CN102559889A - 一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法。它是先提取副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)的基因组DNA，以其作为模板用上述13对多基因PCR引物和一对通用引物进行多重PCR扩增得到多重PCR反应产物，利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对其进行检测分析。本发明针对已知13种副溶血弧菌的毒力基因设计特异性引物，通过单管反应，一次性快速高效的检测13种基因而得知检测出样品中是否含有携带毒力基因、具有潜在致病能力的副溶血弧菌，其检测覆盖面广，可大大提高副溶血弧菌致病性评价的准确性，为副溶血弧菌致病性评价提供了更为有效的检测手段，在水产养殖病害检测、流行病学调查、食品中致病菌检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的应用前景。

Description

一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于在临床检验、公共卫生、食品检查中检测致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticμs，VP.)的多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)是一种嗜盐性革兰阴性菌，属于弧菌科弧菌属，是一种食源性致病菌，主要来源于虾、贝类等海产品。该菌不仅可以使海产品致病，还能感染人体，引起腹泻、恶心、发烧等典型的胃肠炎反应及食物中毒。
据国家食源性疾病监测网公布的数据显示，我国微生物性食物中毒的病原分布发生了显著变化，特别是在沿海省份，副溶血弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模上呈明显上升趋势，已经高居微生物性食物中毒首位。副溶血性弧菌检测在水产养殖疾病临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的作用。
随着分子生物学技术的发展和副溶血弧菌全基因组序列测定的完成，人们对副溶血弧菌的毒力基因和致病机制有了更加深入细致的了解，为从分子水平上鉴定副溶血弧菌和确定菌株的毒力提供了理论依据和技术支撑。
目前已经报道的用于检测、鉴定副溶血弧菌的方法有很多，大多是用PCR(聚合酶链式反应)技术，扩增副溶血弧菌的一段保守基因或一种特征性毒力基因，如：用于检测副溶血弧菌的耐热性溶血素相关溶血素基因的检测试剂、副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒等，这些方法可以用于菌种的鉴定。但是，在副溶血弧菌的致病性检测方面，这些方法的缺陷在于：检测内容过于单一，不能全面反应菌株的潜在致病力。
现有研究认为与副溶血性弧菌致病力相关的主要毒力因子为溶血素类，包括耐热直接溶血素(Thermostable Direct He molysin，TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(TDH-relatedHemolysin，TRH)和不耐热直接溶血素(Thermolabile He molysin，TLH)。自然情况下，绝大多数副溶血弧菌属于水产动物体内和体表的正常菌群，只有极少数带有特定毒力基因的菌株才具有致病性，然而，由于毒力基因种类的多样性、分布的差异性，不同的致病菌株往往携带不同种的毒力基因。因此，在做致病性评估时，如何更快速准确对副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)的致病性进行评估是急需解决的问题。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种更为快速准确的评价副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)致病性的副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒。
本发明的副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13对多基因PCR引物和一对通用引物，具体为：
为毒力基因trh(Genebank登录号：NZ_ACFN01000031.1)设计的引物，扩增的片段大小约为147bp：
trh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATTGACCTACCATCCAT-3’
trh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCAACGATTGCGTTAACTGG-3’；
为毒力基因toxR-vp(Genebank登录号：NZ_ACKB01000055.1)设计的引物，扩增的片段大小约为157bp：
toxR-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCACCAATCTGACGGAACTG-3’
toxR-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATGTGGCTTCTGCTGTGAATC-3’；
为毒力基因vopC(Genebank登录号为：NZ_ACFN01000031.1)基因设计的引物，扩增的片段大小约为167bp：
vopC-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAACCATTGCAGCTCCATCTTT-3’
vopC-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTGGTGCCTTATCTGGT-3’；
为毒力基因tdhI(Genebank登录号为：AFBW01000025.1)基因设计的引物，扩增的片段大小约为177bp：
tdhI-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTTTCATGAAGCCTGCCATT-3’
tdhI-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGATGGAAGCTCAAAGGCAAA-3’；
为毒力基因vopL基因(Genebank登录号为：NZ_ACFN01000031.1)设计的引物，扩增的片段大小约为187bp：
vopL-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTACCAGCGCTTTGGAGAAA-3’
vopL-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTACGATGTCTCGTCCCGAT-3’；
为毒力基因vopD基因(Genebank登录号为：AFBW01000028.1)设计的引物，扩增的片段大小约为197bp：
vopD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCTGCAAGCACGATAGCAAG-3’
vopD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACGTCGTTAGAAAAAGCGAGC-3’；
为毒力基因vopT基因(Genebank登录号为：NZ_ACKB01000054.1)设计的引物，扩增的片段大小约为207bp：
vopT-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTCTGGGTCTCGTGAGGTT-3’
vopT-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGAGCAATTACTGGATA-3’；
为毒力基因vopB基因(Genebank登录号为：NZ_ACFN01000031.1)设计的引物，扩增的片段大小约为217bp：
vopB-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCGCTGCATTCATGGTTTTA-3’
vopB-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTGCTGGTGTTGACGAGAAA-3’；
为毒力基因gyrA-vp基因(Genebank登录号为：NZ_ACKB01000076.1)设计的引物，扩增的片段大小约为227bp：
gyrA-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATACTGCACGTGGTAAACCGA-3’
gyrA-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGTTCACCGCAATTAGACCGT-3’；
为毒力基因vopP基因(Genebank登录号为：AFBW01000028.1)设计的引物，扩增的片段大小约为237bp：
vopP-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTGGTGATTGCACATGCTT-3’
vopP-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCAACGCAGTTATGGTGA-3’；
为毒力基因tlh基因(Genebank登录号为：NZ_ACFO01000050.1)设计的引物，扩增的片段大小约为262bp：
tlh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATGTACTACAAAGCGCA-3’
tlh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCGTGACATTCCAGAACA-3’；
为毒力基因HlyD基因(Genebank登录号为：AFBW01000024.1)设计的引物，扩增的片段大小约为274bp：
HlyD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAAAAACAAGTCCTAATTTGGGGTC-3’
HlyD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCATACTGAAGGCGGTGTTG-3’；
为毒力基因tdh基因(Genebank登录号为：NZ_ACKB01000054.1)设计的引物，扩增的片段大小为284bp：
tdh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3’
tdh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAAGACACCGCTGCCATTGTAT-3’；
通用引物对序列：
TY-F：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’
TY-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。
本发明的第二个目的是提供副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取副溶血弧菌的基因组DNA，以其作为模板，用上述13对多基因PCR引物和一对通用引物进行多重PCR扩增得到多重PCR反应产物，利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对多重PCR反应产物进行检测分析。
所述的以副溶血弧菌的基因组DNA作为模板，用上述13对多基因PCR引物和一对通用引物进行多重PCR扩增得到多重PCR反应产物是以副溶血弧菌的基因组DNA作为模板，用上述13对多基因PCR引物等比例混合，每个引物终浓度为0.2-2μM，再加入通用引物对，终浓度为1-20μM，混合均匀为引物预混液，多重PCR反应体系和程序优选为：20～50μL的PCR反应体系，包括：10×PCR Bμffer 2～5μL，10mM dNTP 1.6～4μL，5M/μL的TaqE 0.2～0.5μL，引物预混液0.2～0.5μL，模板DNA 0.8～2μL，ddH2O 15～37.5μL；反应程序为：94℃3min；94℃30s、57～60℃50～60s、72℃100s，3～10个循环；94℃30s、52～57℃50～60s、72℃100s，15～25个循环；72℃7min。
本发明针对已知13种副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)的毒力基因，设计特异性引物，利用本发明的检测试剂盒，按照本发明的方法，可以通过单管反应，一次性快速、高效的检测13种基因，而得知检测出样品中是否含有携带毒力基因、具有潜在致病能力的副溶血弧菌，其检测覆盖面广，可大大提高副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)致病性评价的准确性，为副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)致病性评价提供了更为有效的检测手段，在水产养殖病害检测、流行病学调查、食品中致病菌检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的应用前景。
附图说明：
图1是实施例1的检测结果图；
图2是实施例2的检测结果图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)提取副溶血弧菌基因组DNA
首先对样品中的副溶血弧菌进行纯化分离。
①在离心管中加入50μL 10％(w/v)无菌Chelex-100溶液；
②从副溶血弧菌的培养平板上，挑取单菌落至上述Chelex-100溶液中；
③将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水浴10min，冷却至室温，再充分震荡10s；
④13000r/min离心2min，上清液即为副溶血弧菌基因组DNA，置于-20℃冰箱备用。
(2)多基因PCR引物的设计与合成
为毒力基因trh设计的引物，扩增的片段大小约为147bp：
trh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATTGACCTACCATCCAT-3’
