BR112019012925A2 - sonda mediadora em duas partes - Google Patents

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Von Stetten Felix
Becherer Lisa
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Abstract

a invenção refere-se a uma sonda mediadora para detectar pelo menos uma molécula alvo, compreendendo pelo menos dois oligonucleotídeos. um primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora de acordo com a invenção compreende uma região de sonda e uma região de ligação mediadora, em que a região de sonda tem uma afinidade a uma molécula alvo e/ou molécula molde, e a região de ligação mediadora tem uma afinidade a pelo menos um mediador. pelo menos um oligonucleotídeo adicional da sonda mediadora é um mediador que é ligado ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora através da região de ligação mediadora e tem uma afinidade a pelo menos uma molécula de detecção. o mediador dispara um sinal detectável após o primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora ser liberado por interação com a molécula de detecção. a invenção refere-se adicionalmente a um sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos um módulo de detecção e a um método para detectar pelo menos uma molécula alvo.

Description

“SONDA MEDIADORA EM DUAS PARTES”
DESCRIÇÃO
Introdução [001] A presente invenção refere-se a uma sonda mediadora compreendendo pelo menos dois oligonucleotídeos para a detecção de pelo menos uma molécula alvo. Um primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora de acordo com a invenção compreende uma região de sonda e uma região de ligação de mediador, em que a região de sonda tem uma afinidade com uma molécula alvo e/ou molécula molde, e a região de ligação de mediador tem uma afinidade com pelo menos um mediador. Pelo menos um oligonucleotídeo adicional da sonda mediadora é um mediador, que é ligado ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora através da região de ligação de mediador e tem uma afinidade para pelo menos uma molécula de detecção, em que o mediador dispara um sinal detectável por interação com a molécula de detecção após liberação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora. Além disso, a presente invenção refere-se a um sistema que compreende pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos uma molécula de detecção, bem como um método para a detecção de pelo menos uma molécula alvo.
Estado da Técnica [002] Amplificações de DNA são usadas, entre outras coisas, em diagnósticos clínicos para a investigação de doenças. A amplificação de DNA envolve a preparação de um grande número de cópias da sequência alvo desejada de modo que uma quantidade inicialmente pequena de DNA possa ser tomada visível.
[003] A amplificação de DNA pode ser realizada por vários métodos. Além do PCR, que requer ciclização térmica entre cerca de 60°C e 95°C, métodos de amplificação isotérmica, tais como, LAMP (62°C) ou RPA (39°C) são também usados. Várias abordagens estão disponíveis para
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2/82 rastreamento em tempo real da amplificação de DNA e detecção de produtos de amplificação. Bioluminescência, quimioluminescência, medidas de turbidez e métodos de detecção com base em fluorescência permitem, entre outras coisas, a detecção e a quantificação do DNA a ser examinado. A maior parte dos métodos acima só são capazes de detectar a quantidade total de DNA amplificado na amostra e não conseguem distinguir entre diferentes sequências alvo. Portanto, esses métodos são adequados apenas para as chamadas verificações de uniplexação. Os métodos à base de fluorescência, bem como luminescência, eletroquímica e outros métodos de detecção, abrem outras possibilidades de aplicação. Além de intercalar moléculas de detecção, que interagem inespecificamente com as fitas de DNA, oligonucleotídeos modificados são usados. Este último pode ser usado para análises específicas de sequência alvo, enquanto as moléculas de detecção intercaladas conduzem frequentemente a uma detecção falso-positiva de subprodutos não específicos. [004] Em análises clínicas e diagnósticos in vitro, faz sentido ser capaz de detectar várias moléculas alvo dentro de uma reação em paralelo, já que, por exemplo, diferentes bactérias ou vírus podem ser a causa de várias doenças. Por conseguinte, as verificações multianalitos são de grande importância, para os quais alguns exemplos estão listados abaixo: Por exemplo, não apenas a genotipagem ABO é relevante para a determinação do grupo sanguíneo, mas também a geração do Perfil de Antígeno Neutrófilo Humano (HNA), que tem a ser determinado para transfusões de sangue e tecido. Testes paralelos de amostras de doadores de sangue para variantes do HIV e vírus da hepatite B ou C também são rotineiramente realizados usando imunoensaios ou técnicas com base em ácido nucleico. A detecção específica de patógenos requer a determinação de vários locais genômicos para permitir um diagnóstico derivado após curtos períodos de análise.
[005] A determinação da atividade de diferentes genes de controle e marcadores permite a criação de um perfil de expressão. Isso pode ser usado,
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3/82 por exemplo, para identificar oncogenes que influenciam a divisão celular e a diferenciação celular e, portanto, estão intimamente correlacionados ao câncer, ou para fazer previsões sobre a eficácia de certos fármacos dependendo do genotipo do paciente (medicina personalizada). Doenças hereditárias também frequentemente representadas podem ser detectadas em diagnósticos biológicos moleculares (pré-natais), incluindo fibrose cística (fibrose cística), fenilcetonúria (distúrbio metabólico) e talassemia (degradação de eritrócitos). Além disso, a detecção conjunta de marcadores de inflamação, tal como procalcitonina ou citocinas, permite tirar conclusões sobre a gravidade de uma infecção.
[006] Se, como nos exemplos acima, a questão diagnostica requer a análise de várias moléculas alvo, locais genéticos ou outros marcadores, bem como controles internos ou referências, métodos que permitem apenas a determinação de um único parâmetro por análise são usualmente de pouca significância. Se, por outro lado, diferentes análises individuais são realizadas em paralelo para registrar vários parâmetros, isso é antieconômico: A solução da amostra deve ser dividida em vários lotes de reação, nos quais diferentes moléculas alvo são detectadas. Um problema que surge é o seguinte: dividindo as soluções da amostra em n alíquotas, a quantidade de substância na reação individual é reduzida por um fator de 1/n, pelo qual a sensibilidade da reação de detecção é reduzida por conseguinte.
[007] De modo a evitar essas desvantagens, abordagens de reação homogênea ou heterogênea são desenvolvidas para capturar vários parâmetros, nos quais diferentes moléculas alvo são detectadas em paralelo. Vários oligonucleotídeos rotulados para detecção são usados, que se ligam especificamente à molécula alvo a ser detectada. Na dependência direta entre o oligonucleotídeo rotulado e a molécula alvo descrita acima, o problema surge de que o uso de uma nova sonda é necessário se uma nova questão experimental surgir, por exemplo, se um genotipo diferente de um vírus for
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4/82 detectado. Isto toma necessário desenvolver novos oligonucleotídeos rotulados para detecção para cada nova questão experimental. Isto é demorado e dispendioso devido às modificações dos oligonucleotídeos requeridos para a detecção.
[008] Como uma alternativa à detecção paralela de diferentes sequências alvo em abordagens de reação homogênea, os oligonucleotídeos podem ser imobilizados para detecção em uma fase sólida (detecção heterogênea). Dependendo da posição de sinalização na fase fixa, a presença de certas sequências alvo pode ser inferida. A dependência direta entre o oligonucleotídeo rotulado e a molécula alvo leva novamente ao problema de os oligonucleotídeos imobilizados terem que ser adaptados ao problema experimental. Para cada nova questão experimental, novos oligonucleotídeos têm que ser imobilizados em uma fase sólida. Isso é muito demorado devido ao processo de fabricação complexo.
[009] O uso desvantajoso de oligonucleotídeos específicos de sequência alvo com rótulos para detecção ou em diferentes posições de uma fase sólida conduz à necessidade de um método de detecção universal, que é específico da sequência e, no entanto, econômico. Em um método universal, a sequência de oligonucleotídeos de geração de sinal (moléculas de detecção) é independente da sequência alvo a ser detectada. Os mesmos oligonucleotídeos de geração de sinal optimizados podem ser usados para diferentes sequências alvo. Como resultado, o tempo de trabalho e, portanto, os custos de mão de obra podem ser salvos, uma vez que os oligonucleotídeos de geração de sinal não precisam ser reajustados para cada reação de detecção.
[0010] Métodos de detecção universais específicos de sequência já são conhecidos, mas apresentam algumas desvantagens. Em particular, enzimas que são apenas compatíveis com certos métodos de amplificação, principalmente métodos de amplificação não isotérmicos. Estes incluem, por exemplo, o sistema repórter multianalitos de acordo com Faltin et al. 2012 e o
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5/82 uso de sondas duplex universais de acordo com Yang et al. 2008. Nos métodos mencionados, é absolutamente necessária uma enzima, por exemplo, uma polimerase, com atividade de nuclease, embora as polimerases usadas em LAMP ou RPA não possuam esta atividade de nuclease. As chamadas polimerases de deslocamento de fita dificilmente são usadas para detecção universal específica de sequência. Além disso, o procedimento de acordo com Yang et al. 2008 corre o risco de gerar sinais falso positivos.
[0011] O WO 2013079307 Al descreve um método universalmente aplicável para a detecção de pelo menos uma molécula alvo usando um sistema compreendendo uma sonda mediadora e uma molécula repórter universal. Uma liberação de mediador por clivagem requer uma enzima com atividade de nuclease. Em uma PCR, a polimerase tem essa atividade de nuclease na maioria das formas, razão pela qual nenhuma enzima adicional é necessária para este método de amplificação. No entanto, em métodos de amplificação isotérmica, tais como LAMP ou RPA, ou em PCDR, as polimerases usadas não possuem esta atividade de nuclease. Consequentemente, a liberação do mediador por clivagem só é possível através da adição de enzimas que exibem atividade de nuclease. Uma desvantagem disto é que enzimas adicionais interagem com outros componentes na mistura reacional e podem assim influenciar a eficiência da reação de detecção. Além disso, a necessidade de enzimas adicionais aumenta o custo da mistura reacional para a reação de detecção. Além disso, o uso de enzimas adicionais resulta em uma carga de trabalho adicional para otimizar a reação de detecção sob as condições mudadas.
[0012] US 2016/0312271 Al descreve um método universalmente aplicável para a detecção de pelo menos uma molécula alvo usando um sistema compreendendo uma sonda clivável e uma molécula de detecção universal. No procedimento de acordo com US 2016/0312271 Al, a reação de detecção é desencadeada de forma análoga a WO 2013079307 Al por
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6/82 divagem de um oligonucleotídeo. Por conseguinte, a mesma desvantagem ocorre que as enzimas com atividade de nuclease são necessárias.
[0013] Procedimentos do estado da técnica são também descritos, nos quais iniciadores são usados, compreendendo uma sequência de formação tipo grampo de cabelo, fluoróforos ligados covalentemente ou sondas rotuladas com fluorescência ligadas. Além disso, uma segunda sonda rotulada com fluorescência é usada, que se liga ao amplicon e pode interagir com o primeiro fluoróforo. A sequência de formação tipo grampo de cabelo específica de sequência alvo e a segunda sonda específica de sequência alvo conduzem à desvantagem de os fluoróforos não estarem ligados a seções de sequências universais e, por conseguinte, este método não pode ser usado universalmente. A geração de sinal deve, portanto, ser otimizada separadamente para novas reações de detecção. Além disso, a segunda sonda adicional apresenta um risco quando são usadas polimerases de deslocamento de fita, uma vez que uma primeira sonda ligada ao iniciador pode ser estendida e assim deslocar a segunda sonda.
[0014] Neste ponto, a detecção específica de sequência de produtos de amplificação usando polimerases de deslocamento de fita em uma LAMP de acordo com Tanner et al. 2012 deve ser mencionado. Com este método de detecção, o doador de fluorescência e o aceitador de fluorescência são ligados aos oligonucleotídeos específicos de sequência alvo, razão pela qual este método não é universal e por isso tem a desvantagem de que a detecção possa ser otimizada para cada nova reação de detecção.
[0015] Além disso, foram descritos métodos de detecção com base em balizas moleculares, que contêm sequências iniciadoras e, deste modo, possuem regiões específicas de sequência alvo. Outra desvantagem resulta da dependência da sequência alvo porque os rótulos de geração de sinal são localizados nos oligonucleotídeos específicos de sequência alvo, razão pela qual este método de detecção não é universalmente aplicável. Além disso, o
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7/82 rendimento de fluorescência e o equilíbrio entre a conformação fechada e aberta da baliza molecular dependem da sequência de iniciador. A reação de detecção deve, portanto, ser otimizada separadamente para cada nova reação de detecção.
[0016] As tecnologias universais descritas na literatura que usam polimerases de deslocamento de fita também apresentam algumas desvantagens. Por exemplo, usando uma baliza molecular hibridizada com um iniciador de acordo com Li et al. 2006 ou CN 101328498 A, existe o risco de que um sinal falso positivo seja gerado na ausência da molécula alvo devido à estabilidade da estrutura tipo grampo de cabelo da baliza molecular (Li et al. 2007). Além disso, este método de detecção só foi usado até agora para reações de amplificação via PCR. A função de métodos de amplificação isotérmica não foi comprovada e a estabilidade da estrutura tipo grampo de cabelo, que é ainda mais pronunciada em temperaturas mais baixas (LAMP, RPA), fala contra o uso deste método em combinação com a amplificação isotérmica. O uso de iniciadores universais rotulados com fluorescência de acordo com G.J. Nuovo et al. 1999, por sua vez, envolve o risco de que a hibridização do iniciador universal também possa levar à geração de sinal falso positivo em produtos de amplificação não específicos.
[0017] Nenhum dos métodos do estado da técnica permite a detecção paralela de diferentes moléculas e classes de moléculas, tais como proteínas e ácidos nucleicos, em uma única etapa, o que podería criar um perfil combinado de DNA-RNA-proteína de uma amostra.
[0018] Para questões de diagnóstico que requerem a análise de várias moléculas alvo diferentes de diferentes classes de substâncias, os métodos de detecção são vantajosos e podem detectar diferentes classes de substâncias, tais como proteínas e ácidos nucleicos, lado a lado. Os métodos de detecção descritos na literatura, que permitem a detecção simultânea de várias classes de moléculas, não são métodos universalmente aplicáveis (Das et al. 2012) ou
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8/82 têm a desvantagem adicional de que a reação de detecção deve ser realizada em vários estágios (Linardy et al., 2016), o que implica uma grande quantidade de trabalho e tempo durante a implementação.
[0019] Isso resulta na necessidade de um método de detecção universal específico de sequência que pode detectar simultaneamente vários analitos e contornar as desvantagens de métodos do estado da técnica. Além disso, um método de detecção é necessário que possa ser usado para diferentes métodos de amplificação, independentemente de estes últimos serem isotérmicos ou não isotérmicos.
[0020] A presente invenção é, assim, baseada na tarefa de prover uma sonda mediadora, bem como um sistema e método para a detecção de pelo menos uma molécula alvo, que não exibe as desvantagens do estado da técnica descrito acima. Por conseguinte, a tarefa era prover uma sonda mediadora e um método, que essencialmente permite a detecção simultânea, universal e/ou específica de sequência de vários analitos de diferentes classes de moléculas.
Descrição geral da invenção [0021] A tarefa é resolvida pelas reivindicações independentes. Formas vantajosas de execução resultam das reivindicações dependentes.
[0022] De acordo com a invenção, a presente tarefa técnica é resolvida provendo uma sonda mediadora em duas partes para a detecção de pelo menos uma molécula alvo.
[0023] A sonda mediadora inventada para a detecção de pelo menos uma molécula alvo compreende pelo menos dois oligonucleotídeos e é caracterizada por
a) um primeiro oligonucleotídeo compreende uma região de sonda e uma região de ligação de mediador, em que a região de sonda tem uma afinidade para uma molécula alvo e/ou molécula molde, e
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9/82 a região de ligação de mediador tem uma afinidade para pelo menos um mediador, e
b) pelo menos um oligonucleotídeo adicional é um mediador que é o é ligado através da região de ligação de mediador ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora, e o tem uma afinidade para pelo menos uma molécula de detecção, em que o mediador desencadeia um sinal detectável após a liberação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora por interação com a molécula de detecção.
[0024] Uma sonda mediadora de acordo com a invenção compreende assim uma primeira molécula ou um oligonucleotídeo compreendendo uma região de ligação de mediador e uma região de sonda, e uma segunda molécula ou um oligonucleotídeo, o mediador. A região de sonda da primeira molécula tem uma afinidade para a molécula alvo e/ou molde e a região de ligação de mediador tem uma afinidade com o mediador ou mediadores. Uma molécula molde é usada se a região de sonda não puder interagir diretamente com a molécula alvo. Consequentemente, uma molécula molde serve como um mediador entre a molécula alvo e a região de sonda.
[0025] Após a ligação da região de sonda a uma molécula alvo e/ou molécula molde, o mediador é deslocado da região de ligação de mediador por uma molécula, de preferência, uma enzima com efeito de separação de fita de DNA, e em certas versões com efeito de polimerização adicional, de preferência polimerase por deslocamento de fita. A interação do mediador com uma molécula de detecção desencadeia um sinal detectável. Uma polimerase por deslocamento de fita tem uma atividade de deslocamento de fita e desloca a fita complementar à fita amplificada durante a amplificação.
[0026] Foi completamente surpreendente que, aproveitando astutamente a aplicabilidade universal da sonda mediadora, fosse possível
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10/82 usá-la para a detecção de diferentes moléculas alvo. Surpreendentemente, é possível detectar várias moléculas alvo simultaneamente em uma amostra usando várias sondas mediadoras de acordo com a invenção.
[0027] A sonda mediadora de acordo com a invenção permite a detecção universal dependente da sequência de quaisquer sequências de ácido nucleico da molécula alvo e/ou molécula molde. Uma molécula de detecção que pode ser usada tem um projeto fixo independente da sequência alvo ou região de sonda da sonda mediadora.
[0028] Surpreendentemente, é possível que a liberação do mediador e a subsequente geração de sinal por interação com uma molécula de detecção possam ser aplicadas a diferentes métodos de amplificação e não se limitem a sistemas específicos. Aproveitando as vantagens das respectivas condições em diferentes métodos de amplificação, a liberação do mediador mencionada acima pode ser facilmente adaptada ao respectivo sistema.
[0029] Existem vários sistemas do estado da técnica para a detecção de sequências de ácido nucleico alvo com base em sondas ou iniciadores oligonucleotídica(o)s rotulados. No entanto, em contraste com o método de acordo com a invenção como aqui descrito, que é baseado no sistema de acordo com a invenção e a sonda mediadora de acordo com a invenção, estes métodos não são métodos de detecção universais que podem ser realizados com diferentes moléculas alvo específicas independentemente da sequência alvo.
[0030] As modificações de geração de sinal, tais como fluoróforo e extintor, são frequentemente aplicadas a oligonucleotídeos específicos de sequência alvo (iniciadores). Nesses casos, a molécula de geração de sinal não pode ser usada para diferentes reações de detecção, porque ela deve ser individualmente projetada e otimizada para cada molécula alvo. Uma grande vantagem da presente invenção sobre o estado da técnica é, portanto, a aplicabilidade universal das moléculas de detecção universal de geração de
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11/82 sinal, chamadas em conexão com a sonda mediadora de acordo com a invenção. Estas moléculas repórteres universais contêm moléculas de geração de sinal, mas não segmentos específicos de sequência alvo. As moléculas repórteres universais podem ser usadas para detectar diferentes moléculas alvo sem ter que redesenhar ou otimizar as moléculas repórter. Apenas a sonda mediadora em duas partes deve ser adaptada. A sonda mediadora de acordo com a invenção também apresenta um projeto de iniciador simplificado. Em contraste com os sistemas do estado da técnica, os oligonucleotídeos usados como iniciadores não têm que conter moléculas capazes de fluorescência ou moléculas ligantes, nem contêm uma segunda região específica de sequência alvo.
