CN103502474B - 包含经由连接基连结的标记的寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种标记的核苷酸，所述核苷酸包含经由连接基连结的标记，其中所述的标记核苷酸具有化学式其中R¹为带负的净电荷的残基，优选地选自磷酸根基团和硫酸根基团；其中R²、R³和R⁴独立地选自H₂、OH₂和O；其中“n”为0至16的整数；其中“a”为1至10的整数；其中SP不存在或为间隔基；其中X为所述的标记；并且其中Y为核苷酸或核苷。此外，在此处公开了包含本发明的标记核苷酸的寡核苷酸和其在扩增类方法中作为引物的用途。

Description

包含经由连接基连结的标记的寡核苷酸

技术领域

本发明涉及生物学领域，更具体地是分子生物学领域。更特别地，它涉及核酸、优选RNA和DNA分子的扩增和检测领域。

背景技术

当今，核酸例如DNA的扩增和检测用于不同的方法中。在很多常规诊断学中，扩增核酸的分析是经由毛细管电泳进行的。该方法根据DNA分子的长度分离被分析物，并且通过荧光标记检测它们。在得到的电泳图谱中，根据峰鉴别某一长度的DNA分子。但是，由于人工产物、例如降解的产物或引物的原因，基线以上的小峰（背景峰）的出现导致了灵敏度的损失。这些背景峰代表游离的荧光标记和/或包含所述标记的短寡核苷酸（1至8个碱基）。

本发明基于的一个问题是提供具有增强的稳定性的标记寡核苷酸，以减少背景峰并且增强检测的灵敏度。

发明内容

发明人令人预料不到地发现，用如下的寡核苷酸作为引物减少了在扩增产物分析中的背景峰，其中所述寡核苷酸包含如下的核苷酸，所述核苷酸经由此处下文公开的含负电荷残基的C-连接基连结标记。因此，本发明涉及一种标记的核苷酸，所述核苷酸包含经由连接基连结的标记，其中所述的标记核苷酸具有化学式

其中R¹为带负的净电荷的残基，优选地选自磷酸根基团和硫酸根基团；

其中R²、R³和R⁴独立地选自H₂、OH₂和O；

其中n为0至16的整数；

其中“a”为1至10的整数；

其中SP不存在或为间隔基；

其中X为所述的标记；并且

其中Y为核苷酸或核苷。

本发明还涉及如下的寡核苷酸，其包含至少一个本发明的标记核苷酸。

此外，本发明涉及包含如下寡核苷酸的试剂盒，所述寡核苷酸包含本发明的标记核苷酸。

本发明还涉及本发明寡核苷酸的用途，其在核酸扩增方法中用作引物。此外，本发明涉及本发明寡核苷酸的用途，其用作杂交探针。

发明详述

本发明的标记核苷酸包含经由连接基连结的标记，其中所述的标记核苷酸具有如下的化学式

该化学式如上文所述的。但是，优选的实施方式将在下文中描述。

在本发明的一个优选实施方式中，R¹为磷酸根基团。

发明人发现，通过增加重复单元的数量（由“a”表示），电泳图谱中染料斑点的减少增加。但是，本领域普通技术人员将意识到，增加C₃-重复单元的数量也会增加所述标记核苷酸或寡核苷酸的成本。因此，在本发明的一个实施方式中，“a”选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。发明人令人预料不到地发现，两个重复单元多次使得所述寡核苷酸和扩增产物在稳定性方面具有优良性能。因此，在本发明的一个优选实施方式中，“a”选自1、2和3,优选地，“a”为2。

在本发明的一个实施方式中，n为1，R²、R³、和R⁴各自为H₂，并且R¹为磷酸根基团；且“a”为2。

重复单元的长度可根据需要进行改变。因此，在本发明的一个实施方式中，n为0至16的整数。但是，发明人令人预料不到地发现，重复长度为3时确实显示出了特别好的性能。因此，在本发明的一个实施方式中，n为1。在这种情形下，所述的标记核苷酸具有如下的化学式：

其中R¹为带负的净电荷的残基，优选地选自磷酸根基团和硫酸根基团；

其中R²、R³和R⁴独立地选自H₂、OH₂和O；

其中“a”为1至10的整数；

其中SP不存在或为间隔基；

其中X为所述的标记；并且

其中Y为核苷酸或核苷。

在此公开的适用于化学式1的所有实施方式，即不包括有关“n”的实施方式，也适用于化学式2。但是，在化学式2的一个实施方式中，R²、R³和R⁴、各自为H₂，且R¹为磷酸根基团；并且“a”为2。

