismatch nucleotide

실시예 2: The effect of 5‘- mismatch nucleotide at real - time target signal amplification reaction without the amplification of target nucleic acid

Template DNA 및 프로브 준비

폐혈증 (Sepsis)원인균인 Staphylococcus aureus를 감별하기 위하여 동정된 분리주로부터 박테리아 genomic DNA를 분리하여 주형으로 사용한다. 연장 프라이머(SEQ ID NO: 2) 및 이중-표지된 프로브(SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)를 이용한다. 연장 프라이머는 DPO 구조를 가지며, 이중-표지된 프로브의 5‘-방향쪽에 위치한다. 이중-표지된 프로브의 5’-말단 부위에 타겟 핵산서열과 상보적인 뉴클레오타이드가 존재(SEQ ID NO: 3)하거나, 혹은 타겟 핵산서열과 비상보적인 미스매치 뉴클레오타이드가 각각 1개(SEQ ID NO: 4), 2개(SEQ ID NO: 5), 3개(SEQ ID NO: 6), 4개(SEQ ID NO: 7), 5개(SEQ ID NO: 8), 6개(SEQ ID NO: 9) 존재한다.

Real - time target signal amplification

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각각 10 pmole 연장 프라이머 (SEQ ID NO: 2), 각각 5 pmole 프로브 (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9), 200uM dNTPs, 5 mM MgCl₂, 2 U의 5’→3’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 129 ng 박테리아 genomic DNA 를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 타겟 시그널 증폭반응을 수행한다. 실시간 타겟 시그널 증폭반응은 95°C에서 10분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 30회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다.

프로브의 5‘-말단 부위에 타겟 핵산서열과 비상보적인 미스매치 뉴클레오타이드 1개를 갖는 프로브(SEQ ID NO: 4)를 포함한 반응에서는 가장 낮은 Ct 값과 가장 높은 fluorescent signal 이 나타났다. 타겟 핵산서열과 비상보적인 미스매치 뉴클레오타이드 6개를 갖는 프로브(SEQ ID NO: 9)를 포함한 반응에서는 가장 높은 Ct 값과 가장 낮은 fluorescent signal 이 나타났다.

그리고 비상보적인 미스매치 뉴클레오타이드 1개(SEQ ID NO: 4), 2개(SEQ ID NO: 5), 3개(SEQ ID NO: 6), 4개(SEQ ID NO: 7)를 포함한 반응에서는 타겟 핵산서열과 완전 매치되는 프로브(SEQ ID NO: 3)를 포함하는 반응 보다 낮은 Ct 값과 높은 fluorescent signal 이 나타났다.

본 실시예의 결과로 5’-말단에 미스매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브(SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7)는 5‘-말단에 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브 보다 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 효율적으로 절단되는 것을 확인하였다. 그러나 5‘-말단의 미스매치 뉴클레오타이드 수가 증가함에 따라서 형광시그널 증폭이 5‘-말단에 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브와 유사하거나 떨어지는 결과를 얻었다(SEQ ID NO: 8, 9). 따라서 프로브의 5’-말단 부위에 일정수의 미스매치 뉴클레오타이드가 존재할 경우에는 주형-의존적 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 효율적으로 프로브가 절단되는 것이 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: The effect of 5‘- mismatch nucleotide at real - time target signal amplification reaction with the amplification of target nucleic acid

Template DNA 및 프로브 준비

폐혈증 (Sepsis)원인균인 Staphylococcus aureus를 감별하기 위하여 동정된 분리주로부터 박테리아 genomic DNA를 분리하여 주형으로 사용한다. 타겟 핵산서열을 증폭하기 위한 DPO 구조를 갖는 연장 프라이머(SEQ ID NO: 1, 2) 및 실시예 2와 동일한 이중-표지된 프로브(SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)를 이용한다.

Real - time signal amplification and target amplification

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각각 10 pmole 연장 프라이머 (SEQ ID NO: 1, 2), 각각 4 pmole 프로브 (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9), 200uM dNTPs, 5 mM MgCl₂, 2 U의 5’→3’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 Staphylococcus aureus genomic DNA를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 증폭반응을 수행한다. 실시간 증폭반응은 95°C에서 10분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 40회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다.

