CN1837364A - 小麦矮腥黑穗病菌实时荧光pcr固相化试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明依据随机引物介导的多聚酶链式反应(RM－PCR)，从美国小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kuhn TCK)基因组DNA中克隆鉴定的端粒相关序列特征片段；并研制出基于差异片段序列的特异性引物、探针和实时荧光PCR固相化试剂盒，用于TCK冬孢子或侵染菌丝体等不同样品诊断、鉴定的快速检测方法，从样品制备到检测结果的全过程仅需4小时，固相化试剂盒灵敏度高(几百个拷贝)、特异性强(仅检出TCK)、稳定可靠。该发明可以准确地区分TCK与近源种腥黑穗菌如小麦网腥黑穗菌(Tilletiatriticii Tul，TCT)，解决了形态学鉴定既费时且不准确的难题，可以满足进境疫麦的快速鉴定和后期监管的需求，适用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断，麦粒包装等带菌材料的分子检验和近缘种的诊断鉴定。

Description

小麦矮腥黑穗病菌实时荧光PCR固相化试剂盒及其检测方法

                              技术领域

本发明涉及一种农业分子生物，具体涉及实时荧光定量PCR检测小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn，TCK)的特异性端粒相关序列，检测引物对、探针和固相化试剂盒及其适合于口岸检验检疫、田间病害早期诊断的快速检测技术。

                              背景技术

小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn，TCK，以下简称TCK)，属担子菌亚门、冬孢纲、黑粉菌目、腥黑穗菌属，是小麦矮腥黑穗病(wheat dwarf bunt disease)的致病菌。主要分布于美洲、欧洲、北非和西亚，尤以美国西北部蒙大拿、犹他、依阿华、科罗拉多、华盛顿、俄勒冈七州冬麦区为主要流行区。该病害是麦类黑穗病中危害最大、极难防治的系统性侵染病害。一旦感病，全株受害，能使麦类植株系统感染导致小麦植株矮化、分蘖增多，整穗麦粒转变为黑穗菌瘿，发病率即为直接损失率，因而病穗颗粒无收，严重影响冬小麦生产的安全。

病菌的传播途径除了土壤传播和粪肥传播外，主要由种子传播。TCK冬孢子可以附着在种子表面、或以菌瘿形式混杂于正常种子中，随小麦种子及商品小麦远距离传播。小麦矮腥黑穗菌冬孢子的抗逆性很强，热致死温度高达120℃，1小时；落入土中的冬孢子可以存活7年以上。小麦矮腥黑穗病病害风险评估表明，我国有19.3％的冬小麦种植区属高风险区，适宜病害发生。

由于TCK与小麦网腥黑穗菌(Tilletia triticii，TCT，以下简称TCT)的冬孢子形态部分交叉，容易混淆。TCK冬孢子外壁有大而规则的多边形网眼，偶尔见网纹状，网眼较深，孢子外有无色至淡色的透明胶鞘。TCT冬孢子外壁也有网纹，网眼相对浅而小，也有胶质鞘但不发达。这两种病原菌在冬孢子大小、网目、网脊高度等形态学特征上有部分重叠。因此对TCK的鉴定难度主要在于如何快速、准确鉴别TCK与TCT，精确鉴定这两种腥黑穗病菌对于快速、准确检验检疫是至关重要的。

国内外主要从形态学、血清学、生化等方面先后开展了不少研究工作。近年来，小麦腥黑穗菌属病原菌的研究工作主要集中在矮腥及其近源种的种内及种间分子分类研究，通过rDNA的转录间区测序分析、RAPD、rep-PCR基因指纹图谱等方法分析腥黑穗菌的种内及种间差异，以寻求其变异特征。加入WTO至今，由于快速检验技术的缺乏，TCK随着输华疫麦的大量流入，加之几种腥黑穗菌在形态上的相互交叉，易于混淆，检验工作量大，耗时费事，主观性强，不能满足进境原粮检疫的快速通关以及进境后疫麦冬孢子流向监控的需求，因此建立TCK早期、快速、灵敏、准确的分子监测技术势在必行。

实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术，它同样也在植物病原体的检测和诊断中逐渐得到了广泛的使用。它是利用荧光信号伴随着PCR靶标产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该循环参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。

