CN1620504A - 食品的检验方法 - Google Patents

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Abstract

用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，用来测定食品中有无特定物质的方法，在检出食品中所含的微量成分和识别有害的特定物质过敏源方面是优异的。

Description

食品的检验方法
技术领域
本发明涉及食品的检验方法，特别涉及为了显示出在食品中是否存在有过敏物质，而在食品的整个流通阶段中检出所含微量特定物质的方法。
背景技术
近年来，为了防止起因于含有过敏物质的食品造成的对健康的危害，对通过标示提供信息的希望日益高涨，伴随着平成13年4月食品卫生法关连法令的修订，对含有过敏物质的标示就成了义务。特别是对于病历数比较多的蛋、奶、小麦和症状比较重的荞麦和花生等5个品种(特定原材料)，在食品的整个流通阶段进行适当的标示已经义务化。由于作为过敏物质的食品是否认为是过敏源，由于个体的差异而有所不同，如果把在食品中所含的极其微量特定物质作出适当的标示，自己就可以知道从食品中摄取的是否含有过敏源。但是，当对食品进行加热等加工来检查有没有极其微量的特定物质时，用历来公知的食品分析方法是很困难的。
如果是生产者在本公司使用的特定物质，当然能够在加工的食品中进行标示，可是在使用特定物质作为终端制品的中间原料的情况下，特别是有时不能确认在购入的中间原料中是否含有微量的特定物质。实际上有时是无意混入的。
在食品制造商那里，正确地把握加工助剂或夹带物等食品添加物的极微量残留或者在制造线之间的相互污染的情况，做出适当的对策的同时，给消费者提供基于法律是正确的信息是很重要的，因此就希望提供过敏物质的正确分析技术。
在我国，荞麦是一种日常的食品，有的患者对荞麦呈现过敏反应。大多数反应是过敏型的反应，最重的病例直至死亡。在标示含有食品卫生法的过敏物质时，荞麦被规定为特定的原材料之一，在食品中有时混入的情况下，对其的标示被义务化。但是没有适当的测定方法，因此希望有微量成分的确实测量方法。
因此，在本发明中的目的就是提供测定食品中有没有特定物质的方法，以开发正确地分析在食品中有没有混入荞麦的方法为目的，在荞麦中构筑特异的引物并确认其检出界限，以及试图用在加工食品中。
发明的公开
[1]本发明基于由特定物质的一部分基因得到的信息，进行设计引物的多聚酶链式反应(PCR)，从而提供测定食品中有无特定物质的方法。
[2]为了标示在食品中有无微量成分，提供一种在食品中的标示方法，基于由特定物质的一部分基因得到的信息，进行设计引物的PCR，测定有没有特定物质。
[3]为了识别含有对食品摄取者有害的特定物质过敏源的食品，可以提供基于特定物质的一部分基因得到的信息，进行设计引物的PCR，从而测定在食品中有无特定物质的方法、提供在食品中是否含有对过敏患者或其疑似患者有害的过敏源的特定物质的信息的方法，或者在食品中标示这其中的任何一种的方法。食品不仅包括人类的食品，也包括动物的食品(饲料)。
[4]在此，优选的方法是，上述特定物质是特定谷类的方法。
[5，6]上述食品可以是经过加工处理的食品，也可以是食品原料。
[7]提供上述特定谷类是荞麦的方法。
[8]在此，优选上述基因是以序列表的序列号11表示的荞麦基因，上述引物如下的方法：
①从第121g至第360c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正向引物或反向引物；或者
②从第1381t至1680c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正向引物或反向引物。
引物是靶基因的互补链，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分进行成对选择，对的长度可以相同，也可以不同。
[9]特别优选在下面表1中表示的FAG3(序列号1)/FAG4(序列号2)、FAG17(序列号5)/FAG18(序列号18)、FAG19(序列号7)/FAG20(序列号8)、FAG19(序列号7)/FAG22(序列号9)、FAG19(序列号7)/FAG24(序列号10)的引物对。
在PCR中使用的引物，如果作为模板的DNA(如以荞麦举例的话，可以举出序列号11的序列)的该区域是同样的区域，那么引物的各个序列的5’-上游侧、3’-下游侧的碱基的位置在对应的同一模板上，或者即使剪切几个碱基到十几个碱基也具有同样的机能，已知得到同样的结果(PCR产物)。
从而，优选的引物对，并不限于如上表1中的，实际上能够在PCR时达到与上述表1的引物对同样功能的，也包括在优选的引物对中。