타겟 핵산서열의 증폭이 없는 실시예 2와 유사한 결과를 얻었으며, 프로브의 5’-말단 부위에 일정수의 미스매치 뉴클레오타이드가 존재할 경우에는 주형-의존적 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 효율적으로 절단되는 것이 구현될 수 있음을 재확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용한 본 발명의 일 실시예의 실시간 타겟 시그널 증폭반응을 보여주는 모식도이다. 이중-표지된 프로브의 5’-말단 부위에는 타겟 핵산서열과 비상보적인 미스매치 뉴클레오타이드가 존재하며, 프로브의 5’-말단 부위에 일정수의 미스매치 뉴클레오타이드는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 효율적으로 절단되게 한다. 이로서 타겟 핵산서열을 검출 가능한 형광 시그널의 증폭을 효율적으로 발생케 한다. 패널 A는 연장 프라이머, 이중-표지된 프로브 및 타겟 핵산서열의 혼성화를 보여준다. 패널 B는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 연장 프라이머의 연장을 보여준다. 패널 C는 주형-의존적 핵산 중합효소의 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단되고, 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되여 형광 시그널이 발생하는 것을 보여준다. 연장 프라이머의 연장 및 프로브의 절단 반응 후 이합체의 변성, 혼성화 및 프로브의 절단 반응을 반복적으로 수행함으로써 타겟 시그널을 증폭하여 타겟 핵산서열의 검출이 가능하다. 또한 역방향의 프라이머를 추가함으로써 시그널 증폭과 타겟 핵산서열의 증폭을 동시에 수행할 수 있다.

도 2는 타겟 핵산서열 증폭이 없는 반응에서 프로브의 5‘-말단 부위에 존재하는 미스매치 뉴클레오타이드가 주형-의존적 핵산 중합효소의 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성에 의한 프로브 절단 효율에 영향을 주는지 알아본 본 발명의 일 실시예의 결과이다. Negative control로써 이용한 주형이 없는 반응에서는 형광 시그널 증폭이 관찰되지 않았다. 5’-말단에 미스매치 뉴클레오타이드 1개(No. 2), 2개(No. 3), 3개(No. 4), 4개(No. 5)를 갖는 프로브가 포함된 반응에서 타겟 핵산서열과 상보적인 완전 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브(No. 1)가 포함한 반응보다 Ct 값이 앞 당겨졌으며, 높은 fluorescent signal이 나타났다. 이와 반대로 5’-말단에 미스매치 뉴클레오타이드 5개(No. 6), 6개(No. 7)를 갖는 프로브 경우에는 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브 보다 Ct 값이 뒤로 밀렸다. 이러한 결과에 의하여 프로브의 5’-말단 부위에 일정수의 미스매치 뉴클레오타이드가 존재할 경우에는 주형-의존적 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 효율적으로 절단됨을 확인할 수 있었다.

도 3은 본 발명의 동시적 실시간 시그널 증폭 및 타겟 증폭반응의 일 실시예의 결과이다. 역방향 프라이머의 첨가를 제외한 나머지는 도2와 동일한 반응에서 수행되었다. 반응 결과도 도2와 유사한 양상을 보여, 5’-말단에 미스매치 뉴클레오타이드를 1개(No. 2), 2개(No. 3), 3개(No. 4), 4개(No. 5)를 갖는 프로브가 완전 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브(No. 1) 보다 Ct 값이 앞 당겨졌다. 이와 반대로 5’-말단에 미스매치 뉴클레오타이드 5개(No. 6), 6개(No. 7)를 갖는 프로브 경우에는 매치 뉴클레오타이드를 갖는 프로브 보다 Ct 값이 뒤로 밀렸다. 따라서 프로브의 5’-말단 부위에 일정수의 미스매치 뉴클레오타이드가 존재할 경우에는 주형-의존적 핵산 중합효소의 5’ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 효율적으로 절단되는 것이 구현됨을 재확인할 수 있었다.

Claims

다음 단계를 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법:

(a) 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머는 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 5’-미스매치 프로브는 (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하며;

(b) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프로브는 5’-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며; 그리고,

(c) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
다음 단계를 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열의 검출방법:

(a) 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머는 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 5’-미스매치 프로브는 (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하며;

(b) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프 로브는 5‘-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며;

(c) 상기 단계 (b)의 반응 결과물을 변성시키는 단계;

(d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널을 증폭시키는 단계; 그리고

(e) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
다음 단계를 포함하는 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 프로브의 제조방법:

(a) 타겟 핵산서열을 선택하는 단계;

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하도록 5’-미스매치 프로브를 디자인하는 단계(designing the probe to comprise (i) a hybridizing nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid sequence, (ii) a mismatch portion for increasing the probe cleavage processivity of the 5' to 3' nuclease activity compared with probes without the mismatch portion containing at least one mismatch nucleotide sequence to the target nucleic acid sequence at its 5'-end and (iii) a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule capable for quenching the fluorescence of the fluorescent reporter molecule); 및

(c) 상기 디자인된 5’-미스매치 프로브를 제조하는 단계.
다음 단계를 포함하는 프라이머의 연장 반응 및 프로브의 절단반응이 동반되는 타겟 핵산서열의 검출방법에서 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성을 증가시키는 방법:

