CN105132581A - 转基因水稻pa110-15转化体特异性定量pcr检测引物 - Google Patents

转基因水稻pa110-15转化体特异性定量pcr检测引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因水稻PA110-15转化体特异性定量PCR检测引物。特异性引物对为：PA110-3-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？No.1所示；PA110-3-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？No.2所示。特异性探针为：PA110-3-P,其序列如序列表SEQ？ID？No.3。采用本发明的引物对与探针进行实时荧光定量PCR反应，可以准确的检测样品中转基因水稻PA110-15转化体的含量。

Description

转基因水稻PA110-15转化体特异性定量PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因水稻PA110-15转化体特异性3’端定量PCR检测引物及其检测方法。
背景技术
目前，关于转基因食品的安全性受到人们越来越广泛的关注，转基因食品的安全性成了人们较为关注的话题，在市场上出售的粮油，蔬菜，瓜果等农产品也都打出非转基因的招牌来吸引客户，但是，所购买的食品是否为非转基因食品，是否掺杂了转基因食品，掺杂的量是多少，普通的消费者无法鉴别。
转基因食品中，粮食作物的转基因尤其受到人们的关注。鉴别转基因作物的一个有效的方法是PCR检测插入基因序列，但是，很多转基因的作物材料转入的基因在其非转基因亲本中也含有该基因或者该基因的类似基因，会对PCR的结果造成干扰。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和转化体特异性方法。转化体特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物转化体，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，转化体特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
专利CN201410081539公开了转基因水稻PA110-15转化体特异性PCR检测引物及定性检测方法和试剂盒。专利CN201410081893公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用。这两个专利都是从转基因水稻PA110-15插入的旁侧序列入手，设计检测的引物，达到了检测特异性的目的，但是，在实际应用中，消费者不仅要了解其购买的大米中是否含有该转基因水稻，而且，还要了解是否全部为该转基因大米，或者部分是，掺杂的量(含量)为多少。目前，这两个专利所设置的引物只能做定性检测，无法实现定量检测。
发明内容
本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过筛选得到转基因水稻PA110-15转化体特异性3’端定量PCR检测引物。
定量检测一般采用荧光定量PCR的方法，引物的设计是成败的关键，对于本发明，计算PCR的特异性引物的荧光量与内参基因荧光量的比值即为转基因水稻的掺入量，为了使该比值检测接近于真实情况，需要对内参引物和特异性引物进行选择优化，具体，我们是采用如下方法筛选到合适的内参引物和特异性引物的：1)根据引物设计的基本原则，设计三组引物；2)采用实验的方法对引物进行评价，筛选出最适合的引物。评价内容：是否有荧光信号的产生；实时荧光PCR反应体系扩增时，特异性引物和内标准基因引物能构建标准曲线，且标准曲线的R2≥0.98，扩增效率在90％～110％之间；能准确的检测水稻产品中转基因含量。
一种转基因水稻PA110-15转化体特异性3’端定量PCR检测引物，所述特异性引物为：PA110-5-qF，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；PA110-5-qR，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；所述特异性引物的探针序列如序列表SEQIDNo.3所示。
一种转基因水稻PA110-15转化体特异性的定量检测方法，按照如下步骤进行：
(1)提取待检测水稻样品的DNA；
(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，设定水稻内标准基因实时荧光PCR反应体系和PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系，将上述体系放入96孔PCR板；
(3)将96孔PCR板放在水平低速离心机中，2000rpm离心30s，然后放入PCR仪中；
(4)运行实时荧光PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明样品中不含有转基因PA110-15水稻转化体；
(5)若特异性实时荧光PCR反应体系扩增出目的荧光信号，则证明样品中含有转基因PA110-15水稻转化体，根据标准梯度样品读取的特异性实时荧光PCR反应的Ct值和水稻内标准基因实时荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k×Lg(Copies)+b,分别得到一条内标准标准曲线方程和一条外源标准曲线方程，再将待测样品中Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量:样品中转基因PA110-15水稻转化体的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数。
所述PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8μL，2×TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/LPA110-3-qF1μL，10μmol/LPA110-3-qR1μL，10μmol/LPA110-3-P0.5μL，DNA模板2.0μL。
所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，45个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用实验的方法，筛选到转基因水稻PA110-15转化体特异性3’端定量PCR检测引物，并配合使用常见的内参引物PLD，该引物不仅能够定性检测样品水稻中是否含有转基因水稻PA110-15转化体，还能定量检测其含量，能够全面检测市场上出售大米的转基因产品含量，对人们的选购具有指导意义。
附图说明
图1是PLD内标基因实时荧光PCR扩增曲线。
