KR20120105811A

KR20120105811A - Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널 발생에 의한 타겟 핵산서열의 검출

Info

Publication number: KR20120105811A
Application number: KR1020110023465A
Authority: KR
Inventors: 천종윤; 이영조
Original assignee: 주식회사 씨젠
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-09-26

Abstract

본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다. 타겟 핵산 서열 존재시 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단 반응 및 상기 절단 반응에 의해 생성된 PTO 단편과 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)와의 혼성화를 기본적으로 이용하는 본 발명은 상기 CTO를 주형으로 하여 상기 PTO 단편을 연장시키는 과정에서 검출 가능한 시그널을 발생시킴으로써, 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있는 것에 특징이 있다. 본 발명에 따르면, CTO의 적절한 위치, 특히 템플레이트 부위에 단일 형광 표지 또는 상호 작용적인 이중 표지를 연결하거나, 연장과정에서 삽입되는 표지 (예를 들어, 뉴클레오타이드 트리포스페이트에 결합된 표지)를 사용하면, 연장과정에서 실시간으로 검출 가능한 시그널을 발생시킬 수 있어 타겟 핵산 서열의 존재를 실시간으로 검출할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 표지 방법은 생성된 연장이합체가 멜팅되거나 멜팅 후 다시 혼성화되는 과정에서 검출 가능한 시그널을 발생시키므로 멜팅 커브 분석을 통하여 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다.

Description

ＴＰＯ 절단과 연장반응 및 이에 따른 시그널 발생에 의한 타겟 핵산서열의 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation}

본 발명은 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석에 의한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.

타겟 핵산 서열을 검출하기 위하여 전형적으로 사용되는 방법 중 하나는 프로브의 혼성화를 이용하는 방법이다. 하지만, 혼성화에만 의존하는 방법은 프로브와 비-타겟 핵산 서열간의 비-특이적인 혼성화에 의한 false positives 문제가 발생되어, 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다.

프로브의 혼성화 이외에도 enzymatic reaction을 추가적으로 이용하는 방법들이 소개되어 있으며, 그 중 하나인 TaqMan probe법이 널리 사용되고 있다.

TaqMan probe법에서 타겟 핵산 서열에 혼성화된 표지된 프로브는 upstream 위치에 존재하는 프라이머에 의존적인 DNA 중합 효소의 5’nuclease activity에 의하여 절단되며, 이 과정에서 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 발생한다 (U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145). TaqMan probe법은 (1) upstream 프라이머가 프로브의 5’-말단과 매우 근접하게 혼성화되도록 하여 중합 반응 없이도 DNA 중합효소의 5’nuclease activity에 의하여 프로브가 절단되도록 하는 polymerization-independent cleavage 및 (2) 보다 먼거리에 위치한 upstream 프라이머가 연장되면서 DNA 중합효소의 5’nuclease activity에 의하여 프로브가 절단되도록 하는 polymerization-dependent cleavage를 개시하고 있다. 한편, 상기 TaqMan probe법은 프로브의 5’말단 부위에 타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않는 5’tail region을 포함하고 있는 경우에도 프로브가 상기 절단 반응에 절단되어 5’tail region을 포함하는 절편이 생성되는 것을 개시하고 있다.

TaqMan probe법 이외에도 5’nuclease가 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 5’tail region을 갖는 형태의 프로브를 절단하고 방출된 5’tail region 절편을 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법들이 알려져 있다.

US 5,691,142는 DNA 중합효소의 5’nulcease activity에 의하여 절단 현상이 일어날 수 있는 소위 “cleavage structure”를 개시하고 있다. cleavage structure의 예로서 template와 상기 template에 비-상보적인 서열을 갖는 5’부위 및 상기 template에 상보적인 서열을 갖는 3’부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 혼성화되어 있고 상기 올리고뉴클레오타이드가 template와 혼성화를 이루고 있는 부위의 upstream 위치에 추가적인 upstream olinucleotide가 근접하게 혼성화되어 있는 구조가 개시되어 있다.

US 5,691,142는 5’nuclease activity는 갖는 DNA 중합효소 또는 5’nuclease activity는 갖지만 감소된 중합 활성을 갖는 modified DNA 중합효소 (modified DNA polymerase with reduced synthetic activity)를 이용하여 상기 구조를 절단하고, 상기 template에 비-상보적인 서열을 갖는 5’부위가 방출되면 이를 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화시켜 cleavage structure를 형성하여 연쇄적인 절단 반응을 유도함으로써 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 개시하고 있다.

U.S. Pat. No.7,381,532는 cleavage structure에서 upstream oligonucleotide의 3’-말단이 blocking된 경우에도 5’nuclease activity를 갖는 DNA polymerase 또는 FEN nuclease 등에 의하여 절단되어 non-complementary 5’flap region이 방출되며, 방출된 5’flap region을 검출하여 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 개시하고 있다.

액상에서 종래 형광 표지된 프로브의 혼성화에 의해 타겟 핵산 서열을 검출하는 방식을 사용하면 멜팅 커브 분석이 가능하므로 다수 타겟 핵산 서열을 동시에 검출하기 위하여 하나의 type의 형광표지를 사용할 수 있는 이점이 있다. 하지만, 프로브의 5’nuclease 절단을 이용하는 상기 종래 방법들은 형광표지를 사용하여 동시 다중 검출하는 경우, 서로 다른 타겟 핵산 서열에 대하여는 서로 다른 형광표지를 사용해야 하는데, 이는 결국 검출 가능한 형광 표지 수의 제한으로 인하여 동시 검출할 수 있는 타겟 핵산 서열의 수에 한계가 있다.

한편, 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 서열을 5’부위에 갖는 프로브의 절단 및 고상에 고정된 capture probe를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법으로 U.S. publication No. 2008-0241838이 있다. 상기 방법에서 레이블은 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 서열을 갖는 5’부위에 위치하며, 상기 프로브가 절단되면 레이블을 포함한 절편이 capture probe에 혼성화되지만, 프로브가 절단되지 않으면 capture probe에 혼성화되지 않아 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 이 방법에서, 절단되지 않은 intact 프로브가 capture probe에 혼성화되지 않는 mechanism을 구현하기 위해서는 고상에 매우 짧은 길이의 capture probe을 심어야 하는데 이러한 제한은 고상에서의 혼성화 효율을 매우 떨어뜨리고, 반응 조건을 구현하는 것이 용이하지 않은 문제가 있다.

프로브의 혼성화에만 의존하지 않고 5’nucleolytic reaction 등의 enzymatic 반응을 추가적으로 적용함으로써 검출 특이성을 높이고, 간편하면서, 액상에서 검출 가능한 형광 표지 수의 제한을 받지 않고 타겟 핵산 서열의 동시 다중 검출이 가능하며, 액상 및 고상 모두에서 타겟 핵산 서열 검출에 사용될 수 있는 검출 방법에 대한 요구가 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 타겟 핵산서열을 검출함에 있어서 보다 개선된 편의성 및 정확성을 가지고 나아가 효율적인 동시다중 검출을 가능하게 하는 기술을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 핵산서열의 검출에 있어서 새로운 프로토콜을 개발하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면 프로브의 혼성화에만 의존하지 않고 5’nucleolytic reaction 및 extension 등의 enzymatic 반응을 추가적으로 적용하여 검출 특이성을 높이고, 간편하게 액상 및 고상 모두에서 타겟 핵산 서열 검출할 수 있고, 특히 효율적으로 동시다중 검출이 가능한 검출 방법이 제공됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림 위치에서 상기 타겟 핵산 서열과 혼성화되고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며;

(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되면, 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;

(c) 단계 (b)에서 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;

(d) 주형-의존성 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되고, 상기 연장은 검출가능한 시그널을 제공하고 연장 이합체를 형성하며, 상기 검출가능한 시그널은 상기 단계 (c)의 결과물에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입되는 표지에 의하여 제공되고,

(e) 상기 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출가능한 시그널의 검출은 연장 이합체의 존재를 나타내고, 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.

본 발명은 타겟 핵산서열에 혼성화 되어 발생되는 events 즉 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단과 연장반응 및 이에 따른 시그널 발생을 이용하여 실시되며, 이에 “PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석”으로 명명된다.

본 발명의 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 타겟 핵산서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 ( upstream oligonucleotide ) 및 PTO 의 혼성화

본 발명의 방법에 따르면, 우선 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)와 혼성화 시킨다.

본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열”, “타겟 서열” 또는 “타겟 핵산”은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 증폭 조건 및 혼성화 조건에서 프라이머 및 프로브와 어닐링 또는 혼성화 된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 바람직하게는, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 및 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도의 길이를 가져야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

타겟 핵산서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명에서 이용되는 PTO 및 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서 이용되는 PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 템플레이트 부위는 PTO에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “비상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 특정 서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 비상보적(substantially non-complementary) 및 완전히 비상보적 (perfectly non-complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서 채택되는 용어 “프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(PTO)”는 프로브로서의 역할을 하는 타겟팅 부위와 타겟 핵산서열에 혼성화 후 후속적으로 PTO로부터 해리되며 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 태깅 부위 및 타겟팅 부위는 PTO에 있어서 반드시 5’to 3’순서로 위치한다. PTO는 도 1에 예시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO와 타겟 핵산서열과의 혼성화는 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화되지 않는 조건 하에서 실시된다.

PTO는 특정한 길이를 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO는 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 40-60 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 35-45 뉴클레오타이드 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PTO의 5’-태깅 부위는 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)의 캡처링 부위에 특이적으로 결합하여 연장될 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.

PTO의 3’-말단이 블록킹되어 있지 않고 -OH기를 갖는 경우 연장도 가능하다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있다.

PTO의 non-extendable blocking은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 또한, 블록킹은 PTO의 3’-말단의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지물질, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 chemical moiety를 결합시켜 실시할 수 있다. 또는, 블록킹은 3’-OH를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드과 같이 3’-OH가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.

택일적으로, PTO는 hairpin 구조를 가지도록 디자인될 수 있다. 바람직한 일 구현예에 따르면, 5’-태깅부위의 말단부위 및 3’-타겟팅 부위의 일부가 stem 구조를 형성하도록 디자인될 수 있다.

바람직한 일 구현예에 따르면, 5’-태깅부위만이 hairpin 구조를 형성하도록 디자인될 수 있다.

본 발명에서 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않는다는 것은 주어진 혼성화 조건에서 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 안정적인 이중 가닥을 형성하지 않는 다는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않고 단일 가닥을 형성한다. 상기 PTO의 5’-태깅 부위가 자체적으로 hairpin 구조를 형성할 수 있는 경우, 타겟 핵산서열과 혼성화되지 않고 자체적으로 hairpin 구조를 형성한다. 이와 같은 경우, 타겟 핵산서열과의 관계에서는 여전히 단일 가닥을 형성하고 있다고 표현될 수 있다.

업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 혼성화 위치에 대해 업스트림 위치에서 상기 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 포함한다.

본 발명에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO 보다 업스트림 위치에서 타겟 핵산 서열과 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다. 즉, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO의 절단을 유도하는 역할을 한다.

업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO의 절단 유도는 크게 두 가지 방식으로 이루어진다: 하나는, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장에 독립적인 절단 유도이고, 다른 하나는, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장(즉, polymerization)에 의존적인 절단 유도이다.

업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 PTO의 절단반응을 유도할 정도로 PTO에 근접해 있는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 연장반응 없이도 PTO를 절단한다. 반면에, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO로부터 이격되어 있는 경우, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존성 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)를 연장시키며 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO를 절단한다.

따라서, 본 발명에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO에 대하여 두 가지 방식으로 location 될 수 있다. 즉, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장(즉, polymerization)에 독립적인 절단 유도가 발생할 정도로 상기 PTO에 근접해 위치할 수 있다. 또한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장에 의존적인 절단 유도를 할 수 있도록 PTO로부터 이격되어 위치할 수 있다.

