ES2538459T3 - Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO - Google Patents

Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO Download PDF

Info

Publication number
ES2538459T3
ES2538459T3 ES12733915.8T ES12733915T ES2538459T3 ES 2538459 T3 ES2538459 T3 ES 2538459T3 ES 12733915 T ES12733915 T ES 12733915T ES 2538459 T3 ES2538459 T3 ES 2538459T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
segment
pto
cto
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12733915.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Jong Yoon Chun
Young Jo Lee
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seegene Inc
Original Assignee
Seegene Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020110002840A external-priority patent/KR20120081482A/ko
Priority claimed from KR1020110023465A external-priority patent/KR20120105811A/ko
Application filed by Seegene Inc filed Critical Seegene Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2538459T3 publication Critical patent/ES2538459T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO), el cual comprende: (a) Hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos diana con un oligonucleótido situado corriente arriba (upstream) y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana; en el que dicho segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con dicha secuencia de ácidos nucleicos diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO; (b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en condiciones para la escisión del PTO; el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO; (c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (Oligonucleótido de captura y molde); el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3'; de forma que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO; (d) Realización de una reacción de extensión con el resultante de la etapa (c) y una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde; en ella el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y se forma un ácido nucleico bicatenario extendido; este ácido nucleico bicatenario extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse con (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO; (e) Fusión del ácido nucleico bicatenario extendido a lo largo de un intervalo de temperaturas que da una señal diana indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido; en ella la señal diana es provista por: (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento y/o al CTO, o (IV) un marcador intercalante; y

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
E12733915
02-06-2015
La Fig. 20 muestra los resultados de la detección simultanea del gen de Neisseria gonorrhoeae (NG) y del gen de Staphylococcus aureus (SA) mediante el ensayo PTOCE complementado con análisis de la fusión tras la PCR. El CTO contiene una molécula indicadora y una molécula amortiguadora en su segmento molde.
La Fig. 21 muestra los resultados de la detección de un gen de Neisseria gonorrhoeae mediante el ensayo PTOCE complementado con el análisis de la fusión en una micromatriz. El CTO está inmovilizado por su extremo 5´. El PTO contiene una molécula indicadora en su segmento de marcaje en 5´.
La Fig. 22 muestra los resultados de la detección de un gen de Neisseria gonorrhoeae mediante el ensayo PTOCE complementado con la detección en tiempo real a una temperatura prefijada en una micromatriz. El CTO está inmovilizado por su extremo 5´. El PTO contiene una molécula indicadora en su segmento de marcaje en 5´.
La Fig. 23 muestra los resultados de la detección de un gen de Neisseria gonorrhoeae mediante el ensayo PTOCE complementado con la detección en tiempo real a una temperatura prefijada en una micromatriz. El CTO queda inmovilizado por su extremo 3´y contiene una molécula indicadora y una molécula amortiguadora en su segmento molde.
La Fig. 24 muestra los resultados de la detección de una o varias dianas mediante el ensayo PTOCE complementado con la detección de punto final a una temperatura prefijada en una micromatriz. El CTO está inmovilizado por su extremo 5´. El PTO contiene una molécula indicadora en su segmento de marcaje en 5´. El gen de Neisseria gonorrhoeae (NG) y el gen de Staphylococcus aureus (SA) actuaron como secuencias de ácidos nucleicos diana.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un novedoso método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo PTOCE (Siglas en inglés de Escisión y extensión de PTO) y un equipo para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo PTOCE conforme a las reivindicaciones de la patente 1 a 36.
La presente invención no solo implica reacciones de hibridación sino, además, reacciones enzimáticas que ocurren dependiendo de la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos diana.
I. Proceso de detección de la diana mediante el PTOCE con análisis de la fusión
Un aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO), el cual comprende:
(a) hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos diana con un oligonucleótido situado corriente arriba y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje); en que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana y se hibrida con ella; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3´ que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana con la cual hibrida, y (II) un segmento de marcaje en 5´ que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; dicho
7
imagen6
imagen7
E12733915
02-06-2015
de ácido nucleico que es complementaria al ácido nucleico molde o a un segmento del mismo.
El término «hibridación» tal y como se emplea en la presente memoria se refiere a la formación de un ácido nucleico bicatenario a partir de ácidos nucleicos monocatenarios que son complementarios. La hibridación puede tener lugar entre dos hebras de ácido nucleico que concuerdan perfectamente o bien concuerdan notablemente con algunos desapareamientos. La complementariedad para la hibridación puede depender de las condiciones de hibridación, en especial de la temperatura.
La hibridación de una secuencia de ácidos nucleicos diana con el oligonucleótido situado corriente arriba y con el PTO puede llevarse a cabo en condiciones de hibridación adecuadas que se determinan habitualmente con procedimientos de optimización. Condiciones como la temperatura, la concentración de los componentes, los tiempos de hibridación y de lavado, los componentes de la solución tampón, y su pH y fuerza iónica pueden variar dependiendo de diversos factores, tales como la longitud y el contenido de GC del oligonucleótido (tanto del oligonucleótido situado corriente arriba como del PTO) y de la secuencia nucleotídica diana. Por ejemplo, cuando se utiliza un oligonucleótido relativamente corto es preferible adoptar condiciones poco restrictivas (poco rigurosas). Las condiciones pormenorizadas de hibridación se pueden encontrar en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); y en M. L.M. Anderson, Nucleic acid Hybridization, Springer-Verlag Nueva York Inc. N.Y.(1999).
No existe distinción pretendida entre los términos «reasociación» e «hibridación» y ambos se usan indistintamente.
El oligonucleótido situado corriente arriba y el PTO poseen secuencias nucleotídicas que hibridan por su complementariedad con la secuencia de ácidos nucleicos diana. El término «complementariedad» se usa en la presente memoria para indicar que los cebadores o las sondas son lo bastante complementarios para hibridar selectivamente con una secuencia de ácidos nucleicos diana en las condiciones de reasociación o de restrictividad indicadas, abarcando los términos «notablemente complementario» y «perfectamente complementario», preferiblemente esto último.
El segmento de marcaje en 5´ del PTO tiene una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana. El segmento molde del CTO (Oligonucleótido de captura y molde) tiene una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5´ y el segmento localizador en 3´ del PTO. El término «no complementario» se usa en la presente memoria para indicar que los cebadores o las sondas no son lo bastante complementarios para hibridar selectivamente con una secuencia de ácidos nucleicos diana en las condiciones de reasociación o de restrictividad indicadas, abarcando los términos «notablemente no complementario» y «perfectamente no complementario», preferiblemente esto último.
El término usado en la presente memoria «PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje)» significa un oligonucleótido que comprende: (I) un segmento localizador en 3´ que sirve como sonda; y (II) un segmento de marcaje en 5´ con una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana, que se
10
imagen8
imagen9
E12733915
02-06-2015
localizador en 3´ es digerido parcialmente junto con el segmento de marcaje en 5´ en la reacción de escisión de la etapa (b).Además, la secuencia solapada permite escindir un punto deseado del segmento localizador en 3´.
