CN1294277C - 一种鉴定动物皮张的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定动物物种的方法，特别是鉴定动物皮张的方法，尤其是鉴定驴皮的方法，所述方法是通过细胞色素B基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法制得的DNA指纹图谱来鉴定。本发明填补了细胞色素B基因PCR-RFLP方法来鉴定动物物种的空白，具有鉴定率为100%的优点。

Description

一种鉴定动物皮张的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定动物物种的方法，特别涉及一种分子标记方法鉴定动物皮的方法，尤其涉及一种分子标记方法鉴定驴皮的方法。

背景技术

阿胶是中国传统中成药，是由驴皮为原料熬制而成，阿胶含有18种氨基酸和多种益于人体的微量元素，寓除疾健身于一体，具有补血、止血、促进造血，增强免疫力，促进钙的吸收与贮存等广泛的医疗保健功能，尤其是其补血、造血功能优于同类中、西药品。

目前在收购驴皮时，需要对驴皮进行鉴定，防止以马皮、骡皮和牛皮等冒充驴皮。驴皮的鉴定常用于驴皮作为中药材鉴定，一般采用质谱或色谱分析、同工酶等基于蛋白质成分的分析方法，但是由于动物个体之间蛋白质构成上的差异，这些方法存在一定的误差，难以标准化。最先进的方法是用分子物种鉴定方法，用分子标记方法来进行鉴定，可以迅速、准确、高效地同时检测鉴定大量样品。分子物种鉴定已经应用于食品科学中的肉类鉴定，通常用微卫星方法鉴别马肉、牛肉、羊肉和猪肉等，但是驴肉的鉴定尚没有报道，这一是因为驴肉不常用于食品加工，鉴定的意义不大。

发明人查阅了国内外大量文献，提出用细胞色素B基因PCR-RFLP方法来对驴皮进行鉴定，目前该鉴定方法还属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定动物物种的方法，特别提供一种分子标记方法鉴定动物皮的方法，尤其提供一种分子标记方法鉴定驴皮的方法，填补了分子标记方法鉴定驴皮的空白。

本发明选择了线粒体细胞色素B基因PCR-RFLP指纹图谱作为鉴定依据，其理由：一是由于陈旧干皮中的基因组DNA已经严重降解，针对基因组DNA的分子标记方法如RAPD，微卫星等难以应用。二是因为线粒体细胞色素B基因具有极高的保守性，在物种之内几乎不存在变异，而在物种之间存在单核苷酸的差异，可以用PCR-RFLP方法方便地检测出来，是一种可用于物种鉴定的标记基因。由于细胞色素B基因在不同物种之间具有一段高度保守的区域，可以用一对引物扩增所有物种的细胞色素B基因保守片段用于检测，免除了对每一物种使用不同引物进行扩增的麻烦。而且由于线粒体基因在细胞中具有较多的拷贝数，即使基因组DNA已经完全降解，线粒体DNA也可能还存在，可以比较容易地用PCR方法扩增出来。

本发明的目的是通过以下技术方案来完成的：

一种鉴定驴皮的方法，包括以下步骤：

按照常规方法提取动物皮样DNA，并以此为PCR扩增模板；

以下述序列为PCR的扩增引物：

B15’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’，

B25’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’；

按照常规方法进行PCR扩增；将PCR扩增产物按照常规方法分别用Hinf I和Hae III两种限制性内切酶切割；将切割后的PCR产物分别进行电泳，将电泳图谱分别与图3进行比对、鉴定；如果用Hinf I和Hae III两种限制性内切酶切割后的产物的电泳图谱分别与图3中驴皮DNA的PCR扩增产物用HinfI或Hae III切割后的电泳图谱相一致，则该动物皮样为驴皮。

图3为分别从牛、马、驴和驴骡皮样中提取DNA后，分别经PCR扩增，再将PCR扩增后的产物分别用Hinf I和Hae III两种限制性内切酶切割后的电泳图谱；其中，M代表分子量标准；N1、N2、N3代表牛，M1、M2代表马，L1、L2代表驴，J1、J2代表驴骡。