본 발명에서 “근접한 위치”는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위가 nick을 형성하거나 1-30, 1-20, 1-15 뉴클레오타이드 떨어진 위치를 포함한다.

본 발명에서 “이격되어 위치”는 “근접한 위치”와 같은 제한은 없으며, 연장반응이 일어날 수 있는 모든 경우 (nick을 포함)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장(즉, polymerization)에 의존적인 절단 유도를 할 수 있도록 PTO로부터 이격되어 위치한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장에 독립적인 절단 유도및 연장에 의존적인 절단 유도에 적합하고, 업스트림 프로브는 연장에 독립적인 절단 유도에 적합하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO의 3’타겟팅 부위는 일부 overlapping 되는 서열을 갖는다. 바람직하게는 1-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드 보다 더 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드의 overlapping 되는 서열을 갖는다. 이와 같이 오버랩핑 서열을 가지는 경우, 단계 (b)에서의 절단반응에서 5’-태깅부위 뿐만 아니라 3’타겟팅 부위의 일부도 절단될 수 있다. 또한, 오버랩핑 서열을 가지는 경우, 단계 (b)에서의 절단반응에서 5’-태깅부위 뿐만 아니라 3’타겟팅 부위의 원하는 특정 위치까지 절단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단반응을 유도한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 그의 일부를 포함하는 부위가 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응과 관련하여 알려진 어떠한 방법도 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,691,142, 5,994,069 및 7,381,532 또는 U.S. publication No. 2008-0241838에 개시된 방법을 사용할 수 있으며, 상기 예에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)는 추가적인 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시한다. 다운스트림 프라이머는 PTO가 혼성화 될 수 있는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시켜 본 발명의 검출 민감도를 향상시키는 이점이 있다.

예를 들어, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 업스트림 프로브이고 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서 DNA 중합효소가 이용되는 경우, 다운스트림 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 PTO가 혼성화 될 수 있는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시키며, 이에 더 많은 방출 단편을 생성하며, 결국 최종적인 타겟 핵산서열 검출에 대한 민감도가 향상된다.

업스트림 올리고뉴클레오타이드가 업스트림 프라이머이고 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서 DNA 중합효소가 이용되는 경우, 다운스트림 프라이머는 업스트림 프라이머와 함께 DNA 중합효소에 의해 PTO가 혼성화 될 수 있는 타겟 핵산서열을 증폭하며, 이에 더 많은 방출 단편을 생성하고, 결국 최종적인 타겟 핵산서열 검출에 대한 민감도가 향상된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, upstream 프라이머 또는 downstream 프라이머를 사용하는 경우 상기 프라이머들의 연장을 위하여 주형-의존성 중합효소를 추가적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브) 또는 다운스트림 프라이머는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드 (DPO)구조를 갖는다. DPO 구조를 갖는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브) 또는 다운스트림 프라이머는 일반적 형태의 프라이머 및 프로브에 비하여 월등히 개선된 타겟 특이도를 갖는다 (see WO2006/095981).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO의 3’-targeting portion은 하기 일반식 II의 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조를 가질 수 있으며 상기 구조는 타겟 핵산서열과 비-타겟 핵산서열을 구별할 수 있도록 해주는 타겟 구별성 역할을 한다:

5’-X’_p-Y’_q-Z’_r-3’ (II)

상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 단일 표지가 결합되어 있고; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDSO 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 mDSO 구조의 혼성화 특이성을 향상시키고; 상기 mDSO 구조가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 mDSO 구조의 5’-제2차 혼성화 부위 및 3’-제1차 혼성화 부위가 모두 타겟 핵산서열과 혼성화 되고 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되고; 상기 mDSO 구조가 비-타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우에는 상기 mDSO 구조의 5’-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 단일가닥을 형성하여 상기 5’-제2차 혼성화 부위는 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소에 의해 절단되지 않으며; 이에 의해 mDSO 구조는 타겟 핵산서열 및 비-타겟 핵산서열을 구별한다.

변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(변형 DSO: mDSO) 구조를 갖는 본 발명의 mDSO 구조는 (i) 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 타겟 및 비-타겟 핵산서열의 구별에 결정적인 역할을 하는 5’-제2차 혼성화 부위와 분할부위를 포함한다.

본 발명에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서 false signals 없이 실시할 수 있는 이유 중 하나는 타겟 구별성 프로브가 가지고 있는 mDSO 구조에 의한 혼성화 특이성이다.

mDSO 구조를 가지는 타겟 구별성 프로브는 타겟 핵산과 비-타겟 핵산에 혼성화 되는 경우 서로 다른 패턴으로 혼성화 된다. 타겟 구별성 프로브가 타겟 핵산에 혼성화 되는 경우에는 프로브 전체 서열에 걸쳐 타겟 핵산과 이중가닥을 형성하지만, 타겟 구별성 프로브가 비-타겟 핵산서열에 혼성화(비-특이적 결합) 되는 경우에는 3’-제1차 혼성화 부위를 통하여 우세적으로 혼성화 되며 5’-제2차 혼성화 부위와 분할 부위는 그의 낮은 Tm 값 때문에 비-타겟 핵산에 혼성화 되지 못하고 단일가닥을 형성하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.

상기 분할부위는 최소한 3개 이상, 보다 바람직하게는 최소한 4개 이상, 가장 바람직하게는 최소한 5개 이상의 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 분할부위는 3-10, 3-8, 4-7 또는 4-5 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 분할부위는 연속된 유니버설 염기를 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다.

바람직하게는, 상기 3'-제1차 혼성화 부위의 길이는 5'-제2차 혼성화 부위보다 길다.

상기 3'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는 15-60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-40 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최소한 3 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 5 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 6 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 한편, 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 최대한 15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 12 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 3-15 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-13 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4-12 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-11 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

5'-제2차 혼성화 부위 및 분할 부위는 최소한 6, 보다 바람직하게는 최소한 9, 보다 더 바람직하게는 최소한 12, 가장 바람직하게는 최소한 15 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-70℃의 Tm을 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 6-40℃의 Tm, 보다 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는 2-15℃의 Tm, 보다 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

용어 “conventional oligonucleotide"는 DPO 구조 또는 mDSO 구조를 갖지 않은 oligonucleotide (프라이머 또는 프로브)를 의미한다.

단계 (b): PTO 의 절단에 의한 단편의 방출

이어, PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨다. PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되면, 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.

용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 통상적인 효소에 의해 타겟 핵산서열에 결합된 PTO의 절단이 발생되는 데 유리한 반응 조건, 예컨대 온도, pH, ionic strength 및 완충액 조건 뿐 만 아니라, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 사용되는 효소 등 포함하는 의미이다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, “PTO의 절단을 위한 조건”은 Tris-HCl 완충액(pH 8.3), KCl, MgCl₂ 및 55℃ 온도를 포함한다.

PTO가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우, PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지만 5’-태깅 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일가닥 상태를 유지할 수 있다(참조: 도 2). 이와 같이, 하나의 올리고뉴클레오타이드에 이중가닥 및 단일가닥 구조가 모두 있는 경우 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 상기 구조를 절단할 수 있는 다양한 방법이 알려져 있다.

PTO의 절단 위치는 사용되는 절단 방법 즉, upstream oligonucleotide가 upstream 프로브인지 프라이머인지 여부에 따라 또는 upstream oligonucleotide 혼성화 위치 등에 영향을 받으며, 절단 조건 및 절단 방법에 따라 절단되는 위치를 선택할 수 있다(참조, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,691,142, 5,994,069 및 7,381,532 또는 U.S. publication No. 2008-0241838).

본 발명은 PTO의 절단을 위하여 종래에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 상기 방법에 의한 절단 위치를 고려할 때, PTO의 절단 반응 결과로 5’-태깅 부위 일부 또는 전부를 포함하는 PTO 단편이 생성될 수 있다.

종합하면, 본 발명의 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 PTO가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 부위(3’-타겟팅 부위)와 혼성화 되지 않는 부위(5’-태깅 부위)의 junction site이다. 두 번째 절단 위치는 PTO가 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않는 부위(5’-태깅 부위)의 3’-말단에서 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치, 즉, 3’-타겟팅 부위 상의 뉴클레오타이드이다. 세 번째 위치는 PTO가 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않는 부위(5’-태깅 부위)의 3’-말단에서 5’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머가 연장되면서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 중합효소에 의해 절단되기 시작하는 부분은 절단 반응조건에 따라 이중가닥이 시작되는 위치 또는 그 위치로부터 1-3 뉴클레오타이드 이격된 위치이다 (즉, 5’-태깅 부위 및 인접한 3’-타겟팅 부위의 일부로 구성된 부위). 이 절단 시작 위치로부터 3’-방향쪽으로 올리고뉴클레오타이드가 절단된다(참조:U.S. Pat. No. 5,210,015)

따라서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되는 PTO의 부위를 설명하면서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편”은 바람직하게는, (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위와 그의 3’-말단에서 3’-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치로 구성된 부위, 즉, 5’-태깅 부위 및 인접한 3’-타겟팅 부위의 일부로 구성된 부위 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부 부위를 갖는 단편을 포괄하는 의미를 갖는다.

본 발명에 따르면, “5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO 단편” 또는 “PTO 절편”으로 표현된다.

본 발명에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 바람직하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다. 보다 바람직하게는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.

본 발명에 적합한 DNA 중합효소는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae, Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus, Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus , Pyrococcus furiosus ( Pfu ), Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus의 DNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 Taq 중합효소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제 활성은 갖지만 중합 활성은 감소되도록 변형된 DNA 중합 효소를 사용할 수 있다.

본 발명에 적합한 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’flap-specific nuclease이다.

본 발명에 적합한 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 Sulfolobus solfataricus , Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis , Archaeaglobus veneficus , Archaeaglobus profundus , Acidianus brierlyi , Acidianus ambivalens , Desulfurococcus amylolyticus , Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii , Thermococcus gorgonarius , Thermococcus zilligii , Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus , Pyrococcus horikoshii , Aeropyrum pernix , 또는 Archaeaglobus veneficus의 FEN 뉴클레아제를 포함한다.

만일, 단계 (a)를 업스트림 프라이머를 이용하여 실시하는 경우 상기 PTO의 절단을 위한 조건은 바람직하게는 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존성 중합효소를 사용하고, 상기 주형-의존성 중합효소는 절단 반응을 위한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소이다.

선택적으로, 단계 (a)에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존성 중합효소를 사용하고, 상기 주형-의존성 중합효소는 상기 절단반응을 위한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 서로 다른 효소이다.

단계 (c): PTO 로부터의 방출 단편과 CTO 의 혼성화

상기 절단반응에 의해 PTO로부터 방출된 단편은 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)와 혼성화 된다. 본 발명에서 사용되는 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 CTO는 PTO로부터 방출된 단편의 template 역할을 한다. PTO로부터 방출된 단편은 프라이머로서 주형인 CTO에 혼성화되고, 연장되어 이합체를 형성한다.

CTO의 캡처링 부위는 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인되며, 템플레이트 부위는 PTO의 5’-태깅 부위와 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인 된다.

바람직하게는, 템플레이트 부위는 PTO의 5’-태깅 부위와 3’-타겟팅 부위에 비상보적인 서열을 갖는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이트 부위는 PTO로부터의 방출 단편의 연장반응에서 템플레이트 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 절단 반응에 의해 PTO의 5’-태킹 부위를 갖는 절단 단편을 생성하는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태킹 부위에 상보적인 서열을 갖도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 절단 반응에 의해 5’-태킹 부위와 3’-타겟팅 부위의 일부를 포함하는 절단 단편을 생성하는 경우, CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위와 상기 3’-타겟팅 부위의 일부에 상보적인 서열을 갖도록 디자인 하는 것이 바람직하다. 절단 반응에 의해 5’-태킹 부위의 일부를 포함하는 절단 단편을 생성하는 경우, CTO의 캡처링 부위는 상기 5’-태킹 부위의 일부를 포함하는 절단 단편에 상보적인 서열을 갖도록 디자인 하는 것이 바람직하다.