En una forma de realización preferida, el cebador situado corriente arriba induce a través de su hebra extendida la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5´nucleasa.
Las técnicas convencionales para las reacciones de escisión con oligonucleótidos situados corriente arriba se pueden aplicar a la presente invención, siempre que el oligonucleótido situado corriente arriba induzca la escisión del PTO hibridado con la secuencia de ácidos nucleicos diana para liberar un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5´ o una parte de ese segmento del PTO. Por ejemplo, a la presente invención se pueden aplicar las patentes de EE. UU. N.º 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 y 7.381.532 y la solicitud publicada de EE. UU. N.º 2008-0241838.
En una forma de realización preferida, el método se lleva a cabo en presencia de un cebador situado corriente abajo (downstream). El cebador situado corriente abajo genera adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos diana que ha de hibridarse con el PTO, lo cual mejora la sensibilidad de la detección de la diana.
Según una forma de realización preferida, cuando se usan el cebador situado corriente arriba y el cebador situado corriente abajo, además, se emplea una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde para la extensión de los cebadores.
Según una forma de realización preferida, el oligonucleótido situado corriente arriba (cebador situado corriente arriba o sonda situada corriente arriba), el cebador situado corriente abajo y/o el segmento de marcaje en 5´ en del PTO tienen una estructura de oligonucleótido de cebado doble (DPO) desarrollada por el presente inventor. Los oligonucleótidos dotados de la estructura DPO presentan una especificidad hacia la diana notablemente mejor que los cebadores y las sondas convencionales (véase WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40 (2007)).
Según una forma de realización preferida, el segmento localizador en 3´ del PTO tiene una estructura de oligonucleótido de especificidad doble modificado (mDSO) desarrollado por el presente inventor. La estructura del oligonucleótido de especificidad doble modificado (mDSO) presenta una especificidad hacia la diana notablemente mejor que las sondas convencionales (véase WO 2011/028041).
Etapa (b): Liberación de un fragmento del PTO
Después, el producto de la etapa (a) se pone en contacto con una enzima dotada de actividad 5´-nucleasa en las condiciones para la escisión del PTO. El PTO hibridado con la secuencia de ácidos nucleicos diana es digerido por la enzima con actividad 5´nucleasa,de forma que se desprende un fragmento que comprende el fragmento de marcaje en 5´ o una parte del segmento de marcaje en 5´ del PTO.
El término usado en la presente memoria «condiciones para la escisión del PTO» designa las condiciones suficientes para digerir el PTO hibridado con la secuencia de
13
E12733915
02-06-2015
ácidos nucleicos diana por la enzima con actividad 5´-nucleasa, tales como temperatura, pH, fuerza iónica, tampón, longitud y secuencia de los oligonucleótidos y enzimas. Por ejemplo, cuando la ADN-polimerasa Taq se usa como enzima con actividad 5´-nucleasa, las condiciones para la escisión del PTO incluyen tampón Tris-HCl, KCl, MgCl2 y temperatura.
Cuando el PTO se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana, su segmento localizador en 3´ participa en la hibridación y el segmento de marcaje en 5´ forma una monocadena sin hibridar con la secuencia de ácidos nucleicos diana (véase la Fig. 2).Así pues, el oligonucleótido comprende tanto estructuras monocatenarias como bicatenarias que pueden ser digeridas con una enzima dotada de actividad 5´nucleasa a través de diversas técnicas conocidas por las personas versadas en la materia.
Los puntos de escisión del PTO varían dependiendo del tipo de oligonucleótidos situados corriente arriba (sonda situada corriente arriba o cebador situado corriente arriba), de los puntos de hibridación de los oligonucleótidos situados corriente arriba y de las condiciones de la escisión (véanse las patentes de EE. UU. n.º 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 y 7.381.532 y la solicitud de EE.UU publicada N.º 2008-0241838).
Se pueden emplear multitud de técnicas convencionales para la reacción de escisión del PTO, que resulta en el desprendimiento de un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5´ o una parte de dicho segmento.
En resumen, en la etapa (b) puede haber tres puntos de escisión. En primer lugar, el punto de escisión es un punto de unión entre el segmento de hibridación del PTO (segmento localizador en 3´) y un segmento no hibridado (segmento de marcaje en 5´). El segundo punto de escisión está alejado varios nucleótidos en dirección 3´ del extremo 3´ del segmento de marcaje en 5´ del PTO. El segundo punto de escisión está ubicado en la parte del extremo 5´ del segmento localizador en 3´ del PTO. El tercer punto de escisión está alejado varios nucleótidos en dirección 5´ del extremo 3´ del segmento de marcaje en 5´ del PTO.
Según una forma de realización preferida, el punto inicial para la escisión del PTO por la polimerasa dependiente de molde con actividad 5´-nucleasa tras la extensión del cebador situado corriente arriba es un punto de partida para la doble cadena formada por el PTO con la secuencia de ácidos nucleicos diana o un sitio situado de 1 a 3 nucleótidos de ese punto de partida.
A este respecto, el término usado en la presente memoria «fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5´ o una parte de dicho segmento del PTO» en conjunción con la escisión del PTO mediante la enzima con actividad 5´-nucleasa se usa para abarcar: (I) el segmento de marcaje en 5´; (II) el segmento de marcaje en 5´ y la parte del extremo 5´ del segmento 3´; y (III) alejado del segmento de marcaje en 5´. En la presente solicitud, el término «fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5´ o una parte de dicho segmento del PTO» también puede aparecer descrito como «fragmento del PTO».
El término «parte» usado en conjunción con el PTO o el CTO en calidad de parte del segmento de marcaje en 5´ del PTO, de la parte del extremo 5´ del segmento
14
E12733915
02-06-2015
localizador en 3´ del PTO y la parte del extremo 5´ del segmento de captura del CTO se refiere a una secuencia nucleotídica compuesta de 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10 o 1 a 5 nucleótidos, preferiblemente 1, 2, 3 o 4 nucleótidos.
Según una forma de realización preferida, la enzima dotada de actividad 5´-nucleasa es una ADN-polimerasa dotada de actividad 5´-nucleasa o una nucleasa FEN, más preferiblemente una ADN-polimerasa termostable dotada de actividad 5´-nucleasa o una nucleasa FEN.
ADN-polimerasas con actividad 5´-nucleasa que resultan adecuadas para la presente invención son las ADN-polimerasas termoestables procedentes de diversas especies de bacterias, entre ellas: Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophiles (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus y Aquifex aeolieus. Pero lo más preferible es que la ADN-polimerasa termoestable sea la polimerasa Taq.
Como alternativa, la presente invención puede emplear ADN-polimerasas con actividad 5´-nucleasa modificadas para tener menos actividad polimerasa.
La nucleasa FEN (endonucleasa de solapa o flap) usada es una nucleasa específica de solapa en 5´.
La nucleasa FEN adecuada para la presente invención comprende nucleasas FEN procedentes de varias especies de bacterias, entre ellas: Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix y Archaeaglobus veneficus.
