CN101076537B - 标记有多个荧光团的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案公开了设计标记的核酸探针和引物的新方法，其通过用多个光谱相同的或相似的染料和任选用一种或者多种淬灭染料标记寡核苷酸。当标记的染料彼此分开时，根据本发明一些实施方案标记的寡核苷酸显示出信号例如荧光信号的可检测的增加。分离染料的方法包括切割标记的寡核苷酸，包括使用具有5′-核酸外切酶活性的酶。在一个实施方案中，本发明的核酸引物可以在杂交到靶序列和掺入到扩增产物后发荧光。本发明的核酸探针和引物具有广泛的应用，从靶核酸序列的一般检测到临床诊断。包含本发明许多实施方案的核酸探针和引物的寡核苷酸的主要优点是其合成的简便性，光谱通用性和优异的荧光信号。

Description

标记有多个荧光团的寡核苷酸
优先权声明 
本申请要求于2003年11月19日提交的US临时专利申请序列号60/523,263的权益，它的全文内容在本说明书中作为参考。 
背景技术
本发明大体上涉及标记有多个光谱相同或相似的染料和任选标记有一种或者多种淬灭染料的寡核苷酸，以及产生标记的寡核苷酸的方法和标记的寡核苷酸作为高灵敏度核酸检测的引物或探针的各种应用，包括实时聚合酶链式反应(PCR)。 
核酸聚合物比如DNA和RNA对遗传信息从一个世代传递到下一世代以及在所有活生物体的常规功能中是关键的。因此这些分子是集中研究的目标，已经发展了许多研究这些分子的技术。这些方法包括但是不限于鉴定给定样品中特定的多核苷酸序列存在的方法，和设计用来测量给定样品中原始存在的特定的核酸分子数量的方法。 
这些技术的实际用途包括鉴定特定的种类和基于寡核苷酸序列相似性鉴定各种类之间的关系。其它的应用包括通过鉴定给定样品中作为给定病理指征的特定序列而诊断疾病。其它的应用，无法一一提到，包括鉴定发展特定病变的倾向的个体，以及根据给定病人的基因组中特定多核苷酸的存在评估提出的治疗方案的效力。 
用于研究和操作寡核苷酸最广泛使用和最强大的技术之一是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是提供体外扩增特定核酸的方法的引物延伸反应。这个技术在1987年首次描述。PCR可以在单个酶促反应混合物中在以小时计的时间以内产生DNA模板百万倍的拷贝，使得研究人员能  确定靶DNA的大小和序列。这种DNA扩增技术已经广泛用于克隆及其他分子生物学操作。关于PCR另外的讨论提供于Mullis等，MethodsEnzymol.(1987)；和Saiki等，Science(1985)。 
在PCR中，待扩增的DNA特定段称为“靶序列”。靶序列的复制是首先将互补的“引物”结合到靶多核苷酸的单链部分。特别有用的一种基于PCR的技术是定量PCR(qPCR)。简单地说，它的机制是基于PCR以指数方式扩增靶DNA的事实。通过运行PCR反应和测量在扩增反应期间给定时间点DNA拷贝的总数，可以倒推计算起始DNA材料的数量。 
已经发展了各种无需停止PCR运行甚至无需在给定的PCR运行过程中对反应取样而确定PCR产物的数量的方法。一种这样的方法通过测量各DNA合成循环产物的数量实时追踪PCR过程。这种方法称为实时PCR(RT-PCR)。由于其灵敏度高和可以对仍然在PCR热循环仪中的样品进行测量，已经发展了各种基于荧光的分析方法来监测PCR产物形成。已经发展了众多用于实时PCR(RT-PCR)的仪器和方法。实时PCR仪器通常是建立在热循环仪基础上的荧光计。市场上可买到的实时PCR仪器包括ABI的Prism 7700，Roche的LightCycler，MJ Research的Opticon，BioRad的iCycler IQ，和Stratagene的MX 4000。 
通过与其杂交而用于鉴定给定核酸序列，但是不起扩增所述给定序列作用的寡核苷酸可以称为“探针”。探针也在PCR反应中具有实用性，其中它们用来以信号表示多核苷酸的扩增。 
考虑到寡核苷酸的重要性和这些分子可以各种方式影响人、动物和植物寿命，存在对于研究和操作寡核苷酸更有效的方法，包括用于有效产生标记的寡核苷酸的新技术的需求。本发明的一个目的是提供标记的寡核苷酸及有效生产和使用这些标记的寡核苷酸的方法。 
发明概述 
本发明提供可用于分析中的标记寡核苷酸的方法，所述分析例如被设计成鉴定样品中给定多核苷酸存在的分析，或扩增给定样品中给定寡核苷酸或多核苷酸的数量的分析。本发明提供使用这些类型的标记的寡核苷酸的方法。 
一个实施方案包括标记有至少两种激发波长彼此在15nm以内的光度分子的寡核苷酸。在一些实施方案中，直到至少两种光度分子作为切割的结果被永久性彼此分离，标记的寡核苷酸才产生相对多的光谱信号。 
一个实施方案是标记有两种光谱相似或相同的光度分子的寡核苷酸，所述光度分子是荧光的。当至少两种所述分子作为寡核苷酸切割的结果被永久性彼此分开时，来自荧光分子的可检测的发射增加。 
在另一个实施方案中，当寡核苷酸杂交到靶寡核苷酸序列时，连接到寡核苷酸的至少两种荧光分子产生的荧光信号增加。 
一个实施方案是标记有至少两种光度分子的寡核苷酸，其中寡核苷酸序列基本上缺乏二级结构比如发夹环和茎环结构。 
一个实施方案包括标记有光度分子的寡核苷酸，该光度分子具有相同或相似的光谱特性并分别连接在所述寡核苷酸的5′和3′末端。在这种实施方案的一个变体中，一种染料连接在磷酸骨架5′末端，而另一种染料连接在磷酸骨架3′末端。 
在一个实施方案中，寡核苷酸适于用作引物，其包含至少两种光谱相同或相似的荧光染料和任选包含一种或者多种荧光淬灭染料。在一个实施方案中，寡核苷酸适于用作标记的引物。在另一个实施方案中，荧光分子可以连接到核苷的碱基，或连接到磷酸骨架5′末端与碱基  的组合。 
在一个实施方案中，寡核苷酸标记有至少两种光谱相同或相似的荧光染料。寡核苷酸可以是用于核酸扩增反应的引物，其包含例如连接到磷酸骨架5′末端和核苷例如胸腺嘧啶核苷酸的碱基的光谱相似或相同的荧光染料。 
一个实施方案包括产生标记有至少两种光度分子的寡核苷酸的方法，其中所述光度分子是相似或相同的。当至少两种光度分子中至少两种被彼此永久性分开时，使用其中一些方法产生的标记的寡核苷酸产生更多可检测信号。 
另一个实施方案包括利用标记有至少两种光度分子的寡核苷酸的方法，所述分子的激发波长彼此在15nm以内。 
其它的实施方案包括根据本发明实施方案标记的寡核苷酸的应用。这些应用包括但是不限于，分析包含在各种环境中的核酸序列的生物样品的试验。一个示例性应用包括荧光原位杂交(FISH)，其中本发明标记的寡核苷酸能被用于定位例如活细胞，固定的组织或染色体样品中具有生物学重要性的靶核酸并测定其相对丰度。 
其它的实施方案包括在基于溶液或基于芯片的阵列检测系统使用标记有多个染料的寡核苷酸，和在基础研究和疾病诊断中定量与疾病相关的基因的差异表达。 
其它的实施方案包括适于制造根据本发明的实施方案标记的寡核苷酸的方法和试剂盒。这些试剂盒可以用于检测扩增的寡核苷酸序列，所述检测包括等温扩增，连接酶链式反应等等。 
各种实施方案适于伴随PCR通过使用寡核苷酸-抗体结合物来检  测核酸之外的生物分子，其中抗体特异于待检测的生物分子。 
本发明另外的形式，实施方案，目的，功能和方面通过此处包含的描述将变得一目了然。 
附图和表格简述 
图1是典型的实时PCR运行的示意扩增图，显示与实时PCR相关的一些参数。 
图2A显示使用PCR扩增MCG基因时收集的数据的图。使用6-ROX-标记的探针在质粒DNA的各种起始浓度收集这些数据。(实施例2) 
图2B显示使用PCR扩增MCG基因时收集的数据的图。使用6CR110标记的探针在人基因组DNA的各种浓度收集这些数据。(实施例3)。 
图2C显示使用PCR扩增MCG基因收集的数据的图。使用6CR110标记的探针在人cDNA的各种浓度收集这些数据。(实施例3)。 
图2D显示使用非磺酸化花青素标记的探针扩增自100,000拷贝质粒DNA的MCG基因的扩增图。(实施例2) 
图3A显示通过比较TaqMan探针和根据本发明一个实施方案制造的探针收集的数据。TaqMan探针在5′末端标记有JOE，在3′末端标记有TAMRA；本发明的探针具有与TaqMan探针相同的寡核苷酸序列，但是其在5′和3′末端标记有R6G。(实施例4) 
图3B显示TaqMan探针与根据本发明一个实施方案生产的探针比较的结果。TaqMan探针在5′末端标记FAM，在3′末端标记TAMRA；本发明的探针具有与TaqMan探针相同的寡核苷酸序列，但是其在5′和3′末端皆标记有6-CR110。(实施例4) 
图3C显示TaqMan探针与根据本发明一个实施方案生产的探针比较的结果。来自ABI的具有未公开的序列的TaqMan探针在5′末端标记有FAM，在3′末端标记有MGB和淬灭剂；本发明的探针在5′和3′末端皆标记有6CR110。(实施例4) 
图4A显示末端标记有两分子5-CR110的GAPDH探针在S1消化前后的吸收光谱(SEQ ID No.3，实施例5)。 
图4B显示在5’末端标记有一个5CR110分子的GAPDH探针(SEQID No.10)在S1消化前后的吸收光谱(实施例5)。 
图4C显示在3’末端标记有一个5CR110分子的GAPDH探针(SEQID No.11)在S1消化前后的吸收光谱(实施例5)。 
图4D显示使用4A、4B和4C中使用的三种探针收集的扩增图。(实施例6)。 
图5A显示标记有两个6-CR110分子的线状和茎环GAPDH探针的吸收光谱。该图说明了茎环结构促进6-CR110二聚体的形成。(实施例7)。 
图5B显示标记有两个6-TAMRA分子的线状和茎环GAPDH探针的吸收光谱。这些数据说明了茎环结构强烈地促进6-TAMRA二聚体的形成。(实施例7)。 
图5C显示标记有两个6-ROX分子的线状和茎环GAPDH探针的吸收光谱。该图所示的数据说明了茎环结构强烈地促进6-ROX二聚体的形成。(实施例7)。 
图6A描述了实时PCR中双6-CR110标记的线状探针和茎环探针在各种探针浓度时性能比较的结果。该图说明线状探针比形成茎环结构的探针产生明显更强的信号。(实施例8)。 
图6B描述了实时PCR中双6-TAMRA标记的线状探针和茎环探针在各种探针浓度时性能的比较。该图说明线状探针比形成茎环结构的探针产生明显更强的信号。(实施例8)。 
图6C描述了实时PCR中双6-ROX标记的线状探针和茎环探针在各种探针浓度时性能的比较。该图说明线状探针比形成茎环结构的探针产生明显更强的信号。(实施例8)。 
图7示例了涉及使用信标探针的核酸检测的化学平衡。(实施例8)。 
图8A描述了分别标记有FAM/FAM，FAM/CR110和CR110/CR110染料对组合的三种探针的光谱。(实施例9)。 
图8B示例了用图8A描述的探针检测的GAPDH基因的扩增图。(实施例9)。 
图9A示例了通过PCR扩增GAPDH基因和用双5-CR110标记的GAPDH正向引物(SEQ ID NO：15)检测产物所收集的数据。(实施例10)。 
图9B示例了通过PCR扩增GAPDH基因和用双5-CR110标记的GAPDH正向引物(SEQ ID NO：16)检测产物所收集的数据。(实施例10)。 
图9C示例了通过PCR扩增GAPDH基因和用双5-CR110标记的GAPDH反向引物(SEQ ID NO：17)检测产物所收集的数据。(实施例10)。 
图9D示例了通过PCR扩增GAPDH基因和用双5-CR110标记的正向引物(SEQ ID No.15)和5′末端5-CR110单标记的相同正向引物(SEQ ID No.18)检测产物所收集的数据。该图显示只有双标记的寡核苷酸能作为荧光探针。(实施例10)。 
