CN101709335B - 一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 - Google Patents
一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101709335B CN101709335B CN2009101552893A CN200910155289A CN101709335B CN 101709335 B CN101709335 B CN 101709335B CN 2009101552893 A CN2009101552893 A CN 2009101552893A CN 200910155289 A CN200910155289 A CN 200910155289A CN 101709335 B CN101709335 B CN 101709335B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hpv
- pcr
- probe
- quadruple
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims abstract description 83
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 13
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 12
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 claims description 8
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 36
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 208000021145 human papilloma virus infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004745 cervical carcinogenesis Effects 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 25
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 102100030500 Heparin cofactor 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710153650 Heparin cofactor 2 Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 4
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 4
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 4
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 4
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 4
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 3
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 206010048461 Genital infection Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009351 contact transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 201000000089 larynx squamous papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000014294 lung papilloma Diseases 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。它包括一个以荧光定量PCR技术为基础的四重PCR反应体系，包含针对4种人乳头瘤病毒(HPV)基因型的正、反向引物和AllGlo荧光探针，在适合的PCR条件下可在一个反应管中同时检测最多包括HPV-6、-11、-16、-18的DNA载量，包括特异性引物及荧光探针的设计、标准分子的构建、标准曲线制备及临床标本检测。本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型HPV感染，实现了单管PCR同时分型检测四型HPV，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，对尖锐湿疣及常见型HPV致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少HPV感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，具体地说，本发明涉及应用四重实时荧光定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四型人乳头瘤病毒(HPV-6，-11，-16，-18)的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种双链DNA病毒，通过人体接触传播，在多种皮肤黏膜的良、恶性增生和生殖器感染中较为常见，迄今为止，全世界已发现逾120多种HPV基因型，各型HPV与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性，一般分为高危型HPV和低危型HPV。
高危型HPV感染可以引起女性宫颈及其他生殖器癌变，而宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，全球每年约有50万新增病人，发病率在女性肿瘤中占第二位，但其死亡率则占第一位，95％以上的宫颈癌与人乳头瘤病毒感染有关。低危型HPV感染可导致宫颈上皮细胞轻度病变、产生生殖器疣、皮肤、经常性喉或呼吸道乳头状瘤等。在引起人类生殖器、肛门等部位感染的诸多基因型HPV中，最常见的只有四种基因型别HPV(HPV-6、-11、-16、-18)。一些研究表明，大约70％的宫颈上皮细胞发育不良和宫颈癌是有HPV-16，-18感染引起的，其中HPV-16约占55％，HPV-18约占10-15％，另外，相当一部分的阴道、外阴、肛门、阴茎等部位癌变与HPV-16、-18持续感染密切相关。在男女外生殖器病变中，90％以上的外生殖器疣是由HPV-6、，-11感染引起的，另外肛门疣也主要是HPV-6，-11感染造成的。在中国，约有90％的生殖器疣肛门疣由HPV-6、-11型引起，中国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95％，其中HPV-16、-18型占90％以上。
鉴于HPV-6、-11、-16、-18的高感染率及其危害性，预防HPV感染尤其是HPV-6、-11、-16、-18感染可以有效控制宫颈癌和尖锐湿疣等的发生，因此，全球很多公司都在研制HPV疫苗，Merck公司已经研制出了针对HPV-6、-11、-16、-18型的四价疫苗，并在很多国家得以应用，然而，在应用四价疫苗前，必须要了解被接种者是否感染了HPV，尤其是HPV-6、-11、-16、-18，只有在被接种者未感染HPV-6、-11、-16、-18情况下，才可以接种HPV四价疫苗，所以首先必须为接种者检测HPV-6、-11、16、-18，因此，同时快速准确的HPV-6、-11、16、-18分型检测意义重大。
HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养，亚临床感染常见，加之血清学试验又不能区别近期和远期感染，因此，对HPV感染的分型诊断，目前主要依赖分子生物学手段对病毒DNA进行检测。目前常用的方法有PCR、基因芯片技术、DNA测序和第二代杂交捕获法，其中杂交信号放大法的杂交捕获II代(HC-II)和靶DNA扩增法的PCR方法是目前应用最多的HPV-DNA检测方法。
但是，这些方法大多对操作人员要求高，试剂昂贵，同时所需临床标本量大，需对临床标本多次扩增及多次分离分析，技术复杂，无法在临床检测中快速高通量地检出患者感染的HPV病毒类型及病毒载量。目前第二代杂交捕获法(HC-II)是惟一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV-DNA的技术，但仍然存在不能分型和定量的缺点。
在PCR基础上发展起来的多重实时荧光PCR技术同时检测多种或型病毒也有应用。但是，目前报道的荧光定量PCR检测HPV要么通量低，要么技术复杂、试剂昂贵、要么未实现四型HPV单管同时定量检测，难以满足临床上同时检测多个亚型的需要。但是，由于荧光定量PCR方法由于成本低、方便快速、操作简单、可以定量等诸多优点，该方法值得优化提高从而能够在临床上广泛应用。
荧光定量PCR技术发展日新月异，美国AlleLogic Biosciences公司推出了最新一代荧光定量探针-AllGlo探针，它拥有普通TaqMan、TaqMan-MGB及Molecular Beacon探针所有优点。本研究通过检测AllGlo特异性探针的荧光增量得知检测结果，能在一个PCR反应中同时检测四型HPV，灵敏度、特异性和重复性都达到了95％。与HC-II方法相比，多重实时荧光PCR方法具有一下优势：灵敏度高，线性范围广，本研究所建立的多重实时荧光PCR方法灵敏度可以达到10Copies/Test，最高可达109Copies/Test。
本项研究采用AllGlo探针技术，设计了四对特异引物和相应的探针，应用四重荧光定量PCR技术同时检测四型HPV，并对该技术反应条件进行了优化，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重荧光定量PCR同时检测四型HPV的方法，适合于尖锐湿疣的快速早期预防和诊治，以及宫颈癌危险因素的评估，为生殖系统常见HPV感染的病程监测和疗效判断提供指导，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。
人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法包括如下步骤：
(1)引物设计：在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-11、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；
(2)荧光探针设计：根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
(3)标准分子的构建：根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；
(4)四重荧光PCR反应液组成：使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2×qPCR Mix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；
(5)四重荧光PCR反应的优化和建立：通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
(6)标准曲线制备：使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；
(7)临床标本检测：用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。
所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-11的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的L1基因。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一段基因序列。
所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。
所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
步骤(1)、(2)所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
HPV-6：
上游引物：GTTATCGCCTCCCCCAAAT
下游引物：ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG
探针：URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URA
HPV-11：
上游引物：TTGCGAAAGGAACAAATGTTT
下游引物：GGAAGACACCAATGAGCCACT
探针：MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MAR
HPV-16：
上游引物：AGGACCCACAGGAGCGAC
下游引物：AGTCATATACCTCACGTCGCAGT
探针：NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEP
HPV-18：
上游引物：GGTTCAGGCTGGATTGCG
下游引物：TACACGCACACGCTTGGC
探针：JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP
URA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及2×qPCRMix定量PCR试剂组成的混合液。
所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.98，扩增效率在1.00-1.25之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。
本发明根据四型HPV特异性基因的保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每型病毒筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针，用自制的不同浓度的标准分子(四型HPV靶基因质粒克隆载体)作为模板，在Qiagen Rotor Gene 6000荧光定量PCR仪中(能够同时检测5种荧光)进行单、四重荧光定量PCR实验，优化四重荧光定量PCR反应体系，确定该方法的灵敏度、特异性、重复性等，制备标准曲线，最后用该方法检测10份临床标本，同时与临床实验室在用的单重TaqMan方法检测结果进行比较，分析四重荧光定量PCR方法的可靠性。
本发明是一种临床最常见的四型人乳头瘤病毒(HPV)的早期、快速、简便而有效的四重实时荧光定量PCR检测方法，涉及的四型HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18，由于采用AllGlo荧光素标记探针，使其检测灵敏度大大提高，达到10-100个拷贝的病毒分子，对于单个检测样本检测时间约为1.5个小时，操作简便，并且可以特殊进行大批量的样本分析检测，较现有的单重荧光定量PCR技术在检测通量方面有了极大提高，较HC-II技术在检测灵敏度、耗时、定量等方面均有很大的提高或改进，对HPV感染的流行监控、快速鉴定、疗效判断及指导HPV四价疫苗的应用等方面具有很大帮助，其应用前景看好。