[0031] Durante o processo de amplificação, o restante do iniciador rotulado com fluoróforo e extintor é deslocado da molécula alvo pela polimerase de dispersão da fita, restaurando assim o sinal ao seu estado original e não garantindo uma mudança de sinal sustentada. Além disso, muitos métodos de detecção do estado da técnica requerem uma enzima com atividade de nuclease, por exemplo, uma polimerase, mas no caso de LAMP ou RPA, as polimerases usadas nesta invenção não possuem esta atividade de nuclease. De acordo com a invenção, a atividade de nuclease não é de preferência necessária, razão pela qual também métodos de amplificação isotérmica são usados. Muitos métodos de detecção do estado da técnica, no entanto, não podem ser usados com o método de amplificação isotérmica, tal como LAMP.
[0032] Em contraste com os procedimentos do estado da técnica, o procedimento de acordo com a invenção de preferência não divide a sonda mediadora. Em contraste com o sistema descrito, a sonda mediadora é em duas partes, de modo que a liberação do mediador pode ocorrer sem dividir uma ligação covalente por deslocamento. Isto permite com vantagem a detecção em tempo real de uma molécula alvo em uma reação de
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12/82 amplificação isotérmica onde nenhuma polimerase com atividade de nucleasse é usada. Além disso, usando múltiplos mediadores por sonda mediadora, o sinal de detecção pode ser amplificado e os diferentes mediadores de uma sonda podem gerar diferentes sinais de detecção. De acordo com a invenção, apenas é necessário um sítio de ligação específico à molécula alvo, mesmo se vários mediadores forem usados por sonda mediadora. Para sistemas ou procedimentos do estado da técnica conhecidos, no entanto, vários sistemas completos de sonda mediadora devem ser usados se vários mediadores forem liberados.
[0033] Sistemas do estado da técnica são conhecidos que contêm iniciadores com uma sequência específica de molécula alvo e podem hibridizar com uma sonda rotulada com fluoróforo. Em contraste com estes métodos, no entanto, o mediador da sonda mediadora em duas partes de acordo com a invenção, de preferência, não transporta quaisquer marcações para a geração de sinal. Se um fluoróforo for ligado a um iniciador por hibridização através de uma sonda separada, o fluoróforo pode ainda ser influenciado pela porção específica de sequência alvo do iniciador. Se as bases de guanina estiverem presentes na sequência de iniciador, o rendimento de fluorescência do fluoróforo pode ser negativamente influenciado pelas bases de guanina. Assim, surge uma influência/dependência do rendimento de fluorescência do fluoróforo em uma sonda separada por seções específicas de sequência alvo na sequência iniciadora. Além disso, na maioria dos casos, não é usada nenhuma molécula de detecção com uma sequência universal.
[0034] Os iniciadores do estado da técnica são também descritos com uma sequência de formação tipo grampo de cabelo e um fluoróforo ligado covalentemente ou por uma sonda hibridizada. A sequência de formação tipo grampo de cabelo contém uma segunda região específica de sequência alvo. De preferência, no entanto, a primeira parte da sonda mediadora de acordo com a invenção contém apenas uma região ou sequência específica de
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13/82 sequência alvo. Além disso, a sonda mediadora de acordo com a invenção, de preferência, não contém uma sequência de formação tipo grampo de cabelo e apenas uma região específica de sequência alvo. Adicionalmente, os sistemas conhecidos requerem um iniciador e frequentemente duas sondas rotuladas adicionais, pelas quais pelo menos uma sonda é específica de sequência alvo. Tais sistemas de iniciador/sonda consistem, assim, em duas ou três moléculas com sequências específicas de molécula alvo. Em contraste, a sonda mediadora inventada, de preferência, tem apenas uma molécula com uma sequência específica de molécula alvo. Além disso, a sonda mediadora em certas versões não contém uma marcação. O mediador também, de preferência, não contém uma sequência específica de molécula alvo.
[0035] A invenção por um lado é um desenvolvimento completamente novo e surpreendente, tendo em vista o conhecido estado da técnica. O estado da técnica não revela sistemas de detecção semelhantes que trabalham com a atividade de dispersão de enzimas. Em vez disso, descreve métodos de detecção que podem ser realizados sob condições de PCR com polimerases que não possuem atividade de deslocamento de fita.
[0036] E completamente surpreendente que uma sonda mediadora, um sistema e um procedimento tenham sido desenvolvidos de acordo com a invenção para tirar partido do deslocamento ativo do mediador por uma enzima com um efeito de dispersão de fita. Muitos processos do estado da técnica são baseados na atividade de nuclease das polimerases usadas, o que é absolutamente necessário. Não há conexão óbvia entre a reação de fissão e deslocamento. Além disso, não é óbvio ou trivial para um especialista adaptar métodos conhecidos que usam a atividade de nuclease de polimerases de modo que eles funcionem com o deslocamento de enzimas, uma vez que um grande número de condições de reação tem que ser modificado ou recombinado de diferentes maneiras.
[0037] Também não é óbvio para um especialista combinar métodos
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14/82 de detecção universais conhecidos com métodos conhecidos usando iniciadores específicos de sequência alvo hibridizada e sondas específicas de sequência alvo sem aplicar um princípio de detecção universal.
[0038] As vantagens da sonda mediadora de acordo com a invenção aqui descrita aplicam-se, em particular, às versões preferidas da execução da sonda mediadora, o sistema de acordo com a invenção e o procedimento de acordo com a invenção.
[0039] A detecção de uma molécula alvo no contexto da invenção significa que a presença da molécula alvo na amostra a ser investigada é detectada quantitativa ou qualitativamente. De acordo com a invenção, uma molécula alvo é uma molécula cuja presença é para ser detectada em uma amostra. E uma biomolécula, tal como, sem limitação, uma molécula de ácido nucleico, uma proteína, um peptídeo, uma molécula de açúcar, um lipídeo ou combinações destas moléculas, tais como proteínas glicosiladas ou outras biomoléculas glicosiladas.
[0040] O termo ácidos nucleicos no significado desta invenção inclui, sem limitação, DNA, RNA, PNA, ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA, tRNA, IncRNA, ncRNA, microRNA, siRNA, rRNA, sgRNA, piRNA, rmRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, gRNA, RNA viral ou RNA modificado, tal como LNA. Oligonucleotídeos no sentido da presente invenção são moléculas de ácido nucleico de comprimento relativamente curto compreendendo aproximadamente até 200 nucleotídeos.
[0041] Os oligonucleotídeos podem ser covalentemente e não covalentemente ligados a outras moléculas ou grupos químicos, tais como, doadores de fluorescência e/ou aceitadores de fluorescência e grupos de blocos.
[0042] As moléculas de açúcar dentro do significado desta invenção são, em particular, carboidratos ou sacarídeos e incluem mono-, di-, oligo- e polissacarídeos. A glicosilação descreve uma série de reações enzimáticas ou
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15/82 químicas nas quais os carboidratos são ligados a proteínas, lipídios ou outras agliconas. O produto da reação resultante é referido como glicosídeo, no caso de proteínas como glicoproteína ou peptidoglicano, no caso de lipídeos como glicolipídeos.
[0043] No sentido da invenção, o termo “lipídeos” refere-se a substâncias completamente ou pelo menos largamente insolúveis em água (hidrofóbicas) que, devido à sua baixa polaridade, dissolvem muito bem em solventes hidrofóbicos (ou lipofílicos). Os lipídios são componentes estruturais nas membranas celulares, e também são usados em organismos vivos como reservas de energia ou moléculas sinalizadoras. A maioria dos lipídeos biológicos são anfifílicos, isto é, têm um resíduo de hidrocarboneto lipofílico e um grupo de cabeça hidrofílico polar, e é por isso que eles formam micelas ou membranas em solventes polares, tal como água. O grupo de lipídeos inclui, em particular, ácidos graxos, triacilglicerídeos (gorduras e óleos graxos), ceras, fosfolipídeos, esfingolipídeos, lipopolissacarídeos e isoprenóides (esteróides, carotenóides etc.).
[0044] A região de sonda é, de preferência, complementar a uma seção da molécula alvo e/ou molécula molde. A região de sonda do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora liga-se a uma molécula alvo e/ou molécula molde. A ligação ocorre através da região de sonda da sonda mediadora, uma vez que esta tem uma afinidade para a molécula alvo e/ou molécula molde. A região de ligação de mediador não necessita ter qualquer afinidade para a molécula molde e não necessita ter um segmento de sequência complementar.
[0045] O mediador tem, de preferência, uma área complementar a uma seção de uma molécula de detecção. O mediador liga-se a uma molécula de detecção, desencadeando um sinal detectável. O sinal detectável permite tirar conclusões sobre a presença da molécula alvo ou molécula molde. A própria molécula molde pode ser a molécula alvo a ser detectada, ou pode
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16/82 estar associada à molécula alvo de modo que a informação sobre a presença da molécula alvo possa ser gerada através da molécula molde.
[0046] A molécula de detecção de acordo com a invenção é um oligonucleotídeo com o qual a molécula alvo pode interagir indiretamente e pode causar uma reação de detecção por processamento (por exemplo, mudança de um sinal de fluorescência, sinal eletroquímico ou massa).
[0047] Uma molécula molde é uma molécula de ácido nucleico que pode ser usada se os reagentes usados para o método de detecção da invenção, por exemplo, iniciadores ou sondas ou a sonda mediadora da invenção, não podem interagir diretamente com a molécula alvo. Uma molécula molde pode, por conseguinte, ser usada como um mediador entre a molécula alvo e o iniciador ou sondas. Os aptâmeros são usualmente usados como moléculas molde.
[0048] Aptâmeros são oligonucleotídeos que, devido às suas propriedades estruturais, interagem ou se ligam a outras moléculas ou complexos de moléculas. As moléculas ligadas por aptâmeros podem ser proteínas, peptídeos, moléculas de açúcar, moléculas lipídicas, moléculas de ácido nucleico ou complexos moleculares formados a partir dessas moléculas. Os aptâmeros podem assumir diferentes conformações no estado ligado e não ligado, de modo que diferentes regiões de sequência de um aptâmero, por exemplo, sejam acessíveis para interações com oligonucleotídeos complementares, tais como, iniciadores ou sondas, dependendo da conformação.
[0049] Uma interação no sentido desta invenção refere-se à interação mútua de diferentes moléculas de interação. Isto pode ser, por exemplo, uma ligação covalente ou não covalente entre duas moléculas, ou uma ligação indireta mediada por uma ou mais outras moléculas, por exemplo, dentro de um complexo molecular.
[0050] No contexto desta invenção, um sinal detectável refere-se a
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17/82 qualquer tipo de mudança que pode ser medida fisicamente ou quimicamente. Estas mudanças incluem, sem limitação, clivagem, digestão, duplicação de fita, hibridização interna, fosforilação, desfosforilação, amidação, ligação ou clivagem de um grupo químico, fluorescência, fosforescência ou mudanças de luminescência.
[0051] Em um projeto preferido da sonda mediadora de acordo com a invenção, o primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora e/ou do mediador não inclui um marcador para a geração de sinal. Uma vantagem decisiva de tal sonda mediadora não rotulada é que pode ser usada em um método de acordo com a invenção para a detecção de pelo menos uma molécula alvo sem a necessidade de mão de obra e custos para otimizar o novo ensaio. Em contraste com o estado da técnica, a sonda mediadora consiste em oligonucleotídeos, que podem ser sintetizados de forma econômica sem modificações tecnicamente complexas, tais como, doadores de fluorescência e/ou aceitadores de fluorescência e grupos de blocos.
[0052] O termo rótulo refere-se, de preferência, a qualquer átomo ou molécula que possa ser usado para prover um sinal detectável (de preferência quantificável) e que possa ser covalentemente ou não covalentemente ligado a um ácido nucleico ou proteína ou outra biomolécula. Os rótulos podem prover sinais que podem ser detectados por reações redox, luminescência, fluorescência, radioatividade, colorimetria, gravimetria, difração ou absorção de raios-X, magnetismo, atividade enzimática e similares.
[0053] Em uma versão preferida, o primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora e/ou do mediador contém um ou mais marcadores para geração de sinal, de preferência uma molécula fluorescente, uma molécula redox, uma molécula luminescente ou outra unidade de geração de sinal.
[0054] Em uma outra versão preferida da invenção, o mediador contém um ou mais marcadores para geração de sinal, de preferência uma molécula fluorescente, uma molécula redox, uma molécula luminescente ou
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18/82 outra molécula de geração de sinal ou outra unidade de geração de sinal. De acordo com esta invenção, o mediador, após o deslocamento da sonda mediadora, pode ligar-se a uma molécula de detecção, que também contém pelo menos um rótulo para geração de sinal, resultando em uma mudança de sinal detectável.
[0055] Por exemplo, o mediador ligado à sonda mediadora pode ser marcado com um doador/aceitador de fluorescência que emite a um determinado comprimento de onda λμ Após o deslocamento da sonda mediadora, o mediador pode ligar-se a uma molécula de detecção rotulada com um aceitador/doador de fluorescência, que é emitido em um segundo comprimento de onda λι, que é diferente de λμ A transferência de energia do doador de fluorescência para o aceitador de fluorescência através do mecanismo de FRET leva a um aumento detectável na intensidade de radiação do aceitador de fluorescência, o que permite que a emissão de λ2 seja detectada. Altemativamente, moléculas doadoras quimioluminescentes ou bioluminescentes podem ser usadas. Aceitadores de fluorescência não emissivos também podem ser usados em projetos preferidos. Usando moléculas de detecção com diferentes números de nucleotídeos, diferentes moléculas alvo podem ser distinguidas simultaneamente em uma amostra por meio de uma análise da curva de fusão.
[0056] Marcando o mediador, o caráter universal do método de detecção descrito não se perde porque o mediador é uma molécula universal independente da sequência alvo. Em projetos adicionais, vária(o)s sondas ou iniciadores por molécula alvo podem ser usada(o)s a(os) quais os mediadores rotulados são ligados, pelos quais as sequências dos mediadores e os rótulos podem diferir. Por exemplo, corantes fluorescentes com diferentes comprimentos de onda de emissão podem ser usados.
[0057] Uma versão preferida da sonda mediadora de acordo com a invenção é caracterizada por a liberação do mediador do primeiro
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19/82 oligonucleotídeo da sonda mediadora ocorrer durante a amplificação da molécula alvo e/ou molécula molde, a qual a sonda mediadora é ligada.
[0058] O termo amplificação ou reação de amplificação, no sentido desta invenção, refere-se à amplificação de uma biomolécula, de preferência uma molécula de ácido nucleico. Os ácidos nucleicos são amplificados com o auxílio de enzimas conhecidas como polimerases. Na amplificação, a sequência inicial é referida como o amplicon e o produto como o amplificado. [0059] Em versões preferidas da sonda mediadora de acordo com a invenção, o primeiro oligonucleotídeo tem 1 a 200, de preferência 20 a 80, particularmente preferido 35 a 65 nucleotídeos, e o mediador 1 a 60, de preferência 10 a 50, particularmente preferido 15 a 40 nucleotídeos.
[0060] De acordo com versões preferidas da sonda mediadora de acordo com a invenção, a molécula alvo e/ou a molécula molde é uma biomolécula selecionada do grupo consistindo em ácidos nucleicos, DNA, RNA, peptídeo, proteína, aptâmero e/ou combinações dos mesmos.
[0061] Em modalidades preferidas da presente invenção, a molécula alvo é a molécula molde. Em outras versões preferidas, a molécula alvo interage com a molécula molde.
[0062] Em versões preferidas da sonda mediadora de acordo com a invenção, a terminação 3 ’ do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora serve como ponto de partida de uma reação de amplificação e pode assim atuar como um iniciador. Esta é uma vantagem decisiva sobre soluções de estado da técnica conhecidas, porque a sonda mediadora para novas moléculas alvo não precisa ser completamente reprojetada e uma região de sonda na molécula alvo selecionada, mas um iniciador existente pode ser facilmente modificado de tal maneira que pode funcionar como uma sonda mediadora de acordo com a invenção.
[0063] Em outra versão preferida da sonda mediadora de acordo com a invenção, a terminação 3’ do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora
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20/82 não serve como ponto de partida de uma reação de amplificação. Na ausência da molécula alvo, uma sonda mediadora correspondente pode formar uma estrutura tipo grampo de cabelo de tal modo que esteja na forma fechada, o mediador sendo ligado ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora. Na presença da molécula alvo, a sonda mediadora liga-se à molécula alvo ou molécula molde, pela qual um iniciador pode ligar-se ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora agora aberta. Por processamento com um sistema enzimático adequado, o iniciador ligado pode ser estendido, pelo qual a sonda mediadora desloca o mediador. O mediador liberado pode ser detectado com a ajuda de uma molécula de detecção específica. Um exemplo de execução preferido é mostrado no exemplo 18.
[0064] Em um projeto preferido, o primeiro oligonucleotídeo de uma sonda mediadora de acordo com a invenção pode compreender uma região de aptâmero, uma região de ligação de mediador e uma região de ligação a iniciador. A molécula alvo a ser detectada pode ser uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, mas não está limitada a ela. Na ausência da molécula alvo, um iniciador pode ligar-se à região de ligação a iniciador do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora e ao estender a terminação 3’ do iniciador usando um sistema enzimático adequado, o mediador é liberado da sonda mediadora. O mediador liberado pode desencadear um sinal detectável usando uma molécula ou um método de detecção específica(o). Na presença da molécula alvo, a região do aptâmero da sonda mediadora liga-se à molécula alvo, pela qual o iniciador ligado à região ligante de iniciador não pode ser prolongado e a sonda mediadora não libera o mediador. Se a molécula alvo estiver presente, uma queda de sinal é detectada em comparação com a ausência da molécula alvo.
[0065] Além disso, a invenção refere-se a um sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos uma molécula de detecção, caracterizada por pelo menos uma molécula de
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21/82 detecção compreender um ou mais oligonucleotídeos e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador, e em que a pelo menos uma molécula de detecção compreende um ou mais oligonucleotídeos e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador
a) uma segunda região compreendendo um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, e/ou
b) uma terceira região que compreende um doador de fluorescência ou um aceitador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, ou
c) pelo menos uma quarta região que interage com pelo menos uma primeira sonda que tem um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência e/ou
d) pelo menos uma quinta região que interage com pelo menos uma segunda sonda compreendendo um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência ou
e) consiste em dois oligonucleotídeos, ambos ou apenas um dos dois oligonucleotídeos tendo um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a um grupo de fase sólida e/ou de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência [0066] As sondas que interagem com a pelo menos uma molécula de detecção podem ser consideradas como componentes da molécula de detecção no sentido da invenção. Neste caso, a molécula de detecção compreende mais
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22/82 do que um oligonucleotídeo.
