JP5307206B2 - 複数のフルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本出願は、2003年11月19日に提出された米国仮特許出願第60/523,263号の利益を主張し、同文献をその全内容において本明細書にて援用する。
本発明は全体として、スペクトル的に同一または類似の複数の色素、および所望により1つまたはそれより多くのクエンチャー色素で標識したオリゴヌクレオチド、ならびに標識オリゴヌクレオチドを作成する方法、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、非常に感度の高い核酸の検出のためのプライマーまたはプローブとしての標識オリゴヌクレオチドの様々な使用に関する。
本発明は、アッセイにおいて有用性を見出せるオリゴヌクレオチドを標識するための方法、例えばサンプル中の所定のポリヌクレオチドの存在を同定するため、または所定のサンプル中の所定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの量を増幅するためにデザインされた方法を提供する。本発明は、これらのタイプの標識オリゴヌクレオチドを使用するための方法を提供する。
類似または同一である。これらの方法のいくつかを用いて生成された標識オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの光度測定可能な分子が互いから永久に引き離される時に、より検出可能なシグナルを発生する。
なおその他の態様は、本発明の態様に従って標識したオリゴヌクレオチドに関する使用を含む。これらの使用は、様々な内容物中に核酸配列を包含する生物学的サンプルを分析するためのアッセイを含むが、これに限定されない。一例としての適用は、蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH)を含み、その場合本発明に従って標識したオリゴヌクレオチドを、例えば生きている細胞、固定した組織、または染色体サンプルにおいて生物学的重要性を持つ標的核酸配列を局在化し、その相対的量を決定するために使用することができる。
本発明の原理の理解を促進する目的のため、ここで本明細書に記載した態様に言及することとし、特定の専門用語を使用して、前記態様を記載することにする。 それでもなお、それにより本発明の範囲を限定することを意図しているのではないことを理解されたい。記載するデバイス、システム、および処置法におけるあらゆる変更およびさらなる修飾、ならびに本明細書に記載したような本発明の原理のあらゆるさらなる適用は、本発明の関連する当業者に通常派生するものとして考慮される。本発明の側面は、具体的または一般的な理論または原理の用語で考察してよいが、本発明はこれらの理論または原理に決して拘束されることはない。そのような考察は、純粋に説明のためであり決して限定するものではない。
“オリゴヌクレオチド”および“オリゴ”という用語は互換性を持 って使用され、核酸、2’−デオキシ核酸、ペプチド核酸(PNA)、ロックト(locked)核酸(LNA)、およびピアゾロピリミジンを含むその他の非天然核酸の配列を言う。一般にオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用するために適する長さのものである。ほとんどのオリゴヌクレオチドは一般に、100ヌクレオチド長より短いポリヌクレオチドであり、多くは50ヌクレオチド長より短く、そしていくつかのオリゴヌクレオチドは25またはそれより少ないヌクレオチドから成る。この用語のより総論的な考察に関しては、読者は以下の参考文献、Kutyavin, I. et al., N. A. R. 30, 2002: 4952-4959;およびHe J. & Seela F., N. A. R. 30, 2002: 5485-5496 および同文献の参考文献を検討されたい。
“レポーター色素”または“蛍光レポーター色素”という用語は、その蛍光がアッセイ中にモニターされる蛍光色素を言う。クエンチャー色素がまた同じ生体分子を標識するために使用される場合、レポーター色素は供与体色素として言ってよく、そしてクエンチャー色素は時には受容体、受容体色素、または受容体分子として言ってよい。
非局在化した正の電荷を有する色素の例は、以下の代表的な構造に示すようなロサミン(rosamine)、シアニン、およびそれらの誘導体を含むが、これに限定されない:
非局在化した負の電荷を有する色素の例は、以下の代表的な構造におけるようなフルオレセインおよびレゾルフィンの誘導体を含むが、これに限定されない:
あるいは一部の態様のオリゴヌクレオチドは、負に荷電した色素および正に荷電した色素を組み合わせで標識され、その場合負に荷電した色素および正に荷電した色素の数は、ほぼ1:1の比率である。負に荷電した色素の例は、フルオレセイン誘導体およびスルホン化した色素、たとえば米国特許第5,696,157号;6,130,101号;5,268,486号;および6,133,445号、ならびに米国特許出願UA2002006479A1およびUA20020077487A1に記載されているものを含む。正に荷電した色素の例は、上述のロサミン系色素およびシアニン系色素、ならびに標準的な化学を用いて第三級アミンまたは第四級アミンで修飾された色素を含む。
(実施例1)
(オリゴヌクレオチドの合成およびラベリング)
材料および装置
無水溶媒、およびヌクレオシドのホスホロアミダイトを含むホスホロアミダイト試薬、および保護されたリンカーはすべて、Proligo、 Boulder、 CO or Glen Research、 Sterling、 VAより購入した。未標識オリゴヌクレオチドおよびアミン修飾オリゴヌクレオチドはすべて、Applied Biosciences (Foster City, CA)によるExpedite 8909 オリゴ合成機で合成した。