한편, PTO의 절단 위치를 예상하는 것만으로도 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 PTO의 5’-태깅 부위와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인하면, 5’-태킹 부위의 일부 서열을 갖는 절단 단편이나 5’-태킹 부위의 서열을 갖는 절단 단편 모두와 혼성화할 수 있다. 나아가, 절단 반응에 의해 5’-태킹 부위와 3’-타겟팅 부위의 일부를 포함하는 절단 단편이 생성되는 경우, 절단 단편의 3’-말단 부위와 CTO가 혼성화되지 않는 미스매치 부위가 생성될 수 있는 데, 프라이머의 3’-말단에 1-3 뉴클레오타이드 미스매치 서열이 오는 경우에도 반응 조건에 따라 프라이머가 연장될 수 있다는 사실을 고려할 때, 일부 미스매치의 서열의 존재하는 절단 단편도 혼성화되어 연장될 수 있다.

특히, 상기와 같이, 3’-타겟팅 부위의 일부를 포함하는 절단 단편이 생성되는 경우, 예상되는 3’-타겟팅 부위의 절단 위치를 포함한 서열과 상보적인 서열을 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 부위가 가지도록 디자인함으로서 미스매치 부위 생성 문제를 효과적으로 해결할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 캡처링 부위에 포함되는 상기 PTO의3’-타겟팅 부위의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 및 길이는 예상되는 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 절단 위치에 따라 선택된다. 다만, 비-절단 PTO의 CTO에 대한 경쟁적인 혼성화를 고려하여 바람직하게는 1-10 개, 보다 바람직하게는 1-5개, 보다 더 바람직하게는 1-3개의 뉴클레오타이드 길이를 갖도록 한다.

본 발명에서 CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편과 혼성화되고 상기 단편이 연장될 수 있으면 충분하므로, CTO의 3’-말단은 PTO 단편과 혼성화에 관여하지 않는 추가적인 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 또한, CTO의 캡처링 부위는 PTO 단편과 안정적으로 혼성화를 이룰 수 있는 조건에서 PTO 단편의 일부 (예를 들어, PTO 단편의 3’-말단 부위를 포함한 PTO 단편의 일부 부위)와만 혼성화되는 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 CTO의 캡처링 부위에 대한 용어 “5’-태깅 부위에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 다양한 형태로 디자인되는 CTO의 캡처링 부위를 포괄적으로 나타내기 위하여 사용한다.

CTO의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, CTO는 20-500 뉴클레오타이드, 20-400 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-200 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-70 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-400 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-200 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-70 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터의 방출 단편에 특이적으로 혼성화 되어 연장될 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 또한, 템플레이트 부위는 PTO로부터의 방출 단편의 연장반응에서 템플레이트 기능을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, CTO의 템플레이트 부위는 10-500 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 10-200 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-70 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-400 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-200 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-70 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 캡처링 부위는 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 서열을 모두 포함한다.

CTO의 3’-말단이 블록킹되어 있지 않고 -OH기를 갖는 경우 연장도 가능하다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있다. CTO의 non-extendable blocking은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 블록킹은 CTO의 3’-말단의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지물질, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 chemical moiety를 결합시켜 실시할 수 있다. 또는, 블록킹은 3'-OH를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드과 같이 3'-OH가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.

절단반응에 의한 PTO로부터의 방출 단편은 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되며, 연장반응이 발생될 수 있는 형태가 된다. 한편, 절단되지 않은 PTO는 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화 되지만, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO에 혼성화 되지 않기 때문에, 연장반응이 발생될 수 있는 형태가 되지 않는다.

단계 (c)에서의 혼성화는 단계 (a)에서의 혼성화에 대한 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.

단계 (d): 주형-의존성 핵산 중합효소에 의한 PTO 로부터의 절단 단편의 연장

이어, 주형-의존성 핵산 중합효소를 이용하여 단계 (c)의 결과물에 대하여 연장반응을 실시한다. 연장 반응에 의해 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 PTO의 절단 단편은 연장되고, 상기 연장은 검출가능한 시그널을 제공하고 연장 이합체를 형성하며, 상기 검출가능한 시그널은 상기 단계 (c)의 결과물에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입되는 표지에 의하여 제공된다.

본 명세서에서 용어 “연장 이합체”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 된 PTO로부터의 절단 단편이 CTO의 템플레이트 부위를 템플레이트로 하여 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되어 형성된 이합체를 의미한다.

본 발명에서 채택된 시그널링 시스템은 연장반응과 시그널 제공이 직접적으로 연관되도록 한 것에 특징이 있다. 즉, 본 발명에 따르면 CTO에 혼성화된 절단 단편의 연장반응이 일어나는 경우 비로소, 검출가능한 시그널이 제공되도록 디자인된다. PTO 단편의 연장 반응은 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우에만 발생되므로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널 제공도 동시적으로 발생된다. 따라서, if desired, 본 발명은 실시간 방식으로 실시할 수 있다.

연장반응과 시그널 제공을 직접적으로 연관시키기 위하여, 본 발명은 단계 (c)의 결과물에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입된 표지를 이용하여 이로부터 시그널을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)의 결과물, 즉, PTO 단편 또는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입된 표지를 이용하여 이로부터 시그널을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 단계 (d)에서의 시그널은 PTO 단편에 결합된 하나의 표지 및 연장과정에서 삽입된 표지에 의하여 제공되며, 양 표지는 상호작용적인 표지이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d)에서의 시그널은 CTO에 결합된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 CTO에 결합된 최소 하나의 표지와 연장과정에서 삽입된 표지 또는 (iii) 연장과정에서 삽입된 표지에 의하여 제공된다. 보다 상세하게는, 상기 연장 이합체에 결합된 최소 하나의 표지는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지로부터 유래된다. 또는, 연장반응에서 연장 이합체에 삽입된 표지는 CTO에 결합되어 있지 않고 연장반응물에 freely suspended 된 표지로부터 유래된다.

연장과정에서 삽입되는 표지는 연장과정에서 삽입될 수 있도록 바람직하게는 뉴클레오타이드 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 트리포스페이트에 연결하여 사용한다.

본 명세서에서 용어 “연장 이합체에 삽입된 표지”는 PTO 단편 또는 CTO에 결합되어 있지 않고 연장반응물에 freely suspended 된 표지로서 연장 반응에 의하여 이합체에 삽입되는 표지를 의미한다.

CTO에 결합된 최소 하나의 표지가 이용되는 경우, 바람직하게는 표지는 연장 이합체 형성 과정에서 연장반응이 발생하는 부위 즉 CTO의 템플레이트 부위에 위치한다. 연장반응에 의해 새롭게 이합체를 형성하는 부위에 표지가 있는 경우, 연장반응을 indicating 하는 potential이 보다 향상될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 표지는 검출가능한 시그널을 제공할 수 있는 표지를 사용하며, 본 발명은 표지의 종류 또는 연장 이합체에 삽입된 표지의 이용 여부에 따라 다음과 같이 구별될 수 있다.

(ⅰ) CTO에 결합된 단일표지

본 발명은 단일표지를 이용하여 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 연장 이합체 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다(참조: 도 2 및 도5).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지가 결합되어 있고 단계 (d)의 연장 이합체 형성은 상기 표지에서 발생되는 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다.

상기 단일 표지는 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 형광 표지, 발광 (luminescent) 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지 또는 전기화학적 표지(electrochemical moiety)이다.

바람직하게는, 상기 단일표지는 형광 표지이고, 표지가 결합되어 있는 핵산서열이 단일 가닥인 경우와 이중 가닥인 경우 서로 다른 크기 (intensity)의 형광을 제공한다.

도 2 및 도 5는 단일 표지를 예시한다. 도 2 및 도 5에서 볼 수 있듯이, 단계 (d)에서 PTO로부터 방출된 절단 단편의 연장가닥과 CTO 사이의 이합체 구조의 단일 형광 표지는 PTO와 혼성화되지 않은 CTO 혹은 절단되지 않은 PTO와 혼성화된 CTO의 형광 표지보다 높은 형광을 나타낸다.

이러한 단일 형광 표지의 형광 시그널의 세기 차이 (증가 또는 감소)를 측정함으로써 결국 타겟 핵산서열의 존재를 검출할 수 있다.

상기 목적을 위한 바람직한 단일 형광 표지의 종류 및 상기 표지의 결합위치는 U.S Pat Nos. 7,537,886 및 7,348,141에 개시된 내용을 참조할 수 있다.

상기 형광 표지의 구체적인 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) and Quasar 705 (610).

바람직하게는, JOE, FAM, TAMRA, ROX 또는 fluorescein-based label이다.

단일 표지는 알려진 다양한 방법으로 CTO에 연결될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 표지는 최소한 3개 이상의 탄소 원자를 포함하는 스페이서 (spacer) (예를 들어, 3-carbon spacer, 6-carbon spaceror 또는 12-carbon spacer)를 매개로 프로브에 연결된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CTO의 템플레이트 부위 상의 단일 표지는 5’-말단으로부터 1-15 뉴클레오타이드, 1-10 뉴클레오타이드 또는 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 보다 바람직하게는 5’-말단 또는 템플레이트 부위의 중앙 부위에 위치한다.

(ii) CTO 가닥내(intrastrand) 상호 작용적 표지

상호작용적 표지 시스템은 공여자 분자 및 수용자 분자 사이에 에너지가 non-radioactive 하게 패싱 되는 signal generating system을 의미한다. 상호작용적 표지 시스템이 대표적인 예로서, FRET (fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여자 분자) 및 퀀처 분자(수용자 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여자는 형광성이지만, 에너지 수용자는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 예에서, 에너지 공여자는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고, 에너지 수용자가 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 예에서, 에너지 공여자는 발광성, 예컨대 bioluminescent, chemiluminescent 또는 electrochemiluminescent이고, 에너지 수용자가 형광성이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의해 발생되며, 바람직하게 상호작용적 표지 시스템은 상호작용적인 이중 표지 시스템이며, 보다 바람직하게는 FRET 표지 시스템에 의해 발생된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO 단편의 CTO 상에서의 연장 여부에 따라 FRET 표지 시스템에서 리포터 분자로부터 나오는 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭되거나 언퀀칭될 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 어떠한 위치에도 있을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO는 표지로서 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있고, 상기 리포터 분자와 퀀처 분자는 3차 구조적(conformational)으로 근접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 상기 단계 (d)의 연장 이합체 형성은 상기 리포터 분자와 퀀처 분자를 이격시켜 상기 리포터 분자로부터의 시그널의 언퀀칭을 유도하여 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다.

가닥내 상호 작용적 표지의 원리는 다음과 같다. PTO가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우 PTO로부터 방출된 절단 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고 이어 절단 단편은 연장되어 CTO와 연장 이합체를 형성한다. 이 경우, CTO에 있는 리포터 분자와 퀀처 분자는 3차 구조적으로 이격되어 퀀처 분자에 의한 퀀칭이 억제되어 시그널의 변화(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가)가 초래된다. 한편, 타겟 핵산서열이 없는 경우, PTO는 절단되지 않으며 절단되지 않은 PTO는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되며 연장되지 않는다. 이 경우, CTO에 결합되어 있는 리포터 분자와 퀀처 분자는 CTO에서 3차 구조적으로 인접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 나오는 에너지를 수용하여 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 퀀칭(quenching)한다.