[0067] As diferentes regiões das moléculas de detecção aqui descritas podem sobrepor-se ou ser idênticas nas versões preferidas da invenção.
[0068] Além disso, a invenção refere-se a um sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos uma molécula de detecção, caracterizada por a pelo menos uma molécula de detecção compreender um ou mais oligonucleotídeos e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador, e em que a pelo menos uma molécula de detecção compreende um ou mais oligonucleotídeos e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador
a) uma segunda região que compreende um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência e/ou
b) uma terceira região que compreende um doador de fluorescência ou um aceitador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, ou
c) pelo menos uma quarta região que interage com pelo menos uma primeira sonda que tem um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência e/ou
d) pelo menos uma quinta região que interage com pelo menos uma segunda sonda compreendendo um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência.
[0069] Além disso, a presente invenção refere-se a um sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos uma molécula de detecção, em que a pelo menos uma molécula
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23/82 de detecção é um oligonucleotídeo e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador, e
a) uma segunda região em uma terminação 5’ da pelo menos uma molécula de detecção que tem um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, e
b) uma terceira região que compreende um doador de fluorescência ou um aceitador de fluorescência e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química, ou
c) pelo menos uma quarta região que interage com pelo menos uma primeira sonda que tem um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência e/ou
d) pelo menos uma quinta região que interage com pelo menos uma segunda sonda compreendendo um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência.
[0070] Aproveitando-se astutamente da aplicabilidade universal da sonda mediadora de acordo com a invenção, é possível usar o presente sistema para a detecção de diferentes moléculas alvo. Usando várias sondas mediadoras universais, várias moléculas alvo podem ser detectadas simultaneamente em uma amostra.
[0071] Uma vez que os doadores de fluorescência e os aceitadores são ligados à molécula de detecção universal e não às moléculas específicas de sequência alvo, o rendimento de fluorescência e o sinal básico não são influenciados pela estrutura da molécula alvo. Em contraste com a tecnologia do estado da técnica, uma molécula de detecção otimizada pode ser usada em diferentes ensaios sem sacrificar o rendimento de fluorescência ou o sinal
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24/82 fundamental.
[0072] Um aceitador de fluorescência ou corante aceitador é uma molécula que pode absorver energia de um doador de fluorescência. Um aceitador de fluorescência pode também ser descrito como um extintor no sentido da invenção. A eficiência de absorção depende, entre outras coisas, da distância entre o aceitador de fluorescência e o doador de fluorescência. Um aceitador de fluorescência pode ser ativado por absorção de um fóton com λι até a emissão com λι ou pode ser não emissivo e levar à extinção de fluorescência.
[0073] Um doador de fluorescência é uma molécula de corante ou fluoróforo que é capaz de fluorescência. Um doador de fluorescência, que é ativado por radiação, pode transferir a energia sem radiação via interações dipolo-dipolo para um aceitador de fluorescência. Isso extingue o sinal de fluorescência do doador de fluorescência. Altemativamente, o sinal de fluorescência do doador de fluorescência a ser detectado pode ser influenciado por extinção estática e dinâmica.
[0074] Um fluoróforo (ou fluorocromo, semelhante a um cromóforo) é um composto químico fluorescente que pode reemitir luz ao acionar a luz. Fluoróforos para uso como rótulos na construção de oligonucleotídeos rotulados da invenção, de preferência, compreendem rodamina e derivados, tais como, Vermelho Texas, Fluoresceína e derivados, tais como, 5bromometil fluoresceína, Amarelo e Lúcifer, IAEDANS, 7-Me2N-cumarina4-acetatos, 7-OH-4-CH3-cumarina-3-acetatos, 7-NH2-4CH3-cumarina-3acetatos (AMCA), monobromobimanas, pirenotrissulfonatos, tais como, Cascade Blue e monobromotrimetilamoniobimanas, FAM, TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor Laranja 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor Vermelho 590, ROX, LC vermelho 610, CAL Fluor Vermelho 610, vermelho Texas, LC vermelho 610, CAL Fluor Vermelho 610, LC vermelho 640 , CAL Fluor Vermelho 635, Cy5, LC
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25/82 vermelho 670, Quasar 670, Oyster 645, LC vermelho 705, Cy5.5, BODIPY FL, Verde Oregon 488, Verde Rodamina, Oregon Verde 514, Cal Ouro, BODIPY R6Gj, Amarelo Yakima, JOE , HEX, Cal Laranja, BODIPY TMRX, Quasar-570/Cy3, TAMRA, Rodamina Vermelho-X, Vermelho Redmond, BODIPY 581/591, Cy3.5, Cal Vermelho/Vermelho Texas, BODIPY TR-X, BODIPY 630/665-X, Puls ar-650, Quasar-670/Cy5.
[0075] “Extinção” refere-se a qualquer processo que reduz a intensidade de fluorescência de uma substância particular. A extinção é a base para os ensaios de transferência de energia por ressonância de Fõrster (FRET). A FRET é um mecanismo de extinção dinâmico porque a transferência de energia ocorre enquanto o doador está em um estado ativado. Um extintor é uma molécula que extingue a fluorescência via FRET emitida pelo fluoróforo quando ativada por uma fonte de luz. Extintores para uso como rótulos na construção de oligonucleotídeos ou sondas rotulado(a)s da invenção compreendendo, de preferência, DDQ-I, Dabcil, Eclipse, TAMRA, Iowa Black FQ, BHQ-1, QSY-7, BHQ-2, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21, BHQ-3, QSY-35, BHQ-0, QSY-9, ElleQuencher, Iowa Black. O qualificado pode selecionar pares apropriados de extintor repórter como descrito na literatura [Johansson, M.K. Methods in Molecular Biology 335, 17 - 29 (2006); Marras, S.A. Methods in Molecular Biology 335, 3-16 (2006)].
[0076] Em uma versão preferida do sistema de acordo com a invenção, a molécula de detecção tem uma estrutura tipo grampo de cabelo. Aqui, a estrutura tipo grampo de cabelo pode ser formada pela terminação 5 ’ complementaridade da molécula de detecção hibridizando com uma porção de sequência interna e a terminação 3 ’ da molécula de detecção compreendendo uma porção de sequência não emparelhada.
[0077] Adicionalmente, uma molécula de detecção pode, de acordo com a invenção, conter pelo menos uma modificação de fluorescência ou modificação de redox ou modificação de luminescência na terminação 5’ e/ou
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26/82 dentro da estrutura tipo grampo de cabelo.
[0078] Uma estrutura tipo grampo de cabelo no sentido da presente invenção significa uma estrutura secundária de uma molécula de ácido nucleico linear ou oligonucleotídeo tendo segmentos de sequência alinhados pelo emparelhamento de bases interno. Essas estruturas ocorrem quando duas regiões da mesma molécula - usualmente com uma sequência de nucleotídeos palindrômicos - formam uma dupla hélice, que é terminada no final por um enovelamento não emparelhado.
[0079] Após a formação da estrutura tipo grampo de cabelo, o doador de fluorescência ou aceitador de fluorescência na terminação 5’ (segunda região) e o doador de fluorescência ou aceitador de fluorescência da terceira região podem interagir uns com os outros, resultando na supressão do sinal de fluorescência (FRET). Como alternativa a uma modificação do doador de fluorescência e aceitador de fluorescência da molécula de detecção na segunda e na terceira regiões, outras modificações de geração de sinal podem ser usadas, tais como, mas não se limitando a, moléculas redox, pares de transferência de energia por ressonância de quimiluminescência (CRET) e moléculas intercalantes.
[0080] Após liberação, o mediador está difusamente presente na solução reacional e pode interagir com a primeira região da molécula de detecção localizada na seção da sequência não emparelhada na terminação 3 ’ da molécula de detecção tipo grampo de cabelo. A molécula de detecção pode ser imobilizada em uma fase sólida ou presente em solução. Uma extensão do mediador ligado à molécula de detecção pode ser efetuada por uma molécula auxiliar adequada, por exemplo, a polimerase por deslocamento de fita, em que a segunda região (terminação 5’) da molécula de detecção, que é hibridizada complementarmente com uma seção de sequência interna da molécula de detecção, e forma assim a estrutura tipo grampo de cabelo, é deslocada pela polimerase ou pela terminação 3’ estendida do mediador,
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27/82 respectivamente. Isto aumenta a distância entre o aceitador de fluorescência e o doador de fluorescência deslocando a terminação 5’ e restaura o sinal de fluorescência anteriormente suprimido do doador de fluorescência. Altemativamente, a distância de uma molécula redox na terminação 5’ da molécula de detecção muda em relação à terminação 3’ da molécula de detecção ou a eficiência de mudanças de CRET ou a intercalação de moléculas muda devido à formação de uma estrutura duplex de mediador ou o seu produto de extensão e a molécula de detecção. Ao deslocar a terminação 5’ hibridizado, a formação da estrutura secundária ou da estrutura tipo grampo de cabelo é eliminada. Neste caso, o mediador pode ser estendido complementarmente pela molécula auxiliar descrita até a terminação 5’ da molécula de detecção.
[0081] De acordo com um projeto preferido do sistema de acordo com a invenção, a molécula de detecção tem a estrutura de uma baliza molecular e contém pelo menos uma região de ligação de mediador. Balizas moleculares são uma classe especial de moléculas de detecção duplamente rotuladas com extremidades de cadeia autocomplementares que formam uma estrutura tipo grampo de cabelo em seu estado nativo. As balizas moleculares podem transportar rótulos, tais como um doador de fluorescência e um aceitador de fluorescência nas extremidades das cadeias, pelas quais os rótulos podem interagir uns com os outros nas versões preferidas. A estrutura tipo grampo de cabelo traz o doador de fluorescência e o aceitador de fluorescência próximos uns aos outros, suprimindo assim o sinal de fluorescência. A hibridização com o mediador separa espacialmente o doador de fluorescência e o aceitador de fluorescência, possivelmente como parte de uma reação de amplificação na qual o mediador é estendido, e gera um sinal de fluorescência. Uma vantagem das moléculas de detecção na forma de balizas moleculares através de moléculas de detecção que transportam rótulos internos tem menor custo de síntese que rótulos terminais, tais como rótulos fluorescentes.
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28/82 [0082] Em outro projeto preferido, a invenção refere-se a um sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção e pelo menos uma molécula de detecção, caracterizada por a pelo menos uma molécula de detecção compreender dois oligonucleotídeos, em que
- o primeiro oligonucleotídeo compreende uma primeira região que interage com pelo menos um mediador e uma segunda região tendo um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção química e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, e
- o segundo oligonucleotídeo compreende uma terceira região tendo um doador de fluorescência ou um aceitador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a um grupo de fase sólida e/ou de proteção química e/ou de fase sólida e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência,
- em que o primeiro e o segundo oligonucleotídeos têm regiões de hibridização entre si.
[0083] De acordo com este projeto, a molécula de detecção pode consistir em dois oligonucleotídeos rotulados hibridizados, pelos quais os dois rótulos dos dois oligonucleotídeos podem ser cada um pelo menos um aceitador de fluorescência ou doador de fluorescência ligado às extremidades dos oligonucleotídeos, pelos quais o sinal de fluorescência no dímero é atenuado ou suprimido pela proximidade espacial dos dois rótulos. Um ou ambos os oligonucleotídeos também te(ê)m uma região de ligação de mediador. Por ligação de mediador à região de ligação de mediador e subsequente extensão, os nucleotídeos rotulados são separados e as extremidades 5’ e 3’ rotuladas são espacialmente separadas umas das outras, resultando em um aumento de sinal detectável. Uma vantagem desta estrutura consiste nos custos de síntese muito baixos para tais oligonucleotídeos terminais e fluorescentes simples. Uma variante preferida deste projeto da
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29/82 molécula de detecção é mostrada na Figura 19.
[0084] De acordo com um projeto preferido do sistema de invenção, a molécula de detecção compreende uma sexta região em uma terminação 3 ’ da molécula de detecção que tem um grupo químico para ligação a um grupo de fase sólida e/ou de proteção química.
[0085] Um grupo protetor no sentido desta invenção refere-se a um substituinte, introduzido em uma molécula para proteger temporariamente um grupo funcional particular e assim prevenir uma reação indesejável. Após a reação desejada ter sido realizada em outra parte da molécula, o grupo de proteção pode ser separado novamente.
[0086] Em um projeto preferido, a molécula de detecção está livremente presente em uma solução. Em outro projeto preferido, a molécula de detecção está ligada a uma fase sólida. A molécula de detecção é imobilizada em uma fase sólida em um vaso de reação adequado para o respectivo método de detecção. A amostra e os reagentes requeridos podem ser adicionados ao vaso de reação e a mistura pode então ser incubada sob as condições apropriadas. A amostra pode consistir em DNA, RNA e/ou peptídeos ou proteínas. Se a molécula alvo estiver presente, o mediador é deslocado ou liberado pela sonda mediadora e pode difundir-se na mistura reacional para a molécula de detecção imobilizada.
[0087] Em versões preferidas da invenção, uma mudança de sinal é detectada após liberação do mediador e ligação a uma molécula de detecção por detecção eletroquímica em uma fase sólida. A molécula de detecção é imobilizada em um eletrodo, que representa simultaneamente a fase sólida. O mediador liberado pode hibridizar com a região de ligação de mediador da molécula de detecção e ser estendido por uma polimerase, por exemplo. Após a extensão bem-sucedida, as moléculas redox podem se intercalar no dímero de molécula de detecção e no mediador estendido e gerar um sinal eletroquímico que pode ser detectado.
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30/82 [0088] Além disso, é também possível que um mediador suficientemente longo hibridize com a molécula de detecção e não seja estendido. Moléculas redox podem se intercalar no dímero da molécula de detecção e mediador e gerar um sinal eletroquímico. Uma variante desse projeto é mostrada na Figura 20.
[0089] Em versões posteriores, o mediador e/ou a molécula de detecção é(são) rotulado(a)(s) com uma ou mais moléculas redox. Se o mediador é rotulado com uma molécula redox, a ligação do mediador liberado à molécula de detecção imobilizada leva a uma mudança de sinal devido à proximidade espacial da modificação redox e da superfície do eletrodo. Uma variante desta forma de invenção é mostrada na Figura 21.
[0090] Pode ser vantajoso liberar múltiplos mediadores por alvo e/ou molécula molde para obter um sinal mais forte. A liberação de vários mediadores por molécula alvo pode ser conseguida, por exemplo, ligando mediadores a vários iniciadores diferentes.
[0091] Em uma versão adicional, um mediador rotulado com uma modificação redox, por exemplo, pode ser estendido por uma polimerase após hibridização com a molécula de detecção, pela qual pode ser conseguida uma estabilização vantajosa da fita dupla (Figura 22).
[0092] Em outras versões, o mediador, que é marcado com uma modificação redox, pode se ligar à extremidade da cadeia da molécula de detecção removida da superfície do eletrodo. O mediador pode ser estendido em uma molécula de detecção mais longa ou o mediador já tem um comprimento semelhante ao da molécula de detecção e não é estendido. A transferência de carga elétrica entre a molécula redox e o eletrodo ocorre através da condutividade elétrica do DNA, pelo qual a condutividade aumenta através da formação de uma fita dupla. Uma variante de tal projeto é mostrada na Figura 23.
[0093] Em versões posteriores, a molécula de detecção pode conter
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31/82 uma molécula redox e o mediador pode estar livre de rótulos. O mediador liberado pode agora ligar-se à molécula de detecção e ser estendido como mostrado na Figura 24. Altemativamente, um mediador já suficientemente longo pode ligar-se à molécula de detecção. A formação de uma fita dupla aumenta a condutividade elétrica do DNA devido a possíveis mecanismos de transferência de carga intra e intermolecular. Consequentemente, uma mudança de sinal no eletrodo pode ser detectada.
[0094] A detecção eletroquímica pode ser realizada através da medição de vários parâmetros, tais como, mudanças de impedância, ciclovoltometria, voltametria de onda quadrada ou mudanças de capacitância. Em versões preferidas da invenção, a detecção de uma mudança de sinal após liberação do mediador e ligação a uma molécula de detecção é realizada através de microscopia por fluorescência por reflexão total interna (TIRF). Neste projeto, a molécula de detecção é imobilizada em uma fase sólida acima de um dispositivo de iluminação de TIRF. O campo evanescente formado pela reflexão total penetra no volume da amostra e desencadeia moléculas de fluorescência, que são localizadas na molécula de detecção e/ou no mediador e/ou nas sondas ou são intercaladas nos dímeros, pelos quais uma mudança do sinal de fluorescência pode ser detectada.
[0095] Em outros projetos preferidos, a ligação do mediador liberado à molécula de detecção pode ser detectada por espectroscopia por ressonância de plasmon de superfície. Pela liberação e subsequente ligação do mediador à molécula de detecção imobilizada em uma superfície, uma mudança no índice de refração na amostra pode ser detectada. As moléculas de detecção podem ser imobilizadas diretamente sobre a superfície metálica na qual os plasmons são ativados ou, por exemplo, em/sobre uma membrana localizada diretamente sobre a superfície de metal.
[0096] A ligação ou imobilização da molécula de detecção em uma fase sólida também é vantajosa para provar a liberação e a ligação do
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32/82 mediador a uma molécula de detecção por medições gravimétricas. Por exemplo, a molécula de detecção é imobilizada em uma superfície portadora cujo peso pode ser determinado com o quartzo oscilante. Mudanças no peso devido à ligação do mediador à molécula de detecção podem assim ser detectadas.
[0097] Altemativamente, as moléculas de detecção podem ser imobilizadas sobre partículas magnéticas. Isto permite a detecção de moléculas alvo por relaxometria magnética. Na relaxometria magnética, as partículas magnéticas são magnetizadas por um curto pulso magnético e a degradação temporal do momento magnético induzido é detectada. A resistência hidrodinâmica das partículas às quais os mediadores se ligam e se estendem através das moléculas de detecção imobilizadas sobre as partículas é maior, isto é, a resistência hidrodinâmica de partículas às quais nenhum mediador se liga. As partículas, às quais os mediadores se ligam e, opcionalmente, são estendidas, portanto, degradam seu momento magnético induzido mais lentamente que as partículas, às quais nenhum mediador se liga. Os tempos de relaxamento dos momentos magnéticos induzidos das partículas mencionadas diferem, portanto, uns dos outros, pelas quais a liberação de mediadores pode ser detectada. Combinando a relaxometria magnética com uma análise de curva de fusão, diferentes moléculas alvo podem ser detectadas lado a lado em uma amostra.
[0098] De acordo com a invenção, o mediador e/ou a molécula de detecção pode(m) ser rotulado(a)(s) com pelo menos uma molécula fluorescente, molécula redox, molécula luminescente ou outra molécula de geração de sinal.