关于上述引物，是各个引物中缺失、置换、添加和/或插入一个或几个碱基的引物，在成为模板的DNA的该区域中杂交的引物，实质上与上述引物是同样的。具体说，比如，关于序列号1～10的各引物，是在与对应的模型DNA相对的5’-上游侧和/或3’-下游侧剪切1个或几个乃至十几个碱基的引物，在序列号1～10的序列中，包括连续的至少80％，更优选90％以上，特别优选95％以上序列的引物等，包括在本发明优选的引物中。
[10]提供一种方法，使用上述引物进行基因扩增反应，在包括苦荞麦和/或荞麦的(不包括荞麦蔓)蓼科荞麦属被检测体中，在电泳图像中辨认出明确的扩增带，而在包括荞麦蔓(Fallopia)(不包括苦荞麦和/或荞麦)的荞麦属以外的蓼科被检测体、含有荞麦以外的动植物(源于食品原料)中则不能辨认出。
[11]提供一种基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的PCR用的引物，和含有这些引物，用来测定在食品中有无特定物质和/或其浓度的试剂盒。
附图的简单说明
图1a是表示荞麦的检出引物，FAG19/22的荞麦特异性结果的电泳图象；图1b是表示FAG5/FAG6特异性的电泳图象。
图2是表示通过PCR进行检出的荞麦检出系统检出限的电泳图象。图2a是DNA水平的模拟混入试样的测定结果的电泳图象；图2b是表示粉末水平的模拟混入试样测定结果的电泳图象。
图3是表示由PCR从加工食品中进行荞麦检出结果的电泳图象，图3a和图3b是分别测定的加工食品每个泳道是不同的。
实施发明的最佳形态
下面详细地说明本发明。
本发明是进行基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR反应来测定食品中有无特定物质的方法。
作为检测体而被测定的食品，可以是原材料，也可以是在任何加工阶段，还可以是加工以后的食品。本发明的方法用来检出在食品中有无微量特定物质的存在，检出量是在DNA水平的体积比或者相对于全部食品中特定物质的质量比，优选在0.1％以下，100ppm以下，特别是50ppm以下，10ppm以下，在食品中含有特定物质基因的情况下，也能够检出并非生产者有意放入，而是作为调味品或添加剂的一部分微量存在的特定物质。DNA与蛋白质等来自生物的其他物质相比，对于加热等食品加工是比较稳定的，能够检出经过加热、调理等加工的食品中微量的存在。
特定物质的基因序列，在未知的情况下也可以由公知的基因检出法来检出，当前能够使用很多的已知基因信息。比如，由国立遗传学研究所(DDBJ)等数据库能够得到特定物质基因全序列的信息，由一部分序列信息就能够选择适合于PCR反应的正向引物和反向引物对组成引物(探头)。
引物的设计，在考虑本发明的检测方法时要注意以下的事项。首先，(i)引物的气相色谱含量为40～60％；(ii)引物的熔点(下面记做Tm值)为55～70℃；(iii)两个引物对的Tm值相近；(iv)在两个引物的3’-末端之间不保有互补的序列；(v)引物本身不形成发夹式的高次结构；(vi)引物的全长取15～35mer；(vii)引物的3’-末端的气相色谱含量低；(viii)在引物内要回避同一核苷酸多数连续的序列；(ix)没有必要与引物扩增的模板DNA片侧一根链的序列完全一致，但在3’-末端的互补性要高；(x)在使用的DNA试样中，没有另外与引物同样的序列等。
本发明的引物，必须不仅能够用于原材料的荞麦，而且要还能够用于在加工阶段的食品经过加热和调理等加工以后的食品。因此，使用的荞麦模板DNA不是完整的，可以认为是切断成非常小的NDA碎片；(xi)由两个引物扩增的一部分基因优选是比较短的区域。特别是在各种荞麦共同具有的一个基因的区域中，设计完全满足(i)～(xi)条件的引物是必要的。但是，在仅仅由A、C、G、T等4个核苷酸组成的DNA序列中，要制造出完全满足这些条件的引物是非常困难的，因此，引物的设计在进行PCR时是一个非常困难的问题。既便是假如能够设计出完全满足这样多数条件的引物，这只是在进行PCR的一个必要条件，实际上还不知道能否按照意图成功地进行PCR。
PCR法没有特别的限制，包括公知的各种改良的方法，但如果举一个例子的话，除了引物对和模型(被检验)DNA以外，取Tris-HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合酶等混和类试剂作为PCR的反应液。PCR的第一循环由热变性、引物的缓冷、由DNA聚合酶合成DNA的反应3个步骤组成。各个步骤是分别不同的，由于在不同的情况下选取相同的反应温度和反应时间是必要的，要将DNA区域的碱基序列及其长度选取适当的范围使其扩增。为进行这样的操作的热循环器是市售的。由气相色谱含量和序列的长度得到的如下公式作为缓冷温度的指标。
Tm(℃)＝4×(G+C)+2×(A+T)
PCR的扩增产物在50～500bp，更优选在100～150bp的程度。这是由于如果在此范围内，即使是在加工食品中断裂的DNA也能够被检出。