实时荧光PCR检测方法正在逐步应用于植物病原菌的检测，然而目前的检测试剂盒都不能常温储存，需要低温保存，给贮存运输造成不便，现配现用的PCR试剂存在人为误差、不能标准化，因此基于生物大分子稳定剂结合分层包被技术研制开发的固相化试剂盒是分子诊断试剂实现标准化和产业化的主要发展方向。

                              发明内容

本发明的目的是：利用首次克隆的小麦矮腥黑穗病菌(TCK)与近缘种之间的端粒相关序列的特征性差异片段，提供片段基因序列，并研制出适用于TCK实时荧光检测的特异性引物对、标记探针、固相化试剂盒以及配套的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、提供一种小麦矮腥黑穗病菌的片段基因序列，其长度为1322个核苷酸，包括5’端和3’端，序列如下：01AGTCAGCCACCACCGCCTTTGTCGCAACAGAGCGTGATTGGTCACCCTAGAGCTTCCATG61ACACTGGGAGCTTTATGGAAAGACGGTACCTTAGTCTTCTGGCGCGGCTCCTCTTAAAGC121CGCTGGATGAAGTCTAACTTACCTCGCGGATGGTATGCAGCCATATGACAAGGGTATAAA181GACGTGTATACACAGGAGTGCCGTCGCCCTTCACTGGTCCGAGCCACACGGCACGTCAAA241GACAGGCCGGGCATCCCCGTATATCTTGCCGTGCGCTGTGCACTCCTGCCGCCACATCGT301TTTACATTCTACACAGTACCAAAACAAATCCATCAGATCATGGTTTATCCTCGTCTCTTC361CTCGCTCTCCTTCTCCTCCTTCTGGCCGCAGCTGACACATCTGCGTTCCTGACCGATCGC421GTGTGCGTTTGGTGCCCGGCTGTATCTCAGTAGTCCAATGTGAGTCCGTTCTGATCGACG481TTGTTTGCCTCCGCCAGGCGTTCACATGTTGATTTTAATACAGATCGAAGCTCGTGCAAA541CCCACCAGCCCGCTCAAACAAGTAGCAGACGGACATGTGGTTTCAATCAAGCTTAAATCC601CAAAGGCTTGATGTGTGTGGCCAAAAATGTGCTGTGAAGATGTGCAGGGGATAGGGAAGG661AGGGCGACAGGGCGAGAGGGCGAAAGGCTGGAAGATTGGAAGGGCGGTAGGTATCGAAAG721ACACGGATGACATCAGCACGGAAGAAGGATTTTGCGAATGGTAGTGCTGAGGCCGAAAAG781GTAAATTGGTGCTCAGAGCTCCGTTCCTCCGCGAAGCGAAAACTTCGGCGTTACGTTGCT841AACGATGTGGCGAAACTCTTTATCCACCCGTCACTGCGTCCTGTGTACGGGTACAATTCA901GATATATGAGTACGCTTTGATATATACGATTACGGTGGCTGAATACGTCGTGGAGCCCAG961AAGAGAGAATCTGTAGGGCCTTTGCACTCTGTACGCTAATGGTAGAATAATGTGGAACGC1021ATCCTGCCGCCTCACAGCGATACATTTTGCGTTGTCGATCTGGACGCTCTATGGAATGCA1081CTGGATCGATGGAGGGCAATGCTCCAACCGTCCGAAGTACTGTTAGCACGATATCTCGCA1141ACACAATTCTGTTCAATGTCATGTCGCCTCGATTACTCTTGCGTCGATGAACCCGACGTT1201CTGATCGTACACATTCCGTCGACAATAATAATTACTCTTTGGCCTCAGTATTGCCCTTTG1261GCCGTTATCTCAAGAGGTTACACATATCACTGTACATAGTTCGTCCGTGTGCTCGGCTGA1321CT。

用于自小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kuhn，TCK)端粒相关序列克隆的差异基因序列(CQUTCK1.3)。