图9E是通过PCR扩增GAPDH基因和用双5-CR110标记的正向引物(SEQ ID No 16)和3′末端单标记的相同的正向引物(SEQ No 19)检测产物所收集的数据的比较。该图显示只有双标记的寡核苷酸能作为荧光探针。(实施例10)。 
图9F示例可以允许5′G用作LUX引物中的淬灭剂的可能的二级结构。该图还说明本发明一些实施方案的荧光引物可以通过不同于使LUX引物起作用的机制运行。(实施例10)。 
图10示例了模式雌激素受体的SNP分型。(实施例11)。 
图11示例了通过PCR扩增HCV基因和使用双ROX标记的探针(SEQ ID No.33)检测产物所收集的数据。如图所示，通过用酶处理产物增强了信号，该酶显示出没有外切(exominus)活性，比如Taq DNA聚合酶。(实施例12)。 
表1说明书全文中参考的一些序列以及适于实施一些实施方案的连接分子结构的简明列表。 
表2活性基团的部分列表，包括可用于一些实施方案中将标记分子和淬火分子连接到寡核苷酸的亲电基团和亲核基团。 
序列表附页详细列出一些序列。 
发明详述 
为促进对本发明原理的理解，现参照这里描述的实施方案并使用特定的术语加以说明。然而应当理解本发明的范围不限于此。对于此处描述的装置、系统、治疗方法和本发明原理的进一步应用的任何改变和进一步修改对本发明所述技术领域的技术人员而言是通常可以预料到的。虽然本发明的一些方面可以依据具体或一般理论或原理来论述，但本发明绝不受这些理论或原理的约束。这样的讨论完全是说明性的而不是限制性的。 
因为核酸聚合物在现代医学和生命科学中起着关键的作用，已经发展了多种试剂包括荧光染料用于检测、测序和测量核酸聚合物的方法中。同样，已经发展了多种方法使用这些染料来产生更灵敏的核酸分析。一个集中研究的领域是开发高度灵敏的分析，以测量通过PCR产生的核酸聚合物的积累。 
通过PCR的DNA扩增可能是相当复杂的，因为该方法受许多因素的影响。一种影响PCR的因素是随着反应进行，起始组分比如dNTP、引物、Mg2+的有效浓度逐渐耗尽。另一个因素是累积的最终产物的抑制作用。在PCR进行过程中，这些组分彼此以相互关连的动态方式互相作用。通常DNA扩增包含三个连续的阶段：指数期，线性期和平台期。各阶段是不同的，并可以显示出与其它两个阶段不同的扩增效率。实际上只有在指数期收集的数据可用于可靠地估计靶寡核苷酸的起始浓度。 
一种通常使用荧光分子实时监测PCR的方法已知商业上称作  TaqMan分析。TaqMan分析利用Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性以实时监测DNA扩增。关于这个公知分析的进一步讨论在Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res.(1993)；和US专利5,210,015；5,538,848；6,258,569和5,691,146中有提供。TaqMan分析通过杂交和随后切割荧光探针(“TaqMan”探针)在扩增反应过程中检测积累的PCR产物。所述探针是寡核苷酸，其序列与待检测的靶DNA互补。所述探针标记有单个荧光报告染料和单个荧光淬灭剂。报告染料和淬灭染料以通常大约15到大约60个核苷酸的间隔连接到寡核苷酸，以获得最理想的荧光淬灭和5′核酸外切酶活性。染料可以连接到核苷酸碱基或寡核苷酸骨架或两者的组合。通常，报告标记/供体标记之一连接到磷酸骨架3′末端，另一个连接到磷酸骨架的5′末端。淬灭剂可以是非荧光染料或合适波长的荧光染料。在两种情况下，通过荧光共振能量转移(FRET)发生结合到探针的荧光团的淬灭。 
为了简要论述如何选择荧光团/淬灭剂对和设计显示出最佳性能的TaqMan探针，回顾一些基本的光物理学是有益的。首先，当染料接受来自外源足够能量的光子时，其被电激发到单线激发态。激发态存在有限的时间，其间电子能量被部分损耗到分子的振动和转动模式中。结果，当染料发射光子时，光子的能量较低，因此分子发射的光子波长比分子吸收的光子波长更长。激发或吸收与发射之间能量或波长的差异被称作斯托克斯位移(Stockes shift)，并且在荧光染料中是常见的。其次，基于FRET的淬灭受Foster能量共振转移理论的约束，其表明光能量转移效率与供体发射光谱和受体吸收光谱的重叠正相关。进一步讨论提供在Foster，Ann.Phys.(1948)；和Stryer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1967)。斯托克斯位移和光谱重叠要求的组合必须使荧光供体和受体是不同的染料。即使供体和淬灭剂分子两者都是荧光染料，上述要求也是必须的。 
事实上，同时也是荧光染料的淬灭分子应理想地选择为发射波长比供体(报告)染料的发射波长显著更长。使用这种组合确保暗背景。附  加的灵敏度增益可以通过使用选择性阻断淬灭分子发射的全部或大多数信号的滤光器而实现。为获得最佳性能，淬灭剂优选选自它们自己是完全非荧光的分子。事实上，获得TaqMan分析的低或零背景已经是相当多的研究工作的焦点。为这一目的，已经开发了许多非荧光淬灭分子。公知的市场上可买到的非荧光淬灭剂包括，例如，来自Biosearch的黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher)(BHQ)染料，其是非荧光偶氮染料，来自Epoch的Eclipse Dark淬灭剂(DQ)(Eurogentec目录号OL-0273-DQ02)，和来自Integrated DNA Technologies的IOWABLACK(IWB)。这些分子的进一步讨论提供在Johansson，M.K.等，J.Am.Chem.，Soc.，(2002)。这些及类似的非荧光淬灭剂通过抑制本底荧光提高TaqMan探针的灵敏度，从而增加酶切割探针后的信号增益。这些受欢迎的供体/受体对(用于TaqMan探针设计的荧光团/淬灭剂对)的例子包括FAM/TAMRA，VIC/BHQ1，HEX/BHQ2和TET/DHQ等。 
除上述的光谱重叠必要条件之外，对基于FRET的荧光淬灭关键的第二参数是供体及受体之间的距离。FRET取决于分子间距离的六次幂的倒数(inverse sixth power)。 
在与靶核酸杂交前，典型的TaqMan探针具有无规则构型，其中供体及淬灭剂能移动到彼此足够接近以发生有效的FRET。由于它们的彼此接近和它们的光谱特性，报告分子被淬灭，因此探针是无荧光的。在与扩增的靶DNA区段杂交后，探针被延伸，结果变成发荧光的，这是因为供体和淬灭剂之间距离的增加使得FRET能量转移不会发生。可选择的，并通常优选的是，探针在扩增过程中被例如具有5′外切核酸酶活性的聚合酶消化。消化使得供体染料与淬灭剂完全地分离开，从而进一步减少淬灭和增强来自供体染料的荧光信号。随着在PCR扩增的过程中产生更多DNA拷贝，更多探针被杂交然后被切割，这继而增加了荧光信号。这种方案的一个变体是使用双酶系统。在这种系统中一种酶负责聚合寡核苷酸，而第二种酶负责从PCR产物切割报告染料。一种这样利用这种策略的市场上可买到的产品是来自Stratagene的  Full Velocity试剂盒。 
利用FRET产生具有良好的信噪比信号的探针设计的另一个变体描述在US专利No.6,492,346。这个变体采用共价连接到寡核苷酸探针内3′末端，5′末端或任何其它位置的小沟结合剂(MGB)。含有MGB的探针可以具有比不使用MGBs的探针更短的核苷酸序列而仍然显示出非常有效的荧光淬灭。此外，相对于被某些其它的不选择性结合到小沟的标记分子标记的探针，标记有MGB的探针往往具有改进的特异性、效率和针对错配增强的识别率。 
另一个检测扩增产物的方法使用所谓的“分子信标探针(beaconprobe)”，其是US专利Nos.5,925,517；和5,118,801和5,312,728的主题。分子信标探针具有茎环结构，包括中央靶识别序列(环区)，其侧翼为一对互补的彼此杂交形成茎状结构的3′和5′末端序列。荧光供体染料和淬灭分子分别连接到3′和5′末端。在缺少互补靶序列的情况下，信标探针保持其闭合的构型，供体染料的荧光通过FRET被淬灭染料淬灭。在与靶序列杂交后，信标探针伸展为开放构型，从而分离供体染料和淬灭剂，并增加供体染料的荧光信号。随着在PCR反应过程中产生另外的靶DNA拷贝，更多信标探针通过杂交到靶DNA而采用开放构型，并因而增加荧光信号。这个技术的进一步讨论提供于Tyagi等，Nature Biotechnol.(1996)。TaqMan探针在PCR过程中通过酶裂解而被“消耗”，与此不同，分子信标探针贯穿DNA扩增过程保持化学性质不变；仅仅信标探针的构型从闭合形式(茎环)改变为开放形式。 
信标探针的两种构型-开放和闭合-彼此存在于动态平衡中。在PCR过程中，平衡取决于各对互补链之间三个竞争的杂交反应。三个平衡存在于：1)靶DNA的两条互补链之间；2)探针互补的3′和5′末端(茎)之间；和3)探针的靶识别序列(环)和靶序列之间。只有第三个杂交反应偏好开放的信标构型，因此只有一个反应产生可检测的荧光信号。第一个和第二个杂交反应皆偏好闭合的信标构型，从而减少荧光信号。  由于竞争性杂交交互作用(1和2)，即使当两者被标记相同或相似的供体/淬灭染料对时，在核酸检测中分子信标探针本质上不如标记的TaqMan探针灵敏。然而，如果具有5′核酸外切酶活性的酶用于所述反应，则杂交到靶序列的信标探针也可以如TaqMan探针一样从寡核苷酸中切割掉。在这种情况下，信标探针变成事实上的TaqMan探针。 
另一个方法公开在US专利6,174,670，这种方法使用能量转移系统，其中在两个杂交探针之间发生能量转移。例如，第一个探针是在3′末端标记荧光供体染料，而第二探针是在5′末端标记受体染料。第二引物上的受体分子以比第一个引物上的供体染料更长的波长发射能量。当应用于PCR时，两个探针以首尾相连的排列方式杂交到靶DNA的两个互补链之一。因为无论两个供体和受体染料位置如何，FRET发生在这两个分子之间。因此，通过测量受体染料的荧光发射，可以将荧光强度与随着PCR进行所产生的靶DNA的数量相关联。 
另一个检测扩增产物的方法公开在US专利6,635,427。这个方法使用内部鸟嘌呤核苷(G)核苷酸作为连接到寡核苷酸探针的单个报告染料的淬灭剂(受体)。在缺少靶序列的情况下，鸟嘌呤核苷核苷酸，其通常策略上被置于报告染料位置旁边，淬灭报告染料的荧光。在与靶序列杂交后，由鸟嘌呤核苷引起的淬灭减少，导致荧光信号的增加。 
还可以通过使用在掺入扩增产物后变成发荧光的荧光引物而监测PCR。使用标记有供体/淬灭染料对的信标样发夹引物的这样一种方法商业上已知称为Ampliphore，并公开在US专利5,866,336。在杂交到其靶DNA序列前，引物以闭合的发夹构型存在，其通过FRET淬灭供体染料的荧光。一旦杂交到靶DNA序列并掺入到扩增产物中，引物具有延伸的开放构型，而引物因为FRET被降低而变成发荧光的。为了获得引物所需的特异性以及保持必要的发夹结构，信标样引物通常是相当长的。探针的长度对引物设计构成限制，并增加合成引物的成本。 
监测PCR的另一个方法使用已知商业上称为LUX引物的引物。该技术的进一步讨论提供于Nazarenko等，Nucleic Acid Research(2002)；和Marras等，Nucleic Acid Research(2002)。LUX引物标记有单个荧光染料(供体分子)，策略上置于内部鸟嘌呤(G)核苷酸附近以用于淬灭染料的荧光。由于染料和其附近的G核苷酸之间的相互作用，游离态的标记引物是非发荧光的或弱荧光的。当引物被延伸，G核苷酸内化到双链DNA中，荧光淬灭被降低或消除，来自供体分子的荧光信号增加。LUX引物的优点是其设计相对简单。LUX系统的一个问题是其要求在染料连接位点(通常胸腺密啶核苷)附近存在G核苷酸，这限制了引物设计的选择。此外，通过G的荧光淬灭只在选定波长的极少数染料中有效。对引物序列的限制和尤其是不能与更长波长的染料相容使得难以开发多重PCR用的一组LUX引物。 