在一个实施方式中，X选自如下的标记：荧光团、生色团、放射性同位素、化学发光团和酶。在一个优选实施方式中，X是荧光团，优选地选自如下的荧光团：5-或6-羧基荧光素（FAM^TM)，VIC^TM，NED^TM，荧光素，异硫氰酸荧光素（FITC），IRD-700/800，花青染料，例如CY3^TM、CY5^TM、CY3.5^TM、CY5.5^TM、Cy7^TM，氧杂蒽，6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素（HEX），6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯-荧光素（TET），6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素（JOE^TM），N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA^TM），6-羧基-X-罗丹明（ROX），5-羧基罗丹明-6G（R6G5），6-羧基罗丹明-6G（RG6），罗丹明，罗丹明绿，罗丹明红，罗丹明110，罗丹明6GBODIPY染料，例如BODIPYTMR，俄勒冈绿，香豆素，例如7-羟基香豆素，苯甲酰亚胺，例如Hoechst33258；菲啶，例如德克萨斯红加利福尼亚红雅吉瓦黄，AlexaFluor350，AlexaFluor405，AlexaFluor430，AlexaFluor488，AlexaFluor500，AlexaFluor514，AlexaFluor532，AlexaFluor546，AlexaFluor555，AlexaFluor568，AlexaFluor594，AlexaFluor610，AlexaFluor633，AlexaFluor647，AlexaFluor660，AlexaFluor680，AlexaFluor700，AlexaFluor750，PET溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶吖啶染料，咔唑染料，吩嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料，Atto390，Atto425，Atto465，Atto488，Atto495，Atto520，Atto532，Atto550，Atto565，Atto590，Atto594，Atto620，Atto633，Atto647N，Atto655，AttoRhoG6，AttoRho11，AttoRho12，AttoRho101，BMN^TM-5，BMN^TM-6，CEQ8000D2，CEQ8000D3，CEQ8000D4，DY-480XL，DY-485XL，DY-495，DY-505，DY-510XL，DY-521XL，DY-521XL，DY-530，DY-547，DY-550，DY-555，DY-610，DY-615，DY-630，DY-631，DY-633，DY-635，DY-647，DY-651，DY-675，DY-676，DY-680，DY-681，DY-700，DY-701，DY-730，DY-731，DY-732，DY-750，DY-751，DY-776，DY-780，DY-781，DY-782，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素（JOE)，TET^TM，CALFluorGold540，CALFluorRED590，CALFluorRed610，CALFluorRed635，IRDye700Dx，IRDye800CW，玛丽娜蓝太平洋蓝雅吉瓦黄6-(4,7-二氯-2′,7′-二苯基-3′,6′-二新戊酰荧光素-6-羧氨基)-己基-1-O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺（SIMA），CALFluorGold540，CALFluorOrange560，CALFluorRed635，Quasar570，Quasar670，LIZ，森尼韦尔红，LCRed610，LCRed640，LCRed670，和LCRed705。在本发明的进一步优选的实施方式中，X选自以下的荧光团：Atto465，DY-485XL，FAM^TM，AlexaFluor488，DY-495，Atto495，DY-510XL，JOE，TET^TM，CALFluorGold540，DY-521XL，罗丹明6G雅吉瓦黄Atto532，AlexaFluor532，HEX，SIMA，AttoRhoG6，VIC，CALFluorOrange560，DY-530，TAMRA^TM，Quasar570，Cy3^TM，NED^TM，DY-550，Atto550，AlexaFluor555，PETCALFluorRED590，ROX，德克萨斯红CALFluorRed610，CALFluorRed635，Atto633，AlexaFluor633，DY-630，DY-633，DY-631，LIZ，Quasar670，DY-635，和Cy5^TM。在又进一步优选的实施方式中，X选自以下的荧光团：FAM^TM，DY-510XL，DY-530，和Atto550。在本发明的又进一步优选的实施方式中，n为1，R²、R³和R⁴各自为H₂，且R¹为磷酸根基团；a为2；并且X选自以下的荧光团：Atto465，DY-485XL，FAM^TM，AlexaFluor488，DY-495，Atto495，DY-510XL，JOE，TET^TM，CALFluorGold540，DY-521XL，罗丹明6G雅吉瓦黄Atto532，AlexaFluor532，HEX，SIMA，AttoRhoG6，VIC，CALFluorOrange560，DY-530，TAMRA^TM，Quasar570，Cy3^TM，NED^TM，DY-550，Atto550，AlexaFluor555，PETCALFluorRED590，ROX，德克萨斯红CALFluorRed610，CALFluorRed635，Atto633，AlexaFluor633，DY-630，DY-633，DY-631，LIZ，Quasar670，DY-635，和Cy5^TM。在本发明的甚至更优选的实施方式中，n为1，R²、R³和R⁴各自为H₂，并且R¹为磷酸根基团；a为2；并且X为选自FAM^TM、DY-510XL、DY-530和Atto550的荧光团。