[0099] A molécula de detecção pode ser uma molécula de ácido nucleico ou um derivado de ácido nucleico de fita simples, de acordo com a invenção. Várias sondas rotuladas podem ser hibridizadas com essa molécula de detecção. Após a liberação do mediador, ele se liga à molécula de detecção
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33/82 e é prolongado. Isto libera as sondas rotuladas hibridizadas com a molécula de detecção, resultando em uma mudança de sinal detectável proveniente dos rótulos das sondas. Por exemplo, a liberação de sondas rotuladas com doador de fluorescência e aceitador de fluorescência conduz a um aumento na fluorescência devido à separação espacial de doador de fluorescência e aceitador de fluorescência. A molécula de detecção de fita simples pode ser linear ou circular, pode ser homogênea em solução ou imobilizada em uma fase sólida e pode ter diversos sítios de ligação a mediador. Esta forma de invenção é, de preferência, usada em métodos de amplificação isotérmica para assegurar que as sondas rotuladas se liguem à molécula de detecção na ausência da molécula alvo e não se dissociem da molécula de detecção devido à alta energia térmica gerada, por exemplo, por PCR . Exemplos da forma da invenção mostrada aqui são mostrados no Exemplo 9.
[00100] Se a molécula de detecção for circular e se vários sítios de ligação a mediador forem inseridos, uma reação de detecção rida pode ocorrer em uma boa faixa dinâmica ligando simultaneamente vários mediadores em sítios diferentes. A estrutura circular da molécula de detecção permite um aumento adicional na sensibilidade a ser alcançada, uma vez que a hibridização e a extensão de um mediador em uma molécula de detecção libera todas as sondas rotuladas ligadas, independentemente do sítio ao qual o mediador se liga. Sondas com diferentes doadores de fluorescência e aceitadores de fluorescência, que emitem em diferentes comprimentos de onda podem ser ligados a uma molécula de detecção. Combinando diferentes corantes fluorescentes, que também podem ser usados em diferentes concentrações (o que é determinado pelo número de sondas rotuladas por molécula de detecção), o grau de multiplexação pode ser aumentado. Certas razões de concentração podem ser atribuídas a uma molécula de detecção definida.
[00101] Em um projeto preferido, o sistema de acordo com a invenção
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34/82 também inclui pelo menos uma molécula de ligação à qual pelo menos uma primeira e/ou pelo menos uma segunda sonda pode se ligar após liberação da molécula de detecção. Moléculas de ligação podem ser usadas para prevenir sondas liberadas, por exemplo, aquelas rotuladas com doadores de fluorescência ou receptores de fluorescência, de se ligarem novamente à molécula de detecção. Um exemplo correspondente da invenção é mostrado na Figura 7.
[00102] Em certas formas, a molécula de detecção consiste em vários oligonucleotídeos, pelos quais um oligonucleotídeo não rotulado é hibridizado com oligonucleotídeos mais curtos, rotulados com fluorescência. O oligonucleotídeo não rotulado pode ser hibridizado com vários oligonucleotídeos rotulados com fluorescência. Aceitadores de fluorescência e/ou doadores de fluorescência são ligados aos oligonucleotídeos mais curtos. Estes estão arranjados de modo que o fluoróforo e o extintor estão espacialmente próximos um do outro. O mediador não rotulado liberado tem uma energia de ligação mais alta que a molécula de detecção não rotulada do que as moléculas de detecção rotuladas com fluorescência e assim desloca, por exemplo, o oligonucleotídeo mais curto rotulado com o extintor. As energias de ligação podem ser ajustadas de modo que o mediador se ligue, de preferência, ao iniciador e não à molécula de detecção sob condições de reação. Um exemplo correspondente da invenção é mostrado na Figura 25.
[00103] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de pelo menos uma molécula alvo, compreendendo as seguintes etapas:
a) Prover pelo menos uma sonda mediadora de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e/ou um sistema de acordo com as reivindicações 4 ou 5;
b) Ligar a região de sonda do primeiro oligonucleotídeo de pelo menos uma sonda mediadora a uma sequência da molécula molde e/ou
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35/82 da molécula alvo,
c) Amplificar o primeiro oligonucleotídeo de pelo menos uma sonda mediadora e/ou da molécula molde e/ou da molécula alvo,
d) Liberar pelo menos um mediador por pelo menos uma molécula auxiliar,
e) Opcionalmente, ligar o pelo menos um mediador liberado a pelo menos uma molécula de detecção, e
f) Detectar uma mudança de sinal.
[00104] As etapas de amplificação do método de acordo com a invenção podem incluir métodos de amplificação isotérmica e/ou não isotérmicos.
[00105] Na amplificação isotérmica ou não isotérmica, a respetiva reação ocorre a uma temperatura constante (isotérmica) com uma polimerase por deslocamento de fita. Como a amplificação isotérmica é realizada a uma temperatura constante, ela também pode ser realizada sem nenhum grande esforço de equipamento técnico. A polimerase por deslocamento de fita, por exemplo, DNA polimerase Φ 29 do bacteriófago Φ 29, desloca uma segunda fita existente de DNA de fita dupla, enquanto usa a primeira fita para produzir uma nova fita com a mesma sequência para formar a segunda fita.
[00106] Métodos para amplificação isotérmica de DNA incluem, mas não estão limitados a, amplificação multideslocamento, montagem isotérmica, amplificação por recombinase polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por enovelamento (LAMP), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), amplificação dependente de helicase (HDA), reação de amplificação enzimática de corte (NEAR), amplificação por círculo rolante (RCA) e amplificação por deslocamento de fita (SDA).
[00107] Em métodos de amplificação não isotérmicos, uma polimerase termoestável é usada porque a temperatura varia durante a reação. Um termociclador pode ser usado para esta finalidade. Exemplos de métodos de
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36/82 amplificação não isotérmica são a reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real e reação de deslocamento de fita de polimerase (PCDR). [00108] Uma vantagem importante do método de acordo com a invenção é que a liberação do mediador e a subsequente geração de sinal, por exemplo, por interação do mediador com uma molécula de detecção, pode ser aplicada a diferentes métodos de amplificação e não é limitada a sistemas de amplificação específicos. Aproveitando as vantagens das respectivas condições em diferentes métodos de amplificação, a liberação do mediador mencionada acima pode ser facilmente adaptada ao respectivo sistema.
[00109] Em versões preferidas da invenção, o mediador não é liberado pela divisão do mediador da sonda mediadora usando a atividade de nuclease de uma enzima, mas por deslocamento. Neste caso, as ligações covalentes não são, de preferência, clivadas porque o mediador não é covalentemente ligado ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora. De preferência, o mediador é liberado sem a clivagem de um oligonucleotídeo. De preferência, o uso de enzimas com atividade de nuclease não é necessária no procedimento da invenção.
[00110] O mediador liga-se à primeira região da molécula de detecção em uma versão preferida do procedimento de acordo com a invenção, pelo qual a ligação pode ser uma interação indireta ou direta. Através desta interação do mediador com a primeira região da molécula de detecção, pode ocorrer uma mudança física ou quimicamente mensurável da molécula de detecção.
[00111] Em uma versão preferida do método de acordo com a invenção, pelo menos um mediador liga-se à primeira região da molécula de detecção e é estendido enzimaticamente por pelo menos uma molécula auxiliar, a molécula auxiliar de preferência de liga à terminação 3’ do mediador ligado, pelo qual ocorre uma mudança fisicamente ou quimicamente mensurável na molécula de detecção. Estas mudanças da molécula de
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37/82 detecção incluem, sem limitação, clivagem, digestão, duplicação de fita, hibridização interna, fosforilação, desfosforilação, amidação, ligação ou clivagem de um grupo químico, fluorescência, fosforescência ou mudanças de luminescência.
[00112] De acordo com outra versão preferida do procedimento de acordo com a invenção, pelo menos um mediador liga-se à primeira região da molécula de detecção, o que resulta em uma mudança fisicamente ou quimicamente mensurável da molécula de detecção. Para gerar uma mudança mensurável, uma extensão enzimática do mediador não é necessária.
[00113] A terminação 3’ do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora é, de preferência, estendida enzimaticamente por uma molécula auxiliar após a ligação da região de sonda do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora a uma sequência da molécula molde e/ou da molécula alvo.
[00114] Um projeto preferido do método de acordo com a invenção é caracterizado por a amplificação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora e/ou da molécula molde e/ou molécula alvo ser realizada por um método de amplificação isotérmica ou não isotérmica.
[00115] De acordo com a invenção, PCR, PCDR ou PCR em tempo real são preferidos como métodos de amplificação não isotérmicos. LAMP ou RPA são os métodos de amplificação isotérmica preferidos.
[00116] Em uma reação de amplificação não isotérmica, tal como PCR ou PCDR, um ou mais dos iniciadores usados podem ser modificados de modo que seja uma sonda mediadora. A amostra e os reagentes são colocados em um recipiente reacional adequado e a mistura é incubada, onde a amplificação pode ocorrer. Durante este processo, a mudança de sinal, por exemplo, de um sinal de fluorescência, é detectada no vaso de reação.
[00117] Em uma outra versão do método de acordo com a invenção, a molécula de detecção tem pelo menos uma modificação de fluorescência ou luminescência e, após a reação com pelo menos um mediador por meio de
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38/82 uma molécula auxiliar, a modificação de fluorescência ou luminescência é clivada molécula de detecção e/ou a terminação 5’ da estrutura tipo grampo de cabelo da molécula de detecção é removida e/ou a estrutura tipo grampo de cabelo é desdobrada e uma mudança no sinal de fluorescência ou luminescência é detectada na molécula de detecção.
[00118] Em versões preferidas do procedimento de acordo com a invenção, vários mediadores por sonda mediadora e/ou várias sondas mediadoras e/ou várias moléculas de detecção por molécula alvo são usado(a)s.
[00119] Isso permite análises multiplex complexas que permitem a detecção simultânea de vários analitos em uma abordagem experimental. Análises multiplex permitem a detecção de várias moléculas alvo e/ou moléculas molde diferentes em uma mistura reacional. De modo a aumentar o grau de multiplexação do método de acordo com a invenção, n diferentes sondas mediadoras podem ser usadas para a detecção de n diferentes moléculas alvo. Cada molécula alvo a ser detectada pode ser atribuída a pelo menos uma sonda mediadora cuja região de sonda interage especificamente com a molécula alvo ou molécula molde. A região de ligação de mediador e o mediador da respectiva sonda mediadora não são afins ou complementares à respectiva molécula alvo ou molécula molde. No entanto, o respectivo mediador representa um parceiro de interação específico para uma molécula de detecção definida. Assim, cada molécula alvo é atribuída indiretamente a pelo menos uma molécula de detecção, que é atribuída pela sonda mediadora. A detecção de diferentes moléculas alvo requer diferentes moléculas de detecção.
[00120] Uma vez que a região de sonda e a região de ligação de mediador da sonda mediadora podem ser livremente combinadas independentemente uma da outra, uma molécula de detecção também pode ser correlacionada com uma outra molécula alvo ligando e sintetizando a
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39/82 região de ligação de mediador correspondente e o mediador com qualquer região de sonda. O método de acordo com a invenção permite, portanto, que a molécula alvo seja projetada independentemente da molécula de detecção. Assim, com um conjunto padronizado de moléculas de detecção, diferentes moléculas alvo podem ser detectadas em uma amostra, pela qual a reação pode ser adaptada de forma rentável à respectiva molécula alvo, adaptando a sonda mediadora e usando moléculas auxiliares adequadas (por exemplo, iniciadores ou aptâmeros).
[00121] De acordo com a invenção, vários mediadores diferentes, que são parte de uma única sonda mediadora e se ligam à região de ligação de mediador do mesmo primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora, podem se ligar a várias moléculas de detecção diferentes. Ao combinar astuciosamente vários mediadores de uma sonda mediadora com diferentes moléculas de detecção, o grau de multiplexação do procedimento de acordo com a invenção pode ser grandemente aumentado. O pré-requisito é que as várias moléculas de detecção diferentes gerem sinais diferentes que sejam distinguíveis e possam, de preferência, ser detectados em paralelo ou simultaneamente.
[00122] Por exemplo, usando n moléculas de detecção e dois mediadores por sonda mediadora e molécula alvo “n mais de 2” + n moléculas alvo diferentes podem ser detectadas. O coeficiente binomial pode ser usado para calcular o número de moléculas alvo detectáveis para um dado número de diferentes moléculas de detecção. Como uma molécula alvo pode ser identificada não apenas gerando dois sinais diferentes, por exemplo, dois sinais de fluorescência com dois comprimentos de onda diferentes, mas também gerando um único sinal, o valor do coeficiente binomial deve ser aumentado por n de modo a calcular o máximo número de moléculas alvo detectáveis. Com quatro diferentes moléculas de detecção, 10 moléculas alvo diferentes podem ser detectadas, enquanto apenas cinco moléculas de detecção podem diferenciar entre 15 moléculas alvo. Um exemplo
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40/82 correspondente é mostrado na Figura 5 A.
[00123] Altemativamente, várias sondas mediadoras podem ser usadas por molécula alvo, pela qual uma sonda mediadora pode conter apenas um mediador.
[00124] Uma ou mais sonda(s) de mediador, que se ligam à mesma molécula alvo ou de molécula molde, pode(m) ser usada(s) em uma versão preferida do processo de acordo com a invenção, pela qual o mediador ou os mediadores destas sondas mediadoras pode(m) ligar-se a uma ou mais moléculas de detecção simultaneamente. Combinando astutamente as regiões ligantes mediadoras nas moléculas de detecção, é possível, por exemplo, distinguir entre três moléculas alvo usando apenas duas moléculas de detecção. Usando n moléculas de detecção e pelo menos dois mediadores por molécula de detecção, “2n - 1” diferentes moléculas alvo podem ser detectadas. De acordo com esta forma de invenção, cada uma das moléculas de detecção contém pelo menos duas regiões de ligação mediadoras diferentes, pelas quais pelo menos dois mediadores, que são ligados a pelo menos duas sequências alvo diferentes, cada um liga-se a apenas uma molécula de detecção específica. Um sinal específico é gerado por molécula alvo. De acordo com esta invenção, um terceiro ou mais mediadores, que são ligados a uma terceira ou mais sequências alvo, podem se ligar a pelo menos as duas moléculas de detecção e assim desencadear pelo menos dois sinais diferentes. Para a probabilidade de que dois mediadores liberados se liguem simultaneamente à mesma molécula de detecção para ser alta o suficiente, a concentração de mediadores liberados deve estar na ordem da concentração de moléculas de detecção. Um exemplo correspondente é mostrado na Figura 5 B. Além disso, moléculas de detecção que podem se ligar mais do que dois mediadores diferentes podem também ser usadas, e várias sondas mediadoras diferentes podem se ligar à mesma molécula alvo.
[00125] Usando várias sondas mediadoras por molécula alvo ou
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41/82 molécula molde, vários mediadores diferentes podem ser liberados na detecção da molécula alvo. Por exemplo, várias sondas mediadoras podem ser usadas, as quais se ligam seletivamente a uma molécula alvo ou molécula molde comum, pela qual o mediador ou os mediadores destas sondas mediadoras te(ê)m sequências diferentes. Vários mediadores diferentes de diferentes sequências podem se ligar a uma e à mesma molécula de detecção, pela qual uma reação de detecção só pode ser acionada pela ligação de vários mediadores. A reação de geração de sinal pode ser controlada aproveitando-se astutamente da interação entre os mediadores liberados e, assim, aumentando a especificidade do método de detecção. Especificidade refere-se à proporção de eventos corretamente classificados como negativos ou à probabilidade de que a ausência de uma molécula alvo também seja classificada como negativa. Por exemplo, dois mediadores liberados por diferentes sondas mediadoras podem interagir em uma molécula de detecção de modo que uma mudança de sinal da molécula de detecção só ocorra se ambos os mediadores se ligarem à molécula de detecção. Um exemplo correspondente é mostrado na Figura 5 C.
[00126] Um projeto preferido do método de acordo com a invenção é caracterizado por a molécula alvo e/ou a molécula molde é uma biomolécula selecionada dentre o grupo que compreende DNA, RNA, peptídeo, proteína, aptâmero e/ou uma combinação dos mesmos.
[00127] Uma grande vantagem do método de acordo com a invenção é que, em contraste com o estado da técnica, a detecção paralela de diferentes moléculas e classes de moléculas, tais como, proteínas e ácidos nucleicos, é possível em uma única etapa e dentro uma única abordagem de reação, permitindo assim a criação de um perfil combinado de DNA-RNA-proteína de uma amostra.
[00128] O método de detecção de acordo com a invenção pode ser usado, por exemplo, para detectar uma molécula de RNA específica como
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A2IZ1 uma molécula alvo, em que o RNA é transcrito em cDNA por transcrição reversa (RT) ou por outro sistema enzimático adequado e depois o cDNA é amplificado, em que o cDNA é usado como uma molécula molde.
[00129] De acordo com a invenção, os aptâmeros específicos de molécula alvo podem ser usados como moléculas molde para a detecção de moléculas alvo. A molécula alvo a ser detectada pode ser uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, mas não está limitada a ela. Um aptâmero liga-se à molécula alvo e muda sua estrutura de modo que, após a interação, um iniciador e uma sonda mediadora específicos de aptâmero possam se ligar ao aptâmero. Por processamento com um sistema de enzima adequado, os iniciadores ligados ao aptâmero podem ser prolongados, resultando na amplificação de uma sequência de aptâmero que se encontra fora da região de ligação à proteína do aptâmero. Uma sonda mediadora de acordo com a invenção pode interagir com o aptâmero ou com a sequência do aptâmero amplificado. Por exemplo, ligando uma sonda mediadora a um produto de amplificação linear, a sonda pode ser aberta e iniciadores adicionais são usados para deslocar o mediador da sonda mediadora. O mediador liberado pode ser detectado usando uma molécula de detecção específica ou um método de detecção adequado. De acordo com a invenção, os aptâmeros específicos de molécula alvo podem ser usados como moléculas molde para a detecção de uma molécula alvo, que compreende uma região de ligação de molécula alvo flanqueada por regiões de ligação a iniciador. Além disso, pelo menos uma sonda mediadora de acordo com a invenção é usada, cuja região de sonda se liga especificamente a uma das regiões ligantes de iniciador do aptâmero. Na ausência da molécula alvo, a região de ligação de molécula alvo do aptâmero pode ser amplificada usando a sonda mediadora e outro iniciador, liberando o mediador da sonda mediadora e detectando uma mudança de sinal. Na presença da molécula alvo, o aptâmero liga-se à molécula alvo e o iniciador ou primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora
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43/82 não pode ser prolongado devido à ligação entre o aptâmero e a molécula alvo e o mediador não é liberado. Se a molécula alvo estiver presente, uma queda de sinal é detectada em comparação com a ausência da molécula alvo. Este método de acordo com a invenção permite uma reação de detecção exponencial.
[00130] De acordo com outra forma do processo da invenção, a molécula auxiliar é selecionada do grupo consistindo em polimerases, RNA polimerases, DNA polimerases, ligases, ribozimas, catalisadores, proteínas, ácidos nucleicos, produtos naturais, enzimas, sistemas enzimáticos, lisados celulares, componentes celulares, derivativos derivados de componentes celulares e/ou moléculas sintéticas. A molécula auxiliar é, de preferência, uma molécula de um sistema de amplificação de ácido nucleico e/ou um sistema de enzima de restrição.
