CN103276101B - 利用四重荧光定量pcr检测番茄转基因成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，包括以下步骤：①设计四重荧光定量PCR扩增所需的引物和探针：所述四重荧光定量PCR为根据转基因番茄常用35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII序列进行四重荧光定量PCR检测；② 待测番茄样品中基因组DNA的提取；③四重荧光定量PCR扩增体系设置；④判定待测番茄是否为转基因番茄。本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测番茄样品是否为转基因番茄的快速、高效的检测。

Description

利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法

技术领域

本发明涉及转基因番茄及其深加工产品，具体而言是一种适用于番茄及其深加工产品中转基因成分的四重荧光定量PCR检测方法，属于食品安全转基因检测领域。

背景技术

番茄（Solanum lycopersicum）是茄科番茄属的一年生或多年生植物。作为一种蔬菜作物，番茄是最早进行基因转化研究的高等植物之一，为基因工程拓宽种质资源研究打下坚实基础，已成为蔬菜基因工程研究的模式植物之一。自 1994年美国Calgene公司成功开发，全球首次批准商品化种植的延熟转基因植物产品——番茄FLAVR SAVR被批准进行商业化生产后，利用基因工程进行番茄品种特性改良的研究取得了很大进展，已培育出延迟成熟、抗病虫害、抗除草剂、抗病毒、抗逆和高品质的优良转基因番茄品种，有一部分番茄品种早已在美国、加拿大、日本、墨西哥和中国获准商品化种植。

随着现代基因工程技术的迅猛发展，越来越多的转基因产品被成功制造出来并实现了商品化生产。但转基因产品可能存在潜在的环境污染，食用安全及生态风险，对人类健康和自然环境带来不利影响。因此，需要加强对转基因产品的有效监督、监测和管理。欧盟、日本、韩国、挪威等国明确规定转基因产品的限量标准并制定相应法规实行转基因产品标签标识制度。我国也十分重视转基因食品的安全管理，颁发了《农业转基因生物安全管理条例》，并对17种转基因产品要求必须加贴标识。

转基因产品的检测目前主要采用PCR检测方法，包括定性PCR、巢氏PCR、多重PCR和荧光定量PCR。根据检测的靶标基因又分为通用元件筛选检测，基因特异性检测，构建特异性检测和品系特异性检测四个检测水平。目前转基因食品种类繁多，转入的靶基因各异，很难通过检测所有的外源基因来确定是否含有转基因成分，筛选检测是对目前商品化生产和正在研究的转基因产品普遍转入的通用的转基因元件，即花椰菜花叶病毒35S启动子（35S promoter from cauliflower mosaic virus）、胭脂碱合成酶NOS终止子（Terminator of nopaline synthase gene）、玄参花叶病毒35S启动子（35S promoter from caulimovirus group）、新毒素转移酶基因NPTII（Neomycintransferase gene）等进行筛查检测，是目前较为快速有效的检测方法。

近年来新发展的多重荧光定量 PCR技术，即在一个反应体系中含两对以上引物和不同荧光基团标记的探针，通过实时荧光反应可同时检测多种目标基因。在当前导入农产品中的外源基因种类越来越多的情况下，单一项目的检测已不能满足食品监管需要，迫切需要开发高通量的快速转基因检测技术。建立快捷准确的多重荧光定量PCR方法进行转基因产品的初筛试验是目前较可行的办法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测番茄样品是否为转基因番茄的快速、高效的检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，包括以下步骤：

①、设计四重荧光定量PCR扩增所需的引物和探针：

所述四重荧光定量PCR为根据转基因番茄常用35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII序列进行四重荧光定量PCR检测；

②、待测番茄样品中基因组DNA的提取；

③、四重荧光定量PCR扩增体系设置；

④、判定待测番茄是否为转基因番茄。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的改进：

所述步骤①中：探针5’ 荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’ 淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

步骤①中所用的引物和探针分别为：

内外源基因的扩增引物为：

P-35S-F: GACATTGCGATAAAGGAAAGGC

P-35S-R: GGGTCCATCTTTGGGACCA

T-NOS-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC

T-NOS-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG

NPTII-F：CGGCACTTCGCCCAATAG

NPTII-R：GCTGTGCTCGACGTTGTCA

Lat52-F：AGACCACGAGAACGATATTTGC

Lat52-R：TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA

内外源基因探针为：

P-35S-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1

T-NOS-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3

NPTII-P：VIC-CCAGTCCCTTCCC-MGB

Lat52-P：NED-AGCCCAAGGGAGGAC-MGB  。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