最近，BD Biosciences开发了基于荧光的用于RT-PCR的引物试剂盒，已知商品名为DNAzyme。这个方法使用荧光寡核苷酸和引物的组合，并公开在US专利申请公开号2001/0001063中。除用于延伸反应的正常启动序列之外，引物序列之一编码在引物延伸过程中切割荧光寡核苷酸的酶。其结果，如同TaqMan分析一样是荧光信号的增加。用于引物试剂盒的荧光寡核苷酸在设计上类似于典型的TaqMan 探针，除了前者不具有互补到靶序列的序列，结果这个技术缺少基于TaqMan分析的特异性。此外，由于需要编码必需的酶，DNAzyme引物很容易超过50个核苷酸长度。需要更长的核苷酸增加了引物的制造成本。 
荧光探针与荧光引物相比一个主要的优点是检测自探针的荧光信号只来自于探针和靶之间的杂交。由于错误引发或引物二聚体假象而产生信号的非特异扩增通常不发生在探针中，但这种情况有时候发生在引物中，不产生有用信号。荧光探针可以标记有不同的可区分的报告染料。通过使用数个各自标记有独特的报告染料的探针，可以在单  个PCR反应中检测具有不同序列的多个靶的扩增。这个方法通常称为多重PCR。荧光探针的开发也可能避免PCR后加工，从而消除交叉污染的可能性，而这是临床诊断和法医学应用的关键因素。 
荧光探针的一个缺点是它们的成本。荧光寡核苷酸至少比相应未标记的寡核苷酸贵10倍。此外，探针设计相对复杂，通常在构建合适的探针时需要考虑许多因素，比如探针的长度，退火温度，和淬灭剂与荧光团适当的光谱匹配。 
与荧光寡核苷酸探针特别是TaqMan探针相比较，荧光引物趋向于产生弱的信号，因为它们在PCR过程中不被切割以永久性将报告染料与淬灭剂分开。另外，从错误引发和引物二聚体的形成所得到的非特异性PCR产物也有助于增加分析的噪声。出于这些原因，在用于实时定量PCR中，通常相对于荧光引物而言优选荧光探针。 
已经开发了许多的方法用于标记寡核苷酸。通常荧光供体染料和淬灭剂以分步方式连接到寡核苷酸。这些方法通常需要昂贵的试剂和复杂的保护法保护步骤，而收率却通常相当低。而且，染料和淬灭剂的选择以及它们连接到寡核苷酸的顺序是受限制的和固定的，这部分因为不是所有的染料可以耐受寡核苷酸合成的苛刻化学条件。 
通常通过以下两种方法之一将染料掺入寡核苷酸中：1)通过在自动合成过程中使用染料改性的核苷或脱氧核苷亚磷酰胺；或2)在合成后通过将胺或硫醇改性的核苷酸或脱氧核苷酸与胺或硫醇的活性染料反应而标记。例如，通过用连接到CPG固相支持物的TAMRA标记的改性剂开始，通常合成在3′和5′末端标记有FAM/TAMRA染料对的寡核苷酸，随后连续积累剩余的寡核苷酸。在最后偶联步骤通过标准的亚磷酰胺化学作用将供体染料FAM连接到寡聚物。这个方法具有两个缺点：首先，染料标记的亚磷酰胺成本高；第二，其减少TAMRA的淬灭能力，因为一般说来罗丹明染料，尤其是TARMA在标准寡核苷  酸合成条件下是不稳定的。为解决这个问题，常规的做法是避免一开始使用连接到CPG支持物的TAMRA。一种方法是用保护的3′-氨基-改性剂连接的CPG开始合成，供体染料FAM照常在自动合成的最后步骤通过标准亚磷酰胺化学作用连接到5′-末端。在随后从固相支持物切割寡核苷酸和3′-胺去保护步骤之后，胺改性的寡核苷酸与TAMRA琥珀酰亚胺基酯反应。为保证探针或引物的性能，在第二个染料连接反应之前后使用HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯化步骤是必须的。探针和引物的设计带来的限制和固定以及标记化学作用的性质使得这些荧光寡核苷酸的制造非常昂贵。 
使用标记的寡核苷酸的一种越来越重要的PCR分析类型是实时PCR。实时PCR监测的一个重要的参数是所谓阈循环点，或Ct值。Ct 值是PCR产物的荧光信号达到基线以上的预先设定值所需要的反应循环的理论数。样品中靶DNA的浓度越高，Ct值越小。图1显示代表性的扩增图，并定义用于定量分析的术语。扩增图是荧光信号对循环数的图。在PCR的初始循环中，荧光信号几乎没有改变。这个相对的“平坦区“定义扩增图的基线。基线以上荧光的增加显示检测到积累的PCR产物。初始靶拷贝数的对数与Ct值以线性方式负相关，这个关系形成实时定量PCR的数学基础。 
此处使用的一些术语的定义 
术语“寡核苷酸”和“寡聚物”是可互换使用的，指核酸，2′-脱氧核酸，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)及包括吡唑嘧啶的其他非天然核酸的序列。一般来说，寡核苷酸的长度要适合作为引物或探针。大多数的寡核苷酸是通常小于100个核苷酸长度的多核苷酸，许多小于50个核苷酸长度，一些寡核苷酸包含25个或更少的核苷酸。关于术语更详尽的讨论，可以参考下列文献：Kutyavin，I.等，N.A.R.30，2002：4952-4959；和He J.&Seela F.，N.A.R.30，2002：5485-5496和其中的参考文献。 
“引物”是指能够用作起点沿着互补链延伸的寡核苷酸。通常在PCR使用一组引物，一个正向的和一个反向的。正向引物包含与靶核酸的一条链互补的序列，并沿着这条链引导合成。同样，反向引物包含与靶核酸的相反链互补的序列，并沿着靶核酸的相反链引导合成。 
“探针”是指含有与靶核酸区域互补的序列的标记的寡核苷酸，其中标记的寡核苷酸与靶序列退火并产生表明靶区域存在的信号。探针通常在3′末端是封闭的，不延伸入产物中。 
术语“光度标记分子”是指由于分子的物理或化学环境变化而产生可检测的信号变化并用于标记另一分子的分子。所述变化可以是吸收的光的量或吸收的光的波长。光度分子包括，例如，在一个波长处吸收光而在另一波长处发光的荧光染料分子。在光度标记分子为荧光染料的情形下，所述分子也可以显示出发射的光量的变化或发射的光波长的变化。 
术语“活性基团”是指可以用于将各种标记基团包括荧光团和淬灭分子连接到寡核苷酸的化学部分。用于将染料连接到寡聚物的活性基团的选择通常取决于寡聚物上待标记的官能团。 
例如染料分子的活性基团与寡聚物的官能团之间的键形成反应通常是亲核试剂和亲电试剂之间的反应。因此，活性基团可以是亲核试剂或亲电子试剂，而相应的官能团可以是亲电试剂或亲核试剂。亲电子试剂/亲核试剂对非穷举的的列表可以在表2中找到。对于活性对的进一步讨论参考US专利6,130,101。 
存在于寡聚物上典型的官能团包括但是不限于，胺，硫醇，醇，酚，醛，酮，肼，羟胺，二取代的胺，卤化物，或羧酸。寡聚物上更典型的官能团是胺，硫醇，醇，醛或酮。 
连接到染料分子的常见的活性基团包括但是不限于：丙烯酰胺，羧酸的活化酯，酰基叠氮，酰基腈，醛，烷基卤，胺，酸酐，苯胺，芳基卤，叠氮化物，氮丙啶，羧酸，卤乙酰胺，卤三嗪，肼，酰肼，亚胺酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，磺酰卤或硫醇。其它的活性基团包括琥珀酰亚胺基酯，胺，卤乙酰胺，肼，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，或亚磷酰胺。存在于寡核苷酸上的官能团是胺，一种染料上的常用活性基团用于将染料连接到寡核苷酸，其是琥珀酰亚胺酯。 
下面是用于包括染料的各种试剂的一些缩写：5-CR110指5-羧基罗丹明110；6-CR110指6-羧基罗丹明110；5-FAM指5-羧基荧光素；6-FAM指6-羧基荧光素；5-R6G指5-罗丹明6G；5-ROX指5-羧基-X-罗丹明；6-ROX指6-羧基-X-罗丹明；5-TAMRA指5-羧基四甲基-罗丹明；6-TAMRA指6-羧基四甲基-罗丹明；JOE指2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素。 
对本发明来说术语“光谱相似的染料”，指可以具有或不具有相似的化学结构但是具有相似的激发和/或激发谱性质的荧光染料。然而所述染料的发射光谱可以相似或可以不相似。这样一对的例子是5-FAM和5-CR110。5-FAM吸收/发射波长在495/519nm，而5-CR110吸收/发射波长在502/524nm处。对本发明来说，差异在15nm以内的吸收或激发波长被认为是相似的。 
术语“光谱相同的染料”指可以具有或不具有相同化学结构但是发射谱或激发或发射和激发谱两者在光谱上不可区分的荧光染料。 
术语“相同的染料”指化学和光谱相同的荧光染料。 
术语“报告染料”或“荧光报告染料”指在分析过程中其荧光被监测的荧光染料。当淬灭染料也用于标记相同的生物分子时，报告染  料可以称为供体染料，而淬灭染料有时可以称为受体，受体染料或受体分子。 
此处使用的术语“淬灭”指降低分子产生的信号，其包括但是不限于将分子产生的信号减少到零或低于检出极限。因此，给定分子可以被例如另一分子“淬灭”，但仍然产生可检测信号，即使分子被淬灭时由淬灭的分子产生的信号小于分子未被淬灭时的信号。 
术语“淬灭剂”或“淬灭染料”或“淬灭分子”指染料或等同的分子，比如鸟嘌呤核苷(G)或2′-脱氧鸟嘌呤核苷(dG)，其能够减少荧光报告染料或供体染料的荧光。淬灭染料可以是荧光染料或非荧光染料。当淬灭剂是荧光染料时，其荧光波长通常基本上不同于报告染料的波长，并且通常在分析过程中不监测淬灭剂荧光。 
本发明的一些实施方案公开了构建荧光寡核苷酸的方法和它们作为引物和探针在核酸检测中的应用，特别是在实时qPCR中的核酸检测。与现有的技术相比较，一些实施方案的荧光寡核苷酸显著更容易制造并基本上比许多市场上可买到的技术更灵敏。此外，不同于常规的荧光寡核苷酸，比如TaqMan探针，其报告染料的选择被伴随的淬灭染料的可用性所限制，本发明各种实施方案的寡核苷酸可以基本上适应任何波长的荧光染料。这种染料选择的灵活性利于不同荧光波长的荧光引物或探针的合成并允许在单管形式中进行多重检测。 
一些实施方案是探针，所述探针是标记有多个光谱相同或相似的荧光染料的单链寡核苷酸。所述探针可以进一步标记有一种或者多种淬灭剂。在缺少靶序列的情况下，探针呈现无规卷曲构型，并且是非荧光仅仅弱荧光的。通常，无规卷曲构型的寡核苷酸基本上不含使寡核苷酸的两个末端彼此接近的二级结构。相反，具有二级结构的寡核苷酸探针的例子是所谓分子信标探针。 
在存在靶序列的情况下，各种实施方案的探针容易地杂交到靶序列。在具有5′核酸外切酶活性的特定试剂或酶类存在的情况下，染料分子随后从寡核苷酸上切割。切割导致染料分子永久性分离，使得荧光大大增加。 
荧光最大的增加取决于通过5′外切核酸酶或等同的核酸酶对连接各相邻染料对的磷酸骨架的可切割性。当染料连接位点彼此太接近时，可能阻碍寡核苷酸杂交到靶和影响5′外切酶核酸活性。另一方面，当染料连接位点彼此过分远离，本底荧光可能会高。因此，为在探针/靶杂交之后在缺少靶序列和最适合的5′外切核酸酶活性的情况下获得最小的荧光本底，各相邻染料对的连接位点应该分开3到60个核苷酸，优选12到35个核苷酸，以及最优选15到25个核苷酸。 
用于这些实施方案有用的酶包括Taq聚合酶或独立外切核酸酶或可以在两个标记的分子之间切割的任何其它的酶。在一些实施方案中，永久性分开标记分子基本上增加荧光发射。 