[00131] Ligases são enzimas ligam as fitas de DNA. Elas formam uma ligação éster entre um resíduo de fosfato e o açúcar desoxirribose. Sabe-se também que as ligases também têm a capacidade de estender as moléculas de ácido nucleico na sua extremidade 3 ’.
[00132] As ribozimas são moléculas de RNA cataliticamente ativas que catalisam reações químicas semelhantes a enzimas. Sabe-se que certas ribozimas podem prolongar e amplificar moléculas de ácido nucleico, semelhantes às polimerases. As ribozimas também podem catalisar outras reações, tais como, a ligação de ligações peptídicas e o splicing de moléculas de RNA.
[00133] De acordo com uma versão preferida do método da invenção, pelo menos uma molécula auxiliar tem um efeito de separação de fita de DNA e/ou um efeito de polimerização, a molécula auxiliar, de preferência, sendo uma polimerase por deslocamento de fita.
[00134] Surpreendentemente, ao usar uma polimerase com atividade de deslocamento de fita, não são necessárias enzimas adicionais, tais como,
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44/82 enzimas com atividade de nuclease, o que é uma grande vantagem sobre as tecnologias do estado da técnica.
[00135] Moléculas auxiliares diferentes podem ser usadas para diferentes etapas do processo dentro do processo de acordo com a invenção. As etapas do processo que podem ser realizadas com o auxílio de moléculas auxiliares compreendem, sem limitação, amplificação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora de acordo com a invenção, amplificação da molécula alvo e/ou da molécula molde, clivagem, liberação ou deslocamento do mediador da sonda mediadora, extensão enzimática do mediador após ligação a uma molécula de detecção e modificação da molécula de detecção.
[00136] Uma mudança mensurável em fluorescência, fosforescência, luminescência, massa, absorção, dispersão de luz, condutividade elétrica, atividade e/ou afinidade enzimática, potencial ou sinal eletroquímico, índice de refração, ativação de plasmons de superfície ou relaxamento magnético ocorre em uma versão preferida do método de acordo com a invenção por interação direta ou indireta entre a molécula de detecção imobilizada ou não imobilizada e pelo menos um mediador.
[00137] Em um projeto preferido do método de acordo com a invenção, uma mudança mensurável em fluorescência, fosforescência, luminescência, massa, absorção, dispersão de luz, condutividade elétrica, atividade e/ou afinidade enzimática, potencial ou sinal eletroquímico, índice de refração, ativação de plasmons de superfície, relaxamento magnético, propriedade magnética, ocorre impedância ou capacitância por interação direta ou indireta entre a molécula de detecção imobilizada ou não imobilizada e pelo menos um mediador.
[00138] Um projeto preferido de acordo com a invenção é caracterizado por a liberação do pelo menos um mediador ser detectada por amplificação do pelo menos um mediador por meio de um método de
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45/82 amplificação isotérmico ou não isotérmico. O mediador liberado pode, por exemplo, desencadear a amplificação por círculo rolante na presença de enzimas de amplificação correspondentes. Assim, a molécula alvo pode ser identificada pela detecção de produtos de amplificação do Círculo Rolante. Os produtos de amplificação de Amplificação por Círculo Rolante podem, por exemplo, ser detectados especificamente em sequência através de sondas ou através de mudanças do valor de pH, eletroforese em gel ou colorimetria. [00139] De acordo com uma versão preferida do procedimento de acordo com a invenção, o pelo menos um mediador liberado é detectado por sequenciamento. Por meio do sequenciamento dos mediadores livres, qualquer número de moléculas alvo em uma amostra pode ser identificado simultaneamente.
[00140] Sequenciamento é a determinação da sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico, especialmente DNA. Métodos de sequenciamento dentro do significado desta invenção incluem, sem limitação, o método Maxam e Gilbert, o método didesoxi de Sanger, pirosquenciamento, sequenciamento de hibridização, o sistema de sequenciamento de DNA semicondutor de íons, sequenciamento de síntese em ponte, sequenciamento de duas bases, sequenciamento de extremidade emparelhada e sequenciamento Nanopore.
[00141] A detecção pode ser demonstrada, por exemplo, pelo sequenciamento de próxima geração (NGS). Um exemplo de um método de NGS é o sequenciamento Nanopore, no qual as mudanças potenciais em uma membrana porosa podem ser medidas como moléculas, tais como ácidos nucleicos, fluxo através da membrana e a sequência do ácido nucleico pode ser assim determinada. O sequenciamento pode ser usado para detectar a liberação simultânea de qualquer número de mediadores, cada um dos quais sinaliza a presença de uma molécula alvo específica. O grau de multiplexação aumenta consideravelmente em comparação com os métodos convencionais,
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46/82 tais como medições de fluorescência. O método de sequenciamento não se limita a sequenciamento Nanopore.
[00142] Em uma versão preferida do método de acordo com a invenção, o pelo menos um mediador liberado liga-se à molécula de detecção por hibridização, é opcionalmente estendido após ligação à molécula de detecção por uma molécula auxiliar, e depois uma análise da curva de fusão é realizada. Isto permite um aumento adicional no grau de multiplexagem a ser alcançado usando diferentes moléculas de detecção, que, por exemplo, são rotuladas com diferentes moléculas de sinalização. De acordo com uma versão preferida da invenção, sondas específicas ou não específicas de sequência que são corantes fluorescentes e/ou rotulados com cromogênio ou fluorogênio interagem com o mediador e/ou a molécula de detecção.
[00143] Em uma versão preferida do método de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula alvo é um RNA, e o RNA é transcrito em cDNA e o cDNA serve como uma molécula molde. Um iniciador com parte pendente de sequência pode ser usado para a reação de reescrita/transcrição reversa de RNA em cDNA, e a região de sonda da sonda mediadora pode ligar-se a uma região contendo, pelo menos, uma porção do cDNA e uma porção da parte pendente da sequência.
[00144] De acordo com outra versão preferida do método de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula alvo é um peptídeo ou uma proteína e a molécula molde é um aptâmero, em que o aptâmero se liga ao peptídeo ou à proteína e ligando o aptâmero à molécula alvo, o sítio de ligação para a região de sonda da sonda mediadora no aptâmero se toma acessível.
[00145] De acordo com a presente invenção, sondas específicas de sequência ou não específicas de sequência, corantes fluorescentes ou moléculas redox podem interagir com pelo menos um mediador e/ou a molécula de detecção.
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47/82 [00146] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso do sistema de acordo com a invenção e/ou processo para detectar uma ou mais biomoléculas similares ou diferentes em uma mistura. Neste caso, a molécula de detecção de acordo com a invenção pode ter um grupo protetor químico na região terminal 3’, o grupo protetor sendo separado da molécula de detecção por meio de uma molécula auxiliar após a reação com o mediador, e o grupo OH terminal 3’ sendo gerado.
[00147] Além disso, a presente invenção refere-se a um kit compreendendo pelo menos uma molécula de detecção e, opcionalmente, pelo menos um mediador no sentido da invenção, polimerases e dNTPs.
Descrição especial da invenção [00148] A seguir, a invenção será explicada por meio de figuras e exemplos de execução, mas sem se limitar a isso. Mostre:
[00149] Figura 1: Representação esquemática da estrutura de uma sonda mediadora em uma modalidade da invenção.
[00150] Figura 2: Sequência esquemática de um deslocamento de mediador durante um processo de amplificação na presença de uma polimerase por deslocamento de fita.
[00151] Figura 3: Representação esquemática de uma possível molécula de detecção.
[00152] Figura 4: Representação esquemática da extensão do mediador enzimático.
[00153] Figura 5: Possibilidades de arranjo quando se utilizam vários mediadores e/ou várias sondas mediadoras e/ou várias moléculas de detecção por molécula alvo.
[00154] Figura 6: Estrutura de uma molécula de detecção com a estrutura de uma baliza molecular.
[00155] Figura 7: Molécula de detecção linear ou circular com doador de fluorescência e sondas hibridizadas rotuladas com fluorescência.
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48/82 [00156] Figura 8: Detecção eletroquímica em uma fase sólida.
[00157] Figura 9: Sequência esquemática de um deslocamento do mediador durante um processo de amplificação na presença de uma polimerase por deslocamento de fita.
[00158] Figura 10: Mecanismo de uma liberação do mediador e subsequente geração de sinal durante uma LAMP.
[00159] Figura 11: Gráfico de uma LAMP de uma LAMP para a detecção de E. coli (W3110, genoma completo) usando sondas mediadoras e moléculas de detecção de acordo com a invenção.
[00160] Figura 12: Gráfico de uma LAMP de uma RT-LAMP para a detecção de RNA de HIV-1 usando sondas mediadoras e moléculas de detecção da invenção.
[00161] Figura 13: Estrutura de uma sonda mediadora que não funciona como iniciador.
[00162] Figura 14: Método de detecção para a detecção de moléculas alvo por aptâmeros específicos de moléculas alvo.
[00163] Figura 15: Método de detecção da invenção para a detecção de moléculas alvo por sondas mediadoras que contêm adicionalmente a região do aptâmero e a região ligante de iniciador.
[00164] Figura 16: Método de detecção da invenção para a detecção de moléculas alvo por sondas mediadoras que atuam como iniciadores e permitem uma reação de detecção exponencial.
[00165] Figura 17: Imobilização de uma molécula de detecção em uma fase sólida.
[00166] Figura 18: Imobilização de uma molécula de detecção rotulada em um eletrodo.
[00167] Figura 19: Molécula de detecção consiste em dois oligonucleotídeos hibridizados rotulados.
[00168] Figuras 20-24: Detecção eletroquímica em uma fase sólida.
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49/82 [00169] Figura 25: A molécula de detecção consiste em vários oligonucleotídeos.
[00170] Figura 26: Gráfico de fluorescência normalizada de uma LAMP para a detecção de H. ducreyi.
[00171] Figura 27: Gráfico de fluorescência normalizada de uma LAMP para a detecção de T. pallidum.
[00172] Figura 28: Gráfico de fluorescência normalizada de uma RTLAMP para detecção de HTLV-1.
[00173] Figura 29: Gráfico de fluorescência normalizada de uma RTLAMP para a detecção de TMV.
[00174] Figura 30: Gráfico de fluorescência normalizada uma PCDR para a detecção de 100 pg de fragmento G3PDH.
[00175] Figura 31: Ligação do mediador a uma nanopartícula magnética ou magnetizável.
[00176] Figura 32: Prova de detecção eletroquímica de mediadores eletroativamente rotulados.
[00177] A Figura 1 mostra uma representação esquemática de uma possível estrutura de uma sonda mediadora, que é uma versão preferida da invenção.
[00178] A Figura 2 mostra a sequência esquemática de deslocamento do mediador durante a amplificação na presença de uma polimerase por deslocamento de fita a partir de uma sonda mediadora que atua como um iniciador na amplificação de DNA.
[00179] A Figura 3 (A) mostra a representação linear de uma possível molécula de detecção. (B) Representação de uma molécula de detecção imobilizada em 3’ sob formação da estrutura secundária. Os segmentos de sequência complementar reversa, cuja interação produz a estrutura secundária da molécula de detecção, são mostrados como regiões negras, a sequência de ligação a mediador como região com tiras na diagonal.
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50/82 [00180] A figura 4 mostra a representação esquemática de uma extensão do mediador enzimático. i) Uma molécula de detecção é livre em solução ou imobilizada em uma fase sólida e assume uma estrutura secundária definida sob condições de reação. Duas modificações de fluorescência adequadas F e Q interagem umas com as outras, pelas quais o sinal de fluorescência de F é suprimido, ii) O mediador pode interagir com a molécula de detecção em uma posição definida (região de ligação de mediador, Região 5) iii) - iv) e é assim estendida enzimaticamente por uma polimerase por deslocamento de fita. A região 1 em conjunto com a molécula aceitadora de fluorescência Q é deslocada pela molécula de detecção, restaurando assim a intensidade de fluorescência do doador de fluorescência F. vi) Após o deslocamento da região 1, o mediador pode ser adicionalmente estendido.
[00181] A Figura 5 (A-C) mostra vários arranjos possíveis quando se usam vários mediadores e/ou várias sondas mediadoras e/ou várias moléculas de detecção por molécula alvo. (A) aumentando o número de moléculas alvo detectáveis usando múltiplos mediadores por sonda mediadora ou múltiplas sondas mediadoras por molécula alvo. O número máximo de moléculas alvo detectáveis como uma função do número de moléculas de detecção quando se usam vários mediadores por molécula alvo pode ser calculado usando o coeficiente binômio e o número de moléculas de detecção. (B) Aumentar o número de moléculas alvo detectáveis usando moléculas de detecção com múltiplas regiões de ligação mediadoras. (C) Aumentar a especificidade de uma reação de detecção usando múltiplos mediadores por molécula alvo e explorando a interação entre os mediadores. A liberação de ambos os mediadores permite que eles interajam de maneira simultânea com a molécula de detecção, prolongando um dos mediadores e desencadeando uma reação de detecção. A interação de um único mediador não leva a uma reação de detecção.
[00182] A Figura 6 mostra a estrutura de uma molécula de detecção
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51/82 correspondente à estrutura de uma baliza molecular. O aceitador de fluorescência e o doador de fluorescência são ligados nas extremidades 5’ e 3’ e a região de ligação de mediador está localizada no enovelamento.
[00183] A Figura 7 mostra uma molécula de detecção linear ou circular à qual o doador de fluorescência e o aceitador de fluorescência são hibridizados. Ao hibridizar o mediador para a molécula de detecção e extensão, as sondas rotuladas são liberadas e uma mudança de sinal pode ser detectada. De modo a evitar sondas liberadas rotuladas com doador de fluorescência ou aceitador de fluorescência da religação à molécula de detecção, moléculas ligantes podem ser usadas às quais as sondas rotuladas podem se ligar após a liberação.
[00184] A Figura 8 mostra uma versão da invenção na qual a detecção eletroquímica é usada em uma fase sólida. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Após a hibridização e a extensão do mediador na molécula de detecção, as moléculas redox presentes na solução podem intercalar no dímero da molécula de detecção e no mediador estendido, pelas quais uma mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada.
[00185] A Figura 9 mostra a sequência esquemática de deslocamento do mediador durante a amplificação na presença de uma polimerase por deslocamento de fita a partir de uma sonda mediadora que atua como um iniciador na amplificação de DNA. O mediador e a molécula de detecção são, cada um, rotulados com um corante fluorescente, que permite um aumento na intensidade de fluorescência a um comprimento de onda a ser detectado se o mediador for hibridizado com a molécula de detecção por transferência de energia FRET. Ao usar moléculas de detecção com diferentes números de nucleotídeos, uma análise de curva de fusão pode ser usada para diferenciar entre diferentes moléculas alvo.
[00186] A Figura 10 mostra o mecanismo de uma liberação de mediador e subsequente geração de sinal durante uma LAMP. A região de
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52/82 ligação de mediador na molécula de detecção e na sonda mediadora é abreviada com Mede (corresponde à sequência complementar ao mediador). Nesta versão da presente invenção, a sonda mediadora serve simultaneamente como iniciador de enovelamento; consequentemente, a sonda mediadora consiste em um iniciador de enovelamento estendido por Mede (Enovelamento_Medc) e um mediador hibridizado a ele (Med). Após as etapas iniciais de LAMP, um produto de amplificação do tipo haltere é formado, ao qual a sonda mediadora pode se ligar. Ao estender a sonda mediadora e reconectar um iniciador a ela, o mediador é deslocado pela polimerase por deslocamento de fita. O mediador liberado pode então gerar um sinal detectável que interage com uma molécula de detecção.
[00187] A Figura 11 mostra um gráfico de fluorescência padronizada de uma LAMP para a detecção de DNA de E. coli (W3110, genoma completo) usando sondas mediadoras e moléculas de detecção de acordo com a invenção. O gráfico mostra uma correlação entre a quantidade de DNA e o curso da fluorescência. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O número de cópias de DNA é expressado em cópias por reação (por exemplo, 10 cp corresponde a 10 cópias por reação com um volume total de 10 μΐ). O controle negativo contém 0 cópias por reação (NTC, sem controle molde).
[00188] A Figura 12 mostra o gráfico de fluorescência padronizado de uma RT-LAMP para a detecção de RNA do HIV-1 usando sondas mediadoras e moléculas de detecção de acordo com a invenção. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O número de cópias de RNA é dado em cópias por reação (3.400 cp corresponde a 3.400 cópias por reação com um volume total de 10 μΐ). O controle negativo contém 0 cópias por reação (NTC, sem controle molde).
[00189] A Figura 13 mostra um projeto de uma sonda mediadora que não serve como um ponto de partida para amplificação.
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53/82 [00190] A Figura 14 mostra uma detecção de acordo com o método da invenção para a detecção de moléculas alvo por aptâmeros específicos de molécula alvo.
[00191] A Figura 15 mostra uma detecção de acordo com o método da invenção para a detecção de moléculas alvo por sondas mediadoras que contêm adicionalmente a região do aptâmero e a região ligante de iniciador. Na ausência da molécula alvo, a sonda mediadora é amplificada, enquanto na presença da molécula alvo, a extensão do iniciador é bloqueada pela molécula alvo ligada. Consequentemente, nenhum sinal detectável é desencadeado na presença da molécula alvo e um sinal detectável é gerado na ausência da molécula alvo.
[00192] A Figura 16 mostra um método de detecção de acordo com a invenção para a detecção de moléculas alvo por sondas mediadoras, que atuam como iniciadores e permitem uma reação de detecção exponencial. Na ausência da molécula alvo, o aptâmero linear é amplificado e o mediador é liberado durante a amplificação, enquanto na presença da molécula alvo, a extensão do iniciador é bloqueada pela molécula alvo ligada. Consequentemente, nenhum sinal detectável é desencadeado na presença da molécula alvo e um sinal detectável é gerado na ausência da molécula alvo.
[00193] A Figura 17 mostra um projeto do método de detecção de acordo com a invenção, no qual as moléculas de detecção são imobilizadas em um vaso de reação adequado em uma fase sólida.
[00194] A Figura 18 mostra uma versão da detecção de acordo com o método da invenção, na qual as moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Através da hibridização e da extensão do mediador na molécula de detecção, a molécula redox ligada à molécula de detecção é espacialmente separada da superfície do eletrodo, gerando uma mudança no sinal. Os esquemas a e b esquematizam possíveis sítios de ligação do mediador em duas diferentes regiões da molécula de detecção.
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54/82 [00195] A Figura 19 mostra uma molécula de detecção consistindo em dois oligonucleotídeos hibridizados rotulados. O aceitador de fluorescência e o doador de fluorescência são ligados nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente; além disso, um dos dois oligonucleotídeos possui(em) uma região de ligação de mediador.
[00196] A Figura 20 mostra uma possibilidade de detecção eletroquímica em uma fase sólida. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Após a hibridização do mediador na molécula de detecção, as moléculas redox presentes na solução podem intercalar-se no dímero da molécula de detecção e mediador, pela qual uma mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada.