用已知PCR方法扩增获得细胞色素B基因PCR产物，所述PCR产物为细胞色素B基因359bpDNA片断，其序列为图5所示核苷酸序列；所述DNA是指PCR至少扩增一次的细胞色素B(cyt B)基因的DNA；所述DNA是指PCR扩增二次细胞色素B基因的DNA；所述DNA是指PCR扩增三次细胞色素B(cyt B)基因片断的DNA；

用限制性内切酶切割细胞色素B基因PCR产物；所述限制性切酶的内切酶可为Hinf I、Hae III、Alu I、Mbo I、Taq I和Mse I之一或其组合；

电泳PCR产物获得所述DNA指纹图谱；所述PCR扩增产物DNA含量可为10-500ng/ul。

所述动物皮，如驴皮、马皮、牛皮、骡皮DNA的提取方法，可按已知的临床样品DNA提取试剂盒说明书提取个样品总DNA；也可用本发明改进的干皮DNA提取方法提取，该提取得到的DNA可作为本发明PCR扩增用的模板，提取所述DNA的方法，包括以下步骤：

剪取皮张样品，除去皮张外表面的毛发及其它附着物，并除去内表面的的污染层，将皮张剪切细小的微粒；

称取切好的皮样置于Eppendorf管中，以去离子水双蒸水振荡或吹打洗涤2～3次，吸去水和杂质；

在所述Eppendorf管中加入消化液，蛋白酶K和SDS过夜，所述消化液为10mmol/L Tris HCl，PH可为8.0，1mmol/LCaCl₂，4M尿素，0.5％SDS，0.2mg/ml蛋白酶K；

离心，取上清液放入另一离心管中；

加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，体积比可为25∶24∶1，抽提样品，所述抽提时最好快速、低温，最好在5分钟以内；可冰上操作；

离心，吸取上清液；

加入等体积的氯仿∶异戊醇，体积比可为24∶1，抽提样品，所述抽提时最好快速、低温，最好在5分钟以内；可冰上操作；

离心，吸取上清液；

加入3mol/L的NaAc溶液，混匀后加适量无水乙醇，混匀置于-5℃～-20℃30分钟以上。

离心，弃去上清液；

加入70％乙醇，离心，弃去上清；

干燥，将干燥的沉淀物溶于适量纯水中；0-10℃暂时保存备用或者-20℃长期保存，得提取物。

所述动物皮DNA的提取方法，还包括用常规生物方法方法检测提取的DNA的质量，尤其用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量，用λDNA/Hind III Marker(标记)作为分子量标准，点样电泳检测；用已知的紫外灯下观察或用凝胶成像系统拍照；也可用DNA微量定量仪检测DNA浓度，所述动物皮DNA电泳图谱为图1所示；

以所提取的DNA为模板，进行PCR设计和合成引物、扩增获得细胞色素B基因片段，即获得所述DNA的片断，其方法可为：从GenBank中查询驴、牛、马、骡等动物的线粒体基因组DNA序列，截取其中的细胞色素B基因序列；并根据截取的细胞色素B基因序列，用已知方法设计合成一对PCR引物；

为保证一对引物可以扩增出所有动物的细胞色素B基因片段，还可采用以下方法：PCR引物根据保守序列设计，首先用已知软件，如Clustal W软件，将将要鉴定的动物细胞色素B基因序列进行多序列比较和对准(align)，找到保守区间，采用PCR引物设计软件，如Oligo 6.0 PCR引物设计软件，在此区间内设计引物，按已知方法合成引物，该引物序列如下：

B15’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’

B25’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’

所述细胞色素B基因片段(Cyt B)PCR扩增方法，包括以下步骤：

可经过多次PCR扩增条件优化，确定合适的PCR扩增条件为：每个PCR反应体积含模板DNA，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.2mM 4种dNTPs，2.0mM MgCl2和2.0单位Taq DNA聚合酶；