此外，所述的连接基可包含现有技术中已知的间隔基（SP）。在本发明的上下文中，所述连接基经由磷酸根基团(PO₄)分别连结至CR⁴或CR³。例如C₅-间隔基或C₆-间隔基可用于本发明的标记和连接基之间，优选地，所述间隔基为支链的或非支链的氨基连接基。在另外优选的实施方式中，所述的间隔基选自C₂-至C₁₈-的间隔基，优选地，所述的间隔基选自C₃-间隔基至C₁₂-间隔基。在一个非常特别的实施方式中，所述的间隔基为C₅-间隔基或C₆-间隔基。在本发明的一个优选实施方式中，n为1，R²、R³和R⁴各自为H₂，并且R¹为磷酸根基团；且a为2以及X为选自FAM^TM、DY-510XL、DY-530和Atto550的荧光团，其中X包含所述荧光团和所述连接基之间的间隔基，优选C₂至C₁₈-间隔基，更优选C₃或C₁₂-间隔基，甚至更优选C₅-间隔基或C₆-间隔基，优选地为C₅或C₆氨基连接基。

本发明上下文中的氨基连接基通常指的是具有1至30个碳的碳链或者以(CH2CH2O)_n（n=2至400）表示的聚乙二醇。它们可以是支链的或非支链的。氨基连接基可用于将伯氨基团连接到寡核苷酸的5’-末端、3’-末端、环外的氨基基团或被改性的2’-位。活泼氨基基团可通过使用标记试剂而用于标记寡核苷酸，例如以N-羟基琥珀酰亚胺酯的形式。

本发明上下文中的术语“核苷酸”涉及连结到5’-碳糖（核糖或2’-脱氧核糖）和1至3个磷酸根基团的核苷碱基（含氮碱基）。所述的核苷碱基和5-碳糖形成核苷。所述的磷酸根基团可键合至所述糖的2’-、3’-或5’-碳上。然而，在一个优选的实施方式中，所述的磷酸根基团键合至5’-碳上。除非另外提示，本发明上下文中的核苷酸指的是在糖的5’-碳上具有磷酸根基团的核苷。在优选的实施方式中，所述核苷酸选自核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。在优选的实施方式中，所述的核苷酸选自嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸，优选地选自腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸和次黄苷核苷酸。还包括改性的核苷酸碱基，其中所述的核苷酸碱基例如为次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、黄苷、7-甲基鸟苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基胞苷。此外，也包括本发明上文描述的分子ddNTP。

本领域普通技术人员将认识到，为了用于后续的化学反应中或为了储藏的目的，对本发明的核苷酸进行保护是合乎需要的。因此，在本发明的一个实施方式中，所述的标记核苷酸还包含保护基团。保护基团是本领域普通技术人员已知的。保护基团例如可选自二甲氧基三苯甲基、5′-O-(α-甲基-6-硝基胡椒氧基羰基)、三氟乙酰基、单甲氧基三苯甲基、甲氧基甲基醚、β-甲氧基乙氧基甲基醚、甲硫基甲基醚、新戊酰基、四氢吡喃基、9-芴基甲氧基羰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、对甲氧基苯基、甲苯磺酰基例如来保护5′-羟基基团或氨基基团；选自苯甲酰基、苄基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、二甲基甲酰胺例如来保护环外的氨基基团；选自2-氰乙基和甲基例如来保护磷酸根基团和亚磷酸根基团；选自叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基例如来保护2′-羟基基团。

发明人令人预料不到地发现，将本发明的标记核苷酸引入寡核苷酸中能够给寡核苷酸带来增加的稳定性。此外，当使用所述的寡核苷酸作为扩增核酸的引物时，扩增产物的稳定性极大地增强。因此，本发明还涉及包含至少一个本发明的标记核苷酸的寡核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，本发明的标记核苷酸可位于寡核苷酸的不同位置，例如，在寡核苷酸的5’-末端或内部的位置处。如果本发明的寡核苷酸被用作杂交探针，那么本发明的标记核苷酸还可位于寡核苷酸的3’-末端处。然而，在本发明的寡核苷酸的一个优选的实施方式中，本发明的标记核苷酸位于寡核苷酸的5’-末端处。本领域普通技术人员很容易理解，本发明的连接基可连结到核苷酸中的糖的碳上或者可连结到核苷碱基上。在本发明的一个实施方式中，所述的连接基连结到核苷酸的核苷碱基上，优选连结到所述核苷碱基的环外氨基基团上。在本发明的一个优选实施方式中，所述的连接基连结到所述糖的5’-碳上。在本发明的一个更优选的实施方式中，R¹为磷酸根基团，并且Y为所述核苷碳的5’-碳。