所述步骤④判定待测番茄是否为转基因番茄为：

根据四重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测番茄样品中是否含有转基因成分；内源基因Lat52 Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常；否则检测无效（必须重做检测）；

在确定Lat52 Ct值﹤35时，当且外源基因无S曲线产生或Ct值＞40时，待测番茄样品的判定结果为阴性（可直接报告未检出转基因）；当外源基因Ct值＜35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测番茄样品重新进行检测，重新进行检测所得的外源基因Ct值≥40时，待测番茄样品的判定结果为阴性，重新进行检测所得的外源基因Ct值≤35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；

当外源基因中的P-35S、 T-NOS、NPTII中的任意一条特异性S曲线被检测出时，待测番茄样品的判定结果为阳性。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

25μL的四重荧光定量PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为80~800nM，12.5μL QuantiFast Multiplex PCR Master Mix（2×，Qiagen，货号204754），基因组DNA 50~100 ng；ddH2O补足至25μL。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

25μL的四重荧光定量PCR扩增体系为：

ddH2O补足至25μL。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

四重荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火并延伸90 sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

在本发明中，设置三个复孔的重复和非模板空白对照（设置三个重复确保数据可靠准确，设置非模板对照避免出现假阴性结果）。实验结果应用ABI 7500 software v2.0.1进行分析处理。

作为本发明的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法的进一步改进：

所述步骤②的待测番茄样品中基因组DNA的提取为：

番茄（即，指未加工过的番茄果实、种子、叶片等）采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取；试剂盒可采用北京全式金（EE111）、天根（DP305）、北京鼎国（NEP003）、Qiagen（69104）等4种植物DNA提取试剂盒。

番茄制品（即，番茄深加工产品，包括番茄酱、番茄沙拉、番茄汁等）采用天根深加工制品提取试剂盒（DP326）、德国Congen SureFood PREP Plant X（S1006）试剂盒进行提取。

在本发明中，DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。

本发明属于四重荧光定量PCR转基因成分筛查技术，本发明针对番茄内源基因Lat52和三个常用的外源基因设计4组扩增引物和4条不同荧光标记的探针。

本发明在设计过程中，通过上海交通大学的转基因数据库http://gmdd.shgmo.org/， 国际环境风险评估中心转基因数据库http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database，加拿大转基因产品库http://www.agbios.com/dbase.php，国际农业生物技术应用服务组织转基因数据库http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp信息，收集得到目前已公开报道的商品化生产的转基因番茄信息。比较分析发现，这些转基因番茄品种均采用35S启动子（P-35S）和NOS终止子(T-NOS)，内源基因主要以Lat52为主，标记基因主要以NPTII为主。根据以上序列信息，以外源基因P-35S、T-NOS和NPTII，番茄内源基因Lat52为目标基因，使用引物探针设计软件Primer Express 3.0（Primer Express Software for Real-time PCR, Version 3.0）设计相应的引物和探针，并委托invitrogen 公司合成。

需要着重说明的是：在本发明中，由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。

在本发明中，所述的探针5’ 荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，第一条检测通道检测P-35S, 其荧光染料的发射波长约为522 nM; 第二条检测通道检测NPTII，其荧光染料的发射波长约为553 nM; 第三条检测通道检测Lat52，其荧光染料的发射波长约为582 nM; 第四条检测通道检测T-NOS，其荧光染料的发射波长约为666 nM。以ABI7500（Applied biosyste）荧光定量PCR仪为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、VIC、NED和Cy5标记。探针的3’淬灭集团可以选择ECLIPSE或BHQ，目前商品化的探针VIC和NED集团必须以MGB作为3’淬灭集团。

综上所述，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，分别检测番茄样本的内源基因和三个外源调控元件，建立了一整套合适的引物和探针、核酸提取及多重扩增和分析方法，对转基因食品（包括深加工食品）进行多重快速检测。与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，降低试剂成本，缩短检测时间；多重扩增体系中设置了内源基因的检测，可以判断核酸提取和扩增反应的有效性，避免出现假阴性反应结果；寻找并验证了适用于深加工样品核酸提取的试剂盒。本发明为番茄及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法，为促进农产品和食品出口提供技术保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为“华番一号” 番茄四重荧光定量PCR体系同时扩增Lat52，P-35S，T-NOS 和 NPTII所得的扩增曲线图谱。