在按常规PCR扩增反应条件扩增细胞色素B基因片段；所述PCR扩增后产生图5所述359bp的DNA片段，即细胞色素B基因；

为了提高特异性，避免产生非特异性扩增，可采用已知的热启动方式，或直接采用热启动型的Taq DNA聚合酶；

由于各个皮张样品陈旧程度不一样，提取的DNA浓度差异很大，第一次扩增可能条带有强有弱，有的可能有非特异扩增或背景较高；可进行PCR定量，即根据第一次PCR扩增的结果，确定DNA样品中目标模板DNA的数量，再据此调整第二次PCR扩增的模板量，还可多次调整，进行更多次PCR扩增，获得强度比较一致的扩增条带，可保证在进一步酶切后获得清晰的酶切图谱，从而得到判定样品所属物种的鉴定率为100％。

所述DNA的限制性酶切片段长度多态性(Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)方法，包括以下步骤：

用限制性内切酶切割细胞色素B基因片段的PCR产物；所述图5所述PCR扩增产物的限制性内切酶，提供大量实验，筛选出可用于鉴别的限制性内切酶，如Hinf I、Hae III、Alu I、Mbo I、Taq I和Mse I等，最好内切酶为Hinf I和Hae III；

所述反应体积含有缓冲液10x buffer R+，内切酶，和PCR产物DNA。可按已知酶切反应条件进行；得PCR-RFLP产物；

所述PCR-RFLP产物可用已知凝胶电泳方法获得图谱；所述图谱可用凝胶成像分析系统扫描输入计算机，分析产生的RFLP带谱，进而根据带谱判定样品所属物种；

实验证明，在检测中只需用2种内切酶Hinf I和Hae III，便可以鉴定所有物种。

所述制备方法还包括反应完毕后，检测和鉴别实验产物；可用常规生物方法方法检测提取的DNA的质量，尤其用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量，用λDNA/Hind III Marker作为分子量标准，点样电泳检测，并用已知的紫外灯下观察或用凝胶成像系统拍照；也可用DNA微量定量仪检测DNA浓度。如：将提取的动物皮DNA进行检测或纯化后检测，所述纯化方式为电泳，见图1所示；对PCR产物检测和鉴别，所述纯化、鉴定方式为电泳，见图2所示；对PCR产物酶切后检测和鉴别，所述纯化、鉴定方式为电泳，见图3、图4所示图谱。

所述制备方法，还包括将所述提取的动物皮DNA直接测序或者将图5基因片段克隆后测序的方法进行鉴定。

如果对鉴别的准确性要求极高，或者极个别的样品，或用2种内切酶HinfI和Hae III进行PCR-RFLP分析不能鉴别时，可采用直接测序或者将该基因片段克隆后再测序的方法进行鉴定；

所述直接测序：可将所述样品的PCR扩增产物直接测序，或用常规凝胶电泳纯化后测序；也可用常规测序仪，如自动测序仪进行；

所述基因片段克隆后再测序：可采用常规克隆、测序的方法；还可为：将PCR产物与质粒载体pGEM-T(购自上海生物工程公司)混合，加入T4DNA连接酶，将得到的连接产物与高效表达态大肠杆菌混合，将菌液铺LB琼脂平板，所述琼脂平板含氨苄青霉素，0.5mM IPTG，40mg/ml X-Gal，并预加温。将平板培养过夜，根据蓝白斑筛选重组子。将重组子(白斑)菌落挑选出来接入含有氨苄青霉素的LB培养基中，振荡培养过夜，已知碱性裂解法提取质粒DNA，用EcoR I酶切质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收DNA插入片段，再用所述内切酶消化；进行RFLP分析，确定所获得的片段是细胞色素B基因的359bp片段后，用双脱氧链终止法进行测序；

将测定的序列与GenBank中的驴、马、牛等动物的细胞色素B基因序列进行比较，其基因序列与哪种动物相一致，该样品就属于哪种动物。

本方法作为鉴别方法，除了一般用于鉴别动物物种，还用于鉴别动物皮张，尤其具有较高药用价值的驴皮，还可作为产品质量控制的鉴别标准，可防止以马皮、骡皮和牛皮等冒充驴皮，如收购的驴皮、原料处理过程中的驴皮、投料使用的驴皮的鉴别标准，尤其作为用于制造药物的原料时，使用本发明DNA分子鉴定驴皮的质控标准。