すべての未標識オリゴヌクレオチド(プライマー)は、ガラスビーズのポアサイズ 500ÅのCPG支持体上の保護されたヌクレオシドを用いて開始することにより合成した。脱保護、カップリングおよび酸化のステップはすべて、製造業者より提供された標準的なプロトコールに従うことにより行った。CPG支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂および脱保護は、CPGビーズを水酸化アンモニウム中で55℃で16−18時間インキュベーションすることにより行った。一度固相支持体からはずした後、オリゴヌクレオチドをSpeedVacにより濃縮し、過剰のアンモニアを除去した後、粗成生物をSephadexG−25カラムまたはC18逆相カートリッジに通すことにより精製した。必要であれば、最終的な精製をHPLCにて行った(以下の精製を参照のこと)。
アミン修飾オリゴヌクレオチドは、標準的な自動オリゴ合成中に、CPG支持体に固定されたアミノ修飾物質、および保護されたアミンを含有する適当なホスホロアミダイト試薬を使用することにより合成した。
色素標識オリゴヌクレオチドの合成
ラベリング反応は、〜40mg/mLのDMF中のスクシンイミジルエステル色素(Biotium, Inc., Hayward, CA)の溶液を、〜1mg/mLの0.1M NaHCO3(pH8.5)中に溶かしたアミノオリゴに加え、この溶液を室温で〜2時間ボルテックスで攪拌することにより行った。色素のNHSエステル 対 オリゴ中の各アミノ基のモル比は、約20−40から1とした。未反応の色素を、Sephadex G−25スピンカラムにより効率的に除去した。こうして得られた粗生成物をHPLCによりさらなる精製を行った(以下参照)。
標識オリゴヌクレオチドを、Hitachi D7000 HPLC システムの逆相HPLCにより精製した。
カラム:C18 YMC ODS−A 5um 12nm 150×4.6mm、またはC18 Microsorb 5um 30nm 200×4.6。
濃度勾配:20分−30分で10%Bから50%Bに 1ml/分にて。A:100mM TEAA pH7.0; B:100% CH3CN。
精製した色素標識オリゴヌクレオチドの230nmから700nmの吸収を分光光度計で測定し,色素のλmax(Amax)およびA260を決定した。色素の濃度はAmax値を測定することにより決定し、一方オリゴヌクレオチドの濃度は260nmでの色素の吸収を計算に入れた後、A260値に基づいて算出した。色素 対 オリゴの濃度の比率からラベリングの程度(DOL)を定義した。出願者らの実験において、単標識に関するDOLは1に近く(例えば図4B&4C)、そして二重標識に関する値は2に近い(例えば図4A)。この計算値に基づき、今回の発明に詳述する二重標識または単標識のプローブまたはプライマーは、全体として90から95%以上純粋であると結論する。
(二重標識プローブを用いてのMCG遺伝子の増幅のモニター)
本実施例における実験の第一のセットは、MCG遺伝子のRT−PCR検出における、二重6−ROX標識プローブの使用について実証する。増幅は、10mM Tris(pH8.0)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、2mM 各dNTP、および1ユニットのAmpliTaq Gold (ABI, Foster City, CA)を含有する20μlの反応溶液中で行った。pTOPOプラスミド中のMCG遺伝子フラグメント(配列番号25)を、0.5μMのフォワードプライマーである5’−TCAAGAGGTGCCACGTCTCC−3’(配列番号4)、0.5μMのリバースプライマーである5’−CTGATCTGTCTCAGGACTCTGACACTGT−3’(配列番号5)を用いて増幅した。二重6−ROX標識MCGプローブである5’−(6−ROX−L3−CAGCACAACT ACGCAGCGCCTCC(−L1−6−ROX)−3’(配列番号6、表1を参照のこと)を、続いての反応に使用した。温度管理は、7分間95℃に、続いて95℃で15秒間および60℃で20秒間を50サイクルに設定した。蛍光は60℃のステップで測定した。鋳型の10倍段階希釈を行って、増幅プロットの滴定曲線を作成した。図2Aは、鋳型の107コピー(曲線1)から鋳型の101コピー(曲線7)を用いて開始する前述の反応の増幅プロットを示す。2つのNTC(鋳型なしのコントロール(no template control)、曲線8および9)もまた図中に示す。挿入図は、Ct値が開始時のコピー数の対数に負に(reversibly)相関することを示す(曲線10)。
(複雑な鋳型から6−CR110で二重に標識したプローブを用いての、MCG遺伝子およびGAPDH遺伝子の増幅のモニタリング)
ヒトゲノムDNA由来のMCG遺伝子フラグメントの増幅を、(1)6−CR110プローブである5’−(6CR110−L3−)CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCC(−L1−6−CR110)−3’(配列番号7、表1を参照のこと)、および(2)ヒトDNAの10倍段階希釈を使用したことを除いて、実施例2におけるように行った。図2Bは、ヒトDNAの105コピー(曲線11)からヒトDNAの101コピー(曲線15)までを用いて開始する反応の増幅プロットを示す。NTC(曲線16)もまた図中に示す。挿入図は、Ct値が開始時のコピー数の対数に負に(reversibly)相関することを示す(曲線17)。
(TaqManプローブの、本発明の二重標識プローブとの比較)
GAPDH遺伝子フラグメントを、フォワードプライマーである5’−GAAGGTGAAGGTCGGAGTC−3’(配列番号1、表1)およびリバースプライマーである5’−GAAGATGGTGATGGGATTTTC−3’(配列番号2、表1)を用いて、GAPDH遺伝子フラグメント(配列番号24、表1)を含有するpTOPOプラスミドから増幅した。レポーター色素としてJOE、およびクエンチャーとしてTAMRAを伴うTaqManプローブ(5’−(6−JOE−L3−)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC (−L1−6−TAMRA)−3’;配列番号8、表1を参照のこと)、または本発明に従って5−R6Gで二重標識したプローブ(5’−(5−R6G−L3−)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC (−L1−5−R6G)−3’;配列番号9、表1を参照のこと)を、アニーリング/伸展の温度を56℃に下げたことを除いて、実施例2において使用したものと同一の反応条件下でこの反応をモニタリングするために使用した。