2、提供用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸引物对，是

寡核苷酸引物对：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’(序列号：NO.1)；

寡核苷酸引物对：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’(序列号：NO.2)。

3、提供用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是检测小麦矮腥黑穗菌的荧光标记探针，其特异的探针序列位于5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATTGCT ATC CGT GAT ACT AGT ATT-3’两端向上游或下游移动1-5个碱基的区域内形成的核苷酸序列。其优化探针序列是5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT ACTAGT ATT-3’。

4、本发明所述用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其荧光报告基团标记在5’端，而自身不发光的非荧光染料用作淬灭基团标记在3’端。

5、本发明用于TCK实时荧光PCR检测和标记探针定量PCR检测的固相化试剂盒，其中提供的核酸扩增固相化试剂是一种冻干的白色胶状混合物，即把PCR反应体系中除模板以外的所有试剂预先混配，再加入生物大分子稳定剂，经过真空冷冻制成的干胶状固相化试剂。

(1)用于小麦矮腥黑穗菌的SYBR Green实时荧光PCR固相化检测试剂盒，包括样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品，其关键在于，所述核酸扩增固相化试剂是PCR反应试剂混合物固相化冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：

组分                                           终浓度

10×PCR缓冲液                                  1X；

25mM MgCl2                                   2～3mmol/L；

25uMdNTP                                       0.2～0.3mmol/L；

5Unit/ul Taq聚合酶                             1Unit/25uL；

10umol引物对                                   各0.5umol/L；

SYBR Green I荧光染料                           9.0～10.0umol/L；

生物大分子稳定剂                               加至23uL；

所使用的引物为上述第2点中所述的任何一对寡核苷酸引物对。

(2)用于小麦矮腥黑穗菌的标记探针定量PCR固相化检测试剂盒，包括样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品，其关键在于，核酸扩增固相化试剂是PCR反应试剂混合物固相化冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：

组分                                        终浓度

10×PCR缓冲液                               1X；

25mM MgCl2                                1.5～2.5mmol/L；

25mM dNTPs                                  0.2～0.3mmol/L；

5Unit/uL Taq聚合酶                          1Unit/25uL；

25uM引物对                                  各0.2～0.5umol/L；

荧光双标记探针                              0.2～0.3umol/L；

生物大分子稳定剂                            加至23uL；

所使用的引物为上述第2点中所述任何一对寡核苷酸引物对；

所使用的探针为第3点中所述的荧光标记探针。

6、提供无害化定量标准品：小麦TCK无害化重组子阳性对照冻干品；健康小麦植株阴性对照冻干品。

7、提供小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测方法，按以下步骤进行：

[1]进入实时荧光PCR检测反应之前，先使用试剂盒中提供的样品核酸提取试剂从待测样品中提取出纯化的样品DNA，再作为模板进入DNA扩增；

[2]将提取的模板加入权利要求7所述固相化试剂盒；

[3]加入权利要求2中所述的引物和权利要求3中所述的探针，如果是SYBR Green I仅需要加入引物即可，再进行小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测反应。

采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于：

1、发明利用筛选的小麦矮腥黑穗病菌(TCK)与近缘种之间的特征性差异序列(CQUTCK1.3)设计出适合于小麦矮腥黑穗病菌实时荧光PCR快速检测引物、探针；

2、用微量材料即可对TCK直接进行实时荧光PCR检测，灵敏度高(20～50个拷贝)、特异性强(能与近缘种TCT区别)，适合于对病害初期无症材料的检测以及病原菌近缘种的鉴别诊断；

3、检测时间短，从制样到PCR检出只需要3小时，适合于口岸检验检疫等时效性要求特别强的场合使用。

4、根据病原菌特异性DNA序列，研制出无害化重组子阳性对照，避免了采用活体疫害生物作为阳性对照可能造成的污染；

5、本发明采用小麦TCK样品核酸提取试剂，经过碱裂解-CTAB-微滤柱离心提取病原菌核酸检测的方法，有效地除去样品中的抑制因子，有效地避免PCR的假阴性；

6、研制的常温储运固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。

综上所述，采用本发明，能对小麦矮腥黑穗病菌检验检疫和田间采集的各种样品进行分子生物学的快速鉴定或检测，尤其是对带菌疫麦的病原菌流向实施跟踪和田间病害流行学动态进行预警监测，实际意义非常重大。