本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型HPV感染，对尖锐湿疣及常见型HPV致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少HPV感染、监测临床疗效等均有很大的临床价值。采用本发明提供的方法，解决了现有HPV的某些检测方法要么不能分型、要么不能检测多重感染、要么不能定量、或者成本高、操作繁琐等诸多缺陷，实现了单管PCR同时分型检测四型HPV，而且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性好，重复性好，结果准确可靠。
附图说明
图1-5是四型HPV四重荧光定量PCR特异性实验扩增图(各型HPV模板质粒量均为104Copies/μl：图1是HPV-6在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图2是HPV-11在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图3是HPV-16在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图4是HPV-18在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图。
图6-9是四型HPV四重PCR标准曲线：模板质粒量(Copies/μl)分别为(从左至右)为107、106、105、104、103。
具体实施方式
人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法包括如下步骤：
(1)引物设计：在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-11、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；
(2)荧光探针设计：根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
(3)标准分子的构建：根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；
(4)四重荧光PCR反应液组成：使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2×qPCR Mix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；
(5)四重荧光PCR反应的优化和建立：通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
(6)标准曲线制备：使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；
(7)临床标本检测：用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。
所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-11的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的L1基因。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一段基因序列。
所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。
所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
步骤(1)、(2)所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下：
HPV-6：
上游引物：GTTATCGCCTCCCCCAAAT
下游引物：ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG
探针：URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URA
HPV-11：
上游引物：TTGCGAAAGGAACAAATGTTT
下游引物：GGAAGACACCAATGAGCCACT
探针：MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MAR
HPV-16：
上游引物：AGGACCCACAGGAGCGAC
下游引物：AGTCATATACCTCACGTCGCAGT
探针：NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEP
HPV-18：
上游引物：GGTTCAGGCTGGATTGCG
下游引物：TACACGCACACGCTTGGC
探针：JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP
URA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及2×qPCRMix定量PCR试剂组成的混合液。
所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.98，扩增效率在1.00-1.25之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。
实施例
1.四型HPV目的基因质粒克隆载体的构建
采用T-A载体克隆方案，将四种目的基因PCR产物经过电泳确认扩增片段分子量后，扩增片段克隆至PMD-19T质粒中，16℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α中，在LB培养基(含Amp100g/ml)上筛选阳性菌落，经质粒小提试剂盒回收、抽提、纯化、重组质粒，并在英俊(上海)生物公司测序验证，序列经Blast后完全正确的目的质粒用紫外分光光度计定量后，用1 ×TE(pH8.0)缓冲液稀释到1010拷贝/μl作为储存液，-20℃保存备用。
2.DNA模板提取：分泌物拭子标本用生理盐水溶解，组织块或尖锐湿疣疣体置4％氢氧化钠液中，用金属棒捣碎。振荡重悬1分钟，高速低温离心1min(4℃，12000g/min)，弃上清液，往沉淀物中加50μlDNA提取液(达安分子诊断公司)，100℃加热10min，高速低温离心5 min(4℃，12000g/min)，备用。
3.AllGlo探针四重荧光定量PCR
3.1引物及探针
查阅相关的专业文献，根据文献报道获取四型HPV特异性保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每型病毒筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针(见表1)。四型HPV单管多重荧光定量PCR引物和相应的A1lGlo探针由上海超世生物公司合成。为了确保多重荧光定量PCR的特异性和灵敏度，所有的引物和探针均与GenBank里的扩增靶序列进行BLAST，所有引物和探针的Tm值几乎一致。为了增加与相应型别HPV扩增靶序列杂交的特异性，每条探针与非特异杂交序列至少有9个碱基不互补配对。采用Qiagen Rotor Gene 6000荧光定量PCR仪中(能够同时检测5种荧光)进行多重荧光定量PCR实验。
表1 AllGlo探针四重定量PCR检测四型HPV引物和探针
| 基因序号 | 扩增靶位 | 引物名称 | 引物序列 | 探针 | 产物长度(bp) |
| FM897165.1 | capsidprotein | HPV6FHPV6R | GTTATCGCCTCCCCCAAATATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG | URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URA | 103 |