与掺入到根据本发明标记的寡聚物中的多标记分子相反，荧光探针比如US专利5,538,848公开的TaqMan探针，US专利5,925,517公开的分子信标和US专利6,174,670公开的Hyb探针只包含单个荧光报告分子。结果，目前可获得的探针可以产生的最大荧光信号是通过单个荧光团产生的信号。另一方面，本发明各种实施方案的探针包括至少两种染料。因此，与靶序列杂交和切割本发明的探针导致从多重荧光染料产生信号。因此，本发明各种实施方案的探针能够产生比根据现用的方法制造的探针产生的信号强许多倍的荧光信号。 
图3A示例了用TagMan探针(JOE作为荧光团，TAMRA作为淬灭剂)检测的典型MCG基因扩增反应的动态荧光测量和用根据本发明一个实施方案制造的探针检测的相同反应的动态荧光测量的比较结果。根据本发明一个实施方案制造的探针在两个末端被标记有两个  R6G染料(参见实施例4)。在两个分析中使用相同的序列。 
图3A的数据示例来自双标记的探针的荧光信号是使用TaqMan探针测量的信号的两倍。令人吃惊的是观察到标记有两个或更多光谱相同或相似的荧光团的寡核苷酸被充分淬灭(没有形成染料聚集物)，通过切割探针使荧光团彼此分离产生超过本底足够高的信号以用于追踪DNA的扩增。因为对寡核苷酸的这一观察是如此出乎意料，申请人寻找对使用荧光染料测量另一生物聚合物多肽水平的技术的解释。 
有时蛋白质被标记带荧光染料标签的抗体。在这些分析中常见的是将两个或更多相同的荧光团连接到单个多肽。添加各染料分子增加标记的蛋白质的总荧光，尽管由于荧光淬灭与染料的物理接触有关，随染料数的荧光增加可能不是线性的。在蛋白质标记实验中，只有当过量染料分子连接到蛋白质时才发生显著的荧光淬灭。在这样的情况下，淬灭通常是染料分子间物理相互作用即染料聚集的结果。这个技术的进一步讨论提供在Haugland，RP Handbook of Fluorescent Probesand Research Products  第9版，第20-74页和其中的参考文献。 
与相对高级结构的多肽相反，缺乏互补的内部序列的寡核苷酸预计呈现无结构的、解开的、延伸结构。这个构型通常称为无规卷曲，特征为缺少可容易定义的内部二级结构。据信寡核苷酸采用无规卷曲构型以使由于分子高度带负电荷的磷酸骨架产生的分子间电斥力最小化。结果，用于标记，例如，具有基本上无规卷曲形状的寡核苷酸的染料不能预期彼此互相作用并且不能预计显示荧光信号淬灭。因此，根据对蛋白质标记和寡核苷酸结构的普遍认识，将可以预期本发明各种实施方案的寡核苷酸将显示太少的荧光淬灭，而不能用于检测给定样品中寡核苷酸的存在或水平。根据现有技术的教导，可以预期这些分子的本底荧光太高以致它们不能用于监测实时PCR。实际上，研究人员竭尽全力设计精细的寡聚物结构来安放置标记荧光团从而促进荧光团聚集以淬灭荧光。例如，两个US专利6,150,097和6,037,137提  到根据分子信标结构设计实时PCR探针的可能性，该结构导致两个报告荧光团彼此物理接触。 
另一个来自使用本发明的一个实施方案的出乎意料的观察是促进染料聚集的寡核苷酸二级结构是不必要的和不希望的。本发明人发现相同的报告染料的聚集不仅是不必要的，而且在许多情况下对实时PCR探针的性能有害。本发明一个实施方案的探针，其具有最简单的结构，通常比根据许多现有技术公开的方法制造的探针更加灵敏。另外，设计具有复杂的内部二级结构的探针通常比基本上缺乏内部二级结构的探针更难以设计和制造。 
已经广泛报道的是某些荧光或非荧光染料趋向于形成基态复合物。在水溶剂中高浓度下或当分子在彼此非常接近的范围以内时，极可能形成这些复合物。有关的进一步讨论提供于West等，J Phys Chem(1965)；Rohatgi等，J Phys Chem(1966)；Rohatgi等，Chem Phys Lett(1971)；和Khairutdinov等，J Phys Chem.(1997)。 
在两个相同的染料之间形成同型二聚体，或在不同染料之间形成异源二聚体导致染料吸收光谱明显的改变。这被认为是染料激发态能量偶合的结果。在两个荧光染料之间或荧光染料和非荧光染料之间形成的称作H二聚体的特定类型二聚体特征为染料最大吸收的蓝移和荧光淬灭。已经利用由于形成H二聚体产生的荧光淬灭构造荧光肽酶底物。这个主题进一步的讨论提供于Packard等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)；Geoghegan等，Bioconjugate Chem(2000)；Tyagi等，Nat.Biotech(1998)；Bernacchi等，Nucleic Acids Res.(2001)；Marras等，Nucleic Acids Res.(2002)；Johansson等，J.Am.Chem.Soc.(2002)；US专利6,037,1376和150,097。 
在所有前面提到过的参考文献中，标记的肽或寡核苷酸的构建方式能保证分子物理上彼此足够接近，从而来自供体染料的信号在酶促  切割前被淬灭。对于肽酶底物，和分子信标探针而言，在它们杂交到其靶序列以前明显是这种情况。例如，US专利6,037,137公开的荧光肽需要所谓的“构型决定区域”，其在肽中引入弯曲，使得染料对被保持非常接近用于有效的“接触荧光淬灭”。同样，US专利号6,150,097和6,037,137公开了具有连接到一个末端的荧光报告染料和连接到另一个末端的淬灭染料的分子信标。可选择地，这些探针具有连接到一个末端的报告染料和连接到另一个末端相同的报告染料，其中所述染料对处于物理接触以实现荧光淬灭。在这种方法的变体中，报道一个基团通过用荧光团和高度疏水的淬灭剂标记线状寡核苷酸而实现接触淬灭，所述淬灭剂利于与荧光团形成异源二聚体。参见，Johansson等，J.Am Chem.Soc.(2002)。 
与这些方法相反，本发明一些实施方案的寡核苷酸探针基本上缺乏可清楚限定的导致探针呈现特别刚性构型的二级结构或其它的构型决定结构。此外，不必要形成促进包含两种或更多荧光报告染料的本发明许多实施方案的探针中的染料之间物理“接触”的二聚体或其它的结构。 
缺少各种实施方案的染料对之间的邻近淬灭，通过在酶消化前后双标记的探针的吸收谱没有显著变化来显示。参见，例如，图4A的迹线29对比28，和实施例5进一步讨论。总体波长从迹线28到迹线29的少量偏移不同于光谱形状或轮廓的变化，是由染料经历的微环境的差异所引起。这被称为“溶剂效应”。标记有双CR110的探针(迹线29)和在5′(图4B的迹线31)或在3′(图4C的迹线33)标记有单个CR110的相同序列的另一寡核苷酸几乎可重叠的光谱证实了溶剂效应。在这种情况下染料经历相似的溶剂效应。再次，双标记的探针和两个单标记的寡核苷酸之间吸收光谱的相似性表明在双标记的探针上基本上没有染料聚集。 
为说明在二聚体形成后的光谱变化，本发明人合成了三种具有环  序列的分子信标探针，所述序列与线性探针的序列相同。一个信标探针在3′和5′末端标记有两个5-CR110染料(SEQ ID No 12)，另一信标探针在3′和5′末端标记有两个5-TAMRA染料(SEQ ID No 13)。另一信标探针在3′和5′末端标记有两个5-ROX染料(SEQ ID No 14)。如图5A，5B和5C所示和进一步详见实施例7。所有信标探针的吸收光谱(迹线38，40，和42)与线性探针的吸收光谱(迹线37，39，和41)显著不同，各自形成新的较短波长的峰，这是H二聚体形成的特征。关于上述内容更详细的讨论请参见Blackman等，Biochemistry(2002)；Packard等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)。在S1核酸酶消化后，光谱变回到游离染料的光谱。尽管标记有两个报告染料的信标探针的荧光作为形成染料二聚体的结果被很好地淬灭，探针检测核酸的灵敏度相对较低。图6A，6B和6C比较了分别根据本发明的各种实施方案各自标记有两个相同的染料5-CR110，5-TAMRA，5-ROX的分子信标和线性探针之间的动态荧光测量。 
数据表明根据本发明各种实施方案制备的探针通常比相应的信标探针灵敏2-10倍。信标探针的灵敏性显著较弱可以依据PCR检测过程中存在的竞争平衡来解释。如图7所示，(详见实施例8)，存在着三种竞争平衡，它们分别介于：1)单链靶DNA和双链靶DNA之间(KA)；2)开放构型的信标和闭合构型的信标之间(KB)；和3)探针靶杂交产物和两个反应物之间，单链靶DNA和无规则构型(Kc)的信标之间(KC)。 
形成探针-靶杂交物分开两个染料，结果产生荧光信号。显然，单链靶DNA浓度越高和无规卷曲构型的探针的量越大，Kc平衡会向形成探针靶杂交产物移动越多，从而增加荧光信号。然而，在给定PCR循环数和因此给定单链靶DNA浓度下，形成的杂交物的量与处于无规则构型的探针的浓度成比例，所述探针与闭合构型的信标处于平衡。因此，闭合信标构型的真正存在降低可形成杂交产物的处于无规则构型的探针的浓度，而这降低荧光信号的强度。另外，在探针末端并列放  置一对染料以形成二聚体可能增加茎环结构的熔解温度，进一步稳定闭合的构型并使得荧光探针-靶杂交物的形成更为不利。 
如果具有5′核酸外切酶活性的酶用于反应中，可以改进信标探针的荧光信号；在形成探针-靶杂交物之后，5′核酸外切酶切割探针并产生不可逆的稳定荧光信号。信标的闭合构型和无规则构型之间的平衡减缓荧光产物形成的速率。在各PCR循环的时间范围以内，通常10-30秒，仅仅形成一小部分热力学允许量的切割产物，导致如图6A，6B和6C所示相对弱的信号(详见实施例8)。另一方面，根据本发明各种实施方案的同型双标记的探针保持开放的无规则构型，因此可以容易地形成荧光探针-靶杂交物。杂交的探针被5′核酸外切酶切割进一步增强信号，因为其产生不可逆的去淬灭的稳定的荧光产物。 
本发明一些实施方案的探针与比如TaqMan探针之间的主要区别是，本发明许多实施方案的探针具有两个或更多报告染料，而TaqMan探针仅仅具有单个报告染料和单个淬灭剂。尽管淬灭剂本身还可以是荧光染料，比如FAM/TAMRA供体/淬灭剂对中的TAMRA，只检测供体染料FAM的发射，并且只有它的荧光信号与产生的DNA的量有关。在TaqMan分析中，淬灭剂的荧光或者被忽略或者甚至检测不到。使用TaqMan探针的实时PCR检测依赖于基于FRET的荧光淬灭供体荧光团以降低分析中的本底信号。在杂交到靶DNA和/或探针被5-外切核酸酶活性水解切割前，供体的荧光被淬灭，因此检测不到信号或只检测到非常弱的信号。在探针杂交和/或探针的酶切割之后，供体的荧光被释放，因此检测到对应于产生的DNA的量增加的正信号。 
因为可以使用TaqMan产生的最大信号通过单个供体分子产生，TaqMan探针的净信号增益(最终的性能)很大程度上由探针切割前荧光团的荧光淬灭效率和探针切割后荧光团的荧光收率来测定。因此，在TaqMan分析中理想的是，淬灭剂将完全淬灭供体的荧光直到报告分子从寡核苷酸上切割。完全淬灭通常是保证实时PCR分析以暗背景  开始所需要的。如前面讨论的，根据公知的FRET原理，基于FRET的淬灭效率与供体分子发射光谱和受体(淬灭剂)分子吸收光谱的重叠正相关。关于FRET更详细的讨论可以参考例如Foster，Ann.Phys.(1948)；Stryer等，和Proc.Natl.Acad.Sci.(1967)。 
此外，鉴于染料的荧光发射波长总是比其吸收波长更长(正如其斯托克斯位移所定义)，给定染料分子最好的淬灭分子必须是不同的染料。这是因为淬灭剂的吸收光谱必须与供体的发射光谱匹配。实际上，供体染料的斯托克斯位移越大，供体染料越好，因为供体其后能在其最大吸收被激发而不与其发射相抵触。这是用于增加信号输出的第二种方法的理论基础。考虑到基于FRET淬灭的原理，具有大斯托克斯位移的供体染料的优点，以及对基于FRET淬灭最大化的需求，必须选择发射波长基本上不同于供体染料发射波长的淬灭剂。 