在特定的谷类是荞麦的情况下，上述基因是序列号11表示的基因，上述引物优选是以序列号11表示的。
①从第121g至360c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选择的正向引物和反向引物；或者
②从第1381t至1680c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段选择的正向引物或反向引物。
引物是靶基因的互补链，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分在对中选择。对的长度可以是相同的，也可以是不同的。
特别是，下面表1的FAG3(序列号1)/FAG4(序列号2)、FAG17(序列号5)/FAG18(序列号6)、FAG19(序列号7)/FAG20(序列号8)、FAG19(序列号7)/FAG22(序列号9)、FAG19(序列号7)/FAG24(序列号10)的引物对或者与它们实质上相同的引物对都是优选的。如在下面的比较例中所说明的，即使选取相同的Tm值的引物对[FAG5(序列号3)/FAG6(序列号4)]，有时也会有检出不当的缺口，因此选择引物是重要的。
如果对TaqDNA聚合酶、MgCl2的浓度或反应循环数等适当的PCR条件进行研究，或者使用网状PCR，都有可能更提高检出的感度。
PCR的反应物可以使用免疫反应进行鉴定，也可以用其他方式鉴定，但如果使用电泳，在必要的情况下，如果在使用阳性对照组或阴性对照组进行的电泳图象上确认出明确的带，就能够确认在检验体中有被检物质存在。
本发明的检出方法，如果使用含有基于由特定物质的一部分基因得到的信息而设计的引物作为试剂的试剂盒，就能够很容易地实施。试剂盒可含有在PCR中普遍使用的公知的试剂，也可以附属于电泳装置等另外的装置。具体说，可以举出dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、Tris-HCl、甘油、DMSO、阳性对照组用DNA、阴性对照组用DNA、蒸馏水等作为试剂。这些试剂在试剂盒中可以分别以独立包装的形式提供，也可以以两种以上混和的形式提供。试剂盒中各个试剂的浓度没有特别的限制，只要在能够实施本发明的PCR的范围内即可。在试剂盒中可以附加适当的PCR条件等信息，也可以只是引物试剂。
                                                       表1
名称 序列号 序列 Tm 气相色谱(GC)％   引物设定部位
    开始     结束
  正向FAG3反向FAG4正向FAG5反向FAG6正向FAG17反向FAG18正向FAG19反向FAG20正向FAG19反向FAG22正向FAG19反向FAG24     1234567879710   5’CCA GCA ATT CCA GCA TCA GTG  3’5’TTG GAG TAG GAA GGA AGC AAGA 3’5’TGT CGC CGT CCG TGT CGT AA  3’5’GGA TTC TTC GCT CTC ACT CTG  3’5’TGG AGT GGG TGG AGT TGA AGA  3’5’TCA TCT CGG GAC TGG AAT GGT  3’5’AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT  3’5’TCT CAT CTC GGG ACT GGA ATG  3’5’AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT  3’5’CCT CCT GCC TCC CAT TCT TC   3’5’AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT  3’5’AAC CTC CTG CCT CCC ATT CTT  3’     646464646464646464646464     524560525252525252605252     14933427853014351624146416261464159014641592     16931329751014551604148416061484157114841572
本发明的方法，只要被检物质是食品就没有限制，但以谷类为例，包括小麦、水稻、玉米、谷子、黍子、稗子、荞麦和豆类。由于DNA是热稳定的，在加工食品中，即使有微量也能够检出，所以得到的结果用来标示食品的话，除了能够作为食品的过敏信息而加以利用外，通过检出在食品中有无特定的谷类，就能够检出残留的极微量加工助剂或夹带物等食品添加物或者在制造线之间有没有生产者无意带来的相互污染。