(二重に色素で標識したオリゴヌクレオチド、およびただ1つの色素で標識したオリゴヌクレオチド、ならびにS1ヌクレアーゼで消化したそれらのオリゴヌクレオチドの、UV/可視光吸収スペクトル)
この実験の目的は、本発明に従って2つのレポーター色素で標識したオリゴヌクレオチド中の色素間に物理的な接触がないことを実証することである。色素が互いに接触する必要がないことを実証するため、出願者らは同じ配列の3つのCR110標識オリゴヌクレオチド:1)3’および5’を二重に標識したGAPDHプローブ(配列番号3、表1);2)5’を単標識したGAPDHプローブ配列(配列番号7、表1);および3)3’を単標識したGAPDHプローブ配列(配列番号8、表1)、を合成した。2つの単標識オリゴヌクレオチドは、コントロールとするために作製した。
(ホモ二重標識プローブおよび2つの単標識コントロールオリゴヌクレオチドを用いてモニターしたGAPDHの増幅)
この実験の目的は、本発明に従ってのプローブのより優れた性能が、使用した色素の何らかの独自性によるのではなく、当該プローブの新規デザインによるものであることを実証することである。出願者らは、すべてが同じGAPDHプローブ配列を有する3つの標識オリゴヌクレオチド:1)3’末端および5’末端を5−CR110で二重標識したGAPDHオリゴ(配列番号3、表1);2)5’末端を5−CR110で単標識したGAPDHオリゴ(配列番号10、表1);および3)3’末端を5−CR110で単標識したGAPDHオリゴ(配列番号11、表1)、を合成した。次に標識オリゴヌクレオチドを、実施例3のものと同一の条件を使用して、GAPDH遺伝子フラグメントの増幅のための可能性あるプローブとしてのそれらの有用性について検討した。
(本発明に従ってのホモ二重標識プローブの、類似する分子ビーコンプローブとのスペクトルの比較)
ここで出願者らは、本発明に従ってレポーター色素で二重に標識したプローブの吸収スペクトルを、先行技術分野に従っての物理的に接触する色素のペアを有するプローブと比較する。この目的は、先行技術分野のプローブとは違って、本発明の二重標識プローブが色素集合体を形成しないことをさらに実証することである。
(本発明に従っての二重標識プローブの、対応するホモ二重標識ビーコンプローブとのシグナル強度の比較)
この実験は、本発明に従ってのホモ二重標識プローブが、対応する二重標識ビーコンプローブより数倍感度が高いことを実証する。
(FAMおよびCR110の混合物で標識したプローブ)
この実験は、本発明のオリゴヌクレオチドを、レポーター色素の混合物で標識することができることを実証する。
(ホモ二重標識プライマー)
これらの実験は、RT−PCRをモニターするための蛍光発生性プライマーとしての、本発明に従ってのオリゴヌクレオチドの使用について実証する。
(1対のホモ二重標識プローブを用いてのSNPタイピング)
Tappらは、コドン10のエストロゲン受容体遺伝子のCからTへの転移に対して各々、FAMおよびTETで各々標識した1対のTaqManプローブを使用することにより、SNPタイピングを示した。この実験は、各々FAMおよびTETの代わりに、CR110またはR6Gで標識した1対のAllGloプローブが、この目的のために均等に十分に作用することを実証する。
(exo−DNAポリメラーゼを使用する増幅)
この実験は、プローブの開裂の代わりにハイブリダイゼーションにより蛍光シグナルをモニターするリアルタイムPCRにおける、exo−DNAポリメラーゼの使用について実証する。増幅は、あらかじめ混合しておいたバッファーおよびTitanium Taq (BD Biosciences, Mountain View, CA)を含有する20μl反応溶液中で行った。pTOPOプラスミド中のHCV遺伝子フラグメント(配列番号32)を、2μM フォワードプライマーである5’−GCACGAATCCTAAACCTCAAAA−3’(配列番号33)、0.2μM リバースプライマーである5’−GGCAACAAGTAAACTCCACCAA−3’(配列番号34)で増幅した。最終濃度0.5μMの二重6−ROX標識HCVプローブである5’−(6−ROX−L3−ATCTGACCACCGCCCGGGAAC− (−L1−6−ROX)−3’(配列番号35)を各反応に使用した。温度管理は2分間95℃の後、95℃で15秒間、60℃で20秒間、および72℃で5秒間を50サイクルに設定した。蛍光は60℃のステップで測定した。鋳型の10倍段階希釈を行い、増幅プロットの滴定曲線を作成した。図12は鋳型の106コピー(曲線140)から鋳型の1コピー(曲線146)までを用いて開始する前述の反応の増幅プロットを示す。NTC(鋳型なしのコントロール、曲線148)もまたこの図に示す。挿入図は、Ct値が開始時のコピー数の対数に負に(reversibly)相関することを示す(曲線148)。
[態様1]
以下:
[標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列;および
前記オリゴヌクレオチドに連結された少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子;
ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は、互いの15nm以内にある励起波長を有する]
を包含する標識オリゴヌクレオチド。
[態様2]
前記の少なくとも2つの光度測定可能な分子の少なくとも2つが互いから引き離される時に、前記の光度測定可能な分子の少なくとも2つがシグナルの検出可能な変化を発生する、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様3]
前記標識オリゴヌクレオチドが、前記の少なくとも2つの光度測定可能な分子の間の位置で開裂される時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能な分子が互いから引き離される、請求項2に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様4]
前記標識オリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズする時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能な分子が互いから引き離される、請求項2に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様5]