总之，根据FRET的基本原理和其在构建包括引物和探针的寡核苷酸中的广泛使用，现有技术看起来教导远离本发明的各种实施方案。 
因此，与用同型双标记FAM或者磺酸化的Cy5的探针得到的结果所显示的引用技术比较，本发明的实施方案是非显而易见的。FAM和Cy5是两种最广泛使用的报告染料。然而，这些染料中没有一个产生显示显著的信号变化和低本底荧光的同型双标记的探针(数据未显示)。实际上，为了增加TaqMan探针的灵敏度，大多数的商业计划聚焦在更有效淬灭剂的开发，特别是基于非荧光染料的淬灭剂。市场上可买到的高效率非荧光淬灭剂的例子包括来自BioSearch公司的基于偶氮染料的BHQ淬灭剂，来自Amersham公司的多硝基花青染料，和来自Molecular Probes的基于罗丹明的YSQ染料。 
根据各种实施方案标记有两种报告染料的探针不必设计成将染料分子安置为彼此物理邻近。然而，聚集更可能发生在标记有多重染料分子和任选的淬灭分子的探针之间，而不是发生在标记有单个报告分  子和淬灭分子的相同寡核苷酸序列之间。因此，根据本发明各种实施方案的至少一些标记有至少两种信号染料(和任选标记有一种或者多种淬灭分子)的寡核苷酸可以在染料作为探针切割的结果而永久性分离后，显示出低本底荧光和高信号输出，因为每寡核苷酸具有大量信号分子。 
优选，在一些实施方案中，寡核苷酸标记有多个光谱相同或相似的荧光染料。荧光报告染料的混合物可以用于标记特定的探针，只要所述染料具有相似的吸收或者激发光谱以便它们全部被单激发光有效激发。例如，本发明的探针可以包括Cy3(Glen Research，Sterling，VA)和TAMRA(Biotium公司，Hayward，CA)，其中两者具有相似的光谱并可以在540nm有效激发。作为另一个实施例，特定的探针可以包括CR110和FAM，其中两者也都具有相似的光谱并可以被488nm氩气激光束很好地激发。尽管标记有混合染料的探针相对更难合成，但在某些情况下如果这样的混合染料在与靶序列杂交前促进荧光淬灭，则其是有利的。例如，本发明的探针可以标记有一种具有净负电荷的染料和另一种具有相似光谱但是带净正电荷的染料的混合物。具有相反电荷的染料的混合物可以促进荧光淬灭。给染料附加电荷的方法对本领域技术人员是公知的。例如，可以通过磺化给染料添加负电荷，而正电荷可以通过向染料添加仲胺，叔胺或季胺而在染料上产生。这些分子更详细的讨论参考Mujumdar等，1993，Bioconjugate Chem。 
更优选，本发明一些实施方案的探针为标记有多个相同荧光染料分子的寡核苷酸。因为染料可在单个步骤结合到寡核苷酸，因此寡核苷酸探针具有容易和经济制造的优点。在20世纪80年代进行了广泛的研究工作以开发有效标记核酸的技术。这些技术被充分记录。这一主题更详细的讨论参见以下文献：Connolly等，Nucleic AcidsRes.(1985)；Dreyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1985)；Nelson等，Nucleic Acids Res.(1989)；Sproat等，Nucleic Acids Res.(1987)和Zuckerman等，Nucleic Acids Res.(1987)。 
具有报告子/淬灭染料对的现有技术的探针需要单独的标记步骤和昂贵的试剂。例如，第一种标记物，染料或者淬灭剂通常连接到寡核苷酸，连接的方式或者通过用连接到CPG固相支持物的已保护的染料开始寡核苷酸合成，或者通过在寡核苷酸合成过程中使用染料标记的核苷(或者2′-脱氧核苷)亚磷酰胺而掺入染料。第二种淬灭剂或染料分子通过在标准寡聚物合成过程中使用染料标记的或者淬灭剂标记的核苷亚磷酰胺而连接到寡核苷酸。可选的并且更常见的，第二染料或者淬灭分子连接到寡聚物，其方式是首先在寡聚物合成过程中向寡聚物中掺入氨基，然后将琥珀酰亚胺酯染料或者淬灭剂与胺改性的寡聚物反应。与这种多步骤标记操作相反，本发明一个实施方案的探针包含多个相同的染料。用单个染料标记仅仅要求单个染料标记步骤，通常在缓冲液中将活性形式的染料与含有所需数量的能够与染料反应的活性基团的寡核苷酸混合1-2小时。通常，首先通过标准亚磷酰胺化学作用使用市场上可买到的试剂向寡核苷酸中引入活性基团。 
最优选，本发明一些实施方案的探针是标记有两个相同的荧光染料的寡核苷酸，所述染料的荧光被淬灭而不形成染料聚集物。优选，染料分别连接到寡核苷酸的3′和5′末端。在本发明的一个实施方案中，一个染料通过柔性脂肪族接头连接到磷酸骨架3′末端，而另一相同的染料通过另一柔性脂肪族接头连接到磷酸骨架的5′末端。柔性接头是C2 到C30直链或者分支的、饱和或不饱和的烃链，任选由杂原子，芳基，低级烷基，低级羟基烷基和低级烷氧基取代。优选，接头是C4到C12 直链或者分支的饱和烃链，任选由杂原子，低级烷基和低级羟基烷基取代。 
在发明的另一个实施方案中，标记有多个报告染料和淬灭剂的探针进一步包括核酸结合基团。核酸结合基团的例子包括小沟结合剂(MGB)，核酸嵌入剂(interculator)和多胺。在核酸结合基团被掺入到本发明各种实施方案的探针中的情况下，探针的寡核苷酸序列可以被  变短并仍然产生有用信号。较短的探针意味着降低制造成本。向寡核苷酸探针或引物中引入核酸结合基团的方法的记录很全面，参见例如US专利Nos.5,801,155；6,472,153；6,486,308；6,492,346和多种公开物，例如Afonina等，N.A.R.(1997)；Kumar，等，N.A.R.(1998)和Kutyavin等，N.A.R.(2000)。优选，核酸结合基团是小沟结合剂(MGB)。优选，包含核酸结合基团的探针标记有两个或更多相同的报告染料。更优选，包含核酸结合基团的探针标记有两个相同的染料，其可以物理上彼此接触或不接触。 
在本发明的另一实施方案中，寡核苷酸探针包括多个荧光报告染料，其中至少一些报告染料连接到G核苷酸或位于标记的寡核苷酸内接近G核苷酸。在这种安排中，最靠近G核苷酸的染料或染料分子的荧光在寡聚物杂交到其互补序列以前被淬灭。 
在本发明的一个实施方案中，引物是包含多个光谱相同或相似的荧光报告染料的单链线状寡核苷酸。在缺少靶序列的情况下，上述引物具有无规卷曲构型并且没有荧光或弱荧光。无规卷曲构型的寡核苷酸引物基本上缺乏内部二级结构。基本上缺乏内部二级结构的寡核苷酸不容易形成二级结构比如茎环，发夹等等。 
一旦标记有光度分子比如荧光分子的引物被引入到扩增产物中，由于扩增产物更加延伸的构型，荧光团被进一步彼此分隔，因此来自光度分子的荧光信号增加。当根据本发明实施方案制造引物时，每个引物包括至少两个荧光团。因此，根据本发明制造的引物可用于分析互补的寡核苷酸，其灵敏度比使用仅仅标记有单个信号分子的引物的分析更大。 
在与靶序列杂交和随后掺入到扩增产物中后，根据本发明实施方案制造的一些引物的荧光增加。因此，本发明一些实施方案的引物的一个优点是当寡聚物上的多个染料分子杂交到其靶时产生信号。因为  每个寡核苷酸有至少两个信号分子，它们产生的信号大于只有连接到其上的单个染料分子的引物产生的信号。这帮助使得根据本发明方法制造的一些引物成为比现有技术仅仅包括单个信号分子的引物更灵敏的核酸检测器。 
染料分子通常通过脂肪族接头连接到核苷酸的碱基或连接到磷酸骨架5′末端和寡核苷酸的碱基的组合。染料连接位点被隔开，其方式是为了在杂交前获得最大的荧光淬灭和在杂交和掺入到扩增产物之后获得最大的荧光。通常，任何两个邻近的荧光标记的核苷酸对之间或5′末端和邻近的荧光标记的核苷酸之间最适合的间隔是10到50个核苷酸；优选，距离大约15到30个核苷酸；最优选，距离为大约15到25个核苷酸。 
在一个实施方案中是标记有两个光谱相同或相似的荧光染料的引物。通常，一个染料通过接头连接到5′末端或其附近，而另一染料通过另一接头连接到3′末端或其附近。优选，一个染料通过接头并且以适当的距离连接到磷酸骨架的5′末端，而另一染料通过另一接头连接到核苷酸比如T的碱基。通常，接头分子C2到C12直链或分支的饱和烃链，任选被杂原子，芳基，低级烷基和低级羟基烷基取代。所述两个染料分子可以分开大约15到大约25个碱基。 
在一个实施方案中，引物是标记有两个相同染料的直链寡核苷酸，其中一个染料通过接头连接到磷酸骨架5′末端而另一染料通过另一接头连接到3′末端或其附近的核苷酸T的碱基。所述接头是C4到C12直链或分支的饱和烃链，任选被杂原子，低级烷基和低级羟基烷基取代。根据本发明标记有两个相同染料的荧光引物比现有技术的引物容易制造得多。当供体染料和淬灭分子需要在单独步骤使用昂贵的试剂连接时，或需要合成长的低得率核苷酸以形成所需的发夹结构时尤其如此。 
相似的，根据本发明各种实施方案制造的引物比许多现在使用的方法制造的引物要便宜。与合成包含具有不同化学性质的标记分子的引物需要多步骤标记操作相反，包含两个相同染料的引物仅仅需要单个染料标记步骤。通常，本发明各种实施方案的标记的寡核苷酸可以通过将活性形式的染料与引物在合适的缓冲液中混合1-2小时而制造，所述引物含有两个能够与该染料反应的活性基团。活性基团首先通过标准亚磷酰胺化学作用使用市场上可买到的试剂引入到寡聚物中。 
根据本发明各种实施方案的荧光寡核苷酸的主要优点是可以自由使用实质上任何类型和任何波长的荧光染料而不必须将报告染料与特定的淬灭剂匹配。如此可能是因为一些实施方案看来不依赖标准的基于FRET的荧光淬灭以产生具有可用信号的分析。用于本发明的合适类型的荧光染料包括，但是不限于，香豆素，呫吨染料，花青素，芘，苯乙烯基染料，BODIPY染料，芪和其衍生物；广泛使用的罗丹明，荧光素和对甲氨基酚属于呫吨染料类型。优选染料包括中性染料分子和具有离域正或负电荷的染料分子。中性染料是不带有任何电荷的染料，或带有等量正电荷和负电荷的染料，后一种类型的中性染料也称为兼性染料。中性染料的例子包含但是不限于如以下代表性的结构所示的BODIPY染料，罗丹明，兼性花青染料，和其衍生物： 
Figure RE-G04840647120060726D000301
Figure RE-G04840647120060726D000311
四甲基罗丹明 
Figure RE-G04840647120060726D000312
其中R是活性基团。 
具有离域正电荷的染料例子包括但是不限于如以下代表性的结构所示的rosamines，花青素，和其衍生物： 
Figure RE-G04840647120060726D000313
花青素                                    四甲基rosamine 
其中R是活性基团。 
具有离域负电荷的染料的例子包括但是不限于如下面代表性的结构所示的荧光素和试卤灵衍生物： 
Figure RE-G04840647120060726D000321
荧光素                                                       试卤灵 
其中R是活性基团。 
或者，一些实施方案的寡核苷酸标记有带负电荷染料和带正电荷染料的组合，其中带负电荷的染料和带正电荷的染料的数量比例近似1∶1。带负电荷的染料的例子包括荧光素衍生物和磺酸化染料，比如US专利5,696,157；6,130,101；5,268,486；和6,133,445，和US专利申请UA2002006479A1和UA20020077487A1中描述的那些。带正电荷的染料的例子包括上述rosamine染料和花青染料以及使用标准化学作用以叔胺或季胺改性的染料。 
在本发明另一实施方案中，用于合成上述寡核苷酸的合适的染料包括能量转移染料，比如US专利5,800,996；6,479,303B1；和6,545,164B1，以及国际公开WO 00/13026描述的那些。标记有不同的能量转移染料和非能量转移染料的探针或引物的组合能被用于在单个封闭管中的多重检测。 