En los casos en que en la etapa (a) se utilice el cebador situado corriente arriba, es preferible que las condiciones para la escisión del PTO comprendan la reacción de extensión del cebador situado corriente arriba.
Según una forma de realización preferida, el cebador situado corriente arriba se usa en la etapa (a), una polimerasa dependiente de molde se usa para la extensión del cebador situado corriente arriba y la polimerasa dependiente de molde es idéntica a la enzima con actividad 5´-nucleasa.
Otra opción consiste en usar el cebador situado corriente arriba en la etapa (a), una polimerasa dependiente de molde para la extensión del cebador situado corriente arriba y la polimerasa dependiente de molde es distinta de la enzima con actividad 5´nucleasa.
Etapa (c): Hibridación del fragmento desprendido del PTO con el CTO
15
imagen10
E12733915
02-06-2015
Preferiblemente, la secuencia nucleotídica de la parte del extremo 5´ del segmento de captura del CTO complementaria con la parte del extremo 5´ escindida del segmento localizador en 3´ puede seleccionarse en función de los puntos de escisión decididos de antemano en el segmento localizador en 3´ del PTO. Es preferible que la secuencia nucleotídica de la parte del extremo 5´ del segmento de captura del CTO complementaria con la parte del extremo 5´ escindida del segmento localizador en 3´tenga entre 1 a 10 nucleótidos, preferentemente de 1 a 5 nucleótidos, y más preferentemente de 1 a 3 nucleótidos.
El extremo 3´ del CTO puede comprender nucleótidos adicionales que no intervengan en la hibridación con el fragmento.Asimismo, el segmento de captura del CTO puede comprender una secuencia nucleotídica que solo sea complementaria con una parte del fragmento (p. ej., una parte del fragmento que contenga el segmento del extremo 3´) siempre que se hibride de forma estable con el fragmento.
El término usado «segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5´ o con una parte del segmento de marcaje en 5´» se describe en la presente memoria para abarcar varios diseños y composiciones del segmento de captura del CTO tal y como se explica arriba.
El CTO puede estar diseñado para tener una estructura de horquilla.
La longitud del CTO puede variar ampliamente.Por ejemplo, el CTO puede tener una longitud de 7-1000 nucleótidos, 7-500 nucleótidos, 7-300 nucleótidos, 7-100 nucleótidos, 7-80 nucleótidos, 7-60 nucleótidos, 7-40 nucleótidos, 15-1000 nucleótidos, 15-500 nucleótidos, 15-300 nucleótidos, 15-100 nucleótidos, 15-80 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 20-1000 nucleótidos, 20-500 nucleótidos, 20-300 nucleótidos, 20-100 nucleótidos, 20-80 nucleótidos, 20-60 nucleótidos, 20-40 nucleótidos, 30-1000 nucleótidos, 30-500 nucleótidos, 30-300 nucleótidos, 30-100 nucleótidos, 30-80 nucleótidos, 30-60 nucleótidos o 30-40 nucleótidos. El segmento de captura del CTO puede tener cualquier longitud siempre que se hibride específicamente con el fragmento desprendido del PTO. Por ejemplo, el segmento de captura del CTO puede tener una longitud de 5-100 nucleótidos, 5-60 nucleótidos, 540 nucleótidos, 5-30 nucleótidos, 5-20 nucleótidos, 10-100 nucleótidos, 10-60 nucleótidos, 10-40 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 10-20 nucleótidos, 15-100 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 15-30 nucleótidos o 15-20 nucleótidos. El segmento molde del CTO puede tener cualquier longitud siempre que pueda actuar como molde en la extensión del fragmento desprendido del PTO. Por ejemplo, el segmento molde del CTO puede tener una longitud de 2-900 nucleótidos, 2-400 nucleótidos, 2-300 nucleótidos, 2-100 nucleótidos, 2-80 nucleótidos, 2-60 nucleótidos, 2-40 nucleótidos, 2-20 nucleótidos, 5-900 nucleótidos, 5-400 nucleótidos, 5-300 nucleótidos, 5-100 nucleótidos, 5-80 nucleótidos, 5-60 nucleótidos, 5-40 nucleótidos, 5-30 nucleótidos, 10-900 nucleótidos, 10-400 nucleótidos, 10-300 nucleótidos, 15-900 nucleótidos, 15-100 nucleótidos, 15-80 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-40 nucleótidos o 15-20 nucleótidos.
El extremo 3´ del CTO puede tener un 3´-OH terminal. Preferiblemente, el extremo 3´ del CTO está bloqueado para impedir su extensión. El bloqueo de la extensión del CTO se puede conseguir con métodos convencionales. Por ejemplo, el bloqueo se puede realizar añadiendo al grupo 3´-hidroxilo del último nucleótido del CTO un
17
imagen11
E12733915
02-06-2015
Según una forma preferida de realización, el valor de Tm se refiere a los valores de Tm reales que se dan en las condiciones de reacción puestas en práctica.
La polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde usada en la etapa (d) puede incluir cualquier polimerasa de ácido nucleico, por ejemplo, el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de E. coli, una ADN-polimerasa termostable y la ADN-polimerasa del bacteriófago T7.Preferiblemente, la polimerasa es una ADN-polimerasa termostable que se puede obtener de varias especies de bacterias, entre ellas: Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophiles (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horlkoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus y Aquifex aeolieus. Pero lo más preferible es que la polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde sea la polimerasa Taq.
Según una forma preferida de realización, la enzima con actividad 5´-nucleasa usada en la etapa (b) es idéntica a la polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde usada en la etapa (d). Más preferiblemente, la enzima con actividad 5´-nucleasa usada en la etapa (b), la polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde usada para la extensión del cebador situado corriente arriba y la polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde usada en la etapa (d) son idénticas entre sí.
El ácido nucleico bicatenario extendido tiene un marcador procedente de: (I) al menos un marcador unido al fragmento de PTO y/o al CTO; (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión; (III) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento de PTO y/o al CTO; o (IV) un marcador intercalante.
La presencia del ácido nucleico bicatenario extendido puede indicar la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos diana porque el ácido nucleico bicatenario extendido se forma cuando dicha secuencia diana está presente. Para detectar la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido de modo directo, en la etapa (d) se forma un ácido nucleico bicatenario extendido portador de un marcador que proporciona una señal detectable. El marcador usado en el ácido nucleico bicatenario extendido proporciona un cambio de la señal dependiendo de si el ácido nucleico bicatenario extendido está en una cadena doble o sencilla, dando finalmente la señal diana indicadora de la presencia de dicho ácido nucleico bicatenario extendido mediante la fusión de éste último.
Etapa (e): Fusión del ácido nucleico bicatenario extendido
Tras la reacción de extensión, el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona a lo largo de un intervalo de temperaturas y da una señal diana indicadora de su presencia.
19
imagen12
E12733915
02-06-2015
El marcaje incluye un marcador interactivo doble y un marcador sencillo.