在本发明的一个尤其优选的实施方式中，n为1，R²、R³和R⁴各自为H₂，且R¹为磷酸根基团；“a”为2且X为选自FAM^TM、DY-510XL、DY-530和Atto550的荧光团，其中SP为C₂至C₁₈-间隔基，更优选C₃至C₁₂–间隔基，甚至更优选C₅或C₆–间隔基，还更优选C₆-间隔基，并且其中Y为所述核苷糖的5’-碳。

将核苷酸或寡核苷酸连结到标记的方法是本领域普通技术人员已知的。本领域普通技术人员例如可以商业订购所需的连接基，即单独的重复单元，例如由已知的商业供应商例如GlenResearch或Berry提供的C3-连接基，并将其分别连结到核苷酸或核苷和所述的标记或间隔基上。然而，本领域普通技术人员此外还知晓生产所述连接基的方法。例如本领域普通技术人员知道生产含有不同保护基团（DMTr，TBDMS，Lev）的亚磷酸酰胺的方法（例如C3-亚磷酸酰胺；(3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酸酰胺)，其之后可用作连接基（例如参见SuJeongKim等人，“SynthesisofNovelPhosphoramiditeBuildingBlocksfromPentaerythritol”（从季戊四醇合成新型的亚磷酸酰胺结构单元）；Synlett2003，第12期；DOI：10.1055/s-2003-41406）。

本领域普通技术人员将认识到，本发明的寡核苷酸可适用于不同的应用。希望本发明寡核苷酸包含多于一个本发明的标记核苷酸。在一个实施方式中，所述的寡核苷酸包含1至4个本发明的标记核苷酸，优选1至3个本发明的标记核苷酸，更优选1或2个本发明的标记核苷酸，甚至更优选1个本发明的标记核苷酸。

本发明上下文中的“内部位置”是指，本发明的标记核苷酸不在本发明寡核苷酸的5’-或3’-末端处。如果本发明的标记核苷酸位于所述寡核苷酸的内部位置，那么希望该位置与3’-末端和/或5’-末端具有最小的距离。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的寡核苷酸具有如下的序列：

5’-N_bZN_c-3’，

其中N可以是任意的核苷酸，

其中“b”和“c”表示核苷酸的数量并且可以是1至150，优选3至50，甚至更优选3至25，又更优选4至15。在另外的实施方式中，“b”为1至150，优选3至50，甚至更优选3至25，又更优选4至15。在另外的实施方式中，“c”为1至150，优选3至50，甚至更优选3至25，又更优选4至15。

取决于方法，可希望所述的寡核苷酸包含另外的标记、淬灭剂、改性的核苷酸或无碱基位点。因此，在本发明的一个方面，本发明的寡核苷酸还包含另外的标记和/或淬灭剂和/或改性的核苷酸和/或非天然的核苷酸和/或无碱基位点。

淬灭指的是如下的任何处理，它降低给定物质的荧光强度。本发明上下文中的“淬灭剂”涉及残基，该残基无需活化即适于淬灭例如所述标记的基本荧光。许多处理能导致淬灭发生，例如激发态反应、能量转移、形成络合物以及碰撞淬灭。因此，淬灭通常非常依赖于压力和温度。分子氧和碘离子是常用的化学淬灭剂。猝灭为非瞬态光谱的方法例如激光诱导荧光带来了问题。淬灭是荧光共振能量转移（FRET）试验的基础。与特定分子生物靶标反应时的淬灭和反淬灭是分子成像的可活化光学造影剂的基础。存在数种不同的机理，根据这些机理能量可被非辐射性地转移：（无光子的吸收或发射）给体和受体的两种染料之间，共振能量转移，Dexter能量转移，激态络合物（Exciplex）形成，以及静态淬灭（也称为接触淬灭）。本领域普通技术人员能够根据需要选择淬灭剂。

“改性的核苷酸”为本领域普通技术人员所已知。然而，在本发明的一个实施方式中，改性的核苷酸选自锁核酸（LNA）或肽核酸（PNA）。

本发明上下文中的“无碱基位点”（还被称作AP位点（无嘌呤/无嘧啶位点））是核酸/寡核苷酸中的一个位置，该位置上既没有嘌呤也没有嘧啶碱基。无碱基位点已在如下文献中提及：“CompositionsandMethodsforEnhancingHybridizationandPrimingSpecificity”（提高杂交和引物特异性的组合物和方法）（US-B16,361,940）以及“MethodforLabel-freeDetectionofHybridizedDNATarget”（杂交DNA靶标的无标记检测的方法）（US-B16,579,680）和“UseofAbasicSite-ContainingDNAStrandsforNucleobaseRecognitioninWater”（含无碱基位点的DNA链用于识别水中的核苷碱基）Yoshimoto等人，JACSCommunications，网络公开，07/04/2003。