用于各种实施方案的合适的染料包括但是不限于具有以下结构的罗丹明呫吨染料： 
Figure RE-G04840647120060726D000322
其中R1，R2，R3和R4独立地是H，F，Cl，C1-C18烷基或C2-C18  烯基；R5是H；R10，R11，R12和R13独立地是H，C1-C18烷基，或C2-C18烯基，任选取代以活性基团；所述结构还包括0到4个另外的饱和或不饱和5或6元环，选自：R1结合R11，R2结合R13，R3结合R10，和R4；所述各另外的环可以被一个或多个低级烷基取代；Q是CO2 -或SO3 -或活性基团；R7和R8独立地是H，F，Cl，或活性基团；R6和R9独立地是H，F，Cl。用于将这些及其他染料和淬灭剂连接到寡核苷酸的合适的活性基团包括，但是不限于如表2所列的亲电子试剂和亲核试剂，及定义部分所列举的其他基团。用于连接光度分子和淬灭剂的其它方式包括脂肪族的接头基团。 
其它用于各种实施方案的染料包括但是不限于具有以下结构的花青染料： 
其中R1，和R2独立地选自H，F，Cl，Br，CN，羧酸基团，羧酰胺，磺酸酯，磺酰胺，低级烷基基团，或至少一种另外的稠合芳环，所述另外的稠环包括独立地选自以下的原子：C，N，O和S，活性基团，用H或活性基团取代的低级烷氧基；R3和R4独立地是用H或活性基团取代的低级烷基；X和Y独立地选自：O，S，NR5和CR6R7；R5，R6，和R7其中R5，R6和R7，R5独立地选自H，C1到C18烷基；以及“桥”是甲烷或聚甲炔基(polymethine group)。适于将所述分子连接到寡核苷酸的活性基团包括但是不限于表2列举的亲核和亲电子基团和其定义部分列举的其他基团。除各种活性基团之外，合适的染料和淬灭分子也可以通过例如脂肪族的接头连接到寡核苷酸。 
或者，合适的染料是能量转移染料，其中染料对之一是罗丹明染料或花青素染料。 
实施例 
实施例1 
寡核苷酸合成和标记 
材料和仪器 
所有的无水溶剂和亚磷酰胺试剂包括核苷亚磷酰胺和保护的接头购自Proligo，Boulder，CO或Glen Research，Sterling，VA。所有未标记的和胺改性的的寡核苷酸在Applied Biosciences(Foster City，CA)的Expedite 8909寡聚物合成仪上合成。 
未标记的寡核苷酸的合成 
所有未标记的寡核苷酸(引物)的合成是在带有玻璃珠孔径大小500 
Figure RE-G04840647120060726D000341
的CPG支持物上以保护的核苷开始。遵循厂家提供的标准规程进行去保护、偶联和氧化步骤。通过将CPG珠子在氢氧化铵中55℃温育16-18小时而从CPG支持物切除寡核苷酸和去保护。一旦从固相支持物切离，寡核苷酸通过SpeedVac浓缩以除去过量氨气，然后将粗产物通过Sephadex G-25柱或C18反相柱体而纯化。如有必要，用HPLC进行最终纯化(参见下面的纯化)。 
胺改性的寡核苷酸的合成 
通过使用CPG支持的氨基改性剂和含有保护的胺的合适的亚磷酰胺试剂在正常的自动寡聚物合成过程中合成胺改性的寡核苷酸。 
可以使用具有不同间隔臂的各种市场上可买到的CPG支持的氨基改性剂。可以向这些产物的3′末端引入氨基。CPG支持的氨基改性剂，3′-氨基-改性剂C7CPG用于表1所列的一些实施例中，并且其具有如下结构： 
Figure RE-G04840647120060726D000342
(具有L1间隔基) 
其中，Fmoc和DMT分别是胺和羟基的保护基团，以及“琥珀酰  -lcaa”是固相支持物和改性剂之间的间隔基。碱不稳定的Fmoc基团在铵处理过程中被除去，以从CPG支持物上除去寡聚物。试剂在胺基和3′末端磷酸之间引入7碳分支间隔基。供参考目的，本发明人将这个间隔基称作L1。本领域技术人员可以理解，固相支持体上有许多其它形式的改性剂试剂用于引入具有不同间隔基的胺，或引入胺以外的不同活性基团。 
含有胺的亚磷酰胺试剂包括保护的氨基脱氧核苷和保护的氨基改性剂的亚磷酰胺。最广泛使用同时也最便宜的保护的氨基脱氧核苷的亚磷酰胺是三氟乙酰氨基-2′-脱氧胸腺嘧啶的亚磷酰胺，或氨基改性剂C6dT，其在表1给出的一些实施例中用于制造T改性的寡核苷酸。如下显示的是氨基改性剂C6dT的结构： 
Figure RE-G04840647120060726D000351
(具有L2间隔基) 
这个试剂在dT和胺基之间或dT和染料之间引入10原子的直链脂肪族间隔基。供参考目的，本发明人将这个间隔基称作L2。 
或者，在自动合成的最后步骤使用保护的胺的亚磷酰胺可引入胺到5′末端。两种氨基改性剂试剂，5′-氨基-改性剂C6-TFA和5′-氨基-改性剂C12用于合成本说明书公开的5′-末端标记的寡核苷酸。结构如下所示： 
(具有L3间隔基) 
Figure RE-G04840647120060726D000361
(具有L4间隔基) 
供参考目的，5′-氨基-改性剂C6-TFA的直链6-碳间隔基称为L3，类似地5′-氨基-改性剂C12的直链12-碳间隔基称为L4。 
有许多其它形式的改性剂试剂可用于引入具有不同间隔基的胺，或引入胺以外的不同活性基团。 
染料标记的寡核苷酸的合成 
通过向以～1mg/ml溶解在0.1M NaHCO3(pH 8.5)中的氨基寡聚物添加～40mg/ml琥珀酰亚胺酯染料(Biotium公司，Hayward，CA)的DMF溶液，和在室温下涡旋振荡所述溶液大约2小时而进行标记反应。染料NHS酯对寡聚物中的各氨基的摩尔比为大约20-40∶1。未反应的染料通过Sephadex G-25离心柱被有效的除去。因此获得的粗产物通过HPLC进行进一步纯化(见下文)。 
标记的寡核苷酸的纯化 
在Hitachi D7000 HPLC系统上通过反相HPLC纯化标记的寡核苷酸。 
通常的HPLC条件： 
柱：C18 YMC ODS-A 5μm 12nm 150×4.6mm，或C18 Microsorb 5μm 30nm 200×4.6。 
柱温度：45℃ 
梯度：在20min到30min内以1ml/min从10％B到50％B。 
A：100mM TEAA PH7.0；B：100％CH3CN。 
测定标记程度 
在分光光度计上测量纯化的染料标记的寡核苷酸从230nm到700nm的吸收，其中测定染料的λmax(Amax)和A260。染料的浓度通过测量Amax值而测定，而寡核苷酸浓度根据染料在260nm的吸收后的A260 相乘而计算。染料与寡聚物浓度的比率定义了标记程度(DOL)。在本发明人的试验中，单标记的DOL接近1(如图4B和4C)，而双标记则接近2(如图4A)。根据这一计算，本发明人总结出本发明详述的双标记或单标记的探针或引物通常纯度大于90到95％。 
实施例2 
使用双标记的探针监测MCG基因扩增 
这个实施例的第一组实验显示双6-ROX标记的探针在RT-PCR检测MCG基因中的应用。扩增在含有10mM Tris(pH 8.0)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，2mM各dNTP，和1单位AmpliTaq Gold(ABI，FosterCity，CA)的20μl反应溶液中进行。以0.5μM正向引物5′-TCAAGAGGTGCCACGTCTCC-3′(SEQ ID No.4)，0.5μM反向引物5′-CTGATCTGTCTCAGGACTCTGACACTGT-3′(SEQ ID No.5)扩增pTOPO质粒中的MCG基因片段(SEQ ID No.25)。双6-ROX-标记的MCG探针，5′-(6-ROX-L3-CAGCACAACT ACGCAGCGCCTCC-(L1-6-ROX)-3′(SEQ ID 6，参见表1)用于以下反应。加热方案设定为95℃，7分钟，随后为95℃15秒和60℃20秒的50次循环。在60℃步骤时测量荧光。对模板进行系列10倍稀释以产生扩增图的滴定曲线。图2A显示以107个拷贝模板开始上述反应的扩增图(迹线1)直至101个拷贝模板开始上述反应的扩增图(迹线7)。两个NTC(无模板对照，迹线8和9)也显示在图中。插图显示Ct值与起始拷贝数的对数反相关(迹线10)。 
在第二组实验中，探针(SEQ ID No 36)用非磺酸化花青素染料双标记，实验在两个模板浓度100,000拷贝(迹线151)和0拷贝(迹线152)下进行。所有其它的试剂和条件同第一组实验。这组实验显示双花青素  标记的探针在RT-PCR检测MCG基因中的应用。 
实施例3 
使用6-CR110双标记的探针监测从复杂模板扩增MCG和GAPDH基因 
如实施例2的操作从人基因组DNA扩增MCG基因片段，除了(1)6-CR110探针，5′-(6CR110-L3)-CAGCACAACT ACGCAGCGCCTCC-(L1-6-CR110)-3′(SEQ ID NO.7，参见表1)和(2)使用系列10倍稀释的人DNA。图2B显示以105个拷贝人DNA开始上述反应的扩增图(迹线11)直至101个拷贝人DNA开始上述反应的扩增图(迹线15)。NTC(迹线16)也显示在图中。插图显示Ct值与起始拷贝数的对数反相关(迹线17)。 
如上所述使用cDNA作为模板进行另一个滴定(图2C)，除了使用GAPDH引物，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID No.1)和5′-GAAGATGGTGATGGGATTTTC-3′(SEQ ID No.2)，和GAPDH探针，5′-(6CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6CR110)-3′(SEQ IDNo.21)。以0.2μl人脑cDNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)开始，进行系列2倍稀释。所有PCR反应在10μl体系中进行。加热方案为95℃(7分钟)，45次循环的95℃(15秒)和56℃(20秒)。 
实施例4 
TaqMan探针与本发明双标记的探针的比较 
从含有GAPDH基因片段(SEQ ID NO.24，表1)的pTOPO质粒使用正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID NO.1，表1)和反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTTC-3′(SEQ ID NO.2，表1)扩增GAPDH基因片段。以JOE作为报告染料和TAMRA作为淬灭剂的TaqMan  探针5′-(6-JOE-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-TAMAR)-3′SEQ ID NO.8，参见表1)或本发明双标记5-R6G的探针(5′-(5-R6G-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-5-R6G)-3′SEQ  ID No.9，参见表1)用于监测该反应，反应条件与实施例2中相同，除了退火/延伸温度降低至56℃。 
所有的扩增反应以一百万个拷贝模板，和各探针浓度分别125nM，250nM和500nM进行。如图3A所示，根据本发明制造的探针信号强度是相应TagMan探针的两倍(迹线18对比21，迹线19对比22，和迹线20对比23)。R6G和JOE具有可比较的光谱以及相似的荧光子产率和消光系数。因此，观察到的两个探针之间的性能差异不是由于染料本身而是反映本发明探针的优良设计。 