一种鉴定驴皮的DNA指纹图谱在驴皮中药材鉴定方面的应用，所述鉴定为细胞色素B基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性指纹图谱制备方法制得的指纹图谱对驴皮进行鉴定。

本发明鉴别方法，对不同动物干皮提取的DNA是一致的，只存在浓度的差别(见图1)，其PCR产物DNA图谱也是一致的(见图2)，但酶切后的DNA图谱却可以将不同动物区别开来，从而鉴定驴皮(见图3)。

本发明动物DNA标准分子量是可从已知文献和Genebank，及公知的DNA分子量测定方法获得。

本发明具有以下优点：

1、本发明的动物皮DNA提取方法，PCR扩增获得了细胞色素B基因保守区域的359bp的片段，通过筛选出的限制性内切酶酶切，用琼脂糖凝胶电泳获得了DNA指纹图谱，根据获得的DNA指纹图谱判定样品所属物种等，证明了该方法可以保证皮样鉴定准确率为100％。

2、由于不同动物细胞色素B基因保守区域片段的相似性，因此，本发明用于鉴别动物皮张，尤其具有较高药用价值的动物皮张，可以有效地防止以其他动物皮毛冒充的现象，可以为产品原料提供可靠的保证。如防止牛皮、马皮冒充驴皮，为驴皮阿胶正品提供可靠的信用依据。因此本发明不仅用于对阿胶原料，而且本发明还可用于鉴定其它动物种类的鉴别。

3、经盲测(blind test)验证了本鉴定方法的有效性。

4、本项研究的关键方法难点有两点：一是皮张样品DNA的提取，要克服某些皮张过于陈旧或者腐烂变质，DNA严重降解，难以提取的问题；二是要找到适合于区别驴、马、牛的分子标记方法，并具有足够的灵敏度，能够正确检测皮张样品，无论该皮张样品是新鲜皮张，还是陈旧干皮或者腐烂变质的皮张。发明人提出用细胞色素B(cyt B)基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)指纹图谱方法对驴皮进行鉴定，鉴定率为100％。

5、本发明还对检测皮革的质量(陈旧或腐烂程度)进行定性分析，应用于原料的检验和把关上，以保证产品的质量。由于皮革不同程度陈旧或者腐烂时，DNA会不同程度的降解，在图谱中会出现不同清晰度的差异，甚至无法测定。

6、本发明鉴定成熟，应用可行；方法简便，易于掌握，可以迅速地同时检测大量的样品；方法稳定性好，对驴皮的检测准确率达100％。除鉴别驴皮种类外，还可区分驴皮的优劣，腐烂变质却未有DNA指纹图谱显示的皮样，应排除在阿胶的原料之外。

7、本发明对阿胶原料进行鉴别，属国内外首创。它可以广泛应用到动物类中药材的种类鉴别中。

8、本方法可作为阿胶生产厂家原料收购和投料的质量标准，可作为纳入药典的依据，提高阿胶生产质量，促进阿胶现现代化水平的提高。

附图说明

图1为本发明从不同动物干皮提取的DNA含量图谱。

其中，M：代表λDNA/Hind III Marker分子量标准；

数字1，7，10，17：代表皮样编号，不同动物结果一致；

N和L对照：代表从新鲜牛肉和驴肉中提取的DNA。

图2为本发明从不同动物细胞色素B基因359bp片段PCR扩增产物图谱

其中，M：代表Gene Ruler 100bp DNA Ladder(100bp DNA分子量标准)