도 3 및 도 6은 CTO 가닥내 상호 작용적 표지를 예시한다. 도 3을 참조하면, 연장 이합체 형성 이전에, CTO의 템플레이트 부위에 있는 결합되어 리포터 분자와 퀀처 분자는 3차 구조적으로 근접하여 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. PTO가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우 PTO로부터 절단 단편이 방출되며, 절단 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화 되고 연장되어 CTO와 연장 이합체를 형성한다. 이 경우, 연장 이합체 형성은 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있는 리포터 분자와 퀀처 분자를 이격시켜 리포터 분자로부터의 시그널의 언퀀칭을 유도하여 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 그러나, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합된 CTO와 비절단 PTO 사이의 이합체는 연장 이합체를 형성하지 못하기 때문에, CTO의 템플레이트 부위의 리포터 분자로부터 발생되는 형광시그널을 퀀처 분자가 계속하여 퀀칭하여 형광시그널이 발생하지 않는다. 이러한 방식으로, 타겟 핵산서열을 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 CTO의 템플레이트 부위에 결합되며, 나머지 하나는 CTO 상의 PTO 단편이 연장되면서 시그널의 변화가 초래될 수 있는 위치에 결합된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 둘 모두 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 CTO의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치해 있다. 예를 들어, 퀀처 분자는 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 이격된 위치에 위치하고, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터 5-50 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 상술한 형광표지의 구체적인 예를 참조할 수 있다.

또한, 적합한 형광분자 및 적합한 리포터-퀀처 pairs는 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

또한, 자체 형광 없이 광범위한 파장 또는 특정 범위의 파장을 퀀칭할 수 있는 물질이 퀀처 분자 (예를 들어, 블랙 퀀처)로 사용될 수 있다.

본 발명에서 리포터 및 퀀처로 이루어진 signalling system에서, 리포터는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 donor를 포괄하는 의미를 가지며, 퀀처는 FRET의 acceptor를 포괄하는 의미를 갖는다.

예컨대, 상기 리포터 분자는 플루오레세인 색소 (fluorescein dyes)로부터 선택되며, 상기 퀀처 분자는 로다민 색소 (rhodamine dyes)로부터 선택된다.

(iii) 연장 이합체 가닥간(interstrand) 상호 작용적 표지

본 발명에서 가닥 간 상호작용적 표지는 CTO에 결합되어 있는 표지 (예컨대, 공여자 분자)와 연장반응에 의해 PTO로부터의 절단 단편에 삽입되는 표지(예컨대, 수용자 분자)사이의 상호작용을 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위는 리포터 분자 또는 퀀처 분자 및 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 비-자연 염기 및 퀀처 분자 또는 리포터 분자를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체에서 상기 두 개의 비-자연 염기는 염기쌍을 이루어 상기 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되어 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “비-자연 염기”는 자연적 염기인 adenine (A), guanine (G), thymine (T), cytosine (C) 및 uracil (U)을 제외한 base pairing 능력이 있는 자연적 염기의 derivatives를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “비-자연 염기”는 mother compound로서 자연적 염기와 다른 base pairing 패턴(즉, 수소결합 패턴)을 갖는 염기를 포함하며, 미국 특허 5,432,272, 5,965,364, 6,001,983 및 6,037,120에 기재된 비-자연 염기를 포함한다. 비-자연 염기 쌍의 수소결합은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합에 의해 이루어진다. 비-자연 염기들 사이의 base pairing도 specific 하게 이루어질 수 있다.

예를 들어, iso-C(또는 iso-dC)는 iso-G(또는 iso-dG)와 염기 K는 염기 X와, 염기 H는 염기 J와 염기 M은 염기 N과 specific하게 base pairing을 형성함을 알 수 있다 (참조 US Pat No. 07422850).

연장과정에서 삽입되는 표지는 바람직하게는 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 트리포스페이트에 연결되어 있다. 상기 표지는 바람직하게는 염기에 표지된다.

도 4 및 도 9를 참조하여 설명하면, 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되고, PTO로부터의 절단 단편은 리포터 분자가 결합되어 있는 iso-dC가 5’-말단에 있는 CTO에 혼성화 되며, 연장반응에서 퀀처 분자가 결합되어 있는 iso-dG가 iso-dC의 반대쪽에 삽입된다. 이 경우, iso-dG에 있는 퀀처 분자가 iso-dC에 있는 리포터 분자의 시그널을 퀀칭하여 시그널 변화를 초래하며, 이 시그널 변화는 검출가능한 시그널을 제공한다.

가닥간 상호작용적 표지를 이용하는 경우, 상호작용적 표지 중 하나의 표지는 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있고, 다른 표지는 연장 이합체 형성 과정에서 reaction solution으로부터 연장 이합체에 삽입된다.

CTO의 템플레이트 부위에 결합되는 상호작용적 표지 중 하나의 표지는 리포터 또는 퀀처 분자일 수 있고, 삽입되는 표지는 퀀처 또는 리포터 분자일 수 있다.

상호작용적 표지에서 하나의 표지는 연장 반응에서 삽입되는 다른 표지와 상호작용을 하여 시그널 변화를 초래할 수 있는 범위에서, CTO의 템플레이트 부위의 어떠한 부위에도 결합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위에 결합된 표지는 상기 CTO의 템플레이트 부위에 포함되어 있는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드에 결합되어 있다. 보다 바람직하게는, 표지가 결합된 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 위치해 있다.

택일적으로, CTO의 템플레이트 부위에 결합된 표지는 상기 CTO의 템플레이트 부위에 포함되어 있는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 아닌, 근접한 뉴클레오타이드에 결합되어 있으며, 상기 표지가 연장 반응에서 삽입된 표지와 상호작용이 가능한 위치에서 상기 뉴클레오타이드가 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치해 있다.

비-자연 염기를 이용한 가닥간 상호작용적 표지에 이용될 수 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상술한 가닥내 상호작용적 표지에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.

(iv) 삽입 단일표지

본 발명에 따르면, 연장 반응에 따른 검출가능한 시그널을 연장과정에서 삽입되는 표지만으로도 제공할 수 있다.

연장과정에서 삽입되는 단일 표지는 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, I¹²⁵ 및 C¹⁴), 형광 표지, 발광 (luminescent) 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지 또는 전기화학적 표지(electrochemical moiety) 또는 금속 표지(예컨대, 금)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위는 표지를 갖지 않으며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 연장과정에서 삽입되는 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되고, 상기 단계 (d)의 연장 이합체에 상기 단일 표지가 삽입되면 상기 단일 표지에서 발생되는 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단일 표지는 형광 표지이고, 표지가 삽입되기 전과 삽입되어 이중가닥에 포함되어 있는 경우 서로 다른 크기 (intensity)의 형광을 제공하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 바람직한 형광 표지의 예는 상술한 CTO에 결합된 단일 형광 표지에 이용될 수 있는 형광 표지에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.

보다 바람직하게는, 연장과정에서 삽입되는 단일 표지는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드에 연결되어 있고 상기 CTO의 템플레이트 부위는 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다.

CTO의 템플레이트 부위에 위치하는 비-자연 염기는 CTO의 템플레이트 부위의 어떤 위치에도 있을 수 있다.

삽입 단일표지를 이용하는 경우, 바람직하게는 본 발명의 방법은 고상에서 실시된다.

고상에서 삽입 단일표지를 이용하는 경우, 고상기질 상에서 삽입된 표지는 삽입 여부에 따라 시그널의 변화를 발생시키지 않더라고 표지 삽입 유무 만을 검출할 수 있으면 적용가능하며, 따라서, 보다 다양한 형태의 표지를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 표지를 갖지 않으며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되고, 상기 단계 (d)의 연장 이합체는 삽입된 단일 표지를 가지며, 결국 고상기질 상에 단일 표지가 존재하게 되어 검출 가능한 시그널을 제공한다.

보다 바람직하게는 상기 CTO의 템플레이트 부위는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기 및 표지로서 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체에서 CTO에 있는 상기 비-자연 염기의 반대쪽에 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기가 위치하고, 결국 고상기질 상에 리포터 분자가 존재하여 고상기질 상에서 검출 가능한 시그널을 제공한다.

도 7을 참조하여 설명하면, 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되고, PTO로부터의 절단 단편은 CTO에 혼성화 되며, 연장반응에서 형광 리포터 분자가 결합되어 있는 dATP가 삽입된다. 이 경우, 연장 이합체는 삽입된 형광 리포터 분자를 가지며, 결국 고상기질 상에 형광 리포터 분자가 존재하게 되어 검출 가능한 시그널을 제공한다.

연장반응에서 형광 리포터 분자가 결합되어 있는 dNTP를 사용하면 다수의 표지가 삽입될 수 있지만, 비-자연적 염기를 사용하면 특정위치에 하나의 표지만을 삽입할 수 있다. 도 8을 참조하여 설명하면, 타겟 핵산서열에 혼성화 된 PTO는 절단되고, PTO로부터의 절단 단편은 iso-dC가 5’-말단에 있는 CTO에 혼성화 되며, 연장반응에서 형광 리포터 분자가 결합되어 있는 iso-dG가 iso-dC의 반대쪽에 삽입된다. 이 경우, 연장 이합체는 삽입된 형광 리포터 분자를 가지며, 결국 고상기질 상에 형광 리포터 분자가 존재하게 되어 검출 가능한 시그널을 제공한다.

고상 반응에서 삽입 단일표지에서 이용될 수 있는 단일 표지는 바람직하게는 형광 표지, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소 표지효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제)이다.

단계 (d)에서 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus , Pyrococcus furiosus ( Pfu ), Pyrococcus woesei , Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus의 DNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 Taq 중합효소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 단계 (d)의 주형-의존성 핵산 중합효소는 동일한 효소이다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이머를 연장하기 위한 주형-의존성 핵산 중합효소 및 단계 (d)의 주형-의존성 핵산 중합효소는 동일한 효소이다.

단계 (e): 검출가능한 시그널의 검출

최종적으로, 단계 (d)에서 제공되는 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출가능한 시그널의 검출은 연장 이합체의 존재를 나타내고, 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.

본 발명은 상술한 바와 같이, 연장 반응과 연장 이합체에 있는 표지의 시그널링을 연동시켜 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 얻을 수 있다. 따라서, 실시간으로 검출할 수 있는 시그널을 제공하는 표지의 경우, 본 발명은 실시간 방식으로 실시할 수 있다.

상술한 본 발명에서 이용되는 표지 방법은 생성된 연장산물이 melting되거나 melting 후 다시 혼성화되는 과정에서 검출 가능한 시그널을 제공할 수 있으므로 멜팅 커브 분석을 통하여 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다.

예를 들어, 도 3에서, 형성된 연장이합체가 melting 되는 경우 CTO가 단일 가닥이 되고 CTO상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 3차 구조적(conformational)으로 근접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하여, 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 한편, 다시 혼성화되어 이중 가닥을 형성하는 경우 리포터 분자와 퀀처 분자가 서로 이격도어 상기 리포터 분자로부터의 시그널의 언퀀칭을 유도하여 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공한다. 연장 이합체가 존재하면, 멜팅 곡선 분석 과정에서 예상되는 연장 이합체의 Tm 값에 해당하는 온도에서 시그널이 발생하여, 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다.

특히, 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체는 metling 되거나 melting 후 다시 혼성화되는 과정에서도 시그널을 발생시키지 않으므로 멜팅 커브 분석시 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체에 대한 peak가 존재하지 않는다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 방출된 PTO의 절단 단편의 연장 이합체의 존재는 연장 이합체의 T_m 값을 이용한 멜팅 커브 분석을 통하여 검출한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 연장 이합체의 T_m 값을 이용하여 분석하는 경우, 반응물에서 형성된 이합체를 분리할 필요없이 homogeneous assay가 가능한 시그널을 제공할 수 있는 표지를 사용하며, 바람직하게는 형광 표지를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체는 상기 PTO로부터 방출된 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절되는 T_m 값을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d) 및 단계 (e) 사이에 단계 (d)에서 형성된 연장이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (e)는 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 검출한다. 이 경우, 단계 (e)에서 검출은 PTO 단편의 연장에 의해 직접적으로 초래되는 시그널 변화가 아니라 연장 이합체 형성과 멜팅 또는 연장이합체 형성과 멜팅/혼성화에 의해 유발되는 시그널 변화에 의하여 제공되는 검출가능한 시그널에 대한 검출이다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 방법은 단계 (a)-(d)를 변성 포함하여 반복실시 하고, 형성된 연장 이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (e)는 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 검출한다.