[00197] A Figura 21 mostra a detecção eletroquímica em uma fase sólida usando um mediador marcado. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Ao hibridizar o mediador rotulado com a molécula de detecção, uma mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada.
[00198] A Figura 22 mostra a detecção eletroquímica em uma fase sólida. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Por hibridização e extensão do mediador rotulado na molécula de detecção, uma mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada.
[00199] A Figura 23 mostra uma possibilidade de detecção eletroquímica em uma fase sólida. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Por hibridização e extensão do mediador rotulado na molécula de detecção, uma mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada. O transporte de carga elétrica entre a molécula redox e o eletrodo é causado pela formação de uma fita dupla.
[00200] A Figura 24 mostra a detecção eletroquímica em uma fase sólida. As moléculas de detecção são imobilizadas em um eletrodo. Por hibridização e extensão do mediador na molécula de detecção rotulada, uma
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55/82 mudança no sinal eletroquímico pode ser detectada. O transporte de carga elétrica entre a molécula redox e o eletrodo é causado pela formação de uma fita dupla.
[00201] Figura 25: A molécula de detecção consiste em vários oligonucleotídeos, nos quais um oligonucleotídeo não rotulado é hibridizado com oligonucleotídeos rotulados com fluorescência mais curtos. Aceitadores de fluorescência e/ou doadores de fluorescência são ligados aos oligonucleotídeos mais curtos. Estes estão arranjados de maneira que o fluoróforo e o extintor estejam espacialmente próximos um do outro. O mediador liberado tem uma maior energia de ligação à molécula de detecção não rotulada e assim desloca, por exemplo, o oligonucleotídeo mais curto rotulado com o extintor.
[00202] A Figura 26 mostra um gráfico de fluorescência padronizada de uma LAMP para a detecção de Haemophilus ducreyi (H. ducreyi) usando sondas mediadoras e moléculas de detecção de acordo com a invenção. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O controle negativo (NTC, sem controle molde) não contêm DNA de H. ducreyi, o controle positivo foi misturado com DNA de H. ducreyi purificado. [00203] A Figura 27 mostra um gráfico de fluorescência padronizada de uma LAMP para a detecção de Treponema pallidum (Γ pallidum) usando uma sonda mediadora de acordo com as invenções e moléculas de detecção. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O controle negativo (NTC, sem controle de padrão) não contém DNA de T. pallidum, o controle positivo foi misturado com DNA de T. pallidum purificado.
[00204] A Figura 28 mostra um gráfico de fluorescência padronizado de uma RT-LAMP para a detecção de HTLV-1 usando sonda mediadora de acordo com as invenções e moléculas de detecção. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O controle
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56/82 negativo (NTC, sem controle molde) não contém RNA de HTLV-1, o controle positivo foi misturado com RNA de HTLV-1 purificado.
[00205] A Figura 29 mostra um gráfico de fluorescência padronizada de uma RT-LAMP para a detecção de TMV usando uma sonda mediadora de acordo com as invenções e moléculas de detecção. As intensidades de fluorescência foram padronizadas para o valor inicial em 0 min. O controle negativo (NTC, sem controle molde) não contém RNA de TMV, o controle positivo foi misturado com RNA de TMV purificado.
[00206] A Figura 30 mostra um gráfico de fluorescência padronizado de uma PCDR para a detecção de 100 pg de DNA de G3PDH de camundongos usando uma sonda mediadora de acordo com as invenções e moléculas de detecção. As intensidades de fluorescência foram normalizadas para o valor inicial em 0 ciclos.
[00207] A Figura 31 mostra um mediador ligado a uma nanopartícula magnética ou magnetizável. Após liberação na presença da molécula alvo, o mediador pode ligar-se à molécula de detecção, detectando uma mudança na propriedade magnética na superfície da fase sólida.
[00208] A Figura 32 mostra uma demonstração funcional da detecção eletroquímica de mediadores eletroativamente rotulados. No controle positivo (60.000 cópias do DNA de E. coli), os mediadores são deslocados durante a reação de LAMP e então podem hibridizar com a molécula de detecção. Por conseguinte, o mediador marcado (aqui, azul de metileno) acumula-se na superfície do eletrodo, o que leva à formação de um pico característico a -0,39 V na análise eletroquímica (aqui voltametria de onda quadrada). Em contraste, a ausência de um pico no NTC indica que não houve liberação significativa de mediadores.
Exemplos de projeto:
[00209] Nas explicações seguintes, vários mediadores podem se ligar a um iniciador especial ou primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora de
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57/82 acordo com a invenção e/ou vários iniciadores diferentes e/ou sondas mediadoras podem ser providos com mediadores para aumentar a concentração do mediador na amostra.
Exemplo 1: Sonda mediadora [00210] Exemplos de projetos de invenção incluem uma sonda mediadora para detectar pelo menos uma molécula alvo, em que a sonda mediadora compreende pelo menos dois oligonucleotídeos. Um primeiro oligonucleotídeo tem uma região de ligação de mediador e uma região de sonda. A região de ligação de mediador é localizada na terminação 5’ e a região de sonda na terminação 3’ do oligonucleotídeo. Um segundo ou vários oligonucleotídeo(s) adicional(ais), o mediador ou mediadores, são química, biológica e/ou fisicamente ligados à região de ligação de mediador do primeiro oligonucleotídeo. Um mediador pode ser composto de DNA, RNA, PNA ou RNA modificado, tal como LNA. A região de sonda do primeiro oligonucleotídeo tem uma afinidade para a molécula alvo e/ou molde e a região de ligação de mediador tem uma afinidade para o mediador ou mediadores (Figura 1). O mediador ou os mediadores te(ê)m afinidade por pelo menos uma molécula de detecção.
Exemplo 2: Procedimento de deslocamento do mediador [00211] Após ligação da região de sonda a uma molécula alvo e/ou molécula molde, o mediador é deslocado pela região de ligação de mediador, por exemplo, usando uma polimerase por deslocamento de fita. Este processo pode ocorrer durante um processo de amplificação da molécula alvo e/ou molécula molde. Nos exemplos da invenção, a região da sonda da sonda mediadora pode atuar como um iniciador na amplificação de DNA. Após ligar a região de sonda a uma molécula alvo e/ou molécula molde, a sonda mediadora é estendida. Um segundo iniciador pode então ser ligado à sonda mediadora estendida e estendido. Durante o processo de amplificação, o mediador ou os mediadores é(são) liberado(s) da região de ligação de
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58/82 mediador e desencadeia(m) um sinal detectável através da interação com uma ou mais moléculas de detecção (Figura 2).
Exemplo 3: Molécula de detecção com 6 regiões [00212] A detecção do mediador liberado e não marcado ocorre com a ajuda de uma reação de detecção. O mecanismo de reação descrito abaixo pode ser realizado em paralelo com a amplificação da molécula alvo e/ou molécula molde descrita acima.
[00213] Em uma versão preferida da invenção, uma molécula de detecção pode consistir em um oligonucleotídeo dividido em seis regiões (Figura 3). A região 1 compreende a terminação 5’ da molécula de detecção consistindo em uma porção de sequência e um aceitador de fluorescência Q. A região 3 é uma sequência complementar reversa da Região 1 e é separada da mesma pela Região 2. A região 4 separa a Região 3 e a Região 5, que pode interagir especificamente com uma molécula mediadora. A região 6 compreende a região da sequência 3’-terminal, que pode ter uma modificação química e, assim, permite a imobilização direcional do oligonucleotídeo. Um doador de fluorescência F é associado de uma maneira adequada a uma região da Região 2 a Região 6, por exemplo, a Região 4. As Região 1 e Região 3 da molécula de detecção formam uma estrutura secundária definida (estrutura tipo grampo de cabelo) sob condições de reação, nas quais a terminação 5’ hibridiza com uma seção de sequência interna (Figura 3 B). Após a formação desta estrutura, o doador de fluorescência F e o aceitador de fluorescência Q interagem entre si e o sinal de fluorescência de F é suprimido (FRET). Como uma alternativa a uma modificação do doador de fluorescência e do aceitador de fluorescência da molécula de detecção na Região 1 e Região 4, outras modificações de geração de sinal podem ser usadas, tais como moléculas redox, pares de transferência de energia por ressonância de quimiluminescência (CRET) e moléculas intercalantes.
Exemplo 4: A extensão do mediador leva a uma mudança de sinal da
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59/82 molécula de detecção [00214] Após liberação, o mediador está difusamente presente na solução reacional e pode interagir com a sequência de ligação a mediador (Região 5) da molécula de detecção (Figura 4 i) + ii)). A molécula de detecção pode ser imobilizada em uma fase sólida ou presente em solução. O mediador é alongado por uma molécula auxiliar adequada, por exemplo, a polimerase por deslocamento de fita, pelo qual a Região 1 da molécula de detecção é deslocada pela polimerase. A distância entre o aceitador de fluorescência Q e o doador de fluorescência F é aumentada pelo deslocamento da terminação 5’ e o sinal de fluorescência anteriormente suprimido do doador de fluorescência F é restaurado (Figura 4 iii) + iv)). Altemativamente, a distância de uma molécula redox na terminação 5’ da molécula de detecção muda em relação à terminação 3 ’ da molécula de detecção ou a eficiência de mudanças de CRET ou a intercalação de moléculas muda devido à formação do duplex de mediador ou o seu produto de extensão e a molécula de detecção. Se o deslocamento descrito impedir a interação da Região 1 e da Região 3, a formação da estrutura secundária será cancelada. Neste caso, o mediador pode ser estendido complementarmente pela molécula auxiliarmente descrita sob certas condições até a terminação 5’ recém formada da molécula de detecção (Figura 4 v) + vi)). Esta extensão completa provê o mediador estendido com um segmento de sequência complementar à Região 1, 2 e Região 3 da molécula de detecção.
[00215] A reação de detecção deve ser projetada de maneira que, em contraste com o mediador, a sonda mediadora inicial não desencadeie uma reação de geração de sinal e, portanto, nenhum resultado falso positivo seja produzido. Inicialmente, o mediador está ligado ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora, por exemplo, por ligações de hidrogênio. De modo a prevenir um sinal que gera reação ligando o mediador à molécula de detecção, o equilíbrio entre a ligação do mediador ao primeiro oligonucleotídeo da
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60/82 sonda mediadora e a ligação do mediador à molécula de detecção pode ser ajustado por conseguinte.
[00216] O evento de interação do mediador com a molécula de detecção produz um sinal local detectável. Se um número suficiente de moléculas de detecção for ativado pela extensão do mediador com o deslocamento resultante da terminação 5’, o sinal é amplificado e pode ser detectado usando dispositivos de detecção adequados. Isso permite a detecção na presença da mistura reacional e não requer etapas de processamento. Exemplo 5: Análises de Multiplexação [00217] Análises de multiplexação requerem a detecção de vários analitos diferentes em uma mistura reacional. De método a aumentar o grau de multiplexação da reação de acordo com a invenção, o uso de n diferentes sondas mediadoras é planejado. Cada molécula alvo a ser detectada pode ser atribuída a uma sonda mediadora cuja região de sonda interage especificamente com a molécula alvo ou molécula molde. A região de ligação de mediador e o mediador da sonda mediadora respectiva não são afins ou complementares à molécula alvo ou molde. No entanto, o mediador representa um parceiro de interação específico para uma molécula de detecção definida. Assim, cada molécula alvo é atribuída indiretamente uma molécula de detecção, que é atribuída pela sonda mediadora. A detecção de diferentes moléculas alvo requer diferentes moléculas de detecção.
[00218] Uma vez que a região de sonda e a região de ligação de mediador da sonda mediadora podem ser livremente combinadas independentemente uma da outra, uma molécula de detecção também pode ser correlacionada com outra molécula alvo ligando e sintetizando a região de ligação de mediador coincidente e o mediador com qualquer região de sonda. O método de acordo com a invenção permite, portanto, que a molécula alvo seja projetada independentemente da molécula de detecção. Assim, com um conjunto padronizado de moléculas de detecção, diferentes moléculas alvo
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61/82 podem ser detectadas em uma amostra, pela qual a reação pode ser adaptada de forma rentável à respectiva molécula alvo, adaptando a sonda mediadora e usando moléculas auxiliares adequadas (por exemplo, iniciadores ou aptâmeros).
[00219] Exemplos de execução de invenção podem incluir múltiplos mediadores e/ou múltiplas sondas mediadoras e/ou múltiplas moléculas de detecção por molécula alvo. As seguintes constelações são possíveis.
[00220] A. Vários mediadores, que se ligam à mesma sonda mediadora, podem se ligar a várias moléculas de detecção. Ao combinar astutamente vários mediadores de uma sonda mediadora com diferentes moléculas de detecção, o grau de multiplexação de um ensaio pode ser grandemente aumentado. O pré-requisito é que as moléculas de detecção gerem sinais de fluorescência com diferentes comprimentos de onda. Usando n moléculas de detecção e dois mediadores por sonda mediadora e molécula alvo, “n mais de 2” + n moléculas alvo diferentes podem ser detectadas. O coeficiente binomial pode ser usado para calcular o número de moléculas alvo detectáveis para um dado número de diferentes moléculas de detecção. Como uma molécula alvo pode ser identificada não apenas gerando dois sinais de fluorescência com dois comprimentos de onda diferentes, mas também gerando um único sinal de fluorescência, o valor do coeficiente binomial deve ser aumentado por n de modo a calcular o número máximo de moléculas alvo detectáveis. Com quatro diferentes moléculas de detecção, 10 moléculas alvo diferentes podem ser detectadas, enquanto apenas cinco moléculas de detecção permitem a diferenciação de 15 moléculas alvo (Figura 5 A). Similarmente, várias sondas mediadoras podem ser usadas por molécula alvo, pela qual uma sonda mediadora pode conter apenas um mediador.
[00221] B. Uma ou mais sondas mediadoras que se ligam ao mesmo alvo ou molécula molde pode(m) ser usada(s) e o mediador ou os mediadores de tais sondas mediadoras pode(m) ligar-se a uma ou mais moléculas de
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62/82 detecção simultaneamente. Combinando as regiões ligantes mediadoras nas moléculas de detecção astutamente, é possível, por exemplo, distinguir entre três moléculas alvo usando apenas duas moléculas de detecção. Usando n moléculas de detecção e pelo menos dois mediadores por molécula de detecção, “2n - 1” diferentes moléculas alvo podem ser detectadas. Várias sondas mediadoras diferentes podem se ligar à mesma molécula alvo. No exemplo acima, em que três moléculas alvo podem ser distinguidas usando apenas duas moléculas de detecção, as moléculas de detecção podem conter, cada uma, duas regiões de ligação de mediador diferentes. Dois mediadores, que estão ligados a duas sequências alvo diferentes, ligam-se a apenas uma molécula de detecção específica. Um sinal específico é gerado por molécula alvo. O terceiro mediador, que está ligado à terceira sequência alvo, liga-se a ambas as moléculas de detecção e, assim, desencadeia dois sinais diferentes. Para garantir que a probabilidade de que dois mediadores liberados se liguem à mesma molécula de detecção simultaneamente seja alta o suficiente, a concentração de mediadores liberados deve estar na ordem da concentração de moléculas de detecção (Figura 5 B). Além disso, moléculas de detecção que podem ligar mais de dois mediadores diferentes também podem ser usadas.
[00222] C. Várias sondas mediadoras, cada uma ligando-se seletivamente a uma molécula alvo comum ou molécula molde, pode ser usada, pela qual o mediador ou os mediadores destas sondas mediadoras te(ê)m sequências diferentes. Vários mediadores diferentes podem se ligar a uma e à mesma molécula de detecção, pela(s) qual(ais) uma reação de detecção só pode ser desencadeada pela ligação de vários mediadores. Este método pode ser usado para aumentar a especificidade da reação de detecção. Uma possível sequência de reação é mostrada na Figura 5 C. Para garantir que a probabilidade de que dois mediadores liberados se liguem à mesma molécula de detecção simultaneamente seja alta o suficiente, a concentração
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63/82 de mediadores liberados deve estar na ordem da concentração de moléculas de detecção.
Exemplo 6: Análise da curva de fusão [00223] Em certas versões da invenção, uma análise da curva de fusão das moléculas de detecção hibridizadas com os mediadores estendidos pode ser realizada após a reação de amplificação. Isto permite um aumento adicional no grau de multiplexagem a ser alcançado usando diferentes moléculas de detecção, que, por exemplo, são rotuladas com diferentes moléculas de sinalização.
Exemplo 7: Molécula de detecção na forma de uma baliza molecular [00224] Em uma forma possível da invenção, a molécula de detecção tem a estrutura de uma baliza molecular na qual a região de ligação de mediador é localizada no enovelamento (Figura 6). Através da ligação do mediador à molécula de detecção descrita e subsequente extensão, a baliza molecular é aberta e as extremidades 5’ e 3’ rotuladas separadas, resultando em um aumento de sinal detectável. Uma vantagem desta estrutura sobre a estrutura considerada até agora (Figura 3) tem menor custo de síntese para marcações fluorescentes terminais.
Exemplo 8: Molécula de detecção que consiste em dois oligonucleotídeos rotulados [00225] Em outra versão da invenção, a molécula de detecção consiste em vários oligonucleotídeos rotulados com fluorescência. Dois oligonucleotídeos rotulados com extintor e fluoróforo podem ser hibridizados um com o outro e separados quando interagem com um mediador, assim uma mudança de sinal pode ser detectada. A molécula de detecção descrita pode ser estruturada como mostrado na Figura 19.
Exemplo 9: Molécula de detecção de DNA de fita simples com sondas hibridizadas [00226] Neste projeto, a molécula de detecção pode consistir em DNA
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64/82 de fita simples ao qual várias sondas rotuladas com doador de fluorescência e aceitador de fluorescência são hibridizadas. Após liberação do mediador, o mediador liga-se à molécula de detecção e é prolongado, pelo qual as sondas rotuladas são liberadas e o doador de fluorescência e o aceitador de fluorescência são espacialmente separados uns dos outros, conduzindo a um aumento da fluorescência. A hibridização múltipla da molécula de detecção com várias sondas rotuladas conduz a um efeito de multiplicação da geração de sinal. A molécula de detecção pode ser linear ou circular, pode ser homogênea em solução ou imobilizada em uma fase sólida e pode ter vários sítios de ligação a mediador. Se a molécula de detecção for circular e vários sítios de ligação a mediador forem inseridos, uma reação de detecção rápida pode ocorrer em uma boa faixa dinâmica ligando simultaneamente vários mediadores em diferentes sítios. A estrutura circular da molécula de detecção permite um aumento adicional na sensibilidade a ser alcançado, uma vez que a hibridização e a extensão de um mediador em uma molécula de detecção libera todas as sondas rotuladas ligadas, independentemente do sítio ao qual o mediador se liga. Sondas com diferentes doadores de fluorescência e aceitadores de fluorescência, que emitem em diferentes comprimentos de onda, podem ser ligados a uma molécula de detecção. Combinando diferentes corantes fluorescentes, que também podem ser usados em diferentes concentrações (o que é determinado pelo número de sondas rotuladas por molécula de detecção), o grau de multiplexação pode ser aumentado. Certas razões de concentração podem ser atribuídas a uma molécula de detecção definida. As moléculas de ligação às quais as sondas rotuladas podem se ligar após a liberação (Figura 7) podem ser usadas para impedir que as sondas liberadas rotuladas com doador de fluorescência ou aceitador de fluorescência se religuem novamente à molécula de detecção a longo prazo. O projeto descrito é, de preferência, usado com métodos de amplificação isotérmica, garantindo assim que as sondas rotuladas se liguem à molécula de detecção na
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65/82 ausência da molécula alvo e não se dissociem da molécula de detecção devido à alta energia térmica gerada, por exemplo, por PCR.