数字1～10代表被测样品号，符号被测样品O：马骡皮，J：驴骡皮，N：牛肉，L：驴肉，不同动物结果一致；

-1：空白对照。

图3为本发明不同动物Hinf I和Hae III酶切指纹图谱

其中，M代表分子量标准；

N1、N2、N3代表牛，M1、M2代表马，L1、L2代表驴，J1、J2代表驴骡(駃騠)。

图4为本发明盲测鉴别物种的酶切指纹图谱

其中，M：为分子量标准；

1～17号为被测样品，Niu为已知牛肉样品对照，Lv为已知驴肉样品对照；Ma已知马皮样品对照。

图5为本发明细胞色素B基因PCR扩增产物359bpDNA序列表

其中：

marker为标准分子量；donkey代表驴；horse代表马；

cattle代表牛；pig代表猪。

具体实施方式

实施例1

鉴定驴皮的DNA指纹图谱的制备方法

材料：

皮样，由东阿阿胶提供驴皮、牛皮、马皮、骡皮样品，每种动物取20个个体的皮样。

分子生物学试剂：

蛋白酶K、RNA酶、DNA连接酶，Hinf I，Hae III，Alu I、Mbo I、TaqI、Mse I、EcoR I、Bam HI、Hind III限制性核酸内切酶，均采用上海生工生物工程公司产品，Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，其他普通试剂为国产AR级试剂。

实验设备和仪器：

PCR仪，琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪，凝胶成像系统，恒温摇床，恒温水浴锅，高速离心机，及其它分子生物学实验常用仪器。

制备步骤：

1、DNA提取

剪取皮张样品，除去外表面附着物、内表面的污染层，剪切成细小的微粒；取25毫克微粒皮样置于Eppendorf管中，每个样品设3个重复样；在每个Eppendorf管中加入1mL的消化液、0.5％SDS、0.2mg/ml蛋白酶K；54℃过夜10小时；所述消化液包括10mmol/L Tris HCl(pH 8.3)，1mmol/LCaCl₂，4M尿素；所述Eppendorf管8000rpm离心5分钟，取1mL上清液，放入一个离心管中；离心管中加入与上清液等体积的25∶24∶1(体积比)的酚∶氯仿∶异戊醇混合液抽提样品；所述抽提样品8000rpm离心5分钟，吸取4/5体积上清；加入等体积的24∶1(体积比)的氯仿∶异戊醇混合液抽提样品；所述抽提样品8000rpm离心5分钟，吸取4/5体积上清液；加入1/10体积3mol/L NaAc溶液，混匀后加2倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃30分钟。然后，12000rpm离心10分钟，弃去上清液；加入1mL70％乙醇，12000rpm离心3分钟，弃去上清液；真空干燥，将干燥的沉淀物溶于100ul纯水；4℃保存备用。用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量，用λDNA/Hind III Marker作为分子量标准，点样量5ul，上样缓冲液2ul，时间30分钟；用凝胶成像系统拍照见图1，用常规DNA微量定量仪检测DNA浓度，用于PCR扩增。

试验结果与分析：

通过动物驴、马、牛、骡干皮的DNA提取，获得皮张样品的DNA，电泳检测表明大部分皮样所获得DNA质量较好，能够满足后续工作的需要，少部分皮样DNA降解比较严重，但是只要能够扩增出目标基因片段即可。线粒体细胞色素B基因片段PCR-RFLP方法的优点就在于具有较高的灵敏度，能够克服样品DNA严重降解的问题。即使基因组DNA已经完全降解，用微卫星方法或RAPD方法等基于基因组DNA的方法扩增不出来或者得出错误的结论时，以及琼脂糖凝胶电泳和DNA定量仪都检测不出DNA存在的情况下，也能够扩增出线粒体细胞色素B基因片段，从而检测出样品所属物种。

2、PCR引物设计与合成、细胞色素B基因(Cyt B)359bp片段PCR扩增

从GenBank中查询驴、牛、马动物的线粒体基因组DNA序列，截取其中的细胞色素B基因序列，根据序列采用Oligo 6.0 PCR引物设计软件设计并合成引物，用所述引物扩增可扩增出细胞色素B基因359bp的片段，引物序列如下：

B15’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’，

B25’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’

引物浓度为5.0umol/L，分装为50ul的小管保存；

PCR扩增条件为：每个PCR反应体积为50ul，含10x Taq酶缓冲液5ul，25mM MgCl₂溶液4ul，10mM混合dNTPs 1ul，5.0uM 5’-引物B11ul，5.0uM 3’-引物B21ul，10ng/ul模板DNA5ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.4ul，余量灭菌去离子双蒸水；