| AF217526.1 | capsidprotein | HPV11FHPV11R | TTGCGAAAGGAACAAATGTTTGGAAGACACCAATGAGCCACT | MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MAR | 159 |
| EU869318.1 | E6protein | HPV16FHPV16R | AGGACCCACAGGAGCGACAGTCATATACCTCACGTCGCAGT | NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEP | 126 |
| EU834744.1 | L1 gene | HPV18FHPV18R | GGTTCAGGCTGGATTGCGTACACGCACACGCTTGGC | JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP | 100 |
探针采用美国AlleLogic Biosciences公司推出了最新一代荧光定量探针-AllGlo探针
URA、MAR、NEP、JUP均为不同波长的AllGlo探针标记荧光素。
3.2单重荧光定量PCR条件优化
采用四个引物探针比例对荧光定量PCR进行优化：40μl PCR反应体系，2×qPCR Mix(上海超世生物公司)20μl，104Copies/μl的质粒模板1μl，引物(上、下游)与相应型别探针分别加1.6μl、1.6μl(400nM∶400nM)，1.6μl、0.8μl(400nM∶200nM)，0.8μl、0.8μl(200nM∶200nM)，0.8μl、0.4μl(200nM∶100nM)，用双蒸水补至40μl，所有引物探针应用浓度均为10μM.，每种引物探针比例均平行做两管，同时用空白质粒做对照。于Qiagen Rotor Gene 6000荧光定量PCR仪(Qiagen公司生产)扩增，循环条件：95℃5min，95℃10s、58℃20s(45cycles)。实时分析软件计算扩增Ct值，以扩增Ct值统计实验结果。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。
3.3四重荧光定量PCR条件优化
根据单重荧光定量PCR条件优化实验所得结果，选择引物探针浓度比例为400nM∶400nM和400nM∶200nM两种比例进行四重PCR，PCR反应体系及扩增条件同上，将四种引物和探针加入同一管中，然后各管分别加入一型104Copies/μl的HPV质粒模板1μl，阴性对照加空白质粒各1μl进行单目的基因多重PCR扩增，另外，加1μl四型HPV质粒和空白质粒的混合液作为模板，用双蒸水补至40μl，每个反应平行做3管。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例作为四重PCR标准曲线制作和其他实验的最终扩增条件。
3.4四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验
将已知拷贝数的含单一型别的HPV目的扩增片段的重组质粒，使用时连续10倍倍比稀释至浓度在1.0×100拷贝/μl-1.0×108Copies/μl之间作为单基因多重PCR的标准品；同时，将四种单一型别的HPV重组质粒和空白质粒混合后进行10倍倍比稀释成1.0×100Copies/μl-1.0×108Copies/μl之间，作为多基因多重荧光定量PCR的标准品。取不同载量的标准品1μl作为四重荧光定量PCR的模板，同时用空白质粒和双蒸水做对照实验，对各稀释度模板按照步骤(3.3)确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测两次，扩增完成后用仪器自带的软件自动分析结果，从而确定该方法的最低检出限，评估四型HPV荧光定量PCR的检测灵敏度。
3.5四重荧光定量PCR标准曲线制备
将1010Copies/μl四个型别HPV重组质粒等量混合均匀，稀释成含每种HPV质粒(Copies/μl)103、104、105、106、107作为制备标准曲线的标准品，按照步骤(3.3)确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测两次，扩增完成后用仪器自带软件分析结果，制备标准曲线。
3.6四重荧光定量PCR的重复性试验
将已知拷贝数的四型HPV重组质粒混合液(104 Copies/μl)平均分成10份，-20℃冷冻保存作为模板，按制备标准曲线的四重荧光定量PCR的反应体系和扩增条件进行扩增，同时按照步骤(3.5)制备标准曲线，每周检测一次，根据标准曲线仪器自动给出定量检测结果，连续5周，最后统计软件分析5次检测结果的重复性(CV％)。
3.7结果判定
3.7.1分析条件设定：根据仪器所带分析软件自动分析结果，阈值设定原则以阈值线刚好覆盖阴性对照品扩增线和仪器噪音进行调整。
3.7.2质控标准：空白对照物无扩增曲线和Ct值，阳性对照的Ct值应与标准曲线的相应标准品的Ct值相对应，并且出现典型的扩增曲线，否则实验视为无效。
3.7.3结果描述及判定
A.阴性：无Ct值无扩增曲线
B.阳性及定量判断：Ct值≤35且出现典型的扩增曲线判定为阳性，且根据标准曲线自动获取定量值，表示样品中存在HPV病毒颗粒。
C.有效原则：Ct值≥35的样品定量结果不可靠，需重做实验，无Ct值为阴性，有Ct值但≥35需重新取标本复查。
3.8临床标本检测
取10份经杂交捕获法(Hybrid Captur，HC-2，凯普生物科技有限公司，HybriBioLimited，HONG KONG)确定基因型别的宫颈细胞刷标本(Cervical cytobrushsamples)或生殖器疣体或分泌物标本，按试剂盒说明提取DNA(达安基因诊断公司或凯普生物科技有限公司)，每份DNA提取样品平均分成4份，2份用临床实验室广泛使用的TaqMan单探针技术单重荧光定量PCR方法检测HPV6-11混合型和HPV16-18混合型(广州达安公司)，1份标本用AllGlo探针多重荧光定量PCR单管同时检测HPV-6、-11、-16、-18，剩余样品置-70℃冷冻保存(以备必要时复查用)。进一步验证四重荧光PCR方法的特异性。在每一个检测试验中采用同管等量的DNA模板，平行两管，只有当所有平行试验结果一致时，才确定该份DNA样品的检测结果，否则需重新进行检测，最后与TaqMan单探针技术检测结果进行比较(表2)。
结果
1.四重荧光定量PCR条件优化结果：各型HPV标准分子(104 Copies/μl)在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，当引物探针比例为(nM))400∶400时，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分别为23-24、20-21、21-22、22-24；当引物探针比例为(nM)400∶200时，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分别为22-23、20-21、22-23、23-25。
2.四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验结果：各型HPV标准分子(104Copies/μl)在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，其特异性均为100％9(见附图1-5)。HPV-6、-11、-16、-18在四重荧光定量PCR体系中检测灵敏度分别为(Copies/μl)102、101、102、101。
3.四重荧光定量PCR标准曲线制备结果：各型HPV标准分子的标准曲线在经过优化的四重荧光定量PCR反应体系进行制备，HPV-6、-11、-16、-18的标准曲线的r2分别为0.995、0.999、0.992、0.983，扩增效率(Efficiency)分别为1.00、1.12、1.25、1.03(见附图6-9)。