trh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCAACGATTGCGTTAACTGG-3’
为毒力基因toxR-vp设计的引物，扩增的片段大小约为157bp：
toxR-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCACCAATCTGACGGAACTG-3’
toxR-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATGTGGCTTCTGCTGTGAATC-3’
为毒力基因vopC基因设计的引物，扩增的片段大小约为167bp：
vopC-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAACCATTGCAGCTCCATCTTT-3’
vopC-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTGGTGCCTTATCTGGT-3’
为毒力基因tdhI基因设计的引物，扩增的片段大小约为177bp：
tdhI-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTTTCATGAAGCCTGCCATT-3’
tdhI-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGATGGAAGCTCAAAGGCAAA-3’
为毒力基因vopL基因设计的引物，扩增的片段大小约为187bp：
vopL-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTACCAGCGCTTTGGAGAAA-3’
vopL-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTACGATGTCTCGTCCCGAT-3’
为毒力基因vopD基因设计的引物，扩增的片段大小约为197bp：
vopD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCTGCAAGCACGATAGCAAG-3’
vopD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACGTCGTTAGAAAAAGCGAGC-3’
为毒力基因vopT基因设计的引物，扩增的片段大小约为207bp：
vopT-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTCTGGGTCTCGTGAGGTT-3’
vopT-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGAGCAATTACTGGATA-3’
为毒力基因vopB基因设计的引物，扩增的片段大小约为217bp：
vopB-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCGCTGCATTCATGGTTTTA-3’
vopB-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTGCTGGTGTTGACGAGAAA-3’
为毒力基因gyrA-vp基因设计的引物，扩增的片段大小约为227bp：
gyrA-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATACTGCACGTGGTAAACCGA-3’
gyrA-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGTTCACCGCAATTAGACCGT-3’
为毒力基因vopP基因设计的引物，扩增的片段大小约为237bp：
vopP-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTGGTGATTGCACATGCTT-3’
vopP-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCAACGCAGTTATGGTGA-3’
为毒力基因tlh基因设计的引物，扩增的片段大小约为262bp：
tlh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATGTACTACAAAGCGCA-3’
tlh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCGTGACATTCCAGAACA-3’
为毒力基因HlyD基因设计的引物，扩增的片段大小约为274bp：
HlyD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAAAAACAAGTCCTAATTTGGGGTC-3’
HlyD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCATACTGAAGGCGGTGTTG-3’
为毒力基因tdh基因设计的引物，扩增的片段大小约为284bp：
tdh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3’
tdh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAAGACACCGCTGCCATTGTAT-3’；
通用引物对序列：
TY-F：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’
TY-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’；
(3)多重PCR扩增(XP-PCR)
以副溶血弧菌基因组DNA作为多重PCR反应的模板，用上述13对多基因PCR引物等比例混合，每个引物终浓度为0.2μM，再加入通用引物对，终浓度为1μM，混合均匀为引物预混液，配制25μL的PCR反应体系，包括：10×PCR Bμffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，5M/μL的TaqE 0.25μL，引物预混液0.25μL，模板DNA 1μL，ddH2O19μL。
将反应物混匀后，放置在PCR仪中，按如下反应循环进行扩增：
Figure BDA0000126116690000091
(4)产物检测
利用贝克曼GenomeLab GeXP遗传分析系统对XP-PCR的产物进行检测分析，具体操作如下：
①GeXP上样
a，制备SLS/DSS混合液：取DSS 400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酰胺)，在涡旋震荡器上震荡30S或者用枪头混匀10次备用；
b，在每个样本孔中加入40μl SLS/DSS混合液，再加入0.01μl XP-PCR产物至GeXP样品板(不要出现气泡)，加一滴石蜡油覆盖样品；
c，在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d，进入Set Mp程序，输入样品名，对每个样本指定Freg-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本.