本领域普通技术人员还将认识到，本发明的寡核苷酸可由不同类型的核酸组成。因此，在一个优选实施方式中，所述的寡核苷酸由DNA、RNA、PNA或LNA组成。

本发明的寡核苷酸可由不同的长度组成。在本发明的一个实施方式中，寡核苷酸具有3到300个核苷酸、优选5到100个核苷酸、更优选6到50个核苷酸、甚至更优选15到30个核苷酸的长度。

本领域普通技术人员将公认，本发明的寡核苷酸可用于不同的目的，即引物或杂交探针。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明寡核苷酸为引物、杂交探针、蝎状引物、蝎状杂交探针、TaqMan探针或本领域普通技术人员已知的另外的功能性寡核苷酸。

然而，在一个另外的实施方式中，本发明的寡核苷酸是探针。多种标记探针是已知的。它们例如包含淬灭剂和标记。优选的是TaqMan探针、蝎状探针、分子信标、LightCycler探针、LUX探针、引物特异性（amplifluor）探针。

TaqMan探针是水解探针，它被设计用来增强实时PCR试验的特异性。所述TaqMan探针的原理是依赖Taq聚合酶的5′–3′核苷酶活性在杂交阶段分开双-标记探针以补充靶标序列和基于荧光团的检测。如在其它实时PCR方法中的，所得到的荧光信号在PCR的指数段中允许产物积聚的定量测量，然而，TaqMan探针显著地增强了检测的特异性。

和TaqMan探针一样，分子信标探针同样用FRET来检测和定量合成的PCR产物，其中经由连结到寡核苷酸的5′-末端的荧光团和连结到3′-末端的淬灭剂。与TaqMan探针不同，分子信标探针被设计成在扩增反应期间保持完整，并且必须在信号测量的每个扩增循环中与靶标物重新键合。分子信标探针在溶液中处于游离状态时形成茎环结构。因此，所述的荧光团和淬灭剂的紧密靠近阻止探针发出荧光。当分子信标探针杂交至靶标物时，所述荧光团和淬灭剂分开，FRET不会发生，并且所述荧光染料在照射下发光。

在蝎状探针的情况下，序列特异引发和PCR产物检测是使用单独的寡核苷酸实现的。蝎状探针在非杂交状态下保持茎环构型。荧光团连结到5′-末端处，并且被连结到3′-末端处的一部分淬灭。所述茎的3′部分还含有序列，该序列与引物的延伸产物互补。该序列经由非扩增的单体连结到特异引物的5′末端处。在蝎状引物延伸后，特异性探针序列能够键合到延伸扩增子中的补体上，因而打开发夹环。这阻止了荧光的淬灭，因而观测到信号。

LightCyclerFRET探针体系是一对单链的荧光标记的寡核苷酸。探针1（给体探针）在它的3′-末端处标记给体荧光团（通常是荧光素），而探针2（受体探针）在它的5′-末端处标记四个可用荧光团中的一个（红610、640、670或705）。探针2中的自由3′-羟基基团必须用磷酸根基团（P）封端以防止TaqDNA聚合酶延伸。为了避免两个探针上的给体和受体荧光团之间的任何位阻问题，两个探针之间应具有1至5nt（4至25距离）的间隔以互相隔开。在任何的实时定量PCR反应发生之前，可观察到管中的荧光背景。

优选地，所述的寡核苷酸是选自TaqMan探针、蝎状探针、分子信标探针、LightCycler探针、LUX探针和引物特异性探针中的探针，其中所述探针包含至少一个本发明的标记核苷酸。

此外，可希望用根据本发明所述的标记核苷酸标记不同长度的核酸。因此，本发明还涉及包含本发明标记核苷酸的核酸。根据本发明所述的核酸可还包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个本发明的标记核苷酸。所述的标记核苷酸可位于所述核酸中的不同位置处。在本发明的一个实施方式中，本发明的标记核苷酸位于本发明核酸的5’-末端处。在另外的实施方式中，本发明的标记核苷酸位于本发明核酸的3’-末端处。在又一另外的实施方式中，本发明的标记核苷酸位于本发明核酸的内部位置处。