(i-1) Marcador interactivo doble
El sistema de marcaje interactivo es un sistema generador de señal en el que se transmite energía no radioactiva entre una molécula donadora y una molécula aceptora. Como ejemplo representativo del sistema de marcaje interactivo, el sistema de marcaje FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) consta de una molécula indicadora (reporter) fluorescente que actúa como donadora y una molécula amortiguadora (quencher) que actúa como aceptora. En FRET, la donadora de energía es fluorescente, pero la aceptora de esa energía puede ser fluorescente o no. En otro tipo de sistemas interactivos de marcaje, el donante de energía no es fluorescente, como p. ej., un cromóforo, y el aceptor de energía es fluorescente. En otros tipos de sistemas interactivos de marcaje, el donador de energía es luminiscente,
p. ej., bioluminiscente, quimioluminiscente, electroquimioluminiscente, y el aceptor es fluorescente. En la presente invención la molécula donadora puede ser descrita como molécula indicadora y la molécula aceptora como molécula amortiguadora.
Preferiblemente, la señal indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido (es decir, la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos diana) es generada por sistemas interactivos de marcaje, más preferiblemente por el sistema de marcaje FRET (es decir, un sistema interactivo de marcaje doble).
Primera forma de realización (marcaje interactivo doble intracatenario)
En una primera forma de realización del sistema interactivo de marcaje doble, el fragmento o el CTO poseen un marcaje interactivo doble que comprende una molécula indicadora y una molécula amortiguadora; la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce un cambio de la señal del marcador interactivo doble que da lugar a la señal diana en la etapa (e). La primera forma de realización del sistema interactivo de marcaje doble se ilustra en las Figs. 2, 6 y 9. La primera forma de realización se denomina marcaje interactivo doble intracatenario.
Primera forma de realización plasmada en la Fig. 2 (marcaje interactivo doble intracatenario)
La forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 2. El segmento molde del CTO contiene una molécula indicadora y una molécula amortiguadora. El PTO hibridado con la secuencia de ácidos nucleicos diana es digerido y libera el fragmento, y éste a su vez se hibrida con el segmento de captura del CTO y se extiende hasta formar el ácido nucleico bicatenario extendido.
Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se forma en la etapa (d), la molécula indicadora y la molécula amortiguadora del CTO quedan separadas por conformación y eso impide que la molécula amortiguadora atenúe la señal emitida por la molécula indicadora; cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona en la etapa (e), la molécula indicadora y la molécula amortiguadora quedan por conformación una junto a la otra de tal modo que la segunda atenúa la señal de la primera, y de esa forma se emite la señal diana que indica la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
21
imagen13
imagen14
E12733915
02-06-2015
del híbrido permite diferenciar la señal diana del ácido nucleico bicatenario extendido de la señal no diana del híbrido.
Segunda forma de realización (marcaje interactivo doble intracatenario)
En la segunda forma de realización del sistema interactivo de marcaje doble, el fragmento tiene un marcador interactivo doble que comprende una molécula indicadora y una molécula amortiguadora y el CTO posee otro marcador interactivo doble; la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce un cambio de la señal del marcador interactivo doble que da lugar a la señal diana en la etapa (e).
La forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 8.
Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se forma en la etapa (d), la señal emitida por la molécula indicadora unida al CTO es amortiguada por la molécula amortiguadora unida al PTO. Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona en la etapa (d), la molécula indicadora y la molécula amortiguadora quedan separadas, lo que impide que la molécula amortiguadora atenúe la señal emitida por la molécula indicadora, de modo que la señal diana es emitida indicando la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
Preferiblemente, la señal diana emitida en la etapa (e) incluye una curva de fusión, un perfil de fusión o un valor de Tm que se obtiene midiendo el cambio de la señal fluorescente emitida por el marcador interactivo doble.
La molécula indicadora y la molécula amortiguadora pueden estar localizadas en cualquier punto del fragmento del PTO y del CTO, siempre que la señal de la molécula indicadora sea atenuada por la molécula amortiguadora en el ácido nucleico bicatenario extendido.
Según una forma de realización preferida, la molécula indicadora o la molécula amortiguadora situadas en el fragmento del PTO está localizada en el extremo 5´ del segmento de marcaje en 5´.
Según una forma de realización preferida, la molécula indicadora o la molécula amortiguadora situada en el CTO está localizada en el extremo 3´.
Tal y como aparece representado en la Fig. 8, el híbrido entre el PTO sin escindir y el CTO proporciona una señal que no es la diana en la etapa de fusión. En tal caso, la diferencia entre el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido y el del híbrido permite diferenciar la señal diana emitida por el ácido nucleico bicatenario extendido de la señal no diana emitida por el híbrido.
La molécula indicadora y la molécula amortiguadora útiles en la presente invención pueden incluir cualquier molécula conocida en la técnica. Algunos ejemplos son:Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), calceína (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), rodamina 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), Ri-boGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), rodamina 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC
24
imagen15
E12733915
02-06-2015
digerido, con lo que se libera el fragmento. El fragmento se hibrida con el segmento de captura del CTO y se extiende hasta formar el ácido nucleico bicatenario extendido. Con la formación del ácido nucleico bicatenario extendido, la intensidad de la fluorescencia emitida por el marcador fluorescente sencillo aumenta. Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona en la etapa (e), la intensidad de la fluorescencia emitida por el marcador fluorescente sencillo disminuye, de tal modo que la señal diana indica la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
Según una forma de realización preferida, el marcador sencillo puede estar localizado en cualquier punto del CTO, siempre que el nivel de la señal emitida por el marcador sencillo cambie en función de la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido.
Según una forma de realización preferida, el marcador sencillo está unido al segmento molde o al segmento de captura del CTO.
En el caso de que el segmento molde del CTO esté marcado con un marcador sencillo como el de la Fig. 3, no se inducirá un cambio de la señal del marcador situado en el híbrido formado por el PTO sin escindir con el CTO. Por tanto, el híbrido no proporciona una señal que no sea la diana.
Si el segmento de captura del CTO está marcado con un marcador sencillo, el híbrido formado por el PTO sin escindir con el CTO proporciona una señal que no es la diana en la etapa de fusión. En este caso, la diferencia entre el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido y el del híbrido permite diferenciar la señal diana emitida por el ácido nucleico bicatenario extendido de la señal no diana emitida por el híbrido.
Segunda forma de realización plasmada en la Fig. 7 (sistema de marcaje sencillo)
La forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 7. El segmento de marcaje en 5´ del PTO tiene un marcador fluorescente sencillo. El PTO hibridado con la secuencia de ácidos nucleicos diana es digerido, con lo que se libera el fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5´ con el marcador fluorescente sencillo. Con la hibridación, la intensidad de la señal emitida por el marcador fluorescente sencillo situado en el segmento de marcaje en 5´ aumenta. Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona en la etapa (e), la intensidad de la señal emitida por el marcador fluorescente sencillo disminuye, de tal modo que la señal diana indica la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
Según una forma de realización preferida, el marcador sencillo puede estar localizado en cualquier punto del fragmento del PTO, siempre que el nivel de la señal emitida por el marcador sencillo cambie en función de la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido.