图2是PLD内标基因实时荧光PCR扩增标准曲线图。
图3是PA110-15转化体3’端实时荧光PCR扩增曲线。
图4是PA110-15转化体3’端实时荧光PCR扩增标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
转基因水稻PA110-15基体标准物质(100％)，转基因水稻PA110-15受体，非转基因水稻。
2、酶与试剂
AppliedBiosystems的GeneExpressionMasterMix，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物及探针由上海生工合成。
3、实验仪器
分光光度计：ThermoND-1000；
离心机：ThermoBiogugePrimoR，中佳科仪SC-3610；
实时荧光定量PCR仪：BioRadCFX96；
其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。
实施例1植物基因组DNA的提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行PA110-15水稻基因组DNA和普通水稻基因组DNA提取和纯化，提取方法如下：
1)取200mg水稻粉末样品；
2)加入800μL65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。
5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
实施例2标准曲线绘制
采用相同的标准样品绘制PA110-15转化体和PLD内标基因的标准曲线。将提取的PA110-15水稻基因组DNA，用0.1×TE梯度稀释至50ng/μL，5ng/μL，0.5ng/μL，0.05ng/μL，0.005ng/μL，在实时荧光PCR反应体系中，取2μL作为模板，对应的拷贝数212766，21276，2127，212，21，准备绘制标准曲线。
根据PA110-15的插入基因载体和其3’端旁侧序列的连接区序列为靶序列设计转化体特异性定量引物及探针，采用PLD作为内标准参照基因，PLD扩增方法引自欧盟标准化检测方法“Event-specificMethodfortheQuantitationofRiceLineLLRICE62UsingReal-timePCR–ValidationReportandProtocol-SamplingandDNAExtractionofRice”。定量引物及探针见表1。
表1实时荧光PCR检测引物及探针
设置PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系见表2。
表2PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系
试剂 终浓度 体积
无菌水 8μL
2×TaqMan反应缓冲液 1× 12.5μL
10μmol/L PA110-3-qF 0.4μmol/L 1μL
10μmol/L PA110-3-qR 0.4μmol/L 1μL
10μmol/L PA110-3-P 0.2μmol/L 0.5μL
DNA模板 2.0μL
总体积 25.0μL
将96孔PCR板放在水平低速离心机中，2000rpm离心30s，然后放入PCR仪中。运行实时荧光PCR反应，反应程序如表3。
表3实时荧光PCR反应程序
数据分析：
1、设定阈值
实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值。
2、记录Ct值
设定阈值后，实时荧光PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。
3、绘制标准曲线
根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制PA110-15转化体和PLD内标基因的标准曲线(如表4及图1-4所示)。
表4实验数据统计
4、数据可接受的标准
PA110-15转化体的阴性对照和空白对照，PLD内标基因的空白对照无典型扩增曲线，或Ct值≥40；标准曲线的R2≥0.98，标准曲线的扩增效率90％≤E≤110％。
实施例3检测的准确性实验
分4个实验组，实验组1取40g转基因PA110-15水稻种子和10g非转基因普通水稻的种子混合；实验组2取25g转基因PA110-15水稻种子和25g非转基因普通水稻的种子混合；实验组3取20g转基因PA110-15水稻种子和30g非转基因普通水稻的种子混合；实验组4取10g转基因PA110-15水稻种子和40g非转基因普通水稻的种子混合。按照实施例1的方法提取上述实验组的基因组DNA,样品稀释至0.7ng/μL，按照实施例2所述的PCR体系，做荧光定量PCR，读取特异性实时荧光PCR反应体系扩增的Ct(Ct值和水稻内标准基因实时荧光PCR反应体系扩增的Ct值，计算样品中转基因PA110-15水稻转化体的百分比含量，计算公式为:
a和b分别为外源基因和内标准基因的拷贝数，从而得出测试样品的转基因含量，见公式：
实验结果如表5所示。
表5PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系
实验组 a b a/b(％) 理论含量
实验组1 2541 3237 78.50％ 80％
实验组2 1508 2971 50.76％ 50％
实验组3 1241 3062 40.53％ 40％
实验组4 582 2877 20.23％ 20％
从表6可以看出，本发明的引物可以定量检测市售的大米产品中转基因PA110-15转化体的含量，准确率高，与转基因含量的理论值相差无几，可以作为检测稻米中转基因含量的参考测量方法。
对比例
按照实施例3设置的实验组，试验方法及计算公式，采用如表6所示的转基因PA110-15侧翼序列3’端引物作为检测引物，内参引物和探针引物不变，重复实施例3的实验并比对试验结果。
表6实时荧光PCR检测引物及探针
实验结果如表7-8所示：
表7PA110-3-qF1和PA110-3-qR1检测的实时荧光PCR反应体系结果
实验组 a b a/b(％) 理论含量
实验组1 1046 3184 32.85％ 80％
实验组2 711 3037 23.41％ 50％
实验组3 509 3122 16.30％ 40％
实验组4 296 3055 9.69％ 20％
表8PA110-3-qF2和PA110-3-qR2检测的实时荧光PCR反应体系结果
实验组 a b a/b(％) 理论含量
实验组1 3348 3088 108.42％ 80％
实验组2 1924 3147 61.14％ 50％
实验组3 1736 3101 55.98％ 40％
实验组4 1071 2999 35.71％ 20％
由表中可以看出，采用常规的特异性很强的引物并不能准确的检测水稻产品中转基因PA110-15转化体的含量，本发明筛选的引物不是本领域的常规选择。