此外本发明还涉及对核酸进行测序、或扩增和检测的方法，其包括以下步骤：

i）提供至少一种包含至少一个本发明的标记核苷酸的寡核苷酸或核酸引物，

ii）提供酶和试剂以扩增靶标核酸，其中使用所述的至少一种核酸引物，

iii）使反应成分在适合扩增靶标核酸引物的条件下孵育，

iv）通过本发明的标记核苷酸的标记来检测扩增的核酸。

在一个实施方式中，本发明的方法包括根据扩增产品的长度分离该扩增产品的步骤。因此，在一个实施方式中，本发明方法的步骤iv)包括一步根据扩增核酸的长度将其分离的步骤，优选在通过所述标记核苷酸检测所述扩增核酸之前。本领域普通技术人员知晓许多根据其长度分离核酸的方法。一个常用的方法是凝胶电泳。因此，在本发明的一个实施方式中，所述的根据其尺寸分离扩增核酸是利用凝胶电泳进行的。凝胶电泳是利用施加到凝胶基质上的电场而用来分离核酸分子的一项技术。术语“凝胶”指的是用来包含、然后分离所述靶标分子的基质。在大部分情形下，凝胶是交联的聚合物，它的组成和多孔性基于特定的重量/长度和待分析靶标的组成进行选择。当分离小核酸（DNA、RNA或寡核苷酸）时，凝胶通常由不同浓度的丙烯酰胺和交联剂构成，从而产生不同尺寸的聚丙烯酰胺的网状网络。丙烯酰胺可以是例如丙烯酰胺、直链聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺或聚异丙基丙烯酰胺。当分离大核酸（大于数百个碱基）时，纯化的琼脂糖可被选作基质。在两种情形下，凝胶都形成固体、然而多孔的基质。琼脂糖由长的非支链的无电荷糖类构成，其中无交联导致其具有大的空隙，从而可分离大分子和大分子络合物。因此，在本发明的一个实施方式中，用来分离所述核酸的基质是聚丙烯酰胺或琼脂糖。

凝胶电泳用于法医学、分子生物学、遗传学、微生物学和生物化学中。通过使用成像装置可视化凝胶中的标记核酸可对结果进行定量分析，所述成像装置通常包括光源，例如通过激光，来激发所述标记的荧光。从所述标记发出的信号被检测装置记录，并且测量谱带或斑点的强度。所述测量和分析通常要使用专门的软件进行，所述软件根据核酸的长度和检测的核酸数量将检测信号转化为电泳图谱。在本发明的一个优选实施方式中，所述扩增核酸的分离是通过毛细管凝胶电泳进行的。

在本发明所述方法的上下文中，“核酸”是指特定种类的核酸，尤其是RNA、DNA、cDNA（互补DNA）、LNA（锁核酸）、mRNA（信使RNA）、mtRNA（线粒体的）、rRNA（核糖体的RNA）、tRNA（转运RNA）、nRNA（核RNA）、siRNA（短的干扰RNA）、snRNA（小核RNA）、snoRNA（小核仁RNA）、scaRNA（小Cajal体特异性RNA）、microRNA、dsRNA（双链RNA）、核酶、核糖开关、病毒RNA、dsDNA（双链DNA）、ssDNA（单链DNA）、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、病毒DNA、mtDNA（线粒体的DNA）、nDNA（核DNA）、snDNA（小核DNA）等或者任何其它种类或亚类的核酸，其可从样品的大批核酸中分辨出来。

本发明此外还涉及包含本发明标记核苷酸的试剂盒。在另一个实施方式中，所述试剂盒包含本发明所述的寡核苷酸。在另外的实施方式中，所述试剂盒还包含聚合酶和任选地dNTP和/或NTP和/或ddNTP。所述试剂盒还可包含用于核酸扩增的缓冲溶液和试剂。

本发明所述的寡核苷酸可用作核酸探针或在核酸扩增方法中用作引物。

然而，发明人发现，本发明所述的寡核苷酸使得寡核苷酸本身以及所述的扩增产物都具有较高的稳定性。因此，在一个优选的实施方式中，本发明寡核苷酸是核酸扩增方法中的引物。在一个优选的实施方式中，本发明涉及本发明寡核苷酸在如下方法中的用途，所述方法选自聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、基于转录的扩增系统（TAS）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、滚环扩增（RCA）、转录介导的扩增（TMA）、自主序列复制（3SR）和Qβ扩增、链置换扩增（SDA）、多重置换扩增（MDA）、环介导等温扩增（LAMP）、解旋酶的依赖性扩增（HDA）、智能扩增方法（SMAP）、实时定量PCR（qPCR）、逆转录酶PCR（RT-PCR）。

具体实施方式

实施例

实施例1

所述PCR按照如下实施：

0.2μl的MultiTaq2DNA聚合酶（德国，希尔登，凯杰公司）用作热启动（Hot-start）DNA聚合酶。2.5μl反应MixB（德国，希尔登，凯杰公司）用作PCR缓冲溶液。