前記標識オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組み込まれる時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能な分子が互いから引き離される、請求項2に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様6]
前記の2つの分子が前記標識オリゴヌクレオチドから開裂される時に、前記の2つの光度測定可能な分子が互いから引き離される、請求項2に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様7]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子が蛍光分子である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様8]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約3から約60ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様9]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約12から約35ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様10]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約15から約25ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様11]
さらに以下:
[前記オリゴヌクレオチドに連結された少なくとも1つの消光分子、
ここで
前記消光分子は、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子が前記オリゴヌクレオチドに連結される時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子により発生されるシグナルを消光する]
を含む、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様12]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非局在化した正の電荷を有する色素、非局在化した負の電荷を有する色素、および等しい数の正の電荷および負の電荷を有する色素から成る群より選択される蛍光色素である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様13]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、BODIPY、非局在化した正の電荷を伴うシアニン系色素、および双性イオンのシアニン系色素から成る群より選択される色素である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様14]
前記の少なくとも2つのラベリング分子の少なくとも1つが、キサンテン系色素分子である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様15]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非スルホン化シアニン系色素分子である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様16]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、CR110、CR6G、TAMRAおよびROXから成る群より選択される色素である、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様17]
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの副溝結合物質(MGB)をさらに含む、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様18]
以下:
[前記オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのグアニジンヌクレオチド、ここで
前記オリゴヌクレオチドが前記標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていない時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、前記の少なくとも1つのラベリング分子により発生されるシグナルが消光されるような、前記のグアニジンヌクレオチドに十分に近い位置にある]
を含む、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様19]
前記オリゴヌクレオチドが5’末端および3’末端を有し;ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の1つが、前記オリゴヌクレオチドの前記5’末端に連結され;ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子のもう1つが、前記オリゴヌクレオチドの前記3’末端に連結される、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様20]
前記オリゴヌクレオチド分子の前記5’末端および前記3’末端に連結された前記の光度測定可能なラベリング分子が、フレキシブルな脂肪族リンカーにより前記オリゴヌクレオチドに連結される、請求項16に記載の標識オリゴヌクレオチド。
[態様21]
前記オリゴヌクレオチド配列が分子内部に二次構造を実質的に持たない、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
[態様22]