图2为“丽春ZN” 番茄四重荧光定量PCR体系同时扩增Lat52，P-35S，T-NOS 和 NPTII所得的扩增曲线图谱。

图3为“合作903”番茄四重荧光定量PCR体系同时扩增Lat52，P-35S，T-NOS 和 NPTII所得的扩增曲线图谱。

图4“屯河17”番茄四重荧光定量PCR体系同时扩增Lat52，P-35S，T-NOS 和 NPTII所得的扩增曲线图谱。

图5为使用10倍梯度稀释的标准品在四重荧光定量PCR体系中同时扩增Lat52，P-35S，T-NOS 和 NPTII所得的标准曲线图谱。

具体实施方式

1  材料和方法

1.1 样品采集

番茄阳性样本主要为“华番一号”、“丽春ZN”，番茄阴性样本为“屯河17”、“屯河48”、 “屯河8”、“屯河731”、“石番15”、“甜红843”和“合作903”，番茄果实样本为以上番茄种子在本实验室培育而成。番茄深加工产品为本实验室2012年出口检测产品和市场上购买的流通产品，共50个批次。

1.2 基因组DNA提取

一、将番茄种子和果实等未加工样本采用天根（DP305）植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并稍作修改。修改后的提取步骤为依次进行以下步骤：

1）取番茄果实或叶片组织约100 mg或者番茄种子约30 mg，加入液氮研磨充分；

2） 迅速加入装有700 μL 65℃预热的缓冲液GP1的离心管中，颠倒混匀，65℃水浴20 min，并隔5 min颠倒混匀一次；

3）加入700 μL氯仿，充分混匀，12000 rpm（或13400×g）离心10 min；

4）吸取上层水相至新离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀，并转入CB3吸附柱中，12000 rpm（或13400×g）离心30 sec，弃掉废液；

5）向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD，12000 rpm（或13400×g）离心30 sec，弃掉废液；

6）向吸附柱中加入600 μL缓冲液PW，12000 rpm（或13400×g）离心30 sec，弃掉废液；

7）重复步骤6）；

8）将吸附柱放回收集管中，12000 rpm（或13400×g）离心2 min，弃掉废液，将吸附柱至于室温放置3 min；

9）将吸附柱转入新的离心管中，加入50~100 μL洗脱液TE， 65℃水浴2 min，12000 rpm（或13400×g）离心2 min。经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.8，OD260/280大于1.5，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。

二、将番茄酱、番茄汁、番茄沙拉的等深加工制品采用德国CongenSureFood PREP Plant X试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作并稍作修改。修改后的提取步骤为依次进行以下步骤：

1）在离心管中称取番茄深加工制品150 mg，加入580 μL LysisBuffer 和20 μL蛋白酶K，涡旋混匀，65℃水浴30 min，并隔5 min涡旋混匀一次；

2）12000 rpm离心2 min，吸取上清400 μL到装有收集管的吸附柱中；

3）12000 rpm离心2 min，弃去吸附柱，在收集管的流出液中加入200 μL的 Binding Buffer，涡旋混匀，转入装有收集管的吸附柱中，12000 rpm离心2 min；

4）在吸附柱中加入550 μL的 Pre-wash，12000 rpm离心1 min，弃去废液；

5）在吸附柱中加入550 μL 的Wash Buffer，12000 rpm离心1min，弃去废液；

6）12000 rpm离心2 min，彻底干燥吸附柱；

7）在吸附柱中加入200 μL的65℃ 预热的Elution Buffer(X)，65℃水浴3 min，12000 rpm离心2 min，弃去吸附柱，在收集管的流出液中加入200 μL的 Binding Buffer和200 μL的 Lysis Buffer，涡旋混匀，转入装有收集管的吸附柱中，12000 rpm离心2 min；

8）重复步骤4）~6）；

9）在吸附柱中加入50 μL 65℃ 预热的Elution Buffer(E)，65℃水浴3 min，10000 rpm离心2 min，并重复收集一次。提取得到的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5，OD260/280大于1.0，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。

1.3 引物和探针设计

在NCBI网站中检索番茄内源基因Lat52 和外源基因P-35S、T-NOS和NPTII相应序列，在保守区域使用Primer Express 3.0（ABI）软件设计多重引物和荧光探针，并在DNA Star软件中验证。探针分别使用荧光基团FAM、VIC、NED和Cy5作为发光基团，使用BHQ和MGB作为非荧光淬灭基团。引物探针可委托英俊公司合成。本发明所用引物和探针的序列信息见表1：

