CN101067155A - 一种海洋弧菌的多重pcr反应试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法，包括PCR反应液，PCR反应液由10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，致病菌种的DNA引物包括溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌的DNA引物，这样用本发明的试剂盒进行检测就能检测出与上述三种海洋弧菌的DNA引物相对应的溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌；另外由于本发明的检测方法利用上述的试剂盒检测海洋动物的弧菌病的致病菌种，因此能检测出上述的三种海洋弧菌，这样就缩短了检测致病菌种的时间，降低检测成本，从而较快地找出感染弧菌病的海洋动物的致病菌种，达到及时有效的防治，避免了更多的海洋动物感染弧菌病，减少了海水养殖业的经济损失。

Description

一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法。
背景技术
由弧菌属的细菌引起的弧菌病已经严重危害了海水养殖业。海洋弧菌中的溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌是主要的致病菌，其能感染石斑鱼、真鲷、鲈鱼、大黄鱼、牙鲆和大菱鲆等鱼类动物，也能感染虾、三疣梭子蟹、锯缘青蟹等甲壳类动物，以及文蛤，鲍，牡蛎等贝类动物，弧菌病具有发病快、传染性高和死亡率高的特点，感染弧菌病的海洋动物会发生表皮溃疡，烂尾，腹水，烂眼等症状，因此弧菌病对养殖海洋动物造成极大的危害，导致海水养殖业的极大经济损失。
对弧菌病的致病菌种的准确快速的检测是用药防治的依据，用多聚酶链反应(PCR反应)检测弧菌病的致病菌种，具有快速，敏感，特异性强的优点，PCR反应试剂盒是在PCR反应管中装有包括10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌去离子水混合的反应液，其检测方法是提取该弧菌病的致病菌种的DNA，把DNA加入到PCR反应试剂盒进行扩增反应，然后对扩增产物进行电泳，通过扩增产物与阳性标准品和阴性对照品的电泳结果对比判断，是否存在该DNA引物的致病菌种，从而找出弧菌病的致病菌种；但现有的PCR反应试剂盒中一般只含有一种致病菌种的单对引物，因此每个PCR反应试剂盒只能扩增一种致病菌种的DNA，即一次只能检测一种致病菌种，而导致弧菌病的致病菌种多种多样，弧菌病的症状表现也多种多样，这样就给选择用含有哪种致病菌种的DNA引物的试剂盒进行检测带来了困难，往往需要多次检测才能找到致病菌种，有些弧菌病是受几种海洋弧菌联合感染，因此就需要对几种致病菌种用不同的PCR反应试剂盒进行检测，才能检测出感染弧菌病的几种致病菌种，这样使得检测致病菌种的时间延长，检测费用也增加，并且耽误了弧菌病的防治时间，导致了弧菌病的扩散传染，从而导致感染弧菌病的海洋动物的病情加重和更多的海洋动物感染弧菌病，使得海水养殖业造成重大经济损失。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法，其具有能同时检测三种海洋弧菌的优点，缩短了检测弧菌病的致病菌种的时间，降低了检测成本。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，包括PCR反应液，所述的PCR反应液由10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，所述的致病菌种的DNA引物为下述三种弧菌的DNA引物，即：
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
Hot star Taq酶是5U/μl的DNA聚合酶的热启动版本。
dNTP是每种浓度为2.5mmol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。
三种弧菌的DNA引物是由生物公司合成，如表1所示，三种弧菌的DNA引物的两两之间无三对碱基以上的互补，引物的PCR反应退火温度为48℃～54℃，引物的PCR反应的扩增产物的片段长度大小接近，但两两之差仍大于100bp，因此能通过电泳把它们分开。
表1
  Bacteria   Target gene   Sequence of primers   Product(bp)
  溶藻弧菌   胶原酶基因   上游引物：5’-cga gta cag tca ctt gaa agcc-3’下游引物：5’-cac aac aga act cgc gttacc-3’   737
  副溶血弧菌   胶原酶基因   上游引物：5’-gaa agt tga aca tca tca gcacga-3’下游引物：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3   271
  哈维氏弧菌   部分toxR基因   上游引物：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’下游引物：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’   382
所述的PCR反应液为23.5μl，包括10×PCR反应缓冲液2.5μl、dNTP2.0μl、Hotstar Taq酶0.2μl、最终浓度为0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈维氏弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用灭菌去离子水定容。
溶藻弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L、哈维氏弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L。