4.四重荧光定量PCR的重复性试验结果：相同的四型HPV标准分子混合液(104 Copies/μl)在四重荧光定量PCR体系检测5次，检测数据经对数转换后各型HPV5次检测的CV均小于5％，详见表2。
表2 四型HPV标准分子混合液重复性检测结果
HPV基因 第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 Mena SD CV
型
6 3.95 4.05 4.41 4.28 4.04 4.146 0.19139 0.046162
11 4.13 4.37 4.55 4.34 4.43 4.364 0.153558 0.035187
16 3.91 4.00 4.01 4.37 4.04 4.066 0.17672 0.043463
18 4.32 4.56 4.39 4.60 4.50 4.474 0.116962 0.026142
5.临床标本检测检测结果：10份临床标本采用三种方法检测，其结果见表3。
表3 临床标本试验结果比较
标本HC-2分型 单重荧光定量 四重荧光定量PCR
号 PCR
6 11 16 18 6-11 16-18 6 11 16 18
1 + - - - 3.5E5* 0 3.2E5 0 0 0
2 - + - - 4.2E4 0 0 4.6E4 0 0
3 - - + - 0 2.6E6 0 0 2.1E6 0
4 - - - + 0 6.9E6 0 0 0 7.6E6
5 + - + - 5.6E4 6.3E4 6.3E4 0 6.0E4 0
6 - + + - 3.3E5 5.6E6 0 5.1E5 5.1E6 0
7 + - + + 5.5E4 8.9E7 4.2E4 0 2.2E8 9.6E4
8 + + + - 7.6E6 5.5E4 5.3E4 9.8E6 4.9E4 0
9 + + + + 6.2E6 7.3E7 5.0E4 8.9E6 2.9E4 2.1E8
10 - - - - 0 0 0 0 0 0
注：*3.5E5表示3.5×105，单位为Copies/μl(test)，余同。
Claims (1)
1.一组用于人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：
所述人乳头瘤病毒常见型为：HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18；
所述引物及探针序列如下：
HPV-6：
上游引物：GTTATCGCCTCCCCCAAAT
下游引物：ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG
探针：URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URA
HPV-11：
上游引物：TTGCGAAAGGAACAAATGTTT
下游引物：GGAAGACACCAATGAGCCACT
探针：MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MAR
HPV-16：
上游引物：AGGACCCACAGGAGCGAC
下游引物：AGTCATATACCTCACGTCGCAGT
探针：NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEP
HPV-18：
上游引物：GGTTCAGGCTGGATTGCG
下游引物：TACACGCACACGCTTGGC
探针：JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP
URA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101552893A CN101709335B (zh) | 2009-12-10 | 2009-12-10 | 一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101552893A CN101709335B (zh) | 2009-12-10 | 2009-12-10 | 一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101709335A CN101709335A (zh) | 2010-05-19 |
| CN101709335B true CN101709335B (zh) | 2011-12-21 |
Family
ID=42402141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009101552893A Expired - Fee Related CN101709335B (zh) | 2009-12-10 | 2009-12-10 | 一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101709335B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013189306A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Ningbo Health Gene Technologies Co., Ltd. | Methods and compositions for assessing copy number of target polynecleotides |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103146834A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-06-12 | 江苏省血吸虫病防治研究所 | 基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法 |
| CN103276101B (zh) * | 2013-05-29 | 2014-12-03 | 中华人民共和国库尔勒出入境检验检疫局 | 利用四重荧光定量pcr检测番茄转基因成分的方法 |
| CN103757102A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-30 | 成都艾迪康医学检测实验室有限公司 | 用于检测b型tel-abl融合基因的方法和寡核苷酸 |
| CN104195247B (zh) * | 2014-08-28 | 2016-03-02 | 广州和实生物技术有限公司 | 多色高危hpv荧光检测试剂盒 |
| CN104561385A (zh) * | 2015-01-24 | 2015-04-29 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测乳头瘤状病毒hpv6型的pcr试剂盒 |
| CN108060268A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | Hpv分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
| CN110283941A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-27 | 湖北大学 | 一种用于hpv分型检测的试剂盒与方法 |
| EP4028559A4 (en) * | 2019-08-15 | 2023-09-20 | Shrestha, Devjani Ghosh | IN VITRO DIAGNOSIS AND RISK STRATIFICATION METHODS FOR HEAD AND NECK CANCER BASED ON EXOSOMAL MARN |