[00227] Em um projeto preferido, as sondas rotuladas com doador de fluorescência e aceitador de fluorescência não são separadas da molécula de detecção por extensão do mediador, mas são deslocadas ajustando o equilíbrio na presença de mediadores liberados. O mediador liberado tem uma energia de ligação maior que a molécula de detecção não rotulada do que a sonda rotulada e assim desloca, por exemplo, a sonda mais curta rotulada com o aceitador de fluorescência (Figura 25).
Exemplo 10: Detecção através de microscopia por fluorescência por reflexão total interna (TIRF) ou espectroscopia por ressonância de plasmon de superfície [00228] Semelhante à detecção eletroquímica, a detecção por microscopia de fluorescência por reflexão total interna (TIRF) pode ser realizada em determinados projetos. Neste método, a molécula de detecção é imobilizada em um suporte de teste de vidro ou polímero acima do iluminador de TIRF. O campo evanescente formado pela reflexão total penetra no volume da amostra e ativa as moléculas de fluorescência, que estão localizadas na molécula de detecção e/ou no mediador e/ou nas sondas ou são intercaladas nos dímeros, pelos quais uma mudança do sinal de fluorescência pode ser detectada. Em outras versões, a ligação do mediador à molécula de detecção é detectada por espectroscopia por ressonância de plasmon de superfície. Pela liberação e subsequente ligação do mediador à molécula de detecção imobilizada em uma superfície, uma mudança no índice de refração da amostra pode ser detectada. As moléculas de detecção podem ser imobilizadas diretamente na superfície metálica na qual os plasmons são ativados ou, por exemplo, em/sobre uma membrana localizada diretamente sobre a superfície de metal.
Exemplo 11: Verificação por medições gravimétricas
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66/82 [00229] Em versões preferidas da invenção, a liberação e a ligação do mediador a uma molécula de detecção podem ser demonstradas por medições gravimétricas. Por exemplo, a molécula de detecção é imobilizada em uma superfície de suporte cujo peso pode ser determinado com o quartzo oscilante. Mudanças no peso devido à ligação do mediador à molécula de detecção podem assim ser detectadas.
Exemplo 12: Prova de amplificação por círculo rolante [00230] Em versões preferidas da invenção, o mediador liberado na presença de enzimas de amplificação apropriadas pode desencadear a amplificação por círculo rolante e assim a molécula alvo pode ser identificada pela detecção dos produtos de amplificação por círculo rolante. Os produtos de amplificação de Amplificação por Círculo Rolante podem, por exemplo, ser detectados especificamente em sequência através de sondas ou através de mudanças do valor de pH, eletroforese em gel ou colorimetria.
Exemplo 13: Detecção via sequenciamento [00231] Em versões preferidas da invenção, o mediador liberado pode ser analisado por sequenciamento e assim identificado. Um exemplo de sequenciamento de próxima geração é o sequenciamento Nanopore, no qual as potenciais mudanças em uma membrana com poros são medidas como moléculas, tais como ácidos nucleicos, fluindo através destes, e a sequência do ácido nucleico pode ser determinada. O sequenciamento pode ser usado para detectar a liberação simultânea de qualquer número de mediadores, cada um dos quais sinaliza a presença de uma molécula alvo específica. O grau de multiplexação aumenta consideravelmente em comparação com os métodos convencionais, tais como medições de fluorescência. O método de sequenciamento não se limita ao sequenciamento Nanopore porque qualquer método de sequenciamento pode ser selecionado para a detecção de mediadores liberados.
Exemplo 14: Uso de um mediador selecionado
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67/82 [00232] Em versões preferidas da invenção, o mediador ligado à sonda mediadora pode ser marcado com um aceitador de fluorescência doador/fluorescência, que emite a um certo comprimento de onda X. Após o deslocamento da sonda mediadora, o mediador pode se ligar a uma molécula de detecção rotulada com um aceitador de fluorescência/doador de fluorescência, que é emitido em um segundo comprimento de onda λ2, que é diferente de λμ A transferência de energia do doador de fluorescência para o aceitador de fluorescência através do mecanismo de FRET leva a um aumento detectável na intensidade de radiação do aceitador de fluorescência, o que permite que a emissão de λ2 seja detectada. Em versões posteriores, moléculas doadoras quimioluminescentes ou bioluminescentes podem ser usadas. Aceitadores de fluorescência, que não são emissivos, também podem ser usados em projetos. Usando moléculas de detecção com diferentes números de nucleotídeos, diferentes moléculas alvo podem ser distinguidas simultaneamente em uma amostra por meio de uma análise da curva de fusão. Marcando o mediador, o caráter universal do método de detecção descrito não é perdido, uma vez que o mediador é uma molécula universal independente da sequência alvo. Em projetos adicionais, várias sondas ou iniciadores por molécula alvo podem ser usada(o)s a(o)s quais os mediadores rotulados com corantes fluorescentes são ligados, pelos quais as sequências dos mediadores e os comprimentos de onda de emissão dos corantes fluorescentes podem diferir (Figura 9).
Exemplo 15: Uso de um método de amplificação isotérmica [00233] Neste exemplo, o método de detecção de acordo com a invenção é usado para a detecção de DNA em um método de amplificação isotérmica, por exemplo, a LAMP. O mecanismo de uma liberação de mediador durante uma LAMP é detalhado na Figura 10. As etapas iniciais de amplificação de uma LAMP levam a uma estrutura tipo haltere de um produto de amplificação intermediária. A sonda mediadora, que atua como iniciador
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68/82 neste exemplo, pode ligar-se a este produto de amplificação intermediária e ser estendida em uma etapa seguinte. Ao deslocar o produto de amplificação intermediária, outro iniciador pode se ligar à sonda mediadora estendida e ser estendido. Durante este processo, o mediador é deslocado pela polimerase por deslocamento de fita. O mediador liberado pode agora se ligar a uma molécula de detecção com uma estrutura tipo grampo de cabelo, e também pode ser estendido. Durante a extensão do mediador, a extremidade 5’ da estrutura tipo grampo de cabelo fechada da molécula de detecção é deslocada da região complementar, gerando um sinal de fluorescência.
[00234] Colocar a amostra e os reagentes em um vaso de reação adequado e incubar a mistura (entre 10 min e 60 min a cerca de 62°C). Durante este processo, a fluorescência é detectada no vaso de reação. A seguir, a execução descrita usando o exemplo de uma LAMP é descrita em detalhes:
[00235] Para detecção de LAMP em tempo real de DNA de E. coli (W3110, genoma completo), os iniciadores listados na Tabela 1 foram usados. Os iniciadores de LAMP foram retirados (Tanner et al. 2012) e parcialmente modificados. A sonda mediadora foi combinada com o iniciador de EnovelamentoF adicionando uma região de ligação de mediador na extremidade 5’ do iniciador, que pode hibridizar com um mediador. Mediador, EnovelamentoF com região de ligação de mediador e a molécula de detecção foram criados manualmente usando VisualOMP (DNA Software, EUA). Os oligonucleotídeos sintéticos da Tabela 1 foram sintetizados por Biomers (biomers.net, Ulm, Alemanha).
Tabela 1: Sequências de iniciador, mediador e molécula de detecção para uma LAMP em tempo real para a detecção de DNA de E. coli.
iriiiiiiiiiiiiiiikkj CTGCCCCGACGACGATAGGGCTTAATTAATCGTGGTGGTGGTGGTGTCTACGG
CCAGTGCGACCTGCTGGGGGTGTGTATTGTTCGCCGCCAGTAC
13 GATCACCGATTTCACCAACC
B3 CTTTTGAGATCAGCAACGTCAG
EnovelamentoF’ <FONT COLOR=#FFFFOO>-==- SYNCrBÇÈÂÈÂ
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69/82
EnovelamentoB TGAGTTAACCCACCTGACG
mediador TCCGCAGCAAGTGGGGGGGCTCTACGACC
EnovelamentoE com sequência de GGTCGTAGAGAGCCCACTTGCTGGCGGATGCGCCATGTCCCGCT
Molécula de deteccão BHQ-2-GACCGGCCCCAAGACGCGCCGGGT(dC-Cy5)TGTTGGTCGT- AGAGCCCAGAACGA
[00236] A reação de LAMP foi realizada com DNA polimerase Bst 2.0 WarmStart em tampão de amplificação isotérmica lx (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha). Tampão de Amplificação Isotérmica lx contém TrisHC1 20 mM, (NH4)2SO4 10 mM, KC1 50 mM, MgSO4 2 mM e Tween® 20 a 0,1% (pH 8,8 a 25°C). Além disso, MgSO4 (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha), concentração final 8,0 mM e dNTP Mix (Qiagen, Hilden, Alemanha), concentração final de 1,4 mM, foram adicionados ao tampão. A reação de LAMP consistiu em FIP 1,6 μΜ e BIP, F3 e B3 0,2μΜ, EnovelamentoB 0,8 μΜ, EnovelamentoF 0,6 μΜ, EnovelamentoF 0,2 μΜ com região de ligação de mediador, Mediador 0,1 μΜ, molécula de detecção 0,05 μΜ, 320 U/ml Bst 2,0 DNA Polimerase WarmStart, Tampão de Amplificação Isotérmica lx e 1 g/1 de BS A. A reação foi realizada em um gene de rotor 6000 (Corbett, Mortlake, Austrália, agora Qiagen, Hilden, Alemanha) a 62°C em triplicata. Os dados de fluorescência foram normalizados para o valor inicial em 0 min (Figura 11).
[00237] O método de detecção também foi usado em uma LAMP de Haemophilus ducreyi (H. ducreyi) e Treponema pallidum (T. pallidum). As condições de desempenho e reação foram idênticas a LAMP de E. coli descrito acima, mas com iniciadores específicos de sequência para H. ducreyi e T. pallidum. Os dados de fluorescência foram normalizados para o valor inicial em 0 min (Figuras 26 e 27).
Exemplo 16: Procedimento de acordo com a invenção usando uma RT-LAMP [00238] Em outros exemplos, a detecção de acordo com o método da invenção pode ser usada para detectar RNA, pelo qual o RNA é transcrito em cDNA usando transcrição reversa (RT) ou outro sistema enzimático adequado
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70/82 e o cDNA é então amplificado. A seguir, o exemplo de execução usando uma RT-LAMP é descrito em detalhes:
[00239] Os iniciadores listados na Tabela 2 foram usados para uma RT-LAMP para a detecção do RNA do HIV-1. Os iniciadores de RT-LAMP foram tirados de (Curtis et al. 2008) e parcialmente modificados. A sonda mediadora foi combinada com o iniciador de EnovelamentoF adicionando uma região de ligação de mediador na extremidade 5’ do iniciador, que pode hibridizar com um mediador. O mediador, EnovelamentoF com a região de ligação de mediador e a molécula de detecção foram criados manualmente usando VisualOMP. O Mediador de oligonucleotídeos sintéticos, EnovelamentoF com a sequência de ligação a mediador e a molécula de detecção foram sintetizados por Biomers (biomers.net, Ulm, Alemanha) e os iniciadores FIP, BIP, F3, B3, EnovelamentoF e EnovelamentoB foram sintetizados por Ella Biotech (Martinsried, Alemanha). O RNA de molde (HIV, VR-3245SD) foi sintetizado por ATCC, LGC Standards GmbH (Wesel, Alemanha).
Tabela 2: Iniciador, mediador e Sequências de moléculas de detecção para uma RT-LAMP em tempo real para a detecção de RNA de HIV-1.
IIP CAGCTTCCTCCTCATTGATGGTTTTTTTTTTTTTTAACACCATGCTAAACA CACAGT
TGTTGCACCAGGCCAGATAATTTTTGTACTGGTAGTTCCTGCTATTTG
1-3 ATTATCAGAAGGAGGAGACCACC
B3 CATCCTATTTGTTCCTGAAGG
Enovelamentol·’ TTTAACATTTGCATGGCTGCTTGAT
EnovelamentoB GAGATCCAAGGGGAAGTGA
Mediador CCATGCCTCAGGAGGAGCTCAGTTCGGTCAGTG
Enovelamentol-- com sequência de ligação a mediador CACTGACCGAACTGAGCTCCTGAGGGCATGGTTTAACATTTTTGCATGGC TGCTTGAT
Molécula de detecção BMN-Q-535-CACCGGGCCAAGACGCGCCGGGG(dT-Atto- 647N)GTGTTCACT-GACCGAACTGGGAGCA
[00240] A reação de RT-LAMP foi realizada com DNA Polimerase Bst
2.0 WarmStart (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha) e Transcriptase
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Reversa do Transcritor (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) em Tampão de Amplificação Isotérmica lx (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha). Tampão de Amplificação Isotérmica Ix contém Tris-HCl 20 mM, (NH4)2SO4 10 mM, KC1 50 mM, MgSO4 2 mM e Tween® 20 a 0,1% (pH 8,8 a 25°C). Além disso, MgSO4 (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha), concentração final 8,0 mM e dNTP Mix (Qiagen, Hilden, Alemanha), concentração final de 1,4 mM, foram adicionados ao tampão. A reação de RT-LAMP consistiu em 1,6 μΜ de FIP e BIP, F3 e B3 0,2 μΜ, EnovelamentoB 0,8 pM, EnovelamentoF 0,6 pM, EnovelamentoF 0,2 pM com região de ligação de mediador, Mediador 0,1 pM, molécula de detecção 0,05pM, 320 U/ml de DNA Polimerase Bst de WarmStart 2,0 pM, 400 U/ml de Transcriptase Reversa do Transcritor e Tampão de Amplificação lx. A reação foi realizada em um gene de rotor 6000 (Corbett, Mortlake, Austrália, agora Qiagen, Hilden, Alemanha) a 63°C em triplicatas. O controle positivo continha 3.400 cópias/reação do RNA do HIV-1 sintético, o controle negativo não continha RNA do HIV-1. Os dados de fluorescência foram normalizados para o valor inicial em 0 min (Figura 12).
[00241] O método de detecção também foi aplicado com sucesso em uma RT-LAMP do vírus linfotrópico T humano (HTLV-1) e RNA do vírus do mosaico do tabaco (TMV). As condições de desempenho e reação foram idênticas às já descritas RT-LAMP de HIV-1, mas com iniciadores específicos de sequência para HTLV-1 e TMV. Os dados de fluorescência foram normalizados para o valor inicial em 0 min (Figuras 28 e 29).
Exemplo 17: Procedimento de acordo com a invenção usando reações de amplificação não isotérmica [00242] Em outros exemplos da invenção, o método de detecção de acordo com a invenção pode ser usado para detectar DNA em uma reação de amplificação não isotérmica, tal como PCR ou PCDR. Isso envolve a modificação de um ou mais iniciadores de maneira que eles representem uma
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Ί2ΙΖ1 sonda mediadora. Em um reator adequado, a amostra e os reagentes requeridos são colocados e a mistura é incubada. Durante este processo, a fluorescência é detectada no vaso de reação. A seguir, o exemplo de execução é descrito em detalhes usando uma PCDR:
[00243] Os iniciadores listados na Tabela 3 foram usados para detecção de PCDR em tempo real de DNA de camundongo. Os iniciadores de PCDR para a amplificação do DNA de G3PDH foram tirados (Ignatov et al. 2014) e parcialmente modificados. A sonda mediadora foi criada usando o iniciador F3 ligando uma região de ligação de mediador à extremidade 5’ do iniciador, que pode hibridizar com um mediador. O mediador, F3 com a região de ligação de mediador e a molécula de detecção foram criados manualmente usando o VisualOMP. Os iniciadores bem como o mediador de oligonucleotídeos sintéticos, F3 com sequência de ligação a mediador e molécula de detecção foram sintetizados por Biomers (biomers.net, Ulm, Alemanha). A sequência de DNA de G3PDH de camundongo a ser amplificada foi tirada de (Ignatov et al. 2014) e o fragmento G3PDH foi sintetizado por Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, ΙΑ).
Tabela 3: Iniciador, mediador e sequências de moléculas de detecção para uma PCDR em tempo real para a detecção de DNA de G3PDH de camundongos.
iifiiiiiiii GTGAAGGTCGGTGTGAACGGA
1-2 TTCTGCCGATGCCCATGT
I<3 GCATCCTGCACCACCAACTG
RI GGTTTCTTACTCCTTGGAGGC
R2 CAGATCCACGACGGACACATT
iiiiiiiiiii GAGCTTCCCGTTCAGCTCTG
Mediador TAAAGCCATAGCCGTACTAGCTGCTCCAGTTCGGTCAGTG
sequência de ligação a mediador CACTGACCGAACTGGACTGGAGCAGCTAGTACGGCTATGGCTTTAGCATCCTGCACC ACCAACTG
Molécula de BMN-Q-535-CACCGGGCCAAGACGCGCCGGGG(dT-Atto- 647N)GTGTTCACTGACCGAACTGGGAGCA
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73/82 [00244] O PCDR foi realizado com DNA Polimerase SD Hotstart em tampão de DNA lx (Bioron, Ludwigshafen, Alemanha). Além disso, MgC12 (Bioron, Ludwigshafen, Alemanha), concentração final 2,75 mM e dNTPs (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha), concentração final 0,25 mM, foram adicionados ao tampão. A reação PCDR consistiu em F3 a 0,1 μΜ e F3, cada um com região de ligação de mediador, R3 0,2 μΜ, F2 0,1 pM e R2, Fl a 0,05 pM e Rl, mediador 0,05 pM, molécula de detecção 0,05 pM, 200 U/ml de DNA Polimerase SD Hotstart e tampão SD lx. A reação foi realizada em um gene de rotor 6000 (Corbett, Mortlake, Austrália, agora Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o seguinte protocolo (Ignatov et al. 2014): desnaturação inicial a 92°C por 2 min, seguido de 45 ciclos a 92°C (15 s) e 66°C (40 s). Os dados de fluorescência foram normalizados para o valor inicial em 0 ciclos (Figura 30). O controle positivo continha 100 pg de fragmento G3PDH por reação, o controle negativo não continha DNA de molde.