一种海洋弧菌的检测方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的样品模板，将样品模板加入到多重PCR反应试剂盒中进行扩增反应，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳检测后得到成像结果，所述的PCR反应扩增的试剂盒包括PCR反应液，所述的PCR反应液由10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，所述的致病菌种的DNA引物为下述三种弧菌的DNA引物，即：
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
PCR的扩增反应的循环参数为：
94℃预变性5min，94℃变性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，进行4个循环后，退火温度降低2℃，退火温度每降低2℃后再进行4个循环，到退火温度降到48℃时，进行20个循环，然后在68℃温度下延伸7min。
成像显示出的扩增片段的特异性条带分别为溶藻弧菌737bp，哈维氏弧菌382bp，副溶血弧菌271bp。
与现有技术相比，本发明的优点在于由于海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒的致病菌种的DNA引物为下述的三种海洋弧菌的DNA引物：
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；
这样用本发明的试剂盒进行检测就能检测出与上述三种海洋弧菌的DNA引物相对应的溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌；另外由于本发明的检测方法利用上述的试剂盒检测海洋动物的弧菌病的致病菌种，因此能检测出上述的三种海洋弧菌，这样就缩短了检测致病菌种的时间，降低检测成本，从而能较快地找出感染弧菌病的海洋动物的致病菌种，达到及时有效的防治，避免了更多的海洋动物感染弧菌病，减少了海水养殖业的经济损失。
附图说明
图1为一种致病菌种感染的弧菌病的本发明检测成像结果照片；
M：100bpDNA Ladder：1、2为溶藻弧菌(737bp)，3、4为哈维氏弧菌(382bp)，5、6为副溶血弧菌(271bp)，7为阴性对照；
图2为二种和三种致病菌种联合感染的弧菌病的本发明检测成像结果照片；
三种致病菌种联合感染：M：100bpDNALadder：1为阳性标准品：溶藻弧菌(737bp)+哈维氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；2～6为检测结果：溶藻弧菌(737bp)+哈维氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；7阴性对照；
二种致病菌种联合感染：M：100bpDNA Ladder：8、9为溶藻弧菌(737bp)+哈维氏弧菌(382bp)；10、11为哈维氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；12、13为溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)；14阴性对照。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，在标准PCR反应管中装有PCR反应液23.5μl，PCR反应液包括10×PCR反应缓冲液2.5μl，dNTP 2.0μl、5U/μl的Hot star Taq酶0.2μl、最终浓度为0.4μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.4μmol/L的哈维氏弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.4μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，加入灭菌去离子水定量到23.5μl；
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；所有引物由生物公司合成。
实施例2
与实施例1基本相同，所不同的只是溶藻弧菌引物的最终浓度为0.6μmol/L，哈维氏弧菌引物的最终浓度为0.6μmol/L，副溶血弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L。
实施例3
一种海洋弧菌的检测方法，其检测步骤如下：
1、采集和提取海洋弧菌的DNA的样品模板：
从感染弧菌病的大黄鱼的肝脏中采集海洋弧菌的样品；然后按下面步骤提取海洋弧菌的DNA的样品模板；
1)将样品稀释到装有1.5ml TE缓冲液的微离心管中，用8000rpm离心1min，去上清后，
2)加入到567μl的TE缓冲液中，反复吹打使之重悬，加入30μl 10％(W/V)SDS溶液，混匀，加入3μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，上下颠倒混匀，置于37℃水浴1h，每10分钟上下颠倒混匀一次；
3)加入100μl 5mol/L的NaCl，充分混匀，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min；
4)加入等体积氯仿/异戊醇，用12000rpm离心5min，将上相移入一新的离心管；
5)加入等量的酚∶氯仿∶戊醇(25∶24∶1)混合液，充分混匀混合液，呈乳浊液，室温下用12000rpm离心5min，若有机相与水相不能充分分开，延长时间重新离心；
6)吸取上层水相于另一离心管中；
7)加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀，沉淀移至1ml70％乙醇中洗涤，12000rpm离心2min，弃上清；
8)室温下晾干，尽量除去乙醇，但不可使DNA过于干燥，得到的DNA沉淀悬浮于50μl TE(PH8.0)缓冲液中，就是海洋弧菌的DNA的样品模板，在-20℃下贮存备用。