Tal y como aparece representado en la Fig. 7, el híbrido entre el PTO sin escindir y el CTO proporciona una señal que no es la diana en la etapa de fusión. En tal caso, la diferencia entre el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido y el del híbrido permite diferenciar la señal diana emitida por el ácido nucleico bicatenario extendido de la señal no diana emitida por el híbrido.
26
imagen16
imagen17
E12733915
02-06-2015
Ejemplos concretos de bases no naturales son, entre otros, las siguientes bases en combinaciones de pares: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J y M/N (véase la patente de EE. UU. n.º 7.422.850).
La forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 11. El fragmento se hibrida con el CTO que incorpora un nucleótido dotado de una segunda base no natural (p. ej., iso-dC) que tiene una afinidad de unión específica hacia una primera base no natural (p. ej., iso-dG). La extensión se lleva a cabo en presencia de un nucleótido dotado de la primera base no natural marcada con un marcador fluorescente sencillo, dando lugar al ácido nucleico bicatenario extendido. En la reacción de extensión, el nucleótido portador de la primera base no natural se incorpora en la posición opuesta a la del nucleótido portador de la segunda base no natural.
La señal fluorescente emitida por el ácido nucleico bicatenario extendido puede ser detectada directamente en el sustrato sólido que acoge el CTO inmovilizado.Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona, la hebra portadora del marcador fluorescente se libera y la señal fluorescente deja de detectarse directamente (no mostrado en la Fig. 11). Por tanto, la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido puede proporcionar directamente un cambio de la señal. A este respecto, se emite la señal diana que indica la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
Si se opta por la incorporación del marcador al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, el marcador no se incorporará al híbrido formado entre el PTO sin escindir y el CTO porque dicho híbrido no se extiende. Así pues, el híbrido no proporciona una señal que no sea la diana.
Los tipos y las características de los marcadores sencillos usados pueden estar descritos con referencia a las descripciones del sistema de marcaje basado en «un marcador unido al fragmento y/o al CTO» tal y como se ha indicado antes en la presente memoria.
(III) Marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido y marcador unido al fragmento o al CTO
La presente invención puede emplear un sistema de marcaje basado en la cooperación de un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión con otro marcador unido al fragmento y/o al CTO, tal y como ilustran las figuras 4 y 5.
Según una forma de realización preferida, la señal diana es proporcionada por un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y por un marcador unido al fragmento y/o al CTO, y el marcador incorporado está unido a un nucleótido incorporado durante la reacción de extensión; ambos marcadores forman una marcador interactivo doble con una molécula indicadora y una molécula amortiguadora; la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa
(e) induce el cambio de señal emitida por el marcador interactivo doble que da lugar a la señal diana en la etapa (e).
29
E12733915
02-06-2015
Más preferiblemente, el nucleótido incorporado durante la reacción de extensión tiene una primera base no natural y el CTO tiene un nucleótido dotado de una segunda base no natural con una afinidad de unión específica hacia la primera base no natural.
La forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 4. El fragmento que se hibrida con el CTO comprende una molécula indicadora o amortiguadora y un nucleótido dotado de una segunda base no natural (p. ej., iso-dC) que tiene una afinidad de unión específica hacia una primera base no natural (p. ej., iso-dG). La extensión se lleva a cabo en presencia de un nucleótido dotado con la primera base no natural marcada con una molécula amortiguadora o indicadora, y da lugar a un ácido nucleico bicatenario extendido en el que la señal emitida por la molécula indicadora es atenuada por la molécula amortiguadora. En la reacción de extensión, el nucleótido portador de la primera base no natural se incorpora en la posición opuesta a la del nucleótido portador de la segunda base no natural.
Cuando el ácido nucleico bicatenario extendido se fusiona en la etapa (e), la molécula indicadora y la molécula amortiguadora quedan separadas, lo que impide que la molécula amortiguadora atenúe la señal emitida por la molécula indicadora, de ese modo la señal diana es emitida e indica la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e).
Preferiblemente, la señal diana emitida en la etapa (e) incluye una curva de fusión, un perfil de fusión o un valor de Tm que se obtiene midiendo el cambio de la señal emitida por el marcador interactivo doble.
El punto que ocupa el marcador en el CTO y el punto de incorporación del marcador incorporado dependen de la contribución de los dos marcadores al sistema de marcaje interactivo doble a la hora de provocar el cambio de señal en la etapa de fusión.
Aún más preferible es que el segmento molde del CTO incorpore una molécula indicadora o amortiguadora y un nucleótido dotado de una segunda base no natural. La reacción de extensión de la etapa (d) se lleva a cabo en presencia de un nucleótido dotado de una molécula indicadora o amortiguadora y de una primera base no natural con una afinidad de unión específica hacia la segunda base no natural del CTO. Las dos bases no naturales del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (d) forman un par de bases que amortigua la señal de la molécula indicadora por efecto de la molécula amortiguadora y provocan así el cambio de la señal, que proporciona la señal diana. Como alternativa, el fragmento posee una molécula indicadora o amortiguadora y el segmento molde del CTO tiene un nucleótido dotado de una segunda base no natural. La reacción de extensión de la etapa (d) se lleva a cabo en presencia de un nucleótido dotado de una molécula indicadora o amortiguadora y de una primera base no natural con una afinidad de unión específica hacia la segunda base no natural del CTO. Las dos bases no naturales del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (d) forman un par de bases que inducen un cambio en la señal de la molécula indicadora por amortiguación, proporcionando así la señal diana.