0.4μM标记的正向引物TH01-P-2xC3（5’-DY530-C6-C3-C3-gtgattcccattggcctgttc-3’；序列编号1）或0.4μM标记的正向引物TH01-P-DY530（5’-DY530-C6-gtgattcccattggcctgttc-3’；序列编号2）与0.4μM未标记的TH01_rev反向引物（5’-attcctgtgggctgaaaagctc-3’；序列编号3）组合用于PCR扩增，其中上述三种物质均由Biomers.net（德国乌尔姆）生产。通过无核酸酶水（德国，希尔登，凯杰公司）达到体积25μl。利用热循环仪9700PCR系统Gold（美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德，生命科技公司）并按照以下方案实施PCR。

表1：引物

表2：循环条件

将1μl循环的PCR探针添加到12μlHi-Di甲酰胺（美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德，生命科技公司）和0.5μl的DNA尺寸标准550（BTO）（德国，希尔登，凯杰公司）中，并且在95℃孵育3分钟。

通过毛细管电泳使用3500遗传分析仪（美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德，生命科技公司）在标准条件下对变性的PCR探针进行分析。结果显示在图1中。

这些结果清楚地表明，使用包含本发明标记核苷酸的标记引物即在本发明连接基的情况下，导致了不需要的人为峰的减少。在这些例子中，通过使用C3改性的PCR引物，在关键的130至550bp范围内的基线是完全干净的。在旁边的范围内，不需要的人为峰的高度和数量明显减少。与此相反，在5’末端处标记的标准的PCR引物导致大量的最高达110相对荧光单位（rfu）的人为峰。带有最低量模板DNA的PCR扩增通常导致PCR产物的峰在200rfu左右。使用标准的标记引物的情况下，对电泳图谱的解释受到大量高的人为峰（染料斑点）的损害，这导致不完整的探针评估。使用连接基改性的引物的情况下，200rfu的PCR产物可清楚地从特别是130至550bp范围内的染料斑点中分辨出来。这些优点给该方法的灵敏度带来巨大的优势。

实施例2

如上所述，当使用被包含两个C3-连接基重复单元（“n”为1且“a”为3）的连接基改性的引物时，背景噪音明显减小。然而，在另外的试验中，分析了不同数量的连结至所述标记引物的连接基重复单元。在一个实施例中，用上述方法分析在5’位置处包含本发明标记核苷酸的引物，其包含三个序列的C3-重复单元；即“a”为3（TH01-P-3xC3：5’-DY530-C6-C3-C3-C3-gtgattcccattggcctgttc-3’；序列编号4）连同所述未标记的反向引物TH01_rev（5’-attcctgtgggctgaaaagctc-3’；序列编号3）。结果显示在图2中。

这些结果表明，包含本发明标记核苷酸的引物同样导致背景噪音的减少，其中所述标记核苷酸包含三个C₃-重复单元。与标准的标记引物（参见图1）相比较，关键的130-550bp范围内的基线是完全干净的。此外，通过使用包含本发明标记核苷酸的引物，在旁边的范围内，不需要的人为峰的高度和数量同样明显减少。

附图说明

图1：本发明的标记核苷酸的效果。不具有模板DNA的PCR通过各自为0.4μM的正向引物和反向引物来实施。然后所述的PCR探针通过毛细管电泳进行分析。在（A）中，示出了具有标准标记引物的无模板控制的（NTC）PCR的结果。使用特异性标记引物（序列编号1）的NTC-PCR的结果显示在（B）中，其中所述引物包含本发明的标记核苷酸。包含本发明标记核苷酸的引物显著地减少了不需要的人为峰的数量和高度。在关键的130-550bp范围内，基线完全是平直的。

图2：不具有模板DNA的PCR通过各自为0.4μM的正向引物和反向引物来实施。然后所述的PCR探针通过毛细管电泳进行分析。示出了使用标记引物的无模板控制（NTC）的PCR的结果，其中所述引物包含本发明的标记核苷酸（序列编号4）。C3改性的引物显著地减少了不需要的人为峰的数量和高度。在130-550bp范围内，基线完全是平直的。

Claims (15)