2、吸取1.5μl的样品模板加入到实施例1的PCR反应试剂盒中，然后在PCR扩增仪上进行扩增反应，PCR扩增反应的循环参数为：
94℃预变性5min，94℃变性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，进行4个循环后，退火温度降低2℃，退火温度每降低2℃后再进行4个循环，到退火温度降到48℃时，进行20个循环，然后在68℃温度下延伸7min；
3、对扩增产物进行电泳检测：
将扩增产物和阳性标准品、阴性对照品在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后在用紫外凝胶成像系统进行成像，得到图1中的1、2的成像结果，从而检测出感染弧菌病的大黄鱼的致病菌种为溶藻弧菌737bp。
实施例4
与实施例3基本相同，所不同的只是从感染弧菌病的鲈鱼的肾脏采集海洋弧菌的样品；得到图2中的2～6的成像结果，从而检测出感染弧菌病的鲈鱼的致病菌种为溶藻弧菌737bp+哈维氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是三种海洋弧菌联合感染。
实施例5
与实施例3基本相同，所不同的只是从感染弧菌病的锯缘青蟹的肝脏采集海洋弧菌的样品；得到图2中的10、11的成像结果，从而检测出感染弧菌病的锯缘青蟹的致病菌种为哈维氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是二种海洋弧菌联合感染。
与实施例3基本相同，也可以对真鲷、石斑鱼、牙鲆和大菱鲆等鱼类动物感染弧菌病的表皮溃疡，烂尾，腹水，烂眼、肝脏，脾脏，肾脏，血液等进行检测；也能对感染弧菌病的甲壳类动物和贝类动物等海洋动物进行检测，可以得到图1中的1、2为溶藻弧菌(737bp)或3、4为哈维氏弧菌(382bp)或5、6为副溶血弧菌(271bp)成像结果的单种致病弧菌的感染，也可以得到图2中的2～6成像结果的三种海洋弧菌联合感染，以及图2中的8、9为溶藻弧菌(737bp)+哈维氏弧菌(382bp)，10、11为哈维氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)，12、13为溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)成像结果的二种海洋弧菌联合感染。

Claims (5)

1、一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，包括PCR反应液，所述的PCR反应液由10×PCR反应缓冲液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，其特征在于所述的致病菌种的DNA引物为下述三种弧菌的DNA引物，即：
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
2、如权利要求1所述的一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液为23.5μl，包括10×PCR反应缓冲液2.5μl、dNTP2.0μl、Hot star Taq酶0.2μl、最终浓度为0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈维氏弧菌引物0.5μl、最终浓度为0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用灭菌去离子水定容。
3、如权利要求2所述的一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒，其特征在于溶藻弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L、哈维氏弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最终浓度为0.4μmol/L。
4、一种海洋弧菌的检测方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的样品模板，将样品模板加入到多重PCR反应试剂盒中进行扩增反应，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳检测后得到成像结果，所述的多重PCR反应试剂盒包括PCR反应液，所述的PCR反应液由10×PCR反应缓冲液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成，其特征在于所述的致病菌种的DNA引物为下述三种弧菌的DNA引物，即：
溶藻弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，
下游引物为：5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，
哈维氏弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物为：5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物：
上游引物为：5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，
下游引物为：5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
5、如权利要求4所述的一种海洋弧菌的检测方法，其特征在于扩增反应的PCR循环参数为：
94℃预变性5min，94℃变性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，进行4个循环后，退火温度降低2℃，退火温度每降低2℃后再进行4个循环，到退火温度降到48℃时，进行20个循环，然后在68℃温度下延伸7min。
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