Otra forma de realización mostrada a modo de ejemplo que se describe aparece esquematizada en la Fig. 5. En esta forma de realización, el fragmento dotado con una molécula indicadora o amortiguadora se hibrida con el CTO que comprende un nucleótido dotado de una segunda base no natural (p. ej., iso-dC) que tiene una
30
imagen18
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29
imagen30
imagen31
imagen32
imagen33
imagen34
imagen35
imagen36
imagen37
imagen38
imagen39
imagen40
imagen41
imagen42
imagen43
imagen44
imagen45
imagen46
imagen47
imagen48
imagen49
imagen50
imagen51
imagen52
imagen53
imagen54
imagen55
imagen56
imagen57
imagen58
imagen59

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
ES12733915.8T 2011-01-11 2012-01-11 Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO Active ES2538459T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110002840 2011-01-11
KR1020110002840A KR20120081482A (ko) 2011-01-11 2011-01-11 태그 프로브 절단 및 연장에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR1020110023465A KR20120105811A (ko) 2011-03-16 2011-03-16 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널 발생에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR20110023465 2011-03-16
WOPCT/KR2011/004452 2011-06-17
PCT/KR2011/004452 WO2012096430A1 (en) 2011-01-11 2011-06-17 Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay
PCT/KR2012/000287 WO2012096523A2 (en) 2011-01-11 2012-01-11 Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2538459T3 true ES2538459T3 (es) 2015-06-22

Family

ID=46507300

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14186326.6T Active ES2629759T3 (es) 2011-01-11 2012-01-11 Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO
ES12733915.8T Active ES2538459T3 (es) 2011-01-11 2012-01-11 Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO
ES13196447.0T Active ES2628327T3 (es) 2011-01-11 2012-01-11 Detección de una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14186326.6T Active ES2629759T3 (es) 2011-01-11 2012-01-11 Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13196447.0T Active ES2628327T3 (es) 2011-01-11 2012-01-11 Detección de una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO

Country Status (22)

Country Link
US (6) US8809239B2 (es)
EP (6) EP3967774A1 (es)
JP (3) JP5756854B2 (es)
KR (1) KR101462192B1 (es)
CN (2) CN102959092B (es)
AU (1) AU2012205956B2 (es)
BR (3) BR122019022348B1 (es)
CA (3) CA2802494C (es)
DK (1) DK2572004T3 (es)
ES (3) ES2629759T3 (es)
IL (2) IL223608A (es)
IN (1) IN2013CN00284A (es)
MX (3) MX352460B (es)
MY (1) MY174052A (es)
NO (1) NO343803B1 (es)
PL (2) PL2708608T3 (es)
PT (2) PT2708608T (es)
RU (1) RU2566562C2 (es)
SG (1) SG190758A1 (es)
UA (1) UA115082C2 (es)
WO (2) WO2012096430A1 (es)
ZA (1) ZA201209536B (es)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008119081A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Signal Diagnostics System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations
US10669574B2 (en) 2008-11-18 2020-06-02 XCR Diagnostics, Inc. DNA amplification technology
WO2012096430A1 (en) 2011-01-11 2012-07-19 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay
CA2827040A1 (en) * 2011-02-18 2012-08-23 NVS Technologies, Inc. Quantitative, highly multiplexed detection of nucleic acids
KR101569479B1 (ko) 2011-03-29 2015-11-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 절단에 의한 타겟 핵산서열의 검출
US9850524B2 (en) 2011-05-04 2017-12-26 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by PO cleavage and hybridization
CN103890245B (zh) * 2011-05-20 2020-11-17 富鲁达公司 核酸编码反应
DE102011055247A1 (de) 2011-11-10 2013-05-16 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Multianalyt-Reportersystem
KR20130101952A (ko) 2012-02-02 2013-09-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
RU2620955C2 (ru) * 2012-03-05 2017-05-30 Сиджен, Инк. Детекция нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)
JP6096885B2 (ja) * 2012-04-19 2017-03-15 シージーン アイエヌシー ＰＴＯ切断及び伸長依存的なシグナリングオリゴヌクレオチド切断を用いたターゲット核酸配列の検出｛ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＣｌｅａｖａｇｅ｝
JP2015524670A (ja) * 2012-08-16 2015-08-27 エヌブイエス テクノロジーズ，インコーポレイティド アッセイ方法及び系
EP2943586B1 (en) 2012-12-27 2017-09-20 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent non-hybridization assay
EP2770065B1 (en) * 2013-02-25 2017-12-13 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
JP2016508733A (ja) * 2013-03-13 2016-03-24 シージーン アイエヌシー メルティングピーク分析を利用したターゲット核酸配列の定量
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
AU2013202788B2 (en) 2013-03-14 2015-10-01 Gen-Probe Incorporated Indexing signal detection module
US10364459B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Sugentech, Inc. Method of quantitatively and qualitatively analyzing biomaterial in real-time
US20160244816A1 (en) * 2013-07-15 2016-08-25 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
WO2015016612A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Seegene, Inc. Method for determining snp genotype
WO2015054516A2 (en) 2013-10-09 2015-04-16 Fluoresentric, Inc. Multiplex probes
EP3058105B1 (en) * 2013-10-18 2019-05-22 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence on solid phase by pto cleavage and extension using hcto assay
US9840697B2 (en) 2013-12-06 2017-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fusion polymerases
WO2015147370A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
KR102295290B1 (ko) * 2014-07-10 2021-08-30 플루어레센트릭 인코포레이티드 Dna 증폭 기술
DE102014110535A1 (de) 2014-07-25 2016-01-28 Certoplast Vorwerk & Sohn Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Klebebandes
JP6664381B2 (ja) 2014-08-11 2020-03-13 ルミネックス コーポレーション 核酸アッセイにおける改善された融解識別と多重化のためのプローブ
KR101750464B1 (ko) 2014-11-28 2017-06-28 케이맥바이오센터주식회사 바이오물질의 실시간 정량 및 정성 분석을 위한 프로브 시스템, 상기 프로브 시스템을 구비한 반응용기 및 이를 이용한 분석 방법
FR3029290B1 (fr) 2014-12-01 2020-03-06 Biomerieux Procede d'estimation de l'affinite sonde-cible d'une puce a adn et procede de fabrication d'une puce a adn
JP2018504096A (ja) * 2014-12-09 2018-02-15 シージーン アイエヌシー 異なる検出温度及び基準値を使用したターゲット核酸配列の検出
WO2016093620A1 (en) * 2014-12-09 2016-06-16 Seegene, Inc. Differentiation of signals for target nucleic acid sequences
WO2017046192A1 (de) * 2015-09-18 2017-03-23 Biotype Diagnostic Gmbh Bestätigungstest für primäre nukleinsäure-amplifikate in einem kontinuierlichen reaktionsansatz und unmittelbare auswertung mittels elektrophoretischer verfahren
DE102015115836A1 (de) * 2015-09-18 2017-03-23 Biotype Diagnostic Gmbh Bestätigungstest für primäre Nukleinsäure-Amplifikate in einem kontinuierlichen Reaktionsansatz und unmittelbare Auswertung mittels immunchromatographischer Verfahren
WO2017086762A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Seegene, Inc. Method for calibrating a data set of a target analyte
US11485998B2 (en) 2015-12-15 2022-11-01 Seegene, Inc. Signal extraction for a target nucleic acid sequence
US11117113B2 (en) 2015-12-16 2021-09-14 Fluidigm Corporation High-level multiplex amplification
EP3411819A4 (en) 2016-02-05 2019-10-23 Seegene, Inc. METHOD FOR REDUCING DATA SET NOISE LEVEL FOR A TARGET ANALYTE