                             附图说明

图1是对小麦矮腥黑穗菌(TCK)和近缘种TCT进行区别鉴定的鉴定结果图。

图2是对不同生育期小麦矮腥黑穗菌(TCK)的侵染菌丝体进行早期检测图。

                            具体实施方式

实施例一：

一种基于SYBR Green I荧光染料的实时荧光PCR检测的引物及固相化试剂盒，用于小麦矮腥黑穗病菌的特异性检测，其组成为：

[1]样品核酸提取试剂：3mol/L NaOH；TES缓冲液；70％乙醇；核酸洗脱液。

[2]核酸扩增固相化试剂：

实时荧光PCR反应试剂固相化混合物为干胶状，加水即可使用，其组分中含有如下试剂：1×PCR缓冲液、2.6mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、1Unit/25uL Taq聚合酶、各0.5umol/L引物对、生物大分子稳定剂加至23uL；9umol/L SYBR Green I荧光染料。

其中寡核苷酸引物对序列为：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                          5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’(序列号：NO.1)；

[3]无害化定量标准品：小麦TCK重组子无害化阳性对照冻干品，按1∶1(W/V)比例加水即可使用；健康小麦植株阴性对照冻干品，按1∶1(W/V)比例加水即可使用；

[4]检测用品：1.5ml微量离心管；实时荧光PCR冻干试剂八联管(48支)。

实施例二

一种基于小麦矮腥黑穗病菌SYBR Green实时荧光PCR检测的引物序列及固相化试剂盒，用于小麦矮腥黑穗病菌的特异性检测，其组成为：

样品核酸提取试剂；核酸扩增固相化试剂；无害化定量标准品；检测用品。

其中寡核苷酸引物序列为：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                        5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’(序列号：NO.2)。

所述样品核酸提取试剂、定量标准品以及检测用品与实施例一相同，所述核酸扩增固相化试剂组分基本相同，所不同的是MgCl₂为3mmol/L、SYBR Green I荧光染料为10umol/L。

实施例三：

一种基于小麦矮腥黑穗菌(TCK)荧光标记探针PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，可以用于小麦矮腥黑穗菌(TCK)的快速检测，其组成为：

[1]样品提取试剂：TES缓冲液100mL；70％乙醇100mL；核酸洗脱液10mL。

[2]核酸扩增固相化试剂：是利用大分子稳定剂经真空冷冻干燥制备而成的可以常温贮存运输的PCR扩增试剂固相化冻干品，其成分中含有如下试剂：

组分                                      终浓度

PCR缓冲液                                 1X；

25mM MgCl₂                              2.5mmol/L；

25mM dNTP                                 0.2mmol/L；

25uM引物对                                各0.5umol/L；

双标记荧光探针                            0.2umol/L；

5Unit/uL Taq聚合酶                        1Unit/25uL；

生物大分子稳定剂                          加至23uL；

所使用的寡核苷酸引物对为：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                          5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’(序列号：NO.2)；

所使用的荧光标记探针序列为：5’(FAM)-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GATACT AGT ATT-3’。

(3)无害化定量标准品：基于小麦矮腥黑穗菌(TCK)特有核酸序列设计的无害化重组子阳性对照；其中小麦矮腥黑穗菌(TCK)重组子阳性对照冻干品；健康小麦植株阴性对照冻干品。

(4)检测用品：

自封式塑料袋；

过滤用具(组装复合滤膜的过滤器)；

1.5ml塑料微量离心管。

实施例四：

一种基于小麦矮腥黑穗菌(TCK)荧光标记探针PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，可以用于小麦矮腥黑穗菌(TCK)的快速检测，其组成为：

样品核酸提取试剂；核酸扩增固相化试剂；无害化定量标准品；检测用品。

其中寡核苷酸引物对序列为：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                          5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’(序列号：NO.1)；

所使用的荧光标记探针序列为：5’(FAM)-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGTGAT ACT AGT ATT-3’。