②GeXP系统操作程序
调整GeXP系统：
1’安装毛细管和凝胶。
2’将毛细管温度调整至50℃。
3’按照0.4ml凝胶，重复3次模式执行初级管路冲洗。
4’执行毛细管充胶，重复3次。
5’执行光路聚焦。
6’监控仪器基线，低于4000RFM。
输入样本信息：
1’输入样本名。
2’对每个样本指定Freg-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法。
3’保存样本信息。
GeXP样本分析：
1’使用蒸馏水清洗水槽。
2’放入样本板和缓冲液板。
3’开始运行样本。
查看片段分析结果：
1’打开片段分析模块；
2’使用分析后结果(Analyzed Data)建立一个新的分析(Stμdy)。
3’在片段列表(Fragments)窗口中设定过滤参数，过滤非D4染料峰及其他非产物峰。
4’确认现有分析结果正确。
5’查看片段分析结果。
6’对照标准图谱可以判读结果，每个峰代表一个基因，结果如图1所示，图1中具有13个峰，根据横坐标size nt数值大小判断基因，从左到右分别为trh 147bp，toxR-vp 157bp，vopC167bp，tdhI 177bp，vopL 187bp，vopD 197bp，vopT207bp，VopB 217bp，gyrA-vp 227bp，vopP237bp，tlh 262bp，HlyD 274bp，tdh 284bp。可见本发明所提供的方法能快速准确地检测副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)的13种毒性因子，从而能快速准确的评价副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)致病性。
实施例2：
(1)副溶血弧菌基因组DNA的制备
首先对样品中的副溶血弧菌进行纯化分离。
①在离心管中加入90μL 10％(w/v)无菌Chelex-100溶液；
②从副溶血弧菌的培养平板上，挑取单菌落至上述Chelex-100溶液中；
③将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡15s，沸水浴8min，冷却至室温后再充分震荡10s；
④8000r/min离心20min，上清液即为副溶血弧菌基因组DNA，置于-20℃冰箱备用。
(2)引物的设计与合成
为毒力基因trh设计的引物，扩增的片段大小约为147bp：
trh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATTGACCTACCATCCAT-3’
trh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCAACGATTGCGTTAACTGG-3’
为毒力基因toxR-vp设计的引物，扩增的片段大小约为157bp：
toxR-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCACCAATCTGACGGAACTG-3’
toxR-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATGTGGCTTCTGCTGTGAATC-3’
为毒力基因vopC基因设计的引物，扩增的片段大小约为167bp：
vopC-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAACCATTGCAGCTCCATCTTT-3’
vopC-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTGGTGCCTTATCTGGT-3’
为毒力基因tdhI基因设计的引物，扩增的片段大小为约177bp：
tdhT-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTTTCATGAAGCCTGCCATT-3’
tdhI-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGATGGAAGCTCAAAGGCAAA-3’
为毒力基因vopL基因设计的引物，扩增的片段大小约为187bp：
vopL-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTACCAGCGCTTTGGAGAAA-3’
vopL-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTACGATGTCTCGTCCCGAT-3’
为毒力基因vopD基因设计的引物，扩增的片段大小约为197bp：
vopD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCTGCAAGCACGATAGCAAG-3’
vopD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACGTCGTTAGAAAAAGCGAGC-3’
为毒力基因vopT基因设计的引物，扩增的片段大小约为207bp：
vopT-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTCTGGGTCTCGTGAGGTT-3’
vopT-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGAGCAATTACTGGATA-3’
为毒力基因vopB基因设计的引物，扩增的片段大小约为217bp：
vopB-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCGCTGCATTCATGGTTTTA-3’
vopB-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTGCTGGTGTTGACGAGAAA-3’
为毒力基因gyrA-vp基因设计的引物，扩增的片段大小约为227bp：
gyrA-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATACTGCACGTGGTAAACCGA-3’
gyrA-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGTTCACCGCAATTAGACCGT-3’
为毒力基因vopP基因设计的引物，扩增的片段大小约为237bp：
vopP-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTGGTGATTGCACATGCTT-3’
vopP-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCAACGCAGTTATGGTGA-3’
为毒力基因tlh基因设计的引物，扩增的片段大小约为262bp：
tlh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATGTACTACAAAGCGCA-3’
tlh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCGTGACATTCCAGAACA-3’
为毒力基因HlyD基因设计的引物，扩增的片段大小约为274bp：
HlyD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAAAAACAAGTCCTAATTTGGGGTC-3’
HlyD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCATACTGAAGGCGGTGTTG-3’
为毒力基因tdh基因设计的引物，扩增的片段大小约为284bp：
tdh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3’
tdh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAAGACACCGCTGCCATTGTAT-3’；
通用引物对序列：
TY-F：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’
TY-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’；
(3)多重PCR扩增(XP-PCR)
以副溶血弧菌基因组DNA作为多重PCR反应的模板，用上述13对多基因PCR引物等比例混合，每个引物终浓度为2μM，再加入通用引物对，终浓度为20μM，混合均匀为引物预混液，配制25μL的PCR反应体系，包括：10×PCR Bμffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，5M/μL的TaqE 0.25μL，引物预混液0.25μL，模板DNA 1μL，ddH2O19μL。
将反应物混匀后，放置在PCR仪中，按如下反应循环进行扩增：
Figure BDA0000126116690000151
(4)产物检测
利用贝克曼GenomeLab GeXP遗传分析系统对XP-PCR的产物进行检测分析，具体操作如下：
①GeXP上样
a，制备SLS/DSS混合液：取DSS 400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酰胺)，在涡旋震荡器上震荡30S或者用枪头混匀10次备用；
b，在每个样本孔中加入40μl SLS/DSS混合液，再加入1μl XP-PCR产物至GeXP样品板(不要出现气泡)，加一滴石蜡油覆盖样品；
c，在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d，进入Set Mp程序，输入样品名，对每个样本指定Freg-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本.
②GeXP系统操作程序
调整GeXP系统：
1’安装毛细管和凝胶。
2’将毛细管温度调整至50℃。
3’按照0.4ml凝胶，重复3次模式执行初级管路冲洗。
4’执行毛细管充胶，重复3次。
5’执行光路聚焦。
6’监控仪器基线，低于4000RFM。
输入样本信息：
1’输入样本名。
2’对每个样本指定Freg-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法。
3’保存样本信息。
GeXP样本分析：
1’使用蒸馏水清洗水槽。
2’放入样本板和缓冲液板。
3’开始运行样本。
查看片段分析结果：
1’打开片段分析模块；
2’使用分析后结果(Analyzed Data)建立一个新的分析(Stμdy)。
3’在片段列表(Fragments)窗口中设定过滤参数，过滤非D4染料峰及其他非产物峰。
4’确认现有分析结果正确。
5’查看片段分析结果。
6’对照标准图谱可以判读结果，每个峰代表一个基因，结果如图2所示，图2中具有13个峰，根据横坐标size nt数值大小判断基因，从左到右分别为trh 147bp，toxR-vp 157bp，vopC 167bp，tdhI 177bp，vopL 187bp，vopD 197bp，vopT207bp，VopB 217bp，gyrA-vp 227bp，vopP 237bp，tlh 262bp，HlyD 274bp，tdh 284bp。可见本发明所提供的方法能快速准确地检测副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)的13种毒性因子，从而能快速准确的评价副溶血弧菌(V.Parahaemolyticμs)致病性。

Claims (3)

1.一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13对多基因PCR引物和一对通用引物，具体为：
为毒力基因trh设计的引物：
trh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATTGACCTACCATCCAT-3’
trh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCAACGATTGCGTTAACTGG-3’；
为毒力基因toxR-vp设计的引物：
toxR-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCACCAATCTGACGGAACTG-3’
toxR-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATGTGGCTTCTGCTGTGAATC-3’；
为毒力基因vopC设计的引物：