1.一种标记的核苷酸，所述核苷酸包含经由连接基连结的标记，其中所述的标记核苷酸具有化学式

其中R¹选自磷酸根基团和硫酸根基团；

其中R²、R³和R⁴是H₂；

其中“n”为0至16的整数；

其中“a”为1至10的整数；

其中SP不存在或为C5或C6-氨基连接基的间隔基；

其中X为所述的标记；并且

其中Y为核苷酸或核苷。

2.根据权利要求1所述的标记核苷酸，其中R¹为磷酸根基团。

3.根据权利要求1或2所述的标记核苷酸，其中n为1，其中R²、R³和R⁴各自为H₂，并且其中R¹为磷酸根基团，并且其中“a”为2。

4.根据权利要求1或2所述的标记核苷酸，其中X选自如下的标记：荧光团，生色团，放射性同位素，和化学发光团，或酶，优选地选自5-或6-羧基荧光素(FAM^TM)，VIC^TM，NED^TM，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，IRD-700/800，花青染料，例如CY3^TM、CY5^TM、CY3.5^TM、CY5.5^TM、Cy7^TM，氧杂蒽，6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)，6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯-荧光素6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE^TM)，N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA^TM)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5)，6-羧基罗丹明-6G(RG6)，罗丹明，罗丹明绿，罗丹明红，罗丹明110，罗丹明BODIPY染料，例如BODIPYTMR，俄勒冈绿，香豆素，例如7-羟基香豆素，苯甲酰亚胺，例如Hoechst33258；菲啶，例如德雅吉瓦黄，Alexa350，Alexa405，Alexa430，Alexa488，Alexa500，Alexa514，Alexa532，Alexa546，Alexa555，Alexa568，Alexa594，Alexa610，Alexa633，Alexa647，Alexa660，Alexa680，Alexa700，Alexa750，溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶吖啶染料，咔唑染料，吩嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料，Atto390，Atto425，Atto465，Atto488，Atto495，Atto520，Atto532，Atto550，Atto565，Atto590，Atto594，Atto620，Atto633，Atto647N，Atto655，AttoRhoG6，AttoRho11，AttoRho12，AttoRho101，BMN^TM-5，BMN^TM-6，CEQ8000D2，CEQ8000D3，CEQ8000D4，DY-480XL，DY-485XL，DY-495，DY-505，DY-510XL，DY-521XL，DY-521XL，DY-530，DY-547，DY-550，DY-555，DY-610，DY-615，DY-630，DY-631，DY-633，DY-635，DY-647，DY-651，DY-675，DY-676，DY-680，DY-681，DY-700，DY-701，DY-730，DY-731，DY-732，DY-750，DY-751，DY-776，DY-780，DY-781，DY-782，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)，TET^TM，CALGold540，CALFluorRED590，CALFluorRed610，CALFluorRed635，700Dx，800CW，6-(4,7-二氯-2',7'-二苯基-3',6'-二新戊酰荧光素-6-羧氨基)-己基-1-O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(SIMA)，CALGold540，CALOrange560，CALFluorRed635，Quasar570，Quasar670，LIZ，森尼韦尔红，LC610，LC640，LC670，和LC705。

5.根据权利要求1或2所述的标记核苷酸，其中Y选自核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、2',3'-双脱氧核糖核苷酸、核苷一磷酸，核苷二磷酸和核苷三磷酸。

6.根据权利要求1或2所述的标记核苷酸，其中Y选自嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸。

7.根据权利要求6所述的标记核苷酸，其中Y选自腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、7-甲基鸟嘌呤核苷酸、5-甲基胞嘧啶核苷酸、次黄苷核苷酸、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄苷、黄苷、7-甲基鸟苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷和5-甲基胞苷，或它们的衍生物。

8.根据权利要求1或2所述的标记核苷酸，其还包含保护基团。

9.一种寡核苷酸，其包含至少一个根据权利要求1至8中的任一项所述的标记核苷酸。

10.根据权利要求9所述的寡核苷酸，其中所述的至少一个标记核苷酸位于所述寡核苷酸的5’-末端处或位于所述寡核苷酸的3’-末端处。

11.根据权利要求9所述的寡核苷酸，其中所述的至少一个标记核苷酸位于所述寡核苷酸的内部位置处。

12.包含根据权利要求9至11中的任一项所述的寡核苷酸的试剂盒。

13.根据权利要求9至11中的任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求12所述的试剂盒的用途，其在核酸扩增方法中作为引物或者作为杂交探针。

14.一种对核酸进行测序、或扩增和检测的方法，其包括以下步骤：

i)提供至少一种寡核苷酸或核酸引物，所述寡核苷酸或核酸引物包含至少一个根据权利要求1至8中的任一项所述的标记核苷酸，

ii)提供酶和试剂以扩增靶标核酸，其中使用所述的至少一种核酸引物，

iii)使反应成分在适合扩增靶标核酸引物的条件下孵育，

iv)通过标记核苷酸的标记来检测扩增的核酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤iv)包括根据扩增核酸的长度对其进行分离的步骤。