(a) 타겟 핵산서열을 선택하는 단계;

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5’-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하도록 5’-미스매치 프로브를 디자인하는 단계(designing the probe to comprise (i) a hybridizing nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid sequence, (ii) a mismatch portion for increasing the probe cleavage processivity of the 5' to 3' nuclease activity compared with probes without the mismatch portion containing at least one mismatch nucleotide sequence to the target nucleic acid sequence at its 5'-end and (iii) a fluorescent reporter molecule and a quencher molecule capable for quenching the fluorescence of the fluorescent reporter molecule);

(c) 상기 타겟 핵산서열을 상기 디자인으로 제조된 5’-미스매치 프로브 및 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 연장 프라이머에 혼성화시키는 단계;

(d) 상기 혼성화 결과물을 연장 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 연장 프라이머가 연장되고 상기 5’-미스매치 프로브가 절단되어 상기 형광 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 형광 시그널이 발생되며; 상기 5’-미스매치 프로브는 5’-말단 미스매치가 없는 프로브와 비교하여 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 절단 반응성을 증가시키며; 그리고,

(e) 상기 형광 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 형광 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1-5개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1-3개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 연속적(continuous) 또는 간헐적(intermittent)으로 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 리포터 분자는 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위 또는 혼성화 뉴클레오타이드 서열에 상기 퀀처 분자는 혼성화 뉴클레오타이드 서열 또는 미스매치 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 연장 프라이머는 하기 일반식 I 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-X_p-Y_q-Z_r-3’ (I)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도 록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브는 하기 일반식 Ⅱ의 5’-미스매치 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(5’-mismatch mDSO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

5’-M’_b-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (Ⅱ)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, M’_b는 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지는 미스매치 부위, p, q, r 및 b는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’, Z’및 M’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할 은 5’-mismatch mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고, 상기 미스매치 부위는 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시킨다.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 5’-미스매치 프로브는 최소 두 종의 프로브이고 상기 연장 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열을 연장 프라이머 및 상기 5’-미스매치 프로브와 혼성화시키는 단계는 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시되며 이에 의해 상기 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 역방향 프라이머의 주형-의존성 연장반응으로 주형이 합성되는 것을 특징으로 하는 방 법.
제 14 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 상기 제10항의 DPO 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 5’-미스매치 프로브를 이용하여 프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트:

(a) 상기 타겟 핵산서열의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 연장 프라이머; 및

(b) (i) 상기 타겟 핵산서열의 제2위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열, (ii) 5‘-말단에 상기 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 절단 반응성을 증가시키기 위한 미스매치 부위 및 (iii) 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 포함하는 5’-미스매치 프로브.
제 16 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1-5개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1-3개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 18 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 1개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위는 연속적(continuous) 또는 간헐적(intermittent)으로 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 형광 리포터 분자는 상기 5’-미스매치 프로브의 미스매치 부위 또는 혼성화 뉴클레오타이드 서열에 상기 퀀처 분자는 혼성화 뉴클 레오타이드 서열 또는 미스매치 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 연장 프라이머는 하기 일반식 I 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 키트:

5’-X_p-Y_q-Z_r-3’ (I)

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
제 16 항에 있어서, 상기 5’-미스매치 프로브는 하기 일반식 Ⅱ의 5’-미스매치 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(5’-mismatch mDSO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 키트:

5’-M’_b-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (Ⅱ)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, M’_b는 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지는 미스매치 부위, p, q, r 및 b는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’, Z’및 M’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 5’-mismatch mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클 레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고, 상기 미스매치 부위는 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시킨다.
제 16 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 5’-미스매치 프로브는 최소 두 종의 프로브이고 상기 연장 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 키트는 역방향 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시되며 이에 의해 상기 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 역방향 프라이머의 주형-의존성 연장반응으로 주형이 합성되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 26 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 상기 제10항의 DPO 구조를 가지 는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 키트는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
프라이머의 연장 반응이 동반되는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 반응성이 증가된 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 하기 일반식 Ⅱ의 5’-미스매치 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(5’-mismatch mDSO) 구조를 가지는 5’-미스매치 프로브:

5’-M’_b-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (Ⅱ)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, M’_b는 타겟 핵산서열에 대하여 최소 하나의 미스매치 뉴클레오타이드를 가지는 미스매치 부위, p, q, r 및 b는 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’, Z’및 M’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 5’-mismatch mDSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고, 상기 미스매치 부위는 미스매치 뉴클레오타이드가 없는 프로브와 비교하여 프로브의 절단 반응성을 증가시킨다.