Claims (5)

1.一种转基因水稻PA110-15转化体特异性定量PCR检测引物，其特征在于，包括转化体特异性引物，
所述特异性引物为：PA110-3-qF，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；PA110-3-qR，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的转基因水稻PA110-15转化体特异性定量PCR检测引物，与其匹配的探针为：PA110-3-P,探针序列如序列表SEQIDNo.3所示。
3.一种转基因水稻PA110-15转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)提取待检测水稻样品的DNA；
(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，设定水稻内标准基因实时荧光PCR反应体系和PA110-15水稻转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，将上述体系放入96孔PCR板；
(3)将96孔PCR板放在水平低速离心机中，2000rpm离心30s，然后放入PCR仪中；
(4)运行实时荧光定量PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明样品中不含有转基因PA110-15水稻转化体；
(5)若特异性实时荧光PCR反应体系扩增出目的荧光信号，则证明样品中含有转基因PA110-15水稻转化体，根据标准梯度样品读取的特异性实时荧光PCR反应的Ct值和水稻内标准基因实时荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k×Lg(Copies)+b,分别得到一条内标准标准曲线方程和一条外源标准曲线方程，再将待测样品中Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量:样品中转基因PA110-15水稻转化体的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数。
4.根据权利要求3所述的转基因水稻PA110-15转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，所述PA110-15水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8μL，2×TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/LPA110-5-qF1μL，10μmol/LPA110-5-qR1μL，10μmol/LPA110-5-P0.5μL，DNA模板2.0μL。
5.根据权利要求3所述的转基因水稻PA110-15转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，45个循环。
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