WO2017213458A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Seegene, Inc. Methods for preparing tagging oligonucleotides
KR102301305B1 (ko) 2016-06-30 2021-09-13 주식회사 씨젠 핵산 증폭용 튜브 및 핵산 증폭용 반응 용기
WO2018050824A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Roche Diagnostics Gmbh Methods for performing multiplexed pcr
US11222713B2 (en) 2016-10-06 2022-01-11 Seegene, Inc. Methods for preparing oligonucleotides for detecting target nucleic acid molecules in samples
BR112019012925A2 (pt) 2016-12-23 2019-12-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg sonda mediadora em duas partes
CN110168103B (zh) 2016-12-29 2023-09-08 Seegene株式会社 降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法
RU2665631C2 (ru) * 2017-01-25 2018-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" Способ специфической идентификации последовательностей днк
JP6846636B2 (ja) * 2017-02-28 2021-03-24 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 核酸検出用オリゴヌクレオチド
CN108823287B (zh) 2017-04-28 2019-04-12 厦门大学 一种检测靶核酸序列的方法
DE102017210140A1 (de) 2017-06-16 2018-12-20 Fidlock Gmbh Verschlussvorrichtung zum lösbaren Verbinden zweier Teile
CN107236815A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法
US11591645B2 (en) 2017-08-31 2023-02-28 Seegene, Inc. Evaluation of performance of components using a pair of dimer-forming primers
KR102420644B1 (ko) 2017-09-28 2022-07-13 주식회사 씨젠 시료 내 타겟 분석물을 분석하는 방법 및 장치
KR102345601B1 (ko) 2017-09-29 2021-12-30 주식회사 씨젠 Pto 절단 및 연장-의존적 연장 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
KR102369388B1 (ko) 2018-01-05 2022-03-02 주식회사 씨젠 시료에서 M. tuberculosis, M. bovis 및 M. bovis BCG의 존재 또는 부존재를 결정하는 방법
KR20200115552A (ko) 2018-01-22 2020-10-07 루미넥스 코포레이션 별개의 용융 분석을 위한 방법 및 조성물
AU2019255933B2 (en) * 2018-04-20 2022-08-25 Seegene, Inc. . Method and apparatus for detecting a plurality of target nucleic acid sequences in sample
JP7249418B2 (ja) 2018-12-20 2023-03-30 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 固相モログラフィーによる標的核酸の検出
WO2021246820A1 (ko) 2020-06-05 2021-12-09 주식회사 씨젠 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법
US20230257801A1 (en) * 2020-11-23 2023-08-17 Pleno, Inc. Encoded Dual-Probe Endonuclease Assays
EP4388132A1 (en) * 2021-08-19 2024-06-26 Luminex Corporation Digital amplification assay analysis method
EP4403645A1 (en) * 2021-09-17 2024-07-24 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by using synthetic non-natural base-bearing tag oligonucleotide
KR20240056605A (ko) 2021-09-30 2024-04-30 주식회사 씨젠 분자진단 시스템의 샘플 처리 및 분석 방법
WO2023068823A1 (ko) 2021-10-21 2023-04-27 주식회사 씨젠 시료 내 표적 분석물질에 대한 양음성 판독 장치 및 방법
WO2023075394A1 (ko) 2021-10-29 2023-05-04 주식회사 씨젠 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법
US20230348957A1 (en) * 2021-12-07 2023-11-02 Luminex Corporation Methods and compositions for nucleic acid analysis
CN114134219A (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用
CN114032337B (zh) * 2021-12-14 2024-08-02 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用
KR20240141247A (ko) 2022-01-26 2024-09-26 주식회사 씨젠 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법
WO2023203230A1 (de) 2022-04-22 2023-10-26 Hahn-Schickard-Gesellschaft Für Angewandte Forschung E. V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
EP4265734A1 (de) 2022-04-22 2023-10-25 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
EP4372100A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-22 Stilla Technologies Data analysis method for multiplex digital pcr using color-combination
WO2024167289A1 (ko) * 2023-02-07 2024-08-15 주식회사 씨젠 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 타겟 올리고뉴클레오타이드를 검출하는 방법
WO2024181774A1 (en) * 2023-02-28 2024-09-06 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid by lpho-assisted pto cleavage and extension assay
CN117802237A (zh) * 2023-10-20 2024-04-02 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 信标探针及其组合、用于检测flt3-itd基因突变的pcr扩增试剂及试剂盒

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5631129A (en) * 1988-12-05 1997-05-20 The Salk Institute For Biological Studies Target nucleic acid amplification/detection systems and methods for the use thereof
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6037120A (en) 1995-10-12 2000-03-14 Benner; Steven Albert Recognition of oligonucleotides containing non-standard base pairs
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5965364A (en) 1990-10-09 1999-10-12 Benner; Steven Albert Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5541311A (en) * 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
CA2170264A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 Michael W. Konrad Optical detection of position of oligonucleotides on large dna molecules
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
DE69739357D1 (de) 1996-06-04 2009-05-28 Univ Utah Res Found Überwachung der hybridisierung während pcr
US6043060A (en) 1996-11-18 2000-03-28 Imanishi; Takeshi Nucleotide analogues
JP4362150B2 (ja) 1996-11-29 2009-11-11 サード ウェーブ テクノロジーズ，インコーポレーテッド Ｆｅｎ−１エンドヌクレアーゼ、混合物、および開裂方法
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
US20060057573A1 (en) 2002-02-15 2006-03-16 Somalogic, Inc Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6656692B2 (en) * 1999-12-21 2003-12-02 Ingeneus Corporation Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
JP4724380B2 (ja) 1999-04-20 2011-07-13 独立行政法人産業技術総合研究所 核酸の測定方法に用いる核酸プローブおよびデータを解析する方法
JP2003510017A (ja) 1999-06-22 2003-03-18 インビトロジェン コーポレイション 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
US7585632B2 (en) * 1999-10-29 2009-09-08 Hologic, Inc. Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7381532B2 (en) 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US7118860B2 (en) * 1999-10-29 2006-10-10 Stratagene California Methods for detection of a target nucleic acid by capture
US6265170B1 (en) * 2000-01-24 2001-07-24 Ingeneus Corporation Homogenous assay of duplex of triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions
AU2001242634B2 (en) 2000-03-29 2006-06-01 Lgc Limited Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
AU7125401A (en) 2000-05-19 2001-12-03 David J Marshall Materials and methods for detection of nucleic acids
US7678541B2 (en) 2000-11-21 2010-03-16 Hologic, Inc. Methods and compositions for the detection of a nucleic acid using a non-invasive cleavage reaction
US7309573B2 (en) * 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US20030165865A1 (en) * 2001-01-29 2003-09-04 Hinkel Christopher A. Methods of analysis of nucleic acids
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
WO2003033741A1 (en) 2001-10-16 2003-04-24 Aclara Biosciences, Inc. Universal e-tag primer and probe compositions and methods
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US20080187910A1 (en) * 2002-06-26 2008-08-07 Nilsen Thor W Nucleic acid assay and method of detecting the presence of a nucleic acid sequence
DE60328116D1 (de) 2002-09-26 2009-08-06 Kenji Yoshida Informationswiedergabe-i/o-verfahren mit punktmuster und informationswiedergabeeinrichtung