Exemplo 18: Sonda mediadora inventada que não age como iniciador [00245] Em exemplos adicionais, a detecção de acordo com o método da invenção pode ser usada para a detecção de DNA ou RNA com especificidade aumentada. Um iniciador não serve como uma sonda mediadora, mas uma sonda especial é usada que não serve como um ponto de partida para a amplificação. Na ausência da molécula alvo, a sonda é fechada. Logo que a molécula alvo esteja na mistura reacional, a sonda mediadora ligase à molécula alvo ou molécula molde, pela qual um iniciador pode ligar-se à extremidade 3 ’ da sonda mediadora aberta agora. Por processamento com um sistema enzimático adequado, o iniciador ligado pode ser estendido, pelo qual o mediador é deslocado pela sonda mediadora. O mediador liberado pode ser detectado com a ajuda de uma molécula de detecção específica. O processo de amplificação enzimática pode incluir, mas não está limitado a, processos isotérmicos (Figura 13).
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Exemplo 19: Uso de aptâmeros específicos de molécula alvo [00246] Em outras versões, a detecção de acordo com o método da invenção para a detecção de moléculas alvo por aptâmeros específicos de moléculas alvo pode ser aplicada. Os aptâmeros específicos de molécula alvo, a amostra a ser investigada e as moléculas de detecção são colocadas em um vaso de reação adequado. A molécula alvo a ser detectada pode ser uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, mas não está limitada a ela. Um aptâmero liga-se à molécula alvo e altera sua estrutura de modo que uma sonda mediadora e um iniciador específica(o) de aptâmero possam se ligar após a interação. Por processamento com um sistema de enzima adequado, os iniciadores ligados ao aptâmero (Figura 14: marcador branco no aptâmero) podem ser prolongados, resultando na amplificação da sequência do aptâmero fora da região de ligação à proteína. Ligando uma sonda mediadora a um produto de amplificação linear, a sonda é aberta e iniciadores adicionais são usados para deslocar o mediador da sonda mediadora. O mediador liberado pode ser detectado usando uma molécula de detecção específica ou um método de detecção adequado. O processo de amplificação enzimática pode incluir, mas não está limitado a, processos isotérmicos (Figura 14).
Exemplo 20: Sondas mediadoras modificadas, que possuem uma região de aptâmero, uma região de ligação de mediador e uma região de ligação a iniciador.
[00247] Nos projetos preferidos, o método de detecção engenhoso pode ser usado para detectar moléculas alvo usando sondas mediadoras modificadas, que possuem uma região de aptâmero, uma região de ligação de mediador e uma região de ligação a iniciador. A molécula alvo a ser detectada pode ser uma proteína ou um peptídeo, por exemplo, mas não está limitada a isto. Na ausência da molécula alvo, o iniciador liga-se à sonda mediadora e pode ser prolongada por processamento com um sistema enzimático adequado, deslocando o mediador da sonda mediadora. O mediador liberado
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75/82 pode desencadear um sinal detectável usando uma molécula ou um método de detecção específica(o). Se a molécula alvo estiver presente, a região do aptâmero da sonda mediadora liga-se à molécula alvo, pela qual o iniciador ligado à região ligante de iniciador não pode ser estendido (Figura 15). Se a molécula alvo estiver presente, uma queda de sinal é detectada em comparação com a ausência da molécula alvo. O processo de amplificação enzimática pode incluir, mas não está limitado a, processos isotérmicos. Exemplo 21: Uso de um aptâmero compreendendo uma região ligante de proteína flanqueada por regiões ligantes de iniciador [00248] De modo a gerar uma reação de detecção exponencial, uma sonda mediadora é usada que consiste em um iniciador com uma sequência de hibridização mediadora na extremidade 5 ’ e um mediador hibridizado com a mesma. Além disso, um aptâmero é usado, que é uma região de ligação à proteína flanqueada por regiões de ligação a iniciador. Na presença da molécula alvo, o aptâmero liga-se à molécula alvo. Os iniciadores que se ligam ao aptâmero não podem ser estendidos devido à ligação à molécula alvo. Consequentemente, o mediador não é liberado e, na presença da molécula alvo, uma queda no sinal em comparação com a ausência da molécula alvo é detectada. Na ausência da molécula alvo, os iniciadores podem se ligar ao aptâmero e ser prolongados, o que leva a um aumento de sinal através da liberação do mediador. O processo de amplificação enzimática pode incluir, mas não está limitado a, métodos isotérmicos (Figura 16).
Exemplo 22: Imobilização de moléculas de detecção [00249] Em outras versões preferidas do método de detecção de acordo com a invenção, as moléculas de detecção podem ser imobilizadas em um vaso de reação adequado em uma fase sólida. A amostra e os reagentes requeridos são então adicionados ao vaso reacional e a mistura é incubada sob as condições apropriadas. A amostra pode consistir em DNA, RNA e/ou
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76/82 peptídeos ou proteínas. Se a molécula alvo estiver presente, o mediador é deslocado pela sonda mediadora e pode difundir-se na mistura reacional para a molécula de detecção imobilizada. O procedimento inclui, mas não está limitado a, procedimentos de amplificação isotérmica (Figura 17).
Exemplo 23: Uso de relaxometria [00250] Em outras versões, a detecção de acordo com o método da invenção pode ser usada em combinação com relaxometria magnética para a detecção de moléculas alvo. As moléculas de detecção podem ser ligadas a partículas magnéticas e permitir a detecção por relaxometria magnética. Na relaxometria magnética, as partículas magnéticas são magnetizadas por um curto pulso magnético e a degradação temporal do momento magnético induzido é detectada. A resistência hidrodinâmica das partículas às quais os mediadores se ligam e se estendem através das moléculas de detecção imobilizadas nas partículas é maior, isto é, a resistência hidrodinâmica das partículas às quais nenhum mediador se liga. As partículas às quais os mediadores se ligam e se estendem, portanto, degradam seu momento magnético induzido mais lentamente que as partículas às quais nenhum mediador se liga. Os tempos de relaxamento dos momentos magnéticos induzidos das partículas mencionadas diferem, portanto, umas das outros, pelas quais a liberação de mediadores pode ser detectada. Combinando a relaxometria magnética com uma análise de curva de fusão, diferentes moléculas alvo podem ser detectadas lado a lado em uma amostra. O procedimento inclui, mas não está limitado a, procedimentos de amplificação isotérmica.
Exemplo 24: Uso de partículas magnéticas ou magnetizáveis [00251] Em outros projetos, a detecção de acordo com o método da invenção pode ser usada em combinação com partículas magnéticas ou magnetizáveis para detectar moléculas alvo (Figura 31). Os mediadores são ligados a nanopartículas magnéticas ou magnetizáveis. Vários mediadores
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77/82 podem ser ligados a uma partícula ao mesmo tempo. De acordo com a invenção, os mediadores hibridizam inicialmente com iniciadores. Durante a amplificação da molécula alvo ou molde, o mediador é deslocado pelo iniciador e pode então hibridizar com uma molécula de detecção imobilizada na fase sólida. A ligação entre o mediador liberado e a molécula de detecção leva as nanopartículas à superfície da fase sólida, o que possibilita uma mudança nas propriedades magnéticas a serem detectadas. Para a detecção de uma mudança de sinal na superfície da fase sólida, sensores de campo magnético podem ser usados, entre outras coisas, que, por exemplo, mas não exclusivamente, são baseados em efeitos galvano-magnéticos, magnetoresistivos, magneto-ópticos ou no efeito Josephson. De modo a evitar sinais falsos positivos devido à deposição de mediadores/unidades de partículas não liberado(a)s na fase sólida, o mediador/unidade de partícula não liberado(a) pode ser separado(a) da fase sólida aplicando um campo magnético fraco.
Exemplo 25: Detecção eletroquímica com moléculas de detecção tendo uma estrutura tipo grampo de cabelo [00252] Em versões adicionais, a detecção de acordo com o método da invenção pode ser usada em combinação com detecção eletroquímica para detectar moléculas alvo. Nesta versão, a molécula de detecção é imobilizada em um eletrodo, que representa simultaneamente a fase sólida. O mediador liberado pode hibridizar com a molécula de detecção na região de ligação de mediador e ser estendido por uma polimerase. A região de ligação de mediador pode estar localizada em diferentes regiões da molécula de detecção. A molécula de detecção pode ter uma estrutura tipo grampo de cabelo e ser marcada com uma molécula redox na extremidade 5’. A extensão do mediador desloca a extremidade 5’ da molécula de detecção e abre a última. Devido ao deslocamento da extremidade 5’ marcada, a distância entre a molécula redox e a superfície do eletrodo aumenta, resultando em uma mudança de sinal detectável. O procedimento inclui, mas não está limitado a,
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78/82 procedimentos de amplificação isotérmica (Figura 18).
Exemplo 26: Prova por detecção eletroquímica em uma fase sólida [00253] Neste projeto preferido, a detecção por detecção eletroquímica pode ocorrer em uma fase sólida. Nesta versão, a molécula de detecção é imobilizada em um eletrodo, que representa simultaneamente a fase sólida. O mediador liberado pode hibridizar com a molécula de detecção na região de ligação de mediador e ser estendido por uma polimerase. Após a extensão, as moléculas redox podem se intercalar no dímero da molécula de detecção e no mediador estendido e gerar um sinal eletroquímico que pode ser detectado (Figura 8). A geração de sinal pode também ocorrer sem extensão do mediador de acordo com a Figura 20. O mediador pode ser isento de rótulo e moléculas redox intercalantes isento de rótulo pode(m) ser usado(as) e/ou o mediador pode ser rotulado com uma ou mais moléculas redox. Se o mediador é rotulado com uma molécula redox, a ligação a mediador liberado e, se necessário, extensão subsequente do mediador à molécula de detecção leva à geração de sinal como descrito nas Figuras 21-23. Em outra versão, a molécula de detecção é marcada com uma ou mais moléculas redox. A ligação a mediador liberado e, possivelmente, a extensão subsequente do mediador à molécula de detecção conduz a uma mudança de sinal de acordo com a Figura 24. Pode ser vantajoso liberar vários mediadores por molécula alvo e/ou amplicon para obter um sinal mais forte. A liberação de vários mediadores por molécula alvo pode ser conseguida, por exemplo, ligando mediadores a várias sondas mediadoras diferentes.
[00254] A seguir, a detecção eletroquímica de acordo com a Figura 21 será discutida. O mediador é rotulado com (a) molécula(s) redox e é liberado durante a amplificação. Nesta versão, a molécula de detecção não rotulada é imobilizada em um eletrodo, que representa simultaneamente a fase sólida, e o mediador liberado pode hibridizar com a molécula de detecção na região ligante a mediador. Devido à proximidade espacial entre a molécula redox no
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79/82 mediador e a superfície do eletrodo, uma mudança de sinal pode ser detectada. A detecção pode ocorrer em tempo real durante a reação de amplificação ou como detecção de ponto final, transferindo os produtos de amplificação para a superfície do eletrodo. O exemplo de execução é descrito em detalhes abaixo usando a detecção eletroquímica do ponto de extremidade dos produtos de amplificação de uma LAMP de E. coli:
[00255] A reação de LAMP foi realizada como descrito no exemplo 15. Contudo, para o mediador de detecção eletroquímica, EnovelamentoF com sequência de ligação a mediador e molécula de detecção foram adaptados por conseguinte (Tabela 1). EnovelamentoF com sequência de ligação a mediador e molécula de detecção foram sintetizados por Biomers (biomers.net, Ulm, Alemanha) e o mediador, que é modificado com um derivado de azul de metileno (Atto MB2), por IBA Lifesciences (Gottingen, Alemanha).
Tabela 1 EnovelamentoF_com sequência de ligação a mediador, mediador e Sequências de molécula de detecção para a detecção eletroquímica de uma LAMP de E. coli.
mediador Atto MB2-TCGTTCTGGGGCTCTACGACC
Enovelamentol·’ com sequência de GGTCGTAGAGAGCCCAGAACGATGCGCCATGTCCCGCT
molécula de deteccão TTTTTTTTTTTTGGTCGTAGAGCCCAGAACGA
[00256] Depois de realizar a LAMP de DNA de E. coli como descrito no exemplo 15, a mistura reacional foi transferida para uma câmara com um eletrodo no qual as moléculas de detecção são imobilizadas. A detecção eletroquímica dos mediadores liberados na reação de controle positivo (60.000 cópias de DNA de E. coli) foi realizada por voltametria de onda quadrada (Figura 32). No controle positivo, os mediadores são deslocados durante a reação de LAMP e podem hibridizar com a molécula de detecção após a transferência da mistura reacional para a câmara do eletrodo. Por
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80/82 conseguinte, o mediador marcado (aqui, azul de metileno) acumula-se na superfície do eletrodo, o que leva à formação de um pico característico a -0,39 V na análise eletroquímica (aqui voltametria de onda quadrada). Em contraste, a ausência de um pico no controle negativo (NTC) indica que não houve liberação significativa de mediadores. A aplicação do método de detecção de acordo com a invenção em combinação com a detecção eletroquímica revela-se particularmente vantajosa aqui, uma vez que após a reação de amplificação não há necessidade de realizar modificações adicionais ou etapas de reação.
Exemplo 27: Detecção paralela de DNA, RNA, peptídeos e/ou proteínas [00257] Em uma versão preferida do método de acordo com a invenção, DNA, RNA e peptídeos ou proteínas ou outra combinação das classes de substâncias mencionadas são detectadas em paralelo pelos métodos descritos em uma abordagem. O procedimento inclui, mas não está limitado a, procedimentos de amplificação isotérmica.
Referências
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Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sonda mediadora para a detecção de pelo menos uma molécula alvo, em que a sonda mediadora compreende pelo menos dois oligonucleotídeos, caracterizada pelo fato de que:
    a) um primeiro oligonucleotídeo compreende uma região de sonda e uma região de ligação mediadora, em que
    i. a região de sonda tem uma afinidade a uma molécula alvo e/ou molécula molde, ii. a região de ligação mediadora tem uma afinidade a pelo menos um mediador, e iii. o primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora não compreende um rótulo para geração de sinal,
    b) pelo menos um oligonucleotídeo adicional é um mediador que
    1. é ligado através da região de ligação mediadora ao primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora, e ii. tem uma afinidade a pelo menos uma molécula de detecção, em que o mediador desencadeia um sinal detectável após a liberação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora por interação com a molécula de detecção.
  2. 2. Sonda mediadora de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o mediador não compreende um marcador para geração de sinal.
  3. 3. Sonda mediadora de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o mediador contém um ou mais marcadores para geração de sinal, de preferência, uma molécula fluorescente, uma molécula de redox, uma molécula luminescente ou outra unidade de geração de sinal.
  4. 4. Sistema compreendendo pelo menos uma sonda mediadora
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    2/5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e pelo menos uma molécula de detecção, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula de detecção compreende um ou mais oligonucleotídeos e compreende pelo menos uma primeira região que interage com pelo menos um mediador, e
    a) uma segunda região que compreende um aceitador de fluorescência ou um doador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção químico e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, e/ou
    b) uma terceira região que compreende um doador de fluorescência ou um aceitador de fluorescência e/ou um grupo químico para ligação a uma fase sólida e/ou um grupo de proteção químico e/ou modificações redox e/ou modificações de luminescência, ou
    c) pelo menos uma quarta região que interage com pelo menos uma primeira sonda que tem um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência, e/ou
    d) pelo menos uma quinta região que interage com pelo menos uma segunda sonda compreendendo um doador de fluorescência e/ou um aceitador de fluorescência.
  5. 5. Sistema de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a molécula de detecção ter uma estrutura tipo grampo de cabelo.
  6. 6. Método para detectar pelo menos uma molécula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
    a) prover pelo menos um sistema como definido na reivindicação 4 ou 5,
    b) ligar a região de sonda do primeiro oligonucleotídeo de pelo menos uma sonda mediadora a uma sequência da molécula molde e/ou da
    Petição 870190057449, de 21/06/2019, pág. 98/102
    3/5 molécula alvo,
    c) amplificar o primeiro oligonucleotídeo de pelo menos uma da sonda mediadora e/ou da molécula molde e/ou da molécula alvo,
    d) liberar pelo menos um mediador por pelo menos uma molécula auxiliar,
    e) ligar pelo menos um mediador liberado a pelo menos uma molécula de detecção, e
    f) detectar uma mudança de sinal.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um mediador se liga à primeira região da molécula de detecção e é estendido enzimaticamente por pelo menos uma molécula auxiliar, a molécula auxiliar preferencialmente se liga ao terminal 3’ do mediador ligado, pelo qual ocorre uma mudança fisicamente ou quimicamente mensurável na molécula de detecção.
  8. 8. Processo de acordo com s reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o terminal 3 ’ do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora é estendido enzimaticamente por uma molécula auxiliar após a ligação da região de sonda do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora a uma sequência da molécula molde e/ou da molécula alvo.
  9. 9. Processo de acordo com uma qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a amplificação do primeiro oligonucleotídeo da sonda mediadora e/ou da molécula molde e/ou molécula alvo, ocorre através de um método de amplificação isotérmico ou não isotérmico.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de detecção tem pelo menos uma modificação de fluorescência ou luminescência e, após a reação com o pelo menos um mediador, as modificações de fluorescência ou luminescência são clivadas da molécula de detecção por meio de uma molécula auxiliar e/ou
    Petição 870190057449, de 21/06/2019, pág. 99/102
    4/5 o terminal 5’ da estrutura tipo grampo de cabelo da molécula de detecção é removido e/ou a estrutura tipo grampo de cabelo é desdobrada e uma mudança no sinal de fluorescência ou sinal de luminescência é detectada na molécula de detecção.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que vários mediadores são usados por sonda mediadora e/ou várias sondas mediadoras e/ou várias moléculas de detecção por molécula alvo.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 all, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula auxiliar tem um efeito de separação de cadeia de DNA e/ou um efeito de polimerização, em que a molécula auxiliar é, de preferência, uma polimerase de deslocamento de cadeia.
  13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo e/ou a molécula molde é uma biomolécula selecionada do grupo consistindo em DNA, RNA, peptídeo, proteína, aptâmero e/ou uma combinação dos mesmos.
  14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que a molécula auxiliar é selecionada do grupo consistindo em polimerases, catalisadores, proteínas, ácidos nucleicos, substâncias naturais, enzimas, sistemas enzimáticos, lisados celulares, componentes celulares, derivados de componentes celulares e/ou moléculas sintéticas.
  15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizado pelo fato de que uma mudança mensurável em fluorescência, fosforescência, luminescência, massa, absorção, dispersão de luz, condutividade elétrica, atividade enzimática e/ou afinidade, potencial ou sinal eletroquímico, índice de refração, desencadeamento de plasmon de superfície, relaxamento magnético, propriedade magnética, impedância ou
    Petição 870190057449, de 21/06/2019, pág. 100/102
    5/5 capacitância ocorre por interação direta ou indireta entre a molécula de detecção imobilizada ou não imobilizada e pelo menos um mediador.
  16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 15, caracterizado pelo fato de que a liberação do pelo menos um mediador é detectada por amplificação do pelo menos um mediador por meio de um método de amplificação isotérmico ou não isotérmico.
  17. 17. Método de acordo com uma das reivindicações 6 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um mediador liberado é detectado por sequenciamento.
  18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos um mediador liberado se liga à molécula de detecção por hibridação, é opcionalmente estendido por uma molécula auxiliar após a ligação à molécula de detecção, e então uma análise da curva de fusão é realizada.
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