| CN112195287B (zh) * | 2020-11-12 | 2022-03-01 | 武汉凯德维斯生物技术有限公司 | 一种用于人乳头瘤病毒hpv分型和整合检测的探针组及其试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005051967A2 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Allelogic Biosciences Corp. | Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores |
| CN1706966A (zh) * | 2004-06-04 | 2005-12-14 | 何以丰 | 人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法 |
| CN1948503A (zh) * | 2005-10-10 | 2007-04-18 | 上海透景生命科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒检测分型方法及试剂盒 |
| CN101082064A (zh) * | 2006-06-02 | 2007-12-05 | 深圳市隆阳生物科技有限公司 | 高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒 |
-
2009
- 2009-12-10 CN CN2009101552893A patent/CN101709335B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005051967A2 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Allelogic Biosciences Corp. | Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores |
| CN1706966A (zh) * | 2004-06-04 | 2005-12-14 | 何以丰 | 人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法 |
| CN1948503A (zh) * | 2005-10-10 | 2007-04-18 | 上海透景生命科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒检测分型方法及试剂盒 |
| CN101082064A (zh) * | 2006-06-02 | 2007-12-05 | 深圳市隆阳生物科技有限公司 | 高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013189306A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Ningbo Health Gene Technologies Co., Ltd. | Methods and compositions for assessing copy number of target polynecleotides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101709335A (zh) | 2010-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101709335B (zh) | 一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法 | |
| CN102994651B (zh) | 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒 | |
| CN101487063B (zh) | 人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒 | |
| CN105755169B (zh) | 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用 | |
| CN104195266B (zh) | 检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN104152584B (zh) | 羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒 | |
| CN101781686A (zh) | 定量检测hpv16/18型感染的荧光pcr试剂盒 | |
| CN101017141A (zh) | 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒 | |
| CN105087827A (zh) | 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒 | |
| CN104818342B (zh) | 用于19种高危型人乳头瘤病毒(hpv)的检测试剂盒、检测体系及方法 | |
| CN105506173A (zh) | 人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN105603121A (zh) | 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒 | |
| CN103131798A (zh) | 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN102154524B (zh) | 12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN112575123B (zh) | 引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN103725792A (zh) | 人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法 | |
| WO2024187844A1 (zh) | 引物及其和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用 | |
| CN101613764B (zh) | 一种高危型hpv荧光pcr筛查方法及引物、探针和试剂盒 | |
| CN105803110B (zh) | 同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用 | |
| CN106048081A (zh) | 一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用 | |
| CN101676408A (zh) | 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN104017907A (zh) | 一种hpv高危型荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN103509880A (zh) | 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒 | |
| CN104560962B (zh) | 用于检测人乳头瘤病毒的荧光pcr试剂盒及其专用引物组 | |
| CN101886137B (zh) | 荧光定量pcr定性检测高危型hpv的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111221 |