PCR反应条件为：预变性94℃，2min；30循环94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s；延伸72℃，2min。

反应后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所述PCR产生图5所示359bp的DNA片段。

试验结果与分析：

PCR扩增获得了细胞色素B基因保守区域的359bp的片段，获得强度比较一致的扩增条带见图2。

上述实验中提取DNA时，每个样品做6个重复。将提取的DNA合并溶解，以提高模板DNA的浓度。PCR扩增时，每个样品做12个重复，并将有扩增条带的PCR扩增产物合并，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，加入1/4体积的10M乙酸铵和两倍体积无水乙醇，混匀后置于-20摄氏度半小时，12000rpm离心15分钟，小心倒出上清夜，将沉淀用500ul 70％乙醇洗涤一次，将沉淀用50ul灭菌去离子双蒸水溶解。这样将PCR产物浓缩后再酶切，可保证下一步酶切后得到较清晰的指纹图谱。

3、限制性酶切片段长度多态性(Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)分析：

将所述每个PCR扩增产物分别用Hinf I、Hae III、Alu I、Mbo I、Taq I和Mse I、Hinf I和Hae III限制性内切酶酶切。反应体积50ul，足够两次电泳所需的样品量，其中含有5ul缓冲液(10x buffer R+)，2ul所述内切酶，和43ul PCR产物DNA，混匀并离心后37℃消化过夜12小时，80℃处理25分钟以灭活内切酶。

所述PCR-RFLP产物用3％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭(EB)显色，获得的电泳图谱，并用凝胶成像分析系统扫描输入计算机，分析产生的RFLP带谱，在检测中筛选出只需用HinfI和Hae III 2种内切酶便可以鉴定所有物种。

试验结果与分析：

本实验筛选可以根据所获得的DNA指纹图谱判定样品所属物种的内切酶。筛选内切酶的标准一是物种之间有明显的差异而物种之内个体之间不存在差异，以保证检测的准确性为100％；二是要简便，在本检测中只需用2种内切酶便可以鉴定所有物种。经过大量试验，确定最合适的内切酶为Hinf I和Hae III，获得区别物种的图3的DNA指纹图谱。

图3图谱说明：该方法可以区分驴、马和牛。提取皮样的DNA后，PCR扩增产生的细胞色素B基因359bp片段，使用两种不同的酶切，产生不同的带谱。其中，Hinf I酶切可以将马区分出来，但牛和驴的谱带相同，M1、M2为马(分子量为234bp)，其他的为驴或牛。其中主带上面弱带为未完全酶切的PCR产物，可在分子量上判断，不影响下面两条带谱的判断。

其中，Hae III酶切可以将牛(分子量为258bp)区分出来，但马和驴的谱带相似，N1、N2、N3为牛，其他的为驴或马。

该方法保证皮样鉴定准确率为100％。

6、DNA克隆和测序

用直接测序或者将该基因片段克隆后再测序的方法进行鉴定。

所述直接测序为：将每个样品的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化后直接测序，测序可以用常规自动测序仪进行。

所述基因片段克隆后再测序为：将20ng PCR产物与50ng质粒载体pGEM-T(所述质粒载体购自上海生物工程公司)混合，加入3U DNA连接酶在4℃连接过夜，将2ul连接产物与100ul高效感受态大肠杆菌混合，0℃冰浴2min，将菌液全部铺LB琼脂平板(所述琼脂平板含100mg/ml氨苄青霉素，0.5mM IPTG，40mg/ml X-Gal，并预加温至37℃)。将平板在37℃培养过夜，根据蓝白斑筛选重组子。将重组子(白斑)菌落挑选出来接入5ml含有50mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，常规碱性裂解法提取质粒DNA，用10U EcoR I酶切1ug质粒DNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳回收插入片段，再用常用内切酶，如Hae III和Hinf I内切酶消化进行RFLP分析，确定所获得的片段是细胞色素B基因的359bp片段后，用双脱氧链终止法进行测序。将序列与GenBank中的驴、马、牛的细胞色素B基因序列进行比较，其基因序列与哪种动物相一致，该样品就属于哪种动物。该方法鉴定率为100％。