前記オリゴヌクレオチドがプローブとしての使用に適する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
[態様23]
前記オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド増幅反応におけるプライマーとしての使用に適する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
[態様24]
前記ポリヌクレオチド増幅反応が、PCR、多重PCR、リアルタイムPCR、定量PCR、およびリアルタイム定量PCRから成る群より選択される、請求項23に記載のオリゴヌクレオチド。
[態様25]
以下:
[標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を提供すること;および
前記オリゴヌクレオチドに少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子を連結すること、ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は、互いの15nm以内にある励起波長を有する]
を包含する、オリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様26]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子が蛍光分子である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様27]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約3から約60ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様28]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約12から約35ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様29]
前記オリゴヌクレオチド上の、前記の光度測定可能なラベリング分子のあらゆるペアが、約15から約25ヌクレオチドにより互いから離されている、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様30]
さらに以下:
[前記オリゴヌクレオチドに少なくとも1つの消光分子を連結すること、
ここで
前記消光分子が、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子が前記オリゴヌクレオチドに連結される時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子により発生されるシグナルを消光する]
を含む、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様31]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非局在化した正の電荷を有する色素、非局在化した負の電荷を有する色素、および等しい数の正の電荷および負の電荷を有する色素から成る群より選択される蛍光色素である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様32]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、BODIPY、非局在化した正の電荷を伴うシアニン系色素、および双性イオンのシアニン系色素から成る群より選択される色素である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様33]
前記の少なくとも2つのラベリング分子の少なくとも1つが、キサンテン系色素分子である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様34]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非スルホン化シアニン系色素分子である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様35]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、CR110、CR6G、TAMRAおよびROXから成る群より選択される色素である、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様36]
前記方法が、少なくとも1つの副溝結合物質(MGB)を前記オリゴヌクレオチドに連結することさらに含む、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様37]
前記オリゴヌクレオチド中に少なくとも1つのグアニジンヌクレオチドを提供することを含み、ここで前記オリゴヌクレオチドが前記標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていない時に、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、前記の少なくとも1つのラベリング分子により発生されるシグナルが消光されるような、前記のグアニジンヌクレオチドに十分に近い位置にある、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様38]
前記オリゴヌクレオチドが5’末端および3’末端を有し、さらに以下:
[前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の1つを、前記オリゴヌクレオチドの前記5’末端に連結すること;そして前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子のもう1つを、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に連結すること]
を包含する、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様39]