本实施例所述样品核酸提取试剂、定量标准品以及检测用品与实施例三相同，所述核酸扩增固相化试剂的成分中含有如下试剂：

组分                                      终浓度

10×PCR缓冲液                             1X；

25mM MgCl2                              1.5mmol/L；

25mM dNTPs                                0.3mmol/L；

5Unit/uL Taq聚合酶                        1Unit/25uL；

25uM引物对                                各0.3umol/L；

荧光双标记探针                            0.3umol/L；

生物大分子稳定剂                          加至23uL；

本发明应用实施例三中的小麦矮腥黑穗菌(TCK)荧光标记探针PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，对小麦矮腥黑穗菌(TCK)和近缘种TCT进行区别鉴定。TaqMan探针实时荧光PCR的定量检测如附图1。

从图1中可知：采用TCK的DNA系列稀释液获得的相对定量标准曲线，可以检出的单拷贝靶标DNA的最低数量为6.9E+6、6.9E+7、6.9E+8、6.9E+9、6.9E+10、6.9E+11，定量检测的Ct值分别为33.8、29.3、26.8、22.2、19.4和16.0；检测疑似样品DNA的Ct值为31.6；而健康小麦DNA阴性对照经过40轮扩增后没有获得可以检测的荧光值。表明定量检测结果准确可靠，(以Ct值的小于40为阳性反应)。

本发明应用实施例三中的小麦矮腥黑穗菌(TCK)荧光标记探针PCR检测的引物对、荧光探针序列及固相化试剂盒，对不同生育期小麦矮腥黑穗菌(TCK)的侵染菌丝体进行早期检测。TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的特异性如附图2。

从图2中可知：TCK的DNA检测积累的Ct值分别为27.5、25.9、24.4和23.9；而近似种TCT

与健康小麦DNA阴性对照经过40轮扩增后，没有获得可以检测的荧光值。表明检测特异性好。

小麦冬孢子样品提取步骤是：

小麦麦苗或麦粒液氮研磨后；混合均匀之后置于65℃水浴1小时(中间不断摇动)；室温下10,000r/min离心10min；吸取上清液(注意此步尽量不要吸到下面的沉淀)加入微滤柱中，10,000g离心1min，弃滤液；向离心微滤柱中加入70％乙醇750uL，10,000g离心1min，弃滤液；重复4步骤；10,000g离心1min，除去微滤柱中的残余乙醇；向微滤柱中加入50uL核酸洗脱液，10,000g离心1min，收集滤液，此即为后续PCR步骤中的模板；

SYBR Green I染料法实时荧光PCR扩增步骤是：

[1]将实时荧光PCR仪开机并设置好后待用；

[2]取配制好的实时荧光PCR反应混合液23uL放入八联管(每个样品检测体系加反应混合液23uL)；

[3]取样品模板适量(建议量为2uL)加入反应管中，将试剂盒提供的健康小麦植株总DNA阴性对照加入阴性对照管中，阳性对照管视情况加入小麦TCK重组子标准品(一般检测)或者重组子标准品的10X梯度稀释液(定量检测)，对照样品的用量均为每管2uL；

[4]混合均匀之后即可直接用于PCR反应；对扩增结果进行分析数据，作出定性或定量的检测结果；如有必要可以进行熔解曲线分析以验证特异性。

10×PCR缓冲液                               1X

25mM MgCl2                                1.5～2.5mmol/L

25uMdNTP                                    0.2～0.3mmol/L

5Unit/ul Taq聚合酶                          1Unit/25uL

10umol引物对                                各0.2～0.5umol/L

SYBR Green I荧光染料                        9.0～10.0umol/L

生物大分子稳定剂                            加至23uL

检测反应的体系中各组分含量分别为(反应体积25uL/管)：

(1)SYBR Green I荧光染料法固相化PCR体系为实时荧光PCR混合液(含1×PCR缓冲液、1.5～2.5mmol/L MgCL₂、0.2～0.3mmol/L dNTP、1Unit Taq酶和0.2～0.5umol/L引物对)，加入大分子稳定剂至23uL，混匀，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，进行PCR扩增。

(2)荧光标记探针法固相化实时荧光PCR体系为核酸扩增混合液15uL(含1×PCR缓冲液、1.5～2.5mmol/L MgCL₂、02～0.3mmol/L dNTP、1Unit Taq酶、0.2～0.5umol/L引物对和探针0.2umol/L)，加入大分子稳定剂至23uL，混匀预冻，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，按照要求设置对照，进行PCR扩增。