US8206904B2 (en) 2002-12-18 2012-06-26 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
AU2003221408B2 (en) 2003-03-17 2010-05-27 Kenji Yoshida Information input/output method using dot pattern
US20070092880A1 (en) 2003-07-16 2007-04-26 Crothers Donald M Invasive cleavage reaction with electrochemical readout
US20050142595A1 (en) 2003-11-07 2005-06-30 U.S. Genomics, Inc. Intercalator FRET donors or acceptors
EP1698897B1 (en) 2003-12-19 2010-03-17 Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. Novel mixtures for assaying nucleic acid, novel method of assaying nucleic acid with the use of the same and nucleic acid probe to be used therefor
US20050191682A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting DNA
US20060024714A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-02 Applera Corporation Compositions and methods for detecting and quantitating polynucleotide sequences
WO2006005081A2 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Applera Corporation Compositions and methods for identifying nucleotides in polynucleotide sequences
KR101032750B1 (ko) 2005-03-05 2011-05-06 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
CA2609328A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 The Trustees Of Boston University Quantification of nucleic acids and proteins using oligonucleotide mass tags
WO2007011946A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 Applera Corporation Detection of nucleic acid amplification
WO2008083259A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Applera Corporation Systems and methods for detecting nucleic acids
US20080241838A1 (en) 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
FI20075124A0 (fi) 2007-02-21 2007-02-21 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testikitti nukleotidivariaatioiden toteamiseksi
KR20090067334A (ko) 2007-12-21 2009-06-25 주식회사 씨젠 핵산 중합효소의 뉴클레아제 활성을 이용한 타깃핵산분자의 검출방법
AU2009225835B2 (en) * 2008-03-15 2013-02-14 Hologic, Inc. Compositions and methods for analysis of nucleic acid molecules during amplification reactions
US20110136118A1 (en) * 2008-06-17 2011-06-09 Sigma-Aldrich Co. Real time polymerase chain reaction process using a universal detection system
EP2586876B1 (en) 2008-08-15 2014-10-08 Cascade Biosystems, Inc. Detecting nucleic acid
US20110171649A1 (en) * 2008-09-10 2011-07-14 Igor Kutyavin Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v
EP2463385B1 (en) 2008-11-13 2014-08-27 RiboxX GmbH Kit for RNA detection
EP2256215A1 (en) 2009-04-30 2010-12-01 Steffen Mergemeier Assay system using a nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP2248915B1 (en) 2009-05-05 2013-09-18 Qiagen GmbH Detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction cartridge
WO2011027966A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
US9315857B2 (en) * 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
BR112012018394B8 (pt) 2009-12-21 2021-07-27 Seegene Inc método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo e kit para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo
US20110281266A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Life Technologies Corporation Identification of Nucleic Acids
CA3060724A1 (en) * 2010-11-05 2012-05-10 Genalyte, Inc. Optical analyte detection systems and methods of use
WO2012096430A1 (en) 2011-01-11 2012-07-19 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay
KR101569479B1 (ko) 2011-03-29 2015-11-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 절단에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR20130101952A (ko) 2012-02-02 2013-09-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출

Also Published As

Publication number Publication date
DK2572004T3 (da) 2015-06-08
US20150086984A1 (en) 2015-03-26
CA3023333A1 (en) 2012-07-19
US11306349B2 (en) 2022-04-19
JP2017070298A (ja) 2017-04-13
CA2802494A1 (en) 2012-07-19
EP2572004A2 (en) 2013-03-27
WO2012096523A2 (en) 2012-07-19
NO20121065A1 (no) 2012-12-18
PL2708608T3 (pl) 2017-09-29
NZ604338A (en) 2015-05-29
IN2013CN00284A (es) 2015-10-02
US10280453B2 (en) 2019-05-07
IL243623A (en) 2017-06-29
MY174052A (en) 2020-03-05
BR112012026221B1 (pt) 2021-03-02
UA115082C2 (uk) 2017-09-11
EP2708608B1 (en) 2017-03-15
CA2979858A1 (en) 2012-07-19
EP3168311B1 (en) 2019-05-15
NZ706144A (en) 2016-11-25
WO2012096430A1 (en) 2012-07-19
US20200087718A1 (en) 2020-03-19
EP2826868A1 (en) 2015-01-21
CN103866037B (zh) 2016-09-07
ES2629759T3 (es) 2017-08-14
SG190758A1 (en) 2013-08-30
MX2017015093A (es) 2023-03-10
EP3967774A1 (en) 2022-03-16
WO2012096523A3 (en) 2012-12-06
EP2708608A1 (en) 2014-03-19
AU2012205956A1 (en) 2013-01-31
NO343803B1 (no) 2019-06-11
IL223608A (en) 2016-08-31
JP2015070848A (ja) 2015-04-16
EP2572004B1 (en) 2015-03-04
KR101462192B1 (ko) 2014-11-14
BR112012026221A2 (pt) 2017-01-10
CA3023333C (en) 2020-06-16
US10519489B2 (en) 2019-12-31
CA2979858C (en) 2019-06-18
US8809239B2 (en) 2014-08-19
CN103866037A (zh) 2014-06-18
EP2826868B1 (en) 2017-03-08
WO2012096523A9 (en) 2014-01-23
US20220213535A1 (en) 2022-07-07
ES2628327T3 (es) 2017-08-02
MX2013001510A (es) 2013-02-27
EP3543352B1 (en) 2021-10-20
JP6244440B2 (ja) 2017-12-06
KR20130006477A (ko) 2013-01-16
US20130109588A1 (en) 2013-05-02
ZA201209536B (en) 2014-03-26
MX352460B (es) 2017-11-24
AU2012205956B2 (en) 2015-07-16
PT2708608T (pt) 2017-06-26
US20160312271A1 (en) 2016-10-27
RU2566562C2 (ru) 2015-10-27
BR122019022348B1 (pt) 2021-05-11
JP2013538041A (ja) 2013-10-10
EP3543352A1 (en) 2019-09-25
EP2572004A4 (en) 2013-05-29
US20170073744A1 (en) 2017-03-16
PT2572004E (pt) 2015-07-07
EP3168311A1 (en) 2017-05-17
BR122019022355B1 (pt) 2021-05-11
CA2802494C (en) 2019-06-18
MX340258B (es) 2016-07-01
JP6054357B2 (ja) 2016-12-27
JP5756854B2 (ja) 2015-07-29
CN102959092A (zh) 2013-03-06
US9540681B2 (en) 2017-01-10
RU2012142160A (ru) 2015-02-20
CN102959092B (zh) 2016-01-13
PL2572004T3 (pl) 2015-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2538459T3 (es) Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO
CN103534358B (zh) 基于pto切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测
RU2608501C2 (ru) Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (варианты)
ES2653642T3 (es) Detección de una secuencia de ácido nucleico diana mediante ensayo sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO
ES2669244T3 (es) Detección de variación de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico diana mediante escisión CTO y ensayo de extensión
US9683259B2 (en) Detection of target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide cleavage
KR102345601B1 (ko) Pto 절단 및 연장-의존적 연장 분석에 의한 타겟 핵산 서열의 검출
KR101778771B1 (ko) Snp 유전자형을 결정하는 방법
AU2015205143B2 (en) Method for testing a mutant gene through real time polymerase chain reaction using inhibition of 5'-flap endonuclease activity
KR20120105811A (ko) Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널 발생에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR20130091939A (ko) 뉴클레오타이드 변이 검출 방법
WO2013187628A1 (en) Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent transcription