택일적으로, 본 발명은 단계 (e) 후에 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 한 번 더 검출한다. 이 경우, 단계 (e)에서 검출은 PTO 단편의 연장에 의해 직접적으로 초래되는 시그널 변화이며, 또한 단계 (e) 후에 연장이합체의 멜팅/혼성화에 의해 유발되는 시그널 변화도 추가적으로 검출한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체를 denaturation 한 다음, 점진적으로 annealing 하면서 나타나는 혼성화 곡선을 분석하는 혼성화 커브 분석(hybridization curve analysis)으로 실시할 수 있다. 선택적으로, 반응 결과물의 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 변화시키면서 hybridization 하는 Tm 값을 측정하는 멜팅 커브 분석 (melting curve analysis)도 가능하다.

본 명세서에서 용어 “T_m"은 멜팅 온도를 의미한다. 상기 멜팅 온도는 이중가닥 핵산 분자의 하나의 파퓰레이션의 반이 단일가닥으로 해리되는 온도이다. T_m 값은 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열의 길이 및 G/C content 등에 의해 결정된다. T_m 값은 Wallace rule(R.B. Wallace, et al., Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 또는 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35:35553562(1996)); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res ., 24:4501-4505(1996)) 등 공지된 방법에 의하여 계산할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Tm 값은 실제 사용하는 반응 조건 하에서의 Tm 값을 의미한다.

변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 변성의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.

멜팅 커브는 혼성화의 stringency를 증가시키고 연장 이합체의 dissociation을 측정함으로써 얻어질 수 있다. 또한, 멜팅 커브는 혼성화의 stringency를 감소시키고 연장 이합체의 association을 측정함으로써 얻어질 수도 있다. 상기 dissociation 또는 association에 의한 연장 이합체의 정도 또는 양을 나타내는 시그널을 측정한다. 혼성화 stringency의 파라미터(예컨대, 온도, pH 등)를 증가시키거나 혹은 감소시킴으로써 혼성화 조건의 stringency는 점진적으로 변화시킬 수 있다. 멜팅 커브를 얻는 많은 방법이 공지되어 있다(참조: USP 6,174,670, USP 5, 789,167, Drobyshev et al, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits et al J. Biomol . Structure Dynam . 11:783(1994); Howell et al Nature Biotechnology 17:87(1999). 예를 들어, 멜팅 커브는 혼성화 stringency의 파라미터에 대한 output signal의 변화의 graphic plot 또는 display로 이루어질 수 있다. Output signal은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브는 형광과 같은 output signal을 가지며 이는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 것이며, Y-축에 output signal, X-축에 혼성화 파라미터로 하여 플롯팅된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e)는 변성을 포함하여 반복적으로 실시된다. 이러한 반복에 의해 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 더 증폭되거나 혹은 타겟 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b)와 단계 (c)-(d)는 하나의 반응용기 또는 별도의 반응용기에서 구별되어 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b)와 단계 (c)-(d)는 하나의 반응용기에서도 구별되어 실시될 수 있다. 예를 들면, PTO의 3’-타겟팅 부위와 타겟 핵산 서열의 혼성화 조건이, PTO로부터의 절단 단편과 CTO의 혼성화 조건보다 높은 stringent 한 조건이 되도록 서열 및 반응 조건을 디자인하면, 단계 (a)-(b)의 반복과정을 진행하더라도 단계 (c)-(d)는 진행되지 않고, 단계 (a)-(b) 반복과정을 종료한 후 단계 (c)-(d)를 진행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)-(b)는 변성을 포함하여 반복적으로 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머를 포함하는 단계 (a)를 포함한 과정을 변성과정 함께 반복 실시할 경우, 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하며, 바람직하게는 PCR 방법에 의하여 실시한다.

본 발명에서 이용되는 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함한다.

mRNA가 타겟 핵산서열인 경우에는, 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머를 사용하거나, 랜덤 프라이머 혹은 타겟 특정적인 프라이머가 이용된다.

타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.

본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 유전자 분석(genetic analysis)에서도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 서열이다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 포함한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서 뉴클레오타이드 변이의 검출은, 지노타이핑 또는 대립유전자형의 검출로 표현될 수 있다.

뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입 및 트랜스로케이션 등 모든 변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 타겟 핵산 서열은 증폭용 프라이머에 의해 전-증폭된 핵산서열이다.

본 발명은 멀티플레스 타겟 핵산 서열의 검출에도 사용된다:

멀티플렉스 검출

본 발명은 특히 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하는 멀티플렉스 검출에서 매우 우수한 performance를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 최소 2종 이상의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함하며, 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우 상응하는 최소 2종의 검출 가능한 시그널이 제공한다.

본 발명에서 검출가능한 시그널은 사용되는 표지에 의하여 제공되므로, 사용되는 표지의 물리적 화학적 성질에 따라 제공되는 시그널의 특성이 다르다.

예를 들어, 서로 다른 2 종의 타겟 핵산 서열의 검출을 위하여 형광표지로서 FAM및 TAMRA를 각각 사용하는 경우, 각 형광표지의 여기 파장 또는 방출 파장이 서로 다르므로, 상기 표지들로부터 제공되는 시그널은 상호 구별될 수 있다. 반면, 서로 다른 2 종의 타겟 핵산 서열의 검출을 위하여 동일한 형광 표지인 FAM을 사용하면, 상호 시그널은 상호 구별되지 않는다.

최종적으로 검출되는 시그널은 타겟 핵산서열에 따라 각각 다르게 할 수 있다.

또는, 최종적으로 검출되는 시그널은 타겟 핵산서열의 종류에 무관하게 동일하게 할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되는 시그널 또는 상호 구별되지 않는 시그널이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이며, 이 경우 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 Tm 값을 갖는다. 즉, 연장 이합체의 T_m 값을 이용하는 경우에는, 타겟 핵산서열의 종류에 무관하게 최종적으로 검출되는 시그널은 동일하게 하여도 복수의 타겟 핵산서열을 분별적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며 최소 2종의 PTO의 5’-태깅 부위는 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함하며, 상기 최소 2종의 CTO는 서로 상이한 템플레이트 부위를 포함하고 그의 Tm 값이 서로 다르다. 이 경우, 사용되는 최소 2종의 CTO를 서로 다른 T_m 값을 갖도록 제작하는 경우, 단계 (d)에서 최소 2종의 연장 이합체는 서로 다른 T_m 값을 가지며 결국 서로 다른 멜팅 패턴을 나타낸다. 따라서, 단계 (e)에서 또는 단계 (e) 이후에 멜팅 패턴 즉 T_m 값 및/또는 멜팅 곡선의 모양을 측정함으로써 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 분별적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연장 이합체는 상기 PTO로부터 방출된 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이를 조절함으로써, T_m 값이 조절될 수 있다. 일예로서, 최소 2종의 CTO를 서로 다른 T_m 값을 갖도록 제작하는 경우, 템플레이트 부위의 길이 및/또는 서열 (바람직하게 G/C content)을 조절하여 제작할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열은 서로 다른 레이블링 방법에 의하여 검출된다. 예를 들어, 서로 다른 표지가 결합된 CTO를 이용하여 멀티플렉스 검출을 실시할 수 있다.

예를 들어, 단일 형광표지를 이용하는 경우, 최소 2종의 CTO의 캡처링 부위에 서로 상이한 단일 형광 표지를 결합시켜 최종적으로 검출되는 형광 시그널을 측정함으로써 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 분별적으로 검출할 수 있다. 상호 작용적 표지를 이용하는 경우, 최소 2종의 CTO의 캡처링 부위에 서로 상이한 리포터/퀀처를 결합시켜 최종적으로 검출되는 시그널을 측정함으로써 최소 2종의 타겟 핵산서열을 분별적으로 검출할 수 있다.

흥미롭게도, 최소 2종의 타겟 핵산 서열은 서로 동일한 레이블링 방법 또는 상호 구별되지 않는 시그널에 의하여 검출될 수 있다.

예를 들어, 단일 형광 표지를 이용하는 경우, 최소 2종의 CTO의 캡처링 부위에 동일한 단일 형광 표지가 결합되어도, 단계 (d)에서 형성된 최소 2종의 연장이합체는 서로 다른 서로 다른 T_m 값을 가지며 결국 서로 다른 멜팅 패턴을 나타낸다. 따라서, 단계 (e) 또는 단계 (e) 이후에 멜팅 패턴 즉 T_m 값 및/또는 멜팅 곡선의 모양을 측정함으로써 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 분별적으로 검출할 수 있다. 상호 작용적 표지를 이용하는 경우, 최소 2종의 CTO의 캡처링 부위에 서로 동일한 리포터/퀀처가 결합되어도, 단계 (d)에서 형성딘 최소 2종의 연장이합체는 서로 다른 서로 다른 T_m 값을 가지며 결국 서로 다른 멜팅 패턴을 나타낸다. 따라서, (e) 또는 단계 (e) 이후에 멜팅 패턴 즉 T_m 값 및/또는 멜팅 곡선의 모양을 측정함으로써 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 분별적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이며, 이 경우 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 Tm 값을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열의 각각 상응하는 검출 가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이며, 이 경우 상기 일부 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 Tm 값을 가지고, 상기 시그널은 나머지 타겟 핵산 서열에 상응하는 검출 가능한 시그널과는 상호 구별된다.

예를 들어, 검출하고자 하는 타겟 핵산 서열이 6 종인 경우, 3 종은 FAM을 사용하여 표지하되 서로 다른 Tm 값을 갖는 연장 이합체가 형성되도록 하고, 나머지 3종은 TAMRA를 사용하여 표지하되 서로 다른 Tm 값을 갖는 연장 이합체가 형성되도록 디자인한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열의 검출에 사용되는 최소 2 종의 PTO의 5’-태깅 부위는 동일할 수 있다. 예를 들어, 다수 타겟 핵산 서열 중 어느 하나라도 존재하는 지 검출하는 스크리닝 목적의 경우 동일한 5’-태깅 부위를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열의 검출에 사용되는 최소 2 종의 CTO의 템플레이트 부위는 상호 동일한 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 2 종의 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하여 실시된다.

본 발명은 액상 또는 고상에서 실시할 수 있다.

고상 반응

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 고상에서 실시되며 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상기질 상에 고정된다(참조: 도 5-도 9).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO가 고정화 되는 고상 기질은 마이크로어레이를 포함한다. CTO는 5’-말단 또는 3’-말단(바람직하게는, 3’-말단)을 통하여 고상 표면에 직접적 또는 간접적으로 고정화되며, 바람직하게는 간접적으로 고정화 된다. 또한, CTO의 말단은 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 표면에 고정화될 수 있다. CTO가 간접적으로 고상 표면에 고정화 되는 경우에는, 링커가 관여를 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 링커는 마이크로어레이에서 프로브를 고정화 하는 데 이용되는 어떠한 링커도 포함한다. 예를 들어, 아민기를 가지는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 가지는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로 이용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용되어 효소의 작용 (예를 들어, 효소적 절단 반응)에 방해가 되는 space hindrance를 최소화하거나, 혼성화 효율을 증가시킬 수 있다. 링커로 사용되는 poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일은 프로브의 서열에 포함되지 않는다.