PCR检测反应条件为：

(1)SYBR Green I荧光染料法：95℃，1min；然后38～45个循环，每个循环为95℃，15s，60℃，45s，在每个循环的延伸阶段(60℃)收集荧光；最后72℃，7min。做熔解曲线的反应条件为：95℃，1min；55℃，1min；从55℃开始每升高0.5℃保持10s，连续升高80次(到95℃为止)。

(2)荧光标记探针法：95℃，2.5min；然后32～37个循环，每个循环为94℃，15s，60℃，45s，在每个循环的退火/延伸阶段(60℃)收集荧光。

结果判定标准是：

(1)使用荧光标记探针法的反应

若定量PCR仪检测到以小麦矮腥黑穗病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的样品中含有小麦矮腥黑穗病菌；若定量PCR仪检测到以小麦矮腥黑穗病菌特异性重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而且样品的检测结果为报告荧光信号没有明显增长，则表示所检测的样品中不含有小麦矮腥黑穗病菌；反之，若样品检测结果为报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的样品中含有小麦矮腥黑穗病菌。

(2)使用SYBR Green I荧光染料法的反应：

若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中含有小麦矮腥黑穗病菌：

A、定量PCR仪检测到以小麦矮腥黑穗病菌特异模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有和阳性对照一样的主峰的。

B、阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个和阳性对照相同的主峰以及一个与阴性对照相同的侧峰的。

若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中不含有小麦矮腥黑穗病菌：

A、定量PCR仪检测到以小麦矮腥黑穗病菌特异性片段重组子为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号没有增长的。

B、阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号也有轻微增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个与阴性对照相同的侧峰。

Claims (9)