表1 用于荧光定量PCR反应的引物和探针信息

1.4 四重荧光PCR反应

使用上述引物和探针对提取的番茄基因组DNA进行单重和多重实时荧光PCR扩增，以番茄内源基因Lat52扩增情况监控反应的有效性。

25μL多重荧光定量PCR反应体系中包括：4组检测引物和探针浓度分别在80-800nM之间，12.5μL QuantiFast Multiplex PCR MasterMix（2×，Qiagen，货号204754），基因组DNA约50~100 ng。具体如表2所示。

荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火并延伸90 sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。设置三个复孔的重复和非模板空白对照。实验结果应用ABI 7500 software v2.0.1进行分析处理。

表 2 多重荧光定量PCR的反应混合液组成

1.5 特异性检测

提取“华番一号”和“丽春ZN”转基因番茄样本以及“合作903”和“屯河17”非转基因番茄样本基因组DNA，使用上述四重荧光定量PCR体系进行转基因成分检测，验证方法的特异性。经检测，“华番一号”、“丽春ZN”、“合作903”和“屯河17”番茄四重反应的反应结果分别见图1至图4，内源基因Lat52均产生了明显的S型扩增曲线，Ct值小于32，外源基因的反应结果与期望结果一致，说明本发明引物探针的设计及反应体系的设置具有特异性，可用于番茄转基因成分的筛查检测。

备注说明：本发明设计的番茄内源基因Lat52的引物和探针以及反应用量，可以在番茄物种中检测到较好的信号（即Ct值小于32，S型扩增曲线），所以这个基因的检测具有番茄物种特异性；外源基因P-35S，T-NOS和NPTII在转基因番茄中检出，而非转基因番茄中不检出，且扩增曲线呈现明显的S型，空白对照无信号，检测基因之间无信号干扰，故说明设计的引物和探针及PCR体系的设置使基因的检测具有特异性。

1.6 灵敏性检测

提取“华番一号”番茄阳性样本基因组DNA，按照10倍浓度稀释5个梯度，稀释介质为基因组DNA提取时所用的洗脱液（即方法一中的洗脱液TE、方法二中的Elution Buffer(E)）。根据番茄的单倍体基因组分子重量约为0.74 pg。稀释后标准品每个反应分别为80000拷贝，8000拷贝，800拷贝，80拷贝和8拷贝。对5个梯度的标准品进行实时荧光定量反应，每个浓度设置3个重复，验证方法的灵敏性。实验结果见表3和表4，标准曲线图谱见图5。结果表明该四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的最低检测限为每25μL 反应8个拷贝。

表3 番茄转基因成分单重和四重荧光定量PCR检测相对灵敏性分析

表4 番茄转基因四重荧光定量PCR灵敏性检测的扩增数据

1.7 对比实验：

1.7.1 改变四重反应中NPTII引物和探针浓度：

将上述步骤1.4 中的四重荧光PCR反应中的NPTII引物和探针的量减半，即由原来的0.16μM降至0.08μM，其余同本发明，最终得到的结果为：在转基因阳性的番茄“华番一号”

和“丽春ZN”中均扩增不到NPTII基因，该基因未检出与实际检测结果不符。

将上述步骤1.4 中的四重荧光PCR反应中的NPTII引物和探针的量加倍，即由原来的0.16μM增至0.32μM，其余同本发明，最终得到的结果为：在NPTII基因的空白对照管中产生了扩增信号，Ct值为32，且扩增Lat52基因的反应管中Ct值降低。表明NPTII引物和探针过量导致非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，此外过量的VIC荧光染料干扰了以NED标记的Lat52基因的扩增。

1.7.2改变四重反应中Lat52引物和探针浓度：

将上述步骤1.4 中的四重荧光PCR反应中的Lat52引物和探针的量加倍，即由原来的0.08μM增至0.16μM，其余同本发明，最终得到的结果为：在Lat52基因的空白对照管中产生了扩增信号，Ct值为34，且扩增NPTII基因的反应管中Ct值降低。表明Lat52引物和探针过量导致非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，此外过量的NED荧光染料干扰了以VIC标记的NPTII基因的扩增。

1.7.3 改变NPTII基因的引物和探针序列

将上述步骤1.3 引物和探针设计中NPTII基因的引物和探针序列设计为：F-P: AGAGCAGCCGATTGTCTGTTG，R-P: AACCTGCGTGCAATCCATCTT，probe: VIC-TGTGCCCAGTCATAGC-MGB，扩增产物长度为85bp，其余同本发明，最终反应在四重PCR反应管中获取不到NPTII基因的扩增信号，Ct值大于40。表明设计的NPTII基因的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到NPTII基因。