본 발명의 반응 환경을 제공하는 고상 기질, 바람직하게는 마이크로어레이는 당업계에서 이용되는 어떠한 마이크로어레이도 포함한다. 본 발명의 모든 과정, 즉 타겟 서열과의 혼성화, 절단반응 및 검출은 마이크로어레이 상에서 이루어진다. 마이크로어레이에서 CTO는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상의 기질(solid substrate)은, 예를 들어 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO₂ 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 복수의 CTO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 복수의 어드레서블 부위에 고정화 되며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다.

본 발명의 고상 반응은, 고정화된 CTO에 존재하는 표지가 물리적으로 분리 되어 있기 때문에 한 종류의 표지 분자를 이용하여 다수의 타겟 핵산을 동시에 검출하는 것이 가능하므로 고상에서 수행되는 본 발명 기술을 이용하면, 검출 가능한 타겟 핵산 가지 수가 제한되지 않는다.

고상에 고정된 CTO를 이용하면서, 상술한 삽입 단일 표지를 이용하는 방법을 사용한다면, 상기 삽입 단일 표지는 결합된 핵산 가닥이 단일 가닥인 경우와 이중 가닥인 경우 변화된 시그널을 제공하는 특징을 갖지 않아도 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위는 표지를 갖지 않으며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 단일표지로서 리포터 분자를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되고, 상기 단계 (d)의 연장 이합체는 삽입된 리포터 분자를 가지며, 결국 고상기질 상에 리포터 분자가 존재하게 되어 검출 가능한 시그널을 제공한다.

보다 바람직하게는, CTO의 템플레이트 부위는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기 및 단일표지로서 리포터 분자를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체에서 CTO에 있는 상기 비-자연 염기의 반대쪽에 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기가 위치하고, 결국 고상기질 상에 리포터 분자가 존재하여 고상기질 상에서 검출 가능한 시그널을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 형광 표지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CTO의 템플레이트 부위에 있는 비-자연 염기는 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 결합되어 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다:

(a) 다음을 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계;

(i) 분석 대상의 핵산 시료, (ii) 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 한 쌍, (iii) PTO, (iv) CTO 및 (v) 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소; 상기 프라이머 한 쌍의 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머는 타겟 핵산서열의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 PTO에 대하여 업스트림 및 다운스트림에 위치에서 상기 타겟 핵산 서열과 혼성화되고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-말단은 연장이 되지 않도록 블록킹 되어 있고; 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며;

(b) 상기 반응 혼합물을 이용하여 변성, 어닐링 및 연장 반응의 최소 2사이클을 실시하는 단계; 및 상기 연장은 검출가능한 시그널을 제공하고 연장 이합체를 형성하며, 상기 검출가능한 시그널은 상기 단계 (c)의 결과물에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입되는 표지에 의하여 제공되고,

(c) 상기 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출가능한 시그널의 검출은 연장 이합체의 존재를 나타내고, 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예

본 발명의 특징 및 이점은 타겟 증폭이 수반되는 멀티플렉스 검출 즉 최소 2종의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하는 데에서 명확하게 나타난다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 핵산 시료 내의 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 최소 2 종의 타겟 핵산 서열을 증폭할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 최소 2종의 프라이머 쌍 및 최소 2종의 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드 (PTO)를 최소 2종의 타겟 핵산 서열과 혼성화 시키는 단계로서; 상기 최소 2종의 프라이머 쌍 각각의 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머는 상응하는 타겟 핵산서열의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 상응하는 PTO 대하여 업스트림 및 다운스트림에 위치에서 상응하는 타겟 핵산 서열과 혼성화되고; 상기 최소 2종의 PTO는 각각 (i) 상기 상응하는 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 상응하는 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-말단은 연장이 되지 않도록 블록킹 되어 있고; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 프라이머 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 중합효소에 의한 PTO의 5’-태깅 부위의 절단을 유도하며; 상기 핵산 시료 내 핵산 분자들이 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열을 포함하는 경우 상기 최소 2종의 PTO 각각은 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열 각각에 혼성화 되고;

(b) 상기 최소 2종의 PTO의 절단을 위한 조건 하에서, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 최소 2종의 PTO 각각이 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 상기 최소 2종의 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소에 의해 절단되어 최소 2종의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;

(c) 단계 (b)에서 상기 최소 2종의 PTO로부터 방출된 최소 2 종의 단편과 최소 2종의 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 2종의 CTO 각각은 3’to 5’순서로 (i) 상기 상응하는 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 상응하는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’- 타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며; 상기 최소 2종의 PTO로부터 방출된 최소 2 종의 단편은 각각 상기 상응하는 CTO의 캡처링 부위와 각각 혼성화되고;

(d) 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 상응하는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 최소 2 종의 단편은 연장되고, 상기 연장은 최소 2 종의 검출가능한 시그널을 제공하고 최소 2종의 연장 이합체를 형성하며, 상기 최소 2 종의 검출가능한 시그널은 각각 (i) 상기 상응하는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 상응하는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지와 연장과정에서 삽입된 표지 또는 (iii) 연장과정에서 삽입된 표지에 의하여 제공되며, 상기 최소 2 종의 검출가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이고, 상기 최소 2종의 연장 이합체는 서로 상이한 T_m 값을 가지며;

(e) denaturing 시키는 단계;

(f) 상기 단계 (a)-(e)를 최소한 2회 이상 반복하는 단계;

(g) 형성된 연장 이합체를 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계; 그리고

(h) 상기 (g)에서의 검출 가능한 시그널을 측정하여 최소 2 종의 연장 이합체의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 최소 2 종의 연장이합체의 존재는 상응하는 최소 2 종의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.

본 발명의 타겟 증폭이 수반되는 멀티플렉스 검출 방법은, 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 타겟 증폭이 수반되는 멀티플렉스 검출 방법은 복수개의 타겟 검출의 편의성 및 정확성 등의 측면에서 매우 우수한 performance를 나타낸다.

키트

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하기 위한 키트를 제공한다:

(a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화 되지 않으며;

(b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림 위치에서 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며;

(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며, 상기 PTO의 절단에 의해 나오는 단편과 혼성화되며; 상기 CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지가 결합되어 있거나, 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있거나, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지 및 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 상기 CTO의 템플레이트 부위는 비-자연 염기(non-natural base)가 결합되어 있다.

본 발명의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 상기 PTO 단편과 CTO을 이용한 연장 반응에서 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하며, 바람직하게는 상기 표지는 뉴클레오타이드에 결합되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는, 상기 CTO의 템플레이트 부위가 리포터 분자 및 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성(specific binding affinity)을 가지며 퀀처 분자가 결합된 비-자연 염기(non-natural base)를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는, 상기 CTO의 템플레이트 부위에 비-자연 염기가 결합되어 있는 경우, 표지가 결합되고 있고 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 사용되는 표지는 형광 표지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 둘 모두 상기 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 최소 2종 이상의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 액상 반응용 키트이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 고상 반응용 키트이고 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상기질 상에 고정되어 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 타겟 핵산 서열 존재 시 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)의 절단 반응 및 상기 절단 반응에 의해 생성된 PTO 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)와의 혼성화를 기본적으로 이용하는 본 발명은 상기 CTO를 주형으로 하여 상기 PTO 단편을 연장시키는 과정에서 검출 가능한 시그널을 발생시킴으로써, 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있는 것에 특징이 있다.

(b) CTO의 적절한 위치, 특히 템플레이트 부위에 단일 형광 표지 또는 상호 작용적인 이중 표지를 연결하거나, 연장과정에서 삽입되는 표지 (예를 들어, 뉴클레오타이드 트리포스페이트에 결합된 표지)를 사용하면 연장과정에서 실시간으로 검출 가능한 시그널을 발생시킬 수 있어 타겟 핵산 서열의 존재를 실시간으로 검출할 수 있다. 특히, 상기 표지 방법은 연장 반응이 일어나야 시그널이 발생되므로 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체 생성은 시그널을 발생시키지 않는다. 따라서, 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체 생성은 타겟 핵산 서열의 검출에 영향을 미치지 않는다.

(c) 본 발명에서 이용되는 표지 방법은 생성된 연장 이합체가 멜팅되거나 멜팅 후 다시 혼성화되는 과정에서 검출 가능한 시그널을 발생시키므로 멜팅 커브 분석을 통하여 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 특히, 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체는 멜팅 되거나 멜팅 후 다시 혼성화되는 과정에서 시그널을 발생시키지 않으므로 멜팅 커브 분석 시 절단되지 않은 PTO와 CTO의 혼성화에 의한 이합체에 대한 피크가 존재하지 않는다.

(d) 본 발명에서 연장 이합체의 Tm 값은 PTO 절편의 서열 및/또는 길이 그리고 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절될 수 있으며, 결국. 연장 이합체의 Tm 값을 임의적으로 선택할 수 있다. 이러한 윈리를 이용하면, (i) 예상되는 Tm 값 이외에서 발생되는 시그널은 위양성 시그널이므로 위양성 시그널 없이 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. (ii) 또한, 연장이합체에 대한 자유로운 Tm 값의 선택은 최소 2 종 이상의 타겟 핵산 서열에 대한 효율적인 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. (iii) 한편, 종래 프라이머 쌍을 이용하여 특정 길이의 산물을 생성한 후 멜팅 커브를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법은 생성되는 산물의 길이를 조절하는 데 제한이 있고, 생성 산물의 길이가 길면 길수록 생성 산물의 Tm 값의 차이를 이용한 정교한 멜팅 커브 분석에 한계가 있게 된다. 반면, 본 발명은 연장 이합체의 길이 조절이나 Tm 값의 선택이 용이하므로 보다 정확하고 정교한 멜팅 커브 분석이 가능하다.

(e) 종래의 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화물 또는 타겟 핵산 서열의 PCR 증폭 산물에 대한 멜팅 커브 분석을 통하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법의 경우, 임상 sample처럼 타겟 핵산 서열에 변이가 많은 sample은 sample 마다 멜팅 커브 패턴에 편차를 보일 수 있다. 반면, 본 발명은 새로운 연장 이합체를 형성시켜 멜팅 커브 분석을 실시하므로 sample에 따른 편차가 없는 결과를 얻을 수 있다.

(f) 본 발명에서 타겟 핵산 서열과 혼성화가 이루어지지 않는 PTO의 5’tagging portion 및 CTO의 서열은 타겟 핵산 서열을 고려하지 않고 선택될 수 있다. 따라서, 사전에 이용 가능한 서열의 pool를 디자인할 수 있다. 한편, PTO의 경우, PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열을 고려하여 제조하여야 하나, CTO의 경우는 타겟 핵산 서열의 고려 없이 ready-made 방식으로 만들어 사용될 수 있다. 이러한 특징은 멀티플렉스 검출 특히, 고상에 고정된 CTO를 사용하는 마이크로어레이 방법 등에서 강력한 이점을 제공한다.

(g) 최소 2 종 이상의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 각각의 타겟 핵산 서열에 상응하는 연장이합체의 Tm 값이 다르면, 동일한 형광 특성의 시그널을 제공하는 표지 방법을 사용하더라도 멜팅 커브 분석을 통하여 동시에 다중 타겟 핵산 서열 검출이 가능하다. 이와 같은 특징은 기존의 real-time methods를 이용하여 멀티플렉스 검출을 실시하는 경우, 검출 가능한 형광 레이블 수의 제한으로 인한 멀티플렉스의 구현의 한계를 극복할 수 있다.