1.一种小麦矮腥黑穗病菌的片段基因序列，其特征是：长度为1322个核苷酸，包括5’端和3’端，序列如下：

01AGTCAGCCACCACCGCCTTTGTCGCAACAGAGCGTGATTGGTCACCCTAGAGCTTCCATG61

ACACTGGGAGCTTTATGGAAAGACGGTACCTTAGTCTTCTGGCGCGGCTCCTCTTAAAGC121C

GCTGGATGAAGTCTAACTTACCTCGCGGATGGTATGCAGCCATATGACAAGGGTATAAA181GA

CGTGTATACACAGGAGTGCCGTCGCCCTTCACTGGTCCGAGCCACACGGCACGTCAAA241GA

CAGGCCGGGCATCCCCGTATATCTTGCCGTGCGCTGTGCACTCCTGCCGCCACATCGT301TTTA

CATTCTACACAGTACCAAAACAAATCCATCAGATCATGGTTTATCCTCGTCTCTTC361CTCGCTC

TCCTTCTCCTCCTTCTGGCCGCAGCTGACACATCTGCGTTCCTGACCGATCGC421GTGTGCGTT

TGGTGCCCGGCTGTATCTCAGTAGTCCAATGTGAGTCCGTTCTGATCGACG481TTGTTTGCCTC

CGCCAGGCGTTCACATGTTGATTTTAATACAGATCGAAGCTCGTGCAAA541CCCACCAGCCCG

CTCAAACAAGTAGCAGACGGACATGTGGTTTCAATCAAGCTTAAATCC601CAAAGGCTTGATG

TGTGTGGCCAAAAATGTGCTGTGAAGATGTGCAGGGGATAGGGAAGG661AGGGCGACAGGG

CGAGAGGGCGA AAGGCTGGAAGATTGGAAGGGCGGTAGGTATCGAAAG721ACACGGATGAC

ATCAGCACGGAAGAAGGATTTTGCGAATGGTAGTGCTGAGGCCGAAAAG781GTAAATTGGTG

CTCAGAGCTCCGTTCCTCCGCGAAGCGAAAACTTCGGCGTTACGTTGCT841AACGATGTGGCG

AAACTCTTTATCCACCCGTCACTGCGTCCTGTGTACGGGTACAATTCA901GATATATGAGTACG

CTTTGATATATACGATTACGGTGGCTGAATACGTCGTGGAGCCCAG961AAGAGAGAATCTGTAG

GGCCTTTGCACTCTGTACGCTAATGGTAGAATAATGTGGAACGC 1021ATCCTGCCGCCTCACAG

CGATACATTTTGCGTTGTCGATCTGGACGCTCTATGGAATGCA1081CTGGATCGATGGAGGGCA

ATGCTCCAACCGTCCGAAGTACTGTTAGCACGATATCTCGCA1141ACACAATTCTGTTCAATGT

CATGTCGCCTCGATTACTCTTGCGTCGATGAACCCGACGTT1201CTGATCGTACACATTCCGTC

GACAATAATAATTACTCTTTGGCCTCAGTATTGCCCTTTG1261GCCGTTATCTCAAGAGGTTACA

CATATCACTGTACATAGTTCGTCCGTGTGCTCGGCTGA1321CT。

2、一种用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸引物对，是

寡核苷酸引物对：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’(序列号：NO.1)；

寡核苷酸引物对：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’(序列号：NO.2)。

3、一种用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是检测小麦矮腥黑穗菌的荧光标记探针，其特异的探针序列位于5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATTGCT ATC CGT GAT ACT AGT ATT-3’两端向上游或下游移动1-5个碱基的区域内形成的核苷酸序列。

4、根据权利权利要求3所述的用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是，优化的探针序列是5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GATACT AGT ATT-3’。

5、根据权利要求3或4所述的用于小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是，荧光报告基团标记在5’端，而自身不发光的非荧光染料用作淬灭基团标记在3’端。

6、一种用于小麦矮腥黑穗菌的SYBR Green实时荧光PCR固相化检测试剂盒，包括样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品，其特征在于，所述核酸扩增固相化试剂是PCR反应试剂混合物固相化冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：

组分                              终浓度

10X PCR缓冲液                     1X；

25mM MgCl2                        2～3mmol/L；

25uMdNTP                          0.2～0.3mmol/L；

5Unit/ul Taq聚合酶                1Unit/25uL；

10umol引物对                      各0.5umol/L；

SYBR Green I荧光染料              9.0～10.0umol/L；

生物大分子稳定剂                  加至23uL；

所使用的引物为权利要求2中所述的任何一对寡核苷酸引物对。

7、一种用于小麦矮腥黑穗菌的标记探针定量PCR固相化检测试剂盒，包括样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品，其特征在于，核酸扩增固相化试剂是PCR反应试剂混合物固相化冻干胶珠，其成分中含有如下试剂：

组分                              终浓度

10X PCR缓冲液                     1X

25mM MgCl2                        1.5～2.5mmol/L；

25mM dNTPs                        0.2～0.3mmol/L；

5Unit/uL Taq聚合酶                1Unit/25uL；

25uM引物对                        各0.2～0.5umol/L；

荧光双标记探针                    0.2～0.3umol/L；

生物大分子稳定剂                  加至23uL；

所使用的引物为权利要求2中所述的任何一对寡核苷酸引物对；

所使用的探针为权利要求3中所述的荧光标记探针。

8、小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于按以下步骤进行：

[1]进入实时荧光PCR检测反应之前，先使用试剂盒中提供的样品核酸提取试剂从待测样品中提取出纯化的样品DNA，再作为模板进入DNA扩增；

[2]将提取的模板加入权利要求7所述固相化试剂盒；

[3]加入权利要求2中所述的引物和权利要求3中所述的探针，如果是SYBR Green I仅需要加入引物即可，再进行小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测反应。

9、根据权利要求8所述小麦矮腥黑穗菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于，PCR检测反应条件为：

(1)SYBR Green I荧光染料法：95℃，1min；然后38～45个循环，每个循环为95℃，15s，60℃，45s，在每个循环的延伸阶段(60℃)收集荧光；最后72℃，7min。做熔解曲线的反应条件为：95℃，1min；55℃，1min；从55℃开始每升高0.5℃保持10s，连续升高80次(到95℃为止)；

(2)荧光标记探针法：95℃，2.5min；然后32～37个循环，每个循环为94℃，15s，60℃，45s，在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光，其温度为60℃。

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