vopC-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAACCATTGCAGCTCCATCTTT-3’
vopC-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTGGTGCCTTATCTGGT-3’；
为毒力基因tdhI设计的引物：
tdhI-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTTTCATGAAGCCTGCCATT-3’
tdhI-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGATGGAAGCTCAAAGGCAAA-3’；
为毒力基因vopL设计的引物：
vopL-F：5’-AGGTGACACTATAGAATACTACCAGCGCTTTGGAGAAA-3’
vopL-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTACGATGTCTCGTCCCGAT-3’；
为毒力基因vopD设计的引物：
vopD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCTGCAAGCACGATAGCAAG-3’
vopD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACGTCGTTAGAAAAAGCGAGC-3’；
为毒力基因vopT设计的引物：
vopT-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTCTGGGTCTCGTGAGGTT-3’
vopT-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGAGCAATTACTGGATA-3’；
为毒力基因vopB设计的引物：
vopB-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCGCTGCATTCATGGTTTTA-3’
vopB-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTGCTGGTGTTGACGAGAAA-3’；
为毒力基因gyrA-vp设计的引物：
gyrA-vp-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATACTGCACGTGGTAAACCGA-3’
gyrA-vp-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAGTTCACCGCAATTAGACCGT-3’；
为毒力基因vopP设计的引物：
vopP-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATTTGGTGATTGCACATGCTT-3’
vopP-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCAACGCAGTTATGGTGA-3’；
为毒力基因tlh设计的引物：
tlh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGATGTACTACAAAGCGCA-3’
tlh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAATGCGTGACATTCCAGAACA-3’；
为毒力基因HlyD设计的引物：
HlyD-F：5’-AGGTGACACTATAGAATAAAAACAAGTCCTAATTTGGGGTC-3’
HlyD-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGATCATACTGAAGGCGGTGTTG-3’；
为毒力基因tdh设计的引物：
tdh-F：5’-AGGTGACACTATAGAATATCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3’
tdh-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGAAGACACCGCTGCCATTGTAT-3’；
通用引物对序列：
TY-F：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’
TY-B：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。
2.一种副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取副溶血弧菌的基因组DNA，以其作为模板，用权利要求1所述的13对多基因PCR引物和一对通用引物进行多重PCR扩增得到多重PCR反应产物，利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对多重PCR反应产物进行检测分析。
3.根据权利要求2所述的副溶血弧菌多重毒力因子GeXP快速检测方法，其特征在于，所述的以副溶血弧菌的基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的13对多基因PCR引物和一对通用引物进行多重PCR扩增得到多重PCR反应产物是以副溶血弧菌的基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的13对多基因PCR引物等比例混合，每个引物终浓度为0.2-2μM，再加入通用引物对，终浓度为1-20μM，混合均匀为引物预混液，多重PCR反应体系和程序为：20～50μL的PCR反应体系，包括：10×PCR Bμffer 2～5μL，10mM dNTP1.6～4μL，5M/μL的TaqE 0.2～0.5μL，引物预混液0.2～0.5μL，模板DNA 0.8～2μL，ddH2O15～37.5μL；反应程序为：94℃3min；94℃30s、57～60℃50～60s、72℃100s，3～10个循环；94℃30s、52～57℃50～60s、72℃100s，15～25个循环；72℃7min。
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