도 1은 본 발명의 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석에 이용되는 PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide) 및 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 구체적인 구성을 보여주는 도면이다. PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다. 바람직하게는, PTO의 3’-말단은 연장이 되지 않도록 블록킹 되어 있다. CTO는 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함한다. 바람직하게는, CTO의 3’-말단은 연장이 되지 않도록 블록킹 되어 있다.
도 2는 본 발명의 PTOCE-SG assay의 일 구현예로서, CTO의 템플레이트 부위에 단일 형광 표지가 결합되어 있다.
도 3은 본 발명의 PTOCE-SG assay의 일 구현예로서, CTO의 템플레이트 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있다.
도 4는 본 발명의 PTOCE-SG assay의 일 구현예로서, CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 리포터 분자를 갖는 iso-dC가 결합되어 있으며, 연장 반응 과정에서 퀀처 분자를 갖는 iso-dG가 연장이합체에 삽입된다.
도 5는 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 고상에서 일 구현예로서, CTO가 3’-말단을 통하여 고상기질에 결합되어 있다. 고정화된 CTO의 템플레이트 부위에 단일 형광 표지가 결합되어 있다.
도 6은 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 고상에서 일 구현예로서, CTO가 3’-말단을 통하여 고상기질에 결합되어 있다. 고정화된 CTO의 템플레이트 부위에 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있다.
도 7은 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 고상에서 일 구현예로서, CTO가 3’-말단을 통하여 고상기질에 결합되어 있다. PTO 단편의 연장 과정에서 리포터 분자를 갖는 dATP가 연장 이합체에 삽입된다.
도 8은 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 고상에서 일 구현예로서, CTO가 3’-말단을 통하여 고상기질에 결합되어 있다. 고정화된 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 iso-dC가 결합되어 있으며, PTO 단편의 연장 과정에서 리포터 분자를 갖는 iso-dG가 연장 이합체에 삽입된다.
도 9는 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 고상에서 일 구현예로서, CTO가 3’-말단을 통하여 고상기질에 결합되어 있다. 고정화된 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 리포터 분자를 갖는 iso-dC가 결합되어 있으며, 연장 반응 과정에서 퀀처 분자가 있는 iso-dG가 연장 이합체에 삽입된다.
도 10은 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 타겟 핵산 서열 (Neisseria gonorrhoeae)의 실시간 증폭 및 실시간 검출 결과이다. PTO 및 CTO의 3’-말단은 블록킹되었다. CTO의 5'-말단은 퀀처 분자로 표지하였으며, 템플레이트 부위에 형광 리포터 분자로 표지되었다.
도 11은 도 10의 real-time PCR 결과물에 대하여 멜팅 커브 분석을 한 결과이다.
도 12는 본 발명의 PTOCE-SG assay를 이용한 멜팅 커브 분석을 통하여 동시다중으로 타겟 핵산 서열을 검출한 결과이다. 각각의 타겟 핵산서열에 상응하는 연장 이합체는 동일한 형광 표지 (FAM)를 갖지만, 서로 다른 Tm 값을 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 주형 ( template ) 및 올리고뉴클레오타이드 준비

본 발명의 PTOCE-SG (PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation) assay를 이용한 타겟 핵산 서열 검출 방법을 구현하기 위하여 표 1과 같이 주형 및 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 액상반응에서는 Neisseria gonorrhoeae 및 Staphylococcus aureus의 genomic DNA를 주형으로 사용하며, 고상반응에서는 Neisseria gonorrhoeae gene의 합성 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 사용한다. 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드 (Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열과 비-상보적인 서열을 가지고, 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열과 상보적인 서열을 가진다. PTO의 3’-말단은 DNA 중합효소에 의한 연장반응을 막기 위해 carbon spacer로 블록킹한다. 캡쳐링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드 (Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)의 캡쳐링 부위는 PTO의 5’-태깅 부위와 상보적인 서열을 가지며, CTO의 템플레이트 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 각각 비-상보적인 서열을 가진다. 액상 반응에서 사용하는 CTO는 이중-표지를 가지며, 연장반응을 막기 위해 3’-말단에 carbon spacer로 블록킹한다. 액상 반응에서 사용하는 CTO의 5’-말단에 퀀쳐 분자 (BHQ-1), CTO의 템플레이트 부위에 형광 리포터 분자 (FAM)를 표지하였다. 고상에 고정하여 사용하는 CTO의 3’-말단은 고상 지지체에 부착하기 위하여 (CH2)₇-NH₂로 변형하였고, CTO의 5’-말단에 퀀쳐 분자 (BHQ-2) 및 템플레이트 부위에 형광 리포터 분자 (Quasar570)를 표지하였다.

명칭	타입	서열 (5’ → 3’)	서열번호
NG_F	프라이머	TACGCCTGCTACTTTCACGCT	SEQ ID NO: 1
NG_R	프라이머	CAATGGATCGGTATCACTCGC	SEQ ID NO: 2
NG_P3	PTO	ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]	SEQ ID NO: 3
NG_P4	CTO	[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]	SEQ ID NO: 4
SA_F	프라이머	TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC	SEQ ID NO: 5
SA_R	프라이머	GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG	SEQ ID NO: 6
SA_P3	PTO	AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3 spacer]	SEQ ID NO: 7
SA_P4	CTO	[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T(FAM)]AGCGTGGTCGGATT[C3 spacer]	SEQ ID NO: 8
NG_T	합성주형	AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA	SEQ ID NO: 9
NG_P4C	고상 CTO	[BHQ-2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(Quasar570)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT TTTTTTTTTT[AminoC7]	SEQ ID NO: 10

BHQ : Quencher (Black Hole Quencher)

PTO : Probing and Tagging Oligonucleotide

CTO : Capturing and Templating Oligonucleotide

실시예 2: Detection of a target nucleic acid sequence by PTOCE - SG assay in liquid phase

액상에서 PTO 및 이중-표지된 CTO를 이용한 PCR 과정을 통하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 지 실험하였다. 타겟 핵산 서열 존재 시에 절단되어 방출된 PTO 절편의 연장 이합체 생성여부는 (1) CTO에 혼성화된 PTO 절편이 연장되어 연장 이합체를 형성하는 온도에서 매 사이클 마다 시그널을 검출하는 방법 (real-time detection) 및 (2) 최종 반응 결과물에 대하여 멜팅 커브 분석을 통하여 검출하는 방법 (melting curve analysis)으로 확인하였다.

타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 DNA 중합효소 및 PTO 절단을 위한 5’뉴클레아제로서 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.

Template DNA 및 올리고뉴클레오타이드

Neisseria gonorrhoeae의 genomic DNA와 실시예 1에서 준비한 프라이머 (SEQ ID NOs: 1 and 2), PTO (SEQ ID NO: 3) 그리고 CTO (SEQ ID NO: 4)를 이용한다.

PTOCE - SG assay using real - time detection

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각 10 pmole 프라이머(SEQ ID NOs: 1 and 2), 5 pmole PTO (SEQ ID NO: 3), 2 pmole CTO (SEQ ID NO: 4), 200 uM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 1.6 U의 5’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 100 pg Neisseria gonorrhoeae genomic DNA를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 PCR 기기 (Real-time PCR machine, 제품명 CFX96 Real-time Cycler, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 실시간 PCR을 수행한다. 증폭반응은 95℃에서 15분 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 반응과정을 60회 반복하고 형광의 탐지는 매 사이클 마다 60℃ 에서 측정한다.

도 10에 따르면, 주형, PTO 및 CTO가 모두 포함되어 있는 real-time PCR 반응에서 사이클에 따른 형광 시그널의 변화가 관찰되었다. 반면, 주형이 없거나, PTO 혹은 CTO가 없는 real-time PCR 반응에서는 형광 시그널의 변화가 없었다. 따라서, 본 발명의 PTO와 CTO를 이용한 실시간 형광 검출 방법을 통하여 타겟 핵산 서열의 실시간 검출이 가능함을 알 수 있다.

PTOCE - SG assay using melting curve analysis

상기 실시간 증폭 과정 후 결과물을, 35℃에서 90℃로 온도를 0.5℃씩 증가시키면서, 형광을 탐지하여 melting curve 분석을 실시한다.

도 11에 따르면, 주형이 있는 반응 결과물에는 방출된 PTO 절편의 연장산물이 갖는 것으로 예상되는 Tm 값 (76.5℃)에서 peak가 존재하였다. 반면, 주형이 없는 반응 결과물에서는 PTO가 절단되지 않은 상태에서 CTO와 혼성화되더라도 이중-표지 위치가 혼성화 부분에 포함되지 않으므로 그 형광의 변화가 없어 유효한 peak가 관찰되지 않았다. 또한 PTO 혹은 CTO가 없는 반응결과물에서도 형광의 변화가 없어 유효한 peak이 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 PTO와 CTO를 이용한 PTOCE-SG assay에서 melting curve analysis를 이용한 검출 방법을 통하여 타겟 핵산 서열의 검출이 가능함을 알 수 있다.

실시예 3: Detection of multiple target nucleic acid sequences by PTOCE - SG assay

액상에서, PTO와 이중-표지된 CTO를 이용한 PCR 과정을 통하여 2 개의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출할 수 있는 지 실험하였다. 타겟 핵산 서열 존재 시에 절단되어 방출된 PTO 절편의 연장산물 생성여부는 최종 반응 결과물에 대하여 멜팅 커브 분석을 통하여 검출하는 방법 (melting curve analysis)으로 확인하였다. 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장 산물의 Tm을 다르게 디자인하여 각 타겟 핵산 서열에 대한 CTO가 동일한 형광 표지 (FAM)를 사용하더라도 동시 검출할 수 있는 지를 확인하였다.

타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 DNA 중합효소 및 PTO의 절단을 위한 5’뉴클레아제로서 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.

Template DNA 및 올리고뉴클레오타이드 준비

Neisseria gonorrhoeae (NG)와 Staphylococcus aureus (SA)의 genomic DNA와 실시예 1에서 준비한 프라이머 (SEQ ID NOs: 1, 2, 5 and 6), PTO (SEQ ID NOs: 3 and 7) 그리고 CTO (SEQ ID NOs: 4 and 8)를 이용한다.

Muliplex PTOCE - SG assay using melting curve analysis

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 각 10 pmole 프라이머(SEQ ID NOs: 1, 2, 5 and 6), 각 5 pmole PTO (SEQ ID NOs: 3 and 7), 각 2 pmole CTO (SEQ ID NOs: 4 and 8), 200 uM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 1.6 U의 5’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소, 100 pg Staphylococcus aureus genomic DNA 및 100 pg Neisseria gonorrhoeae genomic DNA를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 CFX96 Real-time Cycler, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 중합효소연쇄반응 후 melting curve analysis를 수행한다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 15분 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 반응과정을 60회 반복한다. 중합효소연쇄반응 후 결과물을, 35℃에서 90℃로 온도를 0.5℃씩 증가시키면서, 형광을 탐지한다.

도 12와 같이, 각 타겟 핵산 서열에 상응하는 방출된 PTO 절편이 각 CTO에 혼성화하여 연장된 이합체의 각 Tm 값 (SA : 63.5℃, NG : 75.5℃)을 보이는 peak가 존재하였다. 따라서, 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장 산물의 Tm을 다르게 디자인하여 각 타겟 핵산 서열에 대한 CTO가 동일한 형광 표지 (FAM)를 사용하더라도 동시 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 4: Detection of a target nucleic acid by PTOCE - SG assay in solid phase

Template DNA 및 올리고뉴클레오타이드 준비

실시예 1에 의해 준비한 합성 주형(SEQ ID NO: 9), 프라이머 (SEQ ID NO: 2) 와 PTO (SEQ ID NO: 3) 그리고 고상 CTO (SEQ ID NO: 10)를 이용한다.

슬라이드에 CTO 고정

NHS로 활성화된 마이크로어레이 슬라이드(NSBPOSTECH) 상에 실시예 1에서 준비한 CTO (SEQ ID NO: 10)를 고정시킨다. 공유결합에 의하여, 3’-말단이 아민기로 변형된 CTO 를 마이크로어레이 슬라이드에 고정시킨다. CTO를 NSBPOSTECH사 스팟팅 완충용액 (NSB Spotting solution, NSBPOSTECH)을 이용하여 10 μM로 희석한 후 마이크로에레이 슬라이드에 스팟팅한다. 슬라이드는 2X SSPE (0.3 M sodium chloride, 0.02 M sodium hydrogen phosphate, 2.0 mM EDTA), pH 7.4, 7.0 mM SDS가 포함된 완충 용액(37℃) 에서 30분간 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다.