制造5′末端具有FAM和3′末端具有TAMRA的FAM标记的MCG TaqMan探针，并与具有相同序列的双标记的CR110探针(5′-(6CR110-L3-)CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCC(-L1-6CR110)-3′(SEQ ID NO.7)在PCR中相比较。图3B显示分别为1000nM(迹线115对比迹线119)，500nM(迹线116对比迹线120)，250nM迹线117对比迹线121)，和125nM(迹线118对比迹线122)的上述同型双标记的CR110探针与TaqMan探针的扩增图。所有的扩增从一百万个拷贝含有MCG片段的质粒开始。在饱和浓度(1000nM)，同型双标记的探针比TaqMan探针的信号强度强60％。双标记的CR110探针使用TaqMan探针的一半浓度而获得相同信号强度。 
现在由ABI以引物和探针的20x混合物形式提供FAM标记的cMyc TaqMan探针。探针具有未公开的序列并包括位于其3′末端的MGB。对TaqMan探针和双标记CR110的探针(5′-(6CR110-L3-)CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCC(-L1-6CR110)-3′(SEQ ID NO.7)进行比较。图3C显示所述TaqMan探针(迹线110)和1000nM(迹线111)，500nM(迹线112)，250nM(迹线113)和125nM(迹线114)的同型双标记的CR110探针的扩增图。所有的扩增使用相同浓度的来自Invitrogen的人脑cDNA。在饱和浓度(1000nM)，同型双标记的探针比TaqMan探针的信号强度强。掺入MGB可以进一步  提高本发明探针的性能。 
实施例5 
双染料标记的和单染料标记的寡核苷酸的UV/Vis吸收光谱以及其S1核酸酶消化的寡核苷酸 
这个实验的目的是证明在根据本发明标记有两个报告染料的寡核苷酸的染料之间没有物理接触。为了证明染料不必彼此接触，本发明人合成了3种相同序列的CR110-标记的寡核苷酸：1)在3′和5′双标记的GAPDH探针(SEQ ID No.3，表1)；2)在5′单标记的GAPDH探针序列(SEQ ID No.7，表1)；以及3)在3′单标记的GAPDH探针序列(SEQ IDNo.8，表1)。两个单标记的寡核苷酸被制备用作对照。 
S1缓冲液中的三种标记的寡核苷酸的光谱分别显示在图4A(迹线29)，4B(迹线31)以及4C(迹线33)。为评价染料的光谱怎样受到染料周围微环境的影响，用S1消化标记的寡核苷酸然后测量光谱(图4A(迹线28)，4B(迹线30)和4C(迹线32))。通过添加20单位S1核酸酶(Promega，Madison，WI)到含有250到500nM探针的S1缓冲液(50mM乙酸钠(pH 4.5)，280mM NaCl，和4.5mM ZnSO4)的100μl反应溶液中而进行消化。S1消化几乎在添加S1后立刻完成，可以通过后面的UV/Vis吸收光谱的变化而证实。然而，在37℃温育1小时后测量光谱以保证完全消化。 
如图所示，所有的三种标记的寡核苷酸在可见光波长范围具有几乎相同的吸收光谱，表明双标记的探针没有染料聚集物，其特征通常为吸收光谱形状或分布图的显著变化(参见实施例7)。双标记的探针的形状(图4A，迹线29)和消化探针的形状(图4A，迹线28)相仿的事实进一步证明没有形成染料二聚体。从迹线29到迹线28总体波长的轻微位移，与吸收峰值形状的改变相反，是由于染料周围微环境的差异，类似于溶剂效应。可以预料，这个“溶剂效应”对于所有的三种标记的寡核苷酸是相似的(图4A迹线28对比迹线29；图4B迹线30对比  迹线31；和图4C迹线32对比迹线33)。 
实施例6 
用同型双标记的探针和两个单标记的对照寡核苷酸监测的GAPDH的扩增 
这个实验的目的是证明本发明探针的优越性能不是由于采用的染料任何的独特性，而是在于新颖的探针设计。本发明人合成三种标记的寡核苷酸，它们均具有相同的GAPDH探针序列：1)用5-CR110在3′和5末端双标记的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.3，表1)；2)用5-CR110在5′末端单标记的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.10，表1)；和3)用5-CR110在3′末端单标记的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.11，表1)。然后测试标记的寡核苷酸作为潜在的探针，使用与实施例3相同的条件，用于扩增GAPDH基因片段的实用性。 
图4D显示使用3种标记的寡核苷酸作为潜在的探针扩增GAPDH基因的动态图。双标记的探针产生典型的动态图(图4D迹线34)，而在相同扩增条件下两种单标记的寡核苷酸不对应于扩增动力学(图4D迹线35和36)。所有三个反应的成功的基因扩增通过琼脂糖凝胶电泳使用溴化乙锭作为染色剂证实。因此，缺乏来自单标记的寡核苷酸的反应不是由缺少扩增产物引起的。这些结果提示根据本发明各种实施方案制造的探针的优良性能是探针设计新颖的结果。改进不是由染料的独特性质或单独的染料连接到寡核苷酸的方式或通过染料和寡核苷酸之间的相互作用引起的。 
实施例7 
本发明同型双标记的探针与相似的分子信标探针的光谱比较 
这里本发明人比较本发明具有报告染料的双标记的探针与根据现有技术具有物理上接触的染料对的探针的吸收光谱。目的是进一步证明与现有技术的探针不同，本发明双标记的探针不形成染料聚集物。 
合成3′和5′末端分别具有胺基的GAPDH茎环序列，5′-(Am-L3-)CCAAGCGGCTGAGAACGGGAAGCTTGGCTTGG (-L1-Am)-3′，其中在下面划线的核苷酸表示形成茎的序列。然后这个胺改性的序列通过分别与6-CR110(SEQ ID No 12，表1))，6-TAMRA(SEQID No 13，表1)和6-ROX(SEQ ID No 14，表1)的琥珀酰亚胺酯反应，用于合成三种同型双标记的分子信标探针。同样，本发明三种对应的同型双标记的探针通过将双胺改性的序列(Am-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-Am)分别与6-CR 110((SEQ ID No 21，表1)，6-TAMRA(SEQ ID No 22，表1)和6-ROX(SEQ ID No 23，表1)的琥珀酰亚胺酯反应而制造。以～0.5μM在10mM Tris缓冲液(pH 8.0)中、25℃下和Shimadzu 1201UV/Vis光谱仪上测量本发明的上述茎环探针和其对应物的光谱。为比较的方便，各对信标探针和本发明的对应探针分别显示在图5A，5B和5C中。所有同型双标记的信标探针显示较短的波长肩峰，其表明形成染料二聚体(Blackman等，2002，Biochemistry；Packard等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.)。另一方面，本发明的探针光谱类似于单标记的寡核苷酸或消化的标记的寡核苷酸的光谱(参见实施例5)。 
实施例8 
本发明双标记的探针与对应的同型双标记的信标探针信号强度的比较 
这个实验证明本发明同型双标记的探针比对应的双标记的信标探针要灵敏数倍。 
使用与实施例4相同的引物和条件自含有GAPDH基因片段(SEQID No.24)的pTOPO质粒扩增GAPDH基因。来自实施例7的六种探针各自(三种本发明同型双标记的探针和三种对应的信标探针)以四种不同探针浓度125nM，250nM，500nM和1mM用于扩增反应。进行额外的扩增循环以保证所有的反应完全。此外，凝胶电泳显示所有三个反应形成等量的扩增PCR产物。本发明同型双标记的探针和有关的  信标探针各对的动态图分别示在图6A，6B和6C。 
图6A，6B和6C的数据清楚地显示本发明的探针比对应的信标探针在相同浓度使用时要灵敏数倍。图中还显示信标探针即使在1mM浓度也没有变得完全饱和，而本发明有关探针显示在250nM或附近饱和。这种滞后的饱和是由于开放和闭合的信标构型之间的平衡，其使得在给定时刻只有探针总数的一小部分有效与靶序列杂交(图7)。 
实施例9 
标记有FAM和CR110混合物的探针 
这个实验证明本发明的寡核苷酸可以标记有报告染料的混合物。 
为合成标记有单个6-FAM和单个6-CR110的探针，将双胺改性的GAPDH探针序列5′-(Am-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-Am)-3′与6-FAM SE和6-CR110SE的1∶1混合物反应。标记反应产生四种双标记的产物：1)5′-(6-FAM-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-FAM)-3′；2)5′-(6-FAM-L3-)CAAGCTTCCCGTTC予TCAGC(-L1-6-CR110)-3′；3)5′-(6-CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-FAM)-3′；4)5′-(6-CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-CR110)-3′。产物通过C18RP HPLC纯化，对应于产物1)和4)的峰通过比较单独制备产物的HPLC保留时间而鉴定。在产物1)和产物4)的保留时间之间的峰被分配为那些两个异型双标记的探针，收集级分并通过UV/Vis分光术分析。图8A显示产物1)(迹线80)，产物2)和3)(迹线81)和产物4)(迹线82)的UV/Vis谱。异型双标记的探针(产物2)和3)的光谱落入两个同型双标记的探针的光谱之间，正如预料的那样。分离的探针然后被用作在与实施例4使用的相同条件下扩增GAPDH基因的探针。图8B显示使用分离的探针扩增GAPDH基因的动态图。 
或者，异型双标记的寡核苷酸可以经由合成基于FRET的探针或  引物的传统方法通过在单独的步骤中连接染料而制造。然而，这个实施例描述的合成步骤可以作为迅速筛选最适合染料对的途径，所述染料对可产生标记的寡核苷酸的最佳性能。 
实施例10 
同型双标记的引物 
这些实验显示了本发明的寡核苷酸作为监测RT-PCR的荧光引物的应用。 
在第一个实验中，用于GAPDH基因扩增的荧光正向引物(5′-(5-CR110-L3-)GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQNo.15，表1)通过将5-CR110SE与双胺改性的引物5′-(Am-L3-)GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-Am)C-3′反应而合成，其中一个胺通过C6脂肪族接头连接到5′磷酸，而另一胺通过10原子的脂肪族接头连接到NO.18脱氧核苷dT的碱基(合成细节参见实施例1)。使用与实施例4中相同的条件进行GAPDH基因扩增，除了：1)不使用探针；2)正向引物被上述同型双标记的荧光引物取代；和3)使用三种模板拷贝数：一百万，一千和零(对照)。图9A显示扩增分布图，其中迹线87，88和89分别代表模板拷贝为一百万，一千和NTC。 