实施例2

一种鉴定驴皮的DNA指纹图谱在驴皮中药材鉴定方面的应用，所述鉴定为细胞色素B基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性指纹图谱制备方法制得的指纹图谱对驴皮进行鉴定。

1)发明人对东阿阿胶公司前后两次提供的17个分别属于驴、马、牛、猪物种个体的皮样，由厂方编号但不标明皮样所属物种，进行盲测(blindtest)以验证方法的有效性，测定方法同上述实施例，结果如图4，证明了该方法可正确判定皮张所属物种。

试验结果与分析：

根据图4中Hinf I酶切图谱可以判定，4、5、7、8、9、10号为马，其他的为驴或牛。根据图中Hae III酶切图谱可以判定1、2、11、12号为牛，其他为驴或马。

综合以上分析结果可以判定1、2、11、12号为牛，4、5、7、8、9、10号为马，3、13、15、16、17号的为驴(359bp)。

6号和14号样品马皮腐烂严重，未扩增出条带，无法判断。图中5、9、11、13号带谱较弱，但不影响判定。

对上述19个样品进行了6次重复实验，均显示了相同的结果，重现率达100％，说明方法具有很好的重复性和稳定性见下表：

           表：盲测样品重复实验的测试结果和重现率

样品	Lv	Nu	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
																				重复次数	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6	6
阳性次数	6	6	6	6	6	6	6	0	6	6	6	6	6	6	6	0	6	6	6
																				重现率％	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100

2)对不同产地驴皮进行了样品采集和检测。

目的是对方法的准确性、稳定性和重现性进行验证，共采集驴皮样本126个，马皮40个、骡皮26个、牛皮33个，对每一个样品10重复次实验，均能得到相同的结果，重现率100％。所有驴皮样品扩增和酶切带谱清晰，判定准确无误，准确率100％。该方法制备的图谱不受地理群体的影响，种内高度真实和一致，具有良好稳定性。所提供的极个别的样品由于腐烂严重，难以辨别。见表2

            表2：对国内不同驴皮产地样品的检测结果

采集地	驴皮	马皮	骡皮	牛皮	合计
						新疆	20	3	3		26
内蒙	8	4	2		14
						甘肃	11	3	2		16
青海	10	4	1		15
						山西	9	2	2	4	17
河南	15	3	3	3	24
						河北	16	5	2	6	29
山东	37	16	11	20	84
						合计	126	10	16	33	225
检测准确率(％)	100	97.5	100	93.9	/

序列表

<110>山东阿华生物药业有限公司

<120>一种鉴定动物皮张的方法

<130>200310246

<140>03153838.X

<141>2003-08-25

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>359

<212>DNA

<213>驴(Equidae)

<400>1

ccctcaaaca tttcatcatg atgaaacttt ggctccctcc taggaatctg cctaatcctc       60

caaatcctaa caggcctatt cctagccata cactacacat cagacactac aactgccttc      120

tcatccgtca cccatatctg ccgagacgtt aactacggat gaatcattcg ctacctccat      180

gccaacggag catccatatt tttcatctgc ctctttatcc acgtagggcg cggcctctac      240

tatggctcct acacattcct agaaacatga aacattggaa ttatcctact tttcacagta      300

atagccacag cattcatagg ctatgtccta ccatgaggac aaatatcctt ctgaggagc       359

Claims (1)

1.一种鉴定驴皮的方法，包括以下步骤：

按照常规方法提取动物皮样DNA，并以此为PCR扩增模板；

以下述序列为PCR的扩增引物：

B1 5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’，

B2 5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’；

按照常规方法进行PCR扩增；将PCR扩增产物按照常规方法分别用Hinf I和Hae III两种限制性内切酶切割；将切割后的PCR产物分别进行电泳，将电泳图谱分别与图3进行比对、鉴定；如果用Hinf I和Hae III两种限制性内切酶切割后的产物的电泳图谱分别与图3中驴皮DNA的PCR扩增产物用HinfI或Hae III切割后的电泳图谱相一致，则该动物皮样为驴皮。

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