前記オリゴヌクレオチド分子の前記5’末端および前記3’末端に連結される前記の光度測定可能なラベリング分子が、フレキシブルな脂肪族リンカーにより前記オリゴヌクレオチドに連結される、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様40]
前記オリゴヌクレオチド配列が分子内部に二次構造を実質的に持たない、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様41]
前記オリゴヌクレオチドをプライマープローブとして使用することをさらに包含する、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様42]
前記オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチド増幅反応におけるプライマーとして使用することをさらに包含する、請求項25に記載のオリゴヌクレオチドを標識する方法。
[態様43]
以下:
[標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするために適するオリゴヌクレオチド配列;および
前記オリゴヌクレオチドへの連結に適する少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子;ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は、互いの15nm以内にある励起波長を有する]
を包含するオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様44]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非局在化した正の電荷を有する色素、非局在化した負の電荷を有する色素、および等しい数の正の電荷および負の電荷を有する色素から成る群より選択される、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様45]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、BODIPY、非局在化した正の電荷を伴うシアニン系色素、および双性イオンのシアニン系色素から成る群より選択される、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様46]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、キサンテン系色素分子である、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様47]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、非スルホン化シアニン系色素分子である、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様48]
前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、CR110、CR6G、TAMRAおよびROXから成る群より選択される色素である、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様49]
前記キットが副溝結合物質(MGB)をさらに含む、請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
[態様50]
以下のステップ:
[標識オリゴヌクレオチドを提供すること、ここで前記標識オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするために適するオリゴヌクレオチド配列を含む;少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子、ここで前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は互いの15nm以内にある励起波長を有する、そしてここで前記の光度測定可能なラベリング分子は前記オリゴヌクレオチドに連結される;
前記標識オリゴヌクレオチドをサンプルと接触させること]
を包含する、標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
[態様51]
前記サンプルが、組織抽出物、細胞抽出物、体液、in vitroの核酸合成反応、およびPCR反応混合物から成る群より選択される、請求項50に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
[態様52]
前記標識オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応において使用し、ここで前記反応が、PCR、多重PCR、リアルタイムPCR、定量PCR、およびリアルタイム定量PCRから成る群より選択される、請求項50に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
[態様53]
前記オリゴヌクレオチドが、サンプル中の核酸ポリマーの標的配列の存在を同定するためのプローブである、請求項50に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
[態様54]
前記サンプルが核酸チップに適用される、請求項50に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
Claims (8)
- 標識オリゴヌクレオチドであって、以下:
標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、産物中への伸長を防ぐためにその3’末端がブロックされている、前記オリゴヌクレオチド;および