PTOCE - SG assay in solid phase

DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 10 pmole 프라이머(SEQ ID NO: 2), 1 pmole PTO (SEQ ID NO: 3), 200 uM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 2.4 U의 5’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 2 pmole의 합성 주형 (SEQ ID NO: 9)를 포함한 시료 30 ㎕를 CTO (SEQ ID NO: 10)가 부착되어있는 마이크로어레이 슬라이드에 가한 후 증발을 막기 위하여 커버슬립으로 덮는다. 반응은 슬라이드용 연쇄중합반응증폭기 (in situ Thermocycler, 제품명 ‘Genepro B4I, BIOER사 제품, 중국)를 이용하여 수행한다. 반응은 95℃에서 15분 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 63℃에서 60초, 72℃에서 30초 반응과정을 30회 반복한다. 형광의 탐지와 이미지 획득은 공초점 레이져 스캐너 Axon Genepix4100A (Molecular Device, US)를 이용하여 5μm 해상도로 스캔한다. 형광의 정량은 마이크로어레이어 소프트웨어 Genepix pro5.1 (Molecular Device, US)을 이용 하고, 형광 강도는 spot median값에서 local background 시그널을 뺀 값으로 한다.

마이크로어레이 이미지 결과에서, 주형이 있는 반응에서 형광 시그널이 증가되었으나, 주형이 없는 상태에서는 시그널 변화가 없었다. 따라서 고상에서도 PTOCE-SG assay를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장-의존적 시그널 발생(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하는 방법:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide) 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO)와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO보다 업스트림 위치에서 상기 타겟 핵산 서열과 혼성화되고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 PTO가 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되면, 상기 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 절단되어 상기 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 단계 (b)에서 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 주형-의존성 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되고, 상기 연장은 검출가능한 시그널을 제공하고 연장 이합체를 형성하며, 상기 검출가능한 시그널은 상기 단계 (c)의 결과물에 결합된 최소 하나의 표지 및/또는 연장반응에서 삽입되는 표지에 의하여 제공되고,
(e) 상기 검출가능한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출가능한 시그널의 검출은 연장 이합체의 존재를 나타내고, 상기 연장 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서의 시그널은 상기 CTO에 결합된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 CTO에 결합된 최소 하나의 표지와 연장과정에서 삽입된 표지 또는 (iii) 연장과정에서 삽입된 표지에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 PTO 및/또는 상기 CTO는 연장이 되지 않도록 그의 3’-말단이 블록킹 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의해 상기 PTO의 절단반응을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 효소에 의한 상기 PTO의 절단반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 부위는 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 일부 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 1-5 개의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 CTO에 결합된 최소 하나의 표지는 상기 CTO의 템플레이트 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지가 결합되어 있고 상기 단계 (d)의 연장 이합체 형성은 상기 표지에서 발생되는 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 단일 표지는 단일 형광 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 CTO는 표지로서 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있고, 상기 리포터 분자와 퀀처 분자는 3차 구조적(conformational)으로 근접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 상기 단계 (d)의 연장 이합체 형성은 상기 리포터 분자와 퀀처 분자를 이격시켜 상기 리포터 분자로부터의 시그널의 언퀀칭을 유도하여 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 둘 모두 상기 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 연장과정에서 삽입된 표지는 뉴클레오타이드에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 표지를 갖지 않으며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 연장과정에서 삽입되는 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되고, 상기 단계 (d)의 연장 이합체에 상기 단일 표지가 삽입되면 상기 단일 표지에서 발생되는 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 연장과정에서 삽입되는 단일 표지는 비-자연적 염기(non-natural base)를 갖는 뉴클레오타이드에 연결되어 있고 상기 CTO의 템플레이트 부위는 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성(specific binding affinity)을 가지는 비-자연적 염기를 갖는 뉴크레오타이드를 포함하고는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 리포터 분자 또는 퀀처 분자 및 비 자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 비 자연 염기 및 퀀처 분자 또는 리포터 분자를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체에서 상기 두 개의 비 자연 염기는 염기쌍을 이루어 상기 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되어 시그널의 변화를 초래하여 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위에 결합된 표지는 상기 CTO의 템플레이트 부위에 포함되어 있는 비 자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 아닌, 근접한 뉴클레오타이드에 결합되어 있으며, 상기 표지가 연장 반응에서 삽입된 표지와 상호작용이 가능한 위치에서 상기 뉴클레오타이드가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위에 결합된 표지는 퀀처 분자이고 상기 삽입되는 표지는 리포터 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 연장 이합체는 상기 PTO로부터 방출된 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절되는 T_m 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (d) 및 단계 (e) 사이에 단계 (d)에서 형성된 연장이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (e)는 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (e) 후에 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 한 번 더 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 연장 이합체의 존재는 멜팅 커브 분석 (melting curve analysis) 또는 혼성화 커브 분석(hybridization curve analysis)에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e)는 변성을 포함하여 반복적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)-(d)를 변성 포함하여 반복실시 하고, 형성된 연장이합체를 멜팅시켜 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출 가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 연장 이합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(b)와 단계 (c)-(d)는 하나의 반응용기 또는 별도의 반응용기에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(b)는 변성을 포함하여 반복적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 방법이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함하며, 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우 상응하는 최소 2종의 검출 가능한 시그널이 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 PTO의 5’-태깅 부위는 서로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 T_m 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되는 시그널인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되는지 않는 시그널인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 최소 2 종의 검출 가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이며, 이 경우 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 Tm 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열의 각각 상응하는 검출 가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이며, 이 경우 상기 일부 타겟 핵산 서열에 상응하는 각각의 연장 이합체는 서로 다른 Tm 값을 가지고, 상기 시그널은 나머지 타겟 핵산 서열에 상응하는 검출 가능한 시그널과는 상호 구별되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존성 중합효소를 사용하고, 상기 주형-의존성 중합효소는 상기 절단 반응을 위한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고 상기 업스트림 프라이머를 연장하기 위하여 주형-의존성 중합효소를 사용하고, 상기 주형-의존성 중합효소는 상기 절단 반응을 위한 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 서로 다른 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 액상에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 고상에서 실시되며 상기 CTO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상기질 상에 고정된 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 표지를 갖지 않으며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되고, 상기 단계 (d)의 연장 이합체는 삽입된 단일 표지를 가지며, 결국 고상기질 상에 단일 표지가 존재하게 되어 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기 및 표지로서 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 상기 단계 (d)에서 형성된 연장 이합체에서 CTO에 있는 상기 비-자연 염기의 반대쪽에 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기가 위치하고, 결국 고상기질 상에 단일 표지가 존재하여 고상기질 상에서 검출 가능한 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 41 항에 있어서, 상기 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 41 항에 있어서, 상기 CTO의 템플레이트 부위에 있는 비-자연 염기(non-natural base)는 상기 CTO의 템플레이트 부위의 5’-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가적인 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 핵산 시료 내의 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하는 방법:
(a) 상기 최소 2 종의 타겟 핵산 서열을 증폭할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 최소 2종의 프라이머 쌍 및 최소 2종의 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드 (PTO)를 최소 2종의 타겟 핵산 서열과 혼성화 시키는 단계로서; 상기 최소 2종의 프라이머 쌍 각각의 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머는 상응하는 타겟 핵산서열의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 상응하는 PTO 대하여 업스트림 및 다운스트림에 위치에서 상응하는 타겟 핵산 서열과 혼성화되고; 상기 최소 2종의 PTO는 각각 (i) 상기 상응하는 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 상응하는 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-말단은 연장이 되지 않도록 블록킹 되어 있고; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 프라이머 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 중합효소에 의한 PTO의 5’-태깅 부위의 절단을 유도하며; 상기 핵산 시료 내 핵산 분자들이 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열을 포함하는 경우 상기 최소 2종의 PTO 각각은 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열 각각에 혼성화 되고;
(b) 상기 최소 2종의 PTO의 절단을 위한 조건 하에서, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 최소 2종의 PTO 각각이 상기 최소 2종의 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 상기 최소 2종의 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소에 의해 절단되어 최소 2종의 5’-태깅 부위를 포함하거나 또는 그의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 단계 (b)에서 상기 최소 2종의 PTO로부터 방출된 최소 2 종의 단편과 최소 2종의 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing Templating Oligonucleotide: CTO)를 혼성화 시키는 단계로서, 상기 최소 2종의 CTO 각각은 3’to 5’순서로 (i) 상기 상응하는 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 상응하는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’- 타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며; 상기 최소 2종의 PTO로부터 방출된 최소 2 종의 단편은 상기 상응하는 CTO의 캡처링 부위와 각각 혼성화되고;
(d) 5’뉴클레아제 활성을 갖는 상기 주형-의존성 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 상응하는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 최소 2 종의 단편은 연장되고, 상기 연장은 최소 2 종의 검출가능한 시그널을 제공하고 최소 2종의 연장 이합체를 형성하며, 상기 최소 2 종의 검출가능한 시그널은 각각 (i) 상기 상응하는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 상응하는 CTO에 결합된 최소 하나의 표지와 연장과정에서 삽입된 표지 또는 (iii) 연장과정에서 삽입된 표지에 의하여 제공되며, 상기 최소 2 종의 검출가능한 시그널은 상호 구별되지 않는 시그널이고, 상기 최소 2종의 연장 이합체는 서로 상이한 T_m 값을 가지며;
(e) denaturing 시키는 단계;
(f) 상기 단계 (a)-(e)를 최소한 2회 이상 반복하는 단계;
(g) 형성된 연장 이합체를 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계; 그리고
(h) 상기 (g)에서의 검출 가능한 시그널을 측정하여 최소 2 종의 연장 이합체의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 최소 2 종의 연장이합체의 존재는 상응하는 최소 2 종의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
다음을 포함하는 핵산 시료 내의 타겟 핵산서열을 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signal Generation: PTOCE-SG) 분석으로 검출하기 위한 키트:
(a) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide: PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 되고, 상기 PTO의 5’-태깅 부위는 혼성화 되지 않으며;
(b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드(upstream oligonucleotide); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 보다 업스트림 위치에서 상기 타겟 핵산서열과 혼성화되고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide: CTO); 상기 CTO는 3’to 5’순서로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위 각각에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이트 부위를 포함하며, 상기 PTO의 절단에 의해 나오는 단편과 혼성화되며; 상기 CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지가 결합되어 있거나, 상기 CTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자가 결합되어 있거나, 상기 CTO의 템플레이트 부위는 단일 표지 및 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 상기 CTO의 템플레이트 부위는 비-자연 염기(non-natural base)가 결합되어 있다.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는 상기 PTO 단편과 CTO을 이용한 연장 반응에서 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는, 상기 CTO의 템플레이트 부위에 표지 및 비-자연 염기가 결합되어 있는 뉴클레오타이드 또는 비-자연 염기가 결합되어 있는 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 표지가 결합되고 있고 상기 비-자연 염기와 특이적 결합 친화성을 갖는 비-자연 염기를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 47 항에 있어서, 상기 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 둘 모두 상기 CTO의 템플레이트 부위에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는 최소 2종 이상의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트이고, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 CTO는 최소 2 종의 CTO를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 54 항에 있어서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 키트.
제 47 항에 있어서, 상기 키트는 액상 반응용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 46 항에 있어서, 상기 키트는 고상 반응용 키트이고 상기 CTO는 그의 5’-말단또는 3’-말단을 통하여 고상기질 상에 고정된 것을 특징으로 하는 키트.