在第二个实验中，本发明人合成与上述正向荧光引物相同的另一双标记的荧光引物，除了恰好在5′末端删除G，(5′-(5-CR110-L3-)AAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQ ID No 16，表1)。相似的，使用与第一个实验相同的三种模板拷贝数进行PCR反应。图9B显示扩增分布图，其中迹线90，91，和92分别代表模板拷贝数为一百万，一千和零。结果表明本发明同型双标记的引物的成功应用不是由于G核苷酸相关的荧光淬灭/去淬灭，LUX引物的工作机制(Nazarenko等，2002，Nucleic Acid Research)。 
在第三个实验中，本发明人通过将5-CR110SE与双胺改性的反  向引物5′-(Am-L2-)GAAGATGGTGATGGGATT(-L2Am)TC-3′反应而合成了同型双标记的反向引物5′-(5-CR110-L3-)GAAGATGGTGATGGGATT(-L35-CR110)TC-3′(SEQNo 17，表1)，其中一个胺通过C6脂肪族接头连接到5′磷酸，而另一胺通过10原子脂肪族接头连接到NO.18核苷酸dT的碱基。相似的，使用与第一个实验相同的条件扩增GAPDH基因，除了1)使用一般的正向引物和2)使用上述同型双标记的反向引物。图9C显示扩增分布图，其中迹线93，94，和95分别代表模板拷贝数为一百万，一千和零。来自第一个和第二个实验的数据表明无论是正向引物还是反向引物可以根据本发明进行荧光标记用于检测核酸。 
为排除由染料与和靶杂交前后的寡核苷酸之间相互作用的差异引起同型双标记的引物荧光淬灭/去淬灭的可能性，本发明人合成了两种对照引物，一种具有单个5′末端标记物(5′-(5-CR110-L3-)GAAGGTGAAG GTCGGAGTC-3′，SEQ No 18，表1)，另一种具有通过10原子接头连接到No.17dT的碱基的单个5-CR110(5′-(AAGGTGAAGG TCGGAGT(-L2-5-CR110)C)-3′，SEQ No19，表1)。如图9D和9E所示，5′末端标记的引物(图9D的迹线97)或dT-标记的引物(图9E的迹线99)都没有对PCR反应作出反应，尽管终产物的凝胶电泳显示两个PCR反应都正常进行。 
在另一个对照实验中，本发明人合成了具有染料5-CR110通过10原子的柔性接头连接到No.18dT核苷酸的单标记的正向引物(5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQ No 20，表1)。与实验1)和3)的同型双标记的引物类似，当该引物被引入PCR产物后其的确对扩增反应作出反应。对于这一观察可能的解释是，恰好5′末端的dG核苷酸可以成环至3′末端上方以淬火荧光团，正如LUX引物中的情形一样(图9F)。为检测这个假说，本发明人合成了单标记的正向引物，其5′-末端dG被除去(5′-AAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQ No 19，表1)。如图9E所示，该引物不能对扩增反应作出反  应。这个结果，加上本实施例第二个实验的结果，表明在缺少核苷酸G相关的荧光下，本发明淬灭/去淬灭的荧光寡核苷酸需要至少两种报告染料。 
实施例11 
利用一对同型双标记探针的SNP分型 
Tapp等人显示使用一对TaqMan探针进行SNP分型，该探针各自对于在雌激素受体基因密码子10的C到T的转换分别标记有FAM和TET。这个实验证明一对AllGlo标记有CR110或R6G、分别代替FAM和TET的探针，同样能实现上述目的。 
SNP分型反应在20μl反应体系中进行，包含10mM Tris(pH 8.0)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，2mM各dNTP，1单位AmpliTaq Gold(ABI，Foster  City，CA)，0.5μM正向引物5′-CCACGGACCATGACCATGA-3′(SEQ ID NO.26)，0.5μM反向引物5′-TCTTGAGCTGCGGACGGT-3′(SEQ ID NO.27)，0.2μMERcodon10C探针，5′-(6-CR110-L3-CCAAAGCATCCGGGATGGCC(-L1-6-CR110)-3′(SEQ ID No.28)，2μM ERcodon10T探针，5′-(5-R6G-L3-CCAAAGCATCTGGGATGGCC(-L1-5-R6G)-3′(SEQ IDNo.29)，和待分型的模式质粒DNA。反应图设定在95℃7分钟，随后95℃15秒和60℃20秒进行50次循环。在60℃步骤同时测量来自FAM和TET通道的荧光。纯合子CC模型基因型的组成为106拷贝的质粒pER(C)，含有位于雌激素受体基因密码子10侧翼的106bp插入物的pTOPO质粒，其中SNP是C(SEQ ID No.30)；纯合子TT模型基因型的组成为106拷贝的质粒pER(T)，含有雌激素受体基因密码子10侧翼的106bp插入物的pTOPO质粒，其中SNP是T(SEQ ID No.31)；杂合子CT基因型的组成为0.5×105拷贝的pER(C)和0.5×105拷贝的pER(T)。三种基因型显示三种相异的扩增分布图模式，这些模式如下：纯合子CC有高CR110信号(迹线131，图10A)和非常低的R6G信号(迹线132，图10A)；纯合子TT具有低CR 110信号(迹线135，图10C)  和高R6G信号(迹线136，图10C)；杂合子CT具有中等水平CR 110信号(迹线133，图10B)和中等水平R6G信号(迹线134，图10B)。 
实施例12 
使用Exo-DNA聚合酶的扩增 
这个实验证明exo-DNA聚合酶在实时PCR中的应用，其中通过杂交代替切割探针而监测所述荧光信号。扩增在含有预混合的缓冲液和Titanium Taq(BD Biosciences，Mountain View，CA)的20μl反应溶液中进行。扩增pTOPO质粒中的HCV基因片段(SEQ ID 32)，使用2μM正向引物5′-GCACGAATCCTAAACCTCAAAA-3′(SEQ IDNo.33)，0.2μM反向引物5′-GGCAACAAGTAAACTCCACCAA-3′(SEQ ID No.34)。终浓度0.5μM的双6-ROX-标记的HCV探针，5′-(6-ROX-L3-ATCTGACCACCGCCCGGGAAC-(-L1-6-ROX)-3′(SEQ IDNo.35)被用于各反应中。加热方案设定为95℃2分钟，随后95℃15秒，60℃20秒和72℃5分钟运行50次循环。在60℃步骤测量荧光。对模板进行系列10倍稀释以产生扩增图的滴定曲线。图12显示以106拷贝的模板(迹线140)直到1个拷贝的模板(迹线146)开始的上述反应的扩增图。NTC(无模板对照，迹线148)也显示在图中。插入物显示Ct值与起始拷贝数的对数反相关(迹线148)。 
本说明书中引用的所有的公开物，专利，和专利申请在此处引作参考，正如各公开物，专利，或专利申请被特定和单独地指定以其全文引作参考和阐述一样。 
除非特别鉴定为相反的结果，此处使用所有的术语用来包括其标准的和通常的专业名词。此外，尽管此处描述和示例了具有特定的组分和步骤的诊断测试和医疗装置的各种实施方案，应当理解可能的情况下任何选定的实施方案可以包括另一个实施方案中描述的一种或者多种特定的组分和/或步骤。 
另外，所有此处陈述的操作理论，证据，或发现意在进一步增强对本发明的理解，而不是用于使本发明的范围依赖于这样的理论，证据或发现。 
虽然本发明已经在附图和前面的描述中有详细的说明和描述，但这些应当被认为在性质上是说明性的而不是限制性的，应该理解只显示和描述了优选实施方案，而本发明精神的范围内所有的改变和修改都是应该得到保护的。虽然本发明使用特定的实施例，和理论论据，蛋白质和DNA序列，解释和例证，来说明本发明，然而这些实施例，论据，示例，序列，解释和相关的讨论不应以任何方式被认为是对本发明的限制。说明书的摘要被包括在内是为了便于检索本文件的目的，摘要不是发明概述，其不应用于解释或限制权利要求书或说明书。 
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Claims (9)

1.一种标记的寡核苷酸，包括：
与靶多核苷酸序列杂交的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其3′末端被封闭以阻止延伸入产物中；和
与所述寡核苷酸序列连接的至少两种光度标记分子；
其中所述至少两种光度标记分子的激发波长彼此在15nm以内；
其中与所述寡核苷酸连接的至少两种光度标记分子彼此在3-60个核苷酸以内；
其中所述寡核苷酸基本没有内部二级结构；以及
其中当至少两种所述光度标记分子被永久性彼此分开时，所述寡核苷酸产生可检测信号的增加。
2.权利要求1的标记的寡核苷酸，其中所述至少两种光度标记分子是荧光分子。
3.权利要求1的标记的寡核苷酸，其中所述至少两种光度标记分子中的至少一种选自BODIPY，具有离域正电荷的花青素染料，兼性花青素染料，呫吨染料分子，非磺酸化花青素染料分子，CR110，CR6G，TAMRA和ROX。
4.一种标记寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
提供与靶多核苷酸序列杂交的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其3′末端被封闭以阻止延伸入产物中；和将至少两种光度标记分子连接到所述寡核苷酸；其中所述至少两种光度标记分子的激发波长彼此在15nm以内；其中与所述寡核苷酸连接的至少两种光度标记分子彼此在3-60个核苷酸以内；
其中所述寡核苷酸基本没有内部二级结构；以及
其中当至少两种所述光度标记分子被永久性彼此分开时，所产生的标记的寡核苷酸产生可检测信号的增加。
5.一种标记寡核苷酸的试剂盒，包括：
适合杂交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其3′末端被封闭以阻止延伸入产物中；和适合连接到所述寡核苷酸的至少两种光度标记分子，使得至少两种光度标记分子彼此在3-60个核苷酸以内连接到所述寡核苷酸；
其中所述至少两种光度标记分子的激发波长彼此在15nm以内；
其中所述寡核苷酸基本没有内部二级结构；以及
其中当至少两种所述光度标记分子被永久性彼此分开时，所产生的标记的寡核苷酸产生可检测信号的增加。
6.一种使用标记的寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
提供标记的寡核苷酸，
其中所述标记的寡核苷酸包括适合杂交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其3′末端被封闭以阻止延伸入产物中；以及至少两种光度标记分子；
其中所述至少两种光度标记分子的激发波长彼此在15nm以内，以及其中所述光度标记分子彼此在3-60个核苷酸以内连接到所述寡核苷酸；
其中所述寡核苷酸基本没有内部二级结构；以及
其中当至少两种所述光度标记分子被永久性彼此分开时，所述寡核苷酸产生可检测信号的增加。
7.权利要求6的使用标记的寡核苷酸的方法，其中所述样品选自组织提取物，细胞提取物，体液，体外核酸合成反应和PCR反应混合物。
8.权利要求6的使用标记的寡核苷酸的方法，其中所述标记的寡核苷酸用于核酸扩增反应中，所述反应选自PCR，多重PCR，实时PCR，定量PCR，和实时定量PCR。
9.权利要求6的使用标记的寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸是用于鉴定所述样品中存在核酸聚合物靶序列的探针。
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