1.8 日常样本检测

采用上述番茄转基因成分四重荧光定量PCR检测方法分别对2012年出口番茄深加工产品和市场上购买的流通产品，共55个批次进行检测。同时对 “华番一号”和“丽春ZN”等转基因番茄，“屯河17号”、“屯河47号”、“屯河48号”、“屯河16号”、“屯河8号”、“屯河9号”、“屯河731号”、“石番15号”、“甜红843号”、“新红18号”、“新番4号”和“合作903号”等非转基因番茄种子，实验室收集的转基因玉米、大豆、棉花等转基因标准品，以及中国合格评定国家认可委员会（CNAS）组织的能力验证样品进行检测，检测结果见表5。

同时按照目前公认准确性较高的标准SN/T 1204-2003中所述的引物和探针以及荧光定量PCR方法对上述样本进行检测，结果与本发明所述的四重荧光PCR方法的检测结果一致。

表 5 四重荧光定量PCR反应对番茄及其深加工产品品以及玉米、大豆、棉花的筛查检测结果

a：冷破；b：热破

备注说明：CNAS T025-24代表转基因大豆，CNAS T025-30代表非转基因大豆，CNAS T0659-23、CNAS T0659-79、CNAS T0659-104和CNAS T0659-175代表转基因玉米，CNAS T0659-74代表非转基因玉米。

Claims (3)

1.利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是包括以下步骤：

①、设计四重荧光定量PCR扩增所需的引物和探针：

所述四重荧光定量PCR为根据转基因番茄常用35S启动子、NOS终止子和标记基因NPTII序列进行四重荧光定量PCR检测；

探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB；

所用的引物和探针分别为：

内外源基因的扩增引物为：

P-35S-F:GACATTGCGATAAAGGAAAGGC

P-35S-R:GGGTCCATCTTTGGGACCA

T-NOS-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC

T-NOS-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG

NPTII-F：CGGCACTTCGCCCAATAG

NPTII-R：GCTGTGCTCGACGTTGTCA

Lat52-F：AGACCACGAGAACGATATTTGC

Lat52-R：TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA

内外源基因探针为：

P-35S-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1

T-NOS-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3

NPTII-P：VIC-CCAGTCCCTTCCC-MGB

Lat52-P：NED-AGCCCAAGGGAGGAC-MGB；

②、待测番茄样品中基因组DNA的提取；

③、四重荧光定量PCR扩增体系设置：

25μL的四重荧光定量PCR扩增体系为：

ddH₂O补足至25μL；

四重荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火并延伸90sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号；

④、判定待测番茄是否为转基因番茄：

根据四重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测番茄样品中是否含有转基因成分；内源基因Lat52Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常；否则检测无效；

在确定Lat52Ct值﹤35时，当且外源基因无S曲线产生或Ct值＞40时，待测番茄样品的判定结果为阴性；当外源基因Ct值＜35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测番茄样品重新进行检测，重新进行检测所得的外源基因Ct值≥40时，待测番茄样品的判定结果为阴性，重新进行检测所得的外源基因Ct值≤35时，待测番茄样品的判定结果为阳性；

当外源基因中的P-35S、T-NOS、NPTII中的任意一条特异性S曲线被检测出时，待测番茄样品的判定结果为阳性。

2.根据权利要求1所述的利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法，其特征是：

所述步骤②的待测番茄样品中基因组DNA的提取为：

番茄采用CTAB法、SDS法或高盐低pH法进行提取；

番茄制品采用天根深加工制品提取试剂盒、德国Congen SureFood PREP Plant X试剂盒进行提取。

3.利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法中所用的引物和探针，其特征是：

内外源基因的扩增引物为：

P-35S-F:GACATTGCGATAAAGGAAAGGC

P-35S-R:GGGTCCATCTTTGGGACCA

T-NOS-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC

T-NOS-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG

NPTII-F：CGGCACTTCGCCCAATAG

NPTII-R：GCTGTGCTCGACGTTGTCA

Lat52-F：AGACCACGAGAACGATATTTGC

Lat52-R：TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA

内外源基因探针为：

P-35S-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1

T-NOS-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3

NPTII-P：VIC-CCAGTCCCTTCCC-MGB

Lat52-P：NED-AGCCCAAGGGAGGAC-MGB。