少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子であって、当該少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は、互いの励起波長の15nm以内にある励起波長を有し、ここで、少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は当該オリゴヌクレオチドに連結され、そして当該オリゴヌクレオチドに連結された少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子は互いに3〜60ヌクレオチドの範囲内にある、
を含んでなり、
ここで、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つが互いから引き離される時に、前記の光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つがシグナルの検出可能な変化を発生し、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは内部に二次構造を持たない、
前記標識オリゴヌクレオチド。 - 少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも1つが、蛍光分子、BODIPY(登録商標)、非局在化した正の電荷を伴うシアニン系色素、双性イオンのシアニン系色素、キサンテン系色素分子、非スルホン化シアニン系色素分子、CR110、CR6G、TAMRA、およびROX、から成る群より選択される、請求項1に記載の標識オリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドを標識する方法であって、以下の工程:
標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、産物中への伸長を防ぐためにその3’末端がブロックされている、前記オリゴヌクレオチド、および少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子を提供すること、ここで当該ラベリング分子は互いの励起波長の15nm以内にある励起波長を有する;および
当該少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つを当該オリゴヌクレオチドに、少なくとも2つのラベリング分子が互いに3〜60ヌクレオチドの範囲内にあり、そして、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つが互いから引き離される時に、前記の光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つがシグナルの検出可能な変化を発生するように連結すること;
を含んでなり、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは内部に二次構造を持たない、
前記方法。 - オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、以下:
標的分子に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、産物中への伸長を防ぐためにその3’末端がブロックされている、前記オリゴヌクレオチド;
少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子であって、当該光度測定可能なラベリング分子は互いの励起波長の15nm以内にある励起波長を有する、前記ラベリング分子;および
少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子を当該オリゴヌクレオチドに、少なくとも2つのラベリング分子が互いに3〜60ヌクレオチドの範囲内にあり、そして、当該少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つが互いから引き離される時に、当該光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つがシグナルの検出可能な変化を発生するように連結する手段;
を含んでなり、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは内部に二次構造を持たない、
前記キット。 - 標識オリゴヌクレオチドを使用する方法であって、以下の工程:
第一の標識オリゴヌクレオチドを提供する、ここで、前記オリゴヌクレオチドは産物中への伸長を防ぐためにその3’末端がブロックされており、そして前記オリゴヌクレオチドは少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子であって、互いの励起波長の15nm以内にある励起波長を有する光度測定可能なラベリング分子を含み、ここで、少なくとも2つのラベリング分子は互いに3〜60ヌクレオチドの範囲内にあるように前記第一の標識オリゴヌクレオチドに連結されており、そして、前記の少なくとも2つの光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つが互いから引き離される時に、前記の光度測定可能なラベリング分子の少なくとも2つがシグナルの検出可能な変化を発生する;ここで、前記オリゴヌクレオチドは内部に二次構造を持たない;そして
当該標識オリゴヌクレオチドをサンプルと接触させる、ここで当該サンプルは第二のオリゴヌクレオチドを含む;
を含んでなる、前記方法。 - 標識オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応において使用し、ここで前記反応が、PCR、多重PCR、リアルタイムPCR、定量PCR、およびリアルタイム定量PCRから成る群より選択される、請求項5に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
- オリゴヌクレオチドが、サンプル中の核酸ポリマーの標的ポリヌクレオチドの存在を同定するためのプローブである、請求項5に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
- サンプルが、組織抽出物、細胞抽出物、体液、in vitro核酸合成反応、およびPCR反応混合物から成る群より選択される、請求項5に記載の標識オリゴヌクレオチドを使用する方法。
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