下面用荞麦作为一个例子具体说明本发明，但本发明并不限于此。
(1)构筑用来检出荞麦的引物
在构筑用于检出源于荞麦DNA的引物时，首先在国立遗传学研究所(DDBJ)的数据库中，对已知的荞麦(Fagopyrum esculentum)基因进行检索，从得到的有关荞麦的基因信息中选择Fagopyrum esculentum major allergenicstorage protein gene(Accession #AF152003全长1825bp)。然后通过DDBJ的BLAST检索，确认在荞麦以外的植物中没有所选择的荞麦基因序列和类似的序列。
为了设计引物，本发明人使用了有关特定物质基因序列的软件“GENETYXMAC”，对成为候补引物的序列进行检索。GENETYX MAC，用来设定在上述设计引物的各个条件中难以用手工计算解析的各种条件，比如(i)气相色谱含量和(ii)Tm值的范围等。结果，能够检索出67对成为候补的序列。通过本发明人独自检索，在其中发现了完全满足上述(i)～(xi)的引物设计条件，能够在本发明的检测方法中使用的引物序列。这样就制造出包括如此发现的引物序列在内的9对寡核苷酸DNA引物(バイオロジカ(株)合成的)。
(2)DNA抽出
对荞麦和其他植物的种子，用1％的TritonX(和光纯药)洗涤表面，然后用蒸馏水漂洗，用很好干燥后的多球破碎机(安井机械)进行微粉碎。然后将1～1.5g试样，用迪西植物最大量试剂盒(Dneasy Plant Maxi kit，Qiagen)抽提DNA。而对于加工食品，含水量高的，在冷冻干燥24h以后，使用1g，含水量低的就原封不动地使用1g，用Genomic Tip 20/G(Qiagen)抽出DNA。抽出的DNA通过吸光度测定求出浓度以后，用纯水稀释到10ng/μL，用其作为PCR模型(被检)DNA的试样液。
(3)通过PCR和电泳图像检出荞麦
按照如下方式调节PCR的反应液。即在含有PCR缓冲液(PCR buffer II，アプライドバイオシステムズ社)，200μmol/L；dNTP，1.5mmol/L；MgCl2，0.5μmol/L；正向和反向引物，以及0.625单位TaqDNA聚合酶(AmpliTaq Gold，アプライドバイオシステムズ社)的液体中加入2.5μL的DNA试样液调节到10ng/μL，使总量为25μL。表3中没有记载模型DNA量的是在此情况下的浓度。但是，在抽出的DNA浓度在10ng/μL以下的情况下，或者在添加物比较多的加工食品等当中，得到的DNA的吸光度OD260/OD280的值在1.7以下和杂质比较多、DNA的纯度很低的情况下，要将抽出的DNA原液或10ng/μL的稀释液添加到2.5μL～17.8μL的PCR反应液中，根据其量的不同，用纯水调节到总量25μL。在表3中模型DNA上附加的就是此时的浓度。
在PCR扩增装置中使用了GeneAmp PCR System 9600(アプライドバイオシステムズ社)，将反应条件设定如下。首先，在95℃下开始反应并保持10min，然后在95℃下反应30sec、在60℃下反应30sec、在72℃下反应30sec作为一个循环，进行40循环的PCR扩增。最后，在72℃下作为最终反应保持7min，然后保持在4℃下，得到的反应液作为PCR扩增反应液。
PCR扩增反应液，通过含有2％溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2％E-Gel，Invitrogen)供给电泳，在通过阳性对照组(由荞麦粉抽出的DNA)和阴性对照组(没有模型DNA的空白反应液)有无扩增带来判断PCR的妥当性的同时，通过确认由各种引物得到的最合适尺寸的DNA扩增带来判断在试样中有没有混入荞麦。
(4)实验1.检知荞麦引物特异性的确认
以选拔特异性地检出荞麦的引物为目的，使用由荞麦和其他植物种子得到的DNA进行PCR。使用7种荞麦的种子[マンカン(美国、加拿大、中国)、内蒙古(中国)、榆林(中国)、キナワセ(北海道)、会津在来(福岛)]和两种业务用荞麦粉A、B作为荞麦的试样。使用两种小麦(农林61号、CanadianAmber Durum)、裸麦(加拿大)、大麦(ミノリムギ)、稻米(コシヒカリ)、玉米(饲料用非GMO)、大豆(ムラユタカ)、小米(熊本)、菜种(Canola)、燕麦(赛马用饲料)和荞麦蔓(由冈山大学资源生物科学研究所得到)的种子作为其他植物。
进行PCR后电泳，将只在荞麦试样中辨认出最适当尺寸的明确的扩增带，而在其他植物中没有辨认出的引物作为能够特异性地检出荞麦的引物。
图1a中表示检出荞麦用的引物，显示出FAG19/22的特异性检出结果的电泳图象。在图1a中，M：100bp的指针标记，NC：无模板DNA对照组(没有模型DNA的空白)水。图1a的泳道序号(试样名)及其结果显示在下面的表2中。
图1b中表示显示出在表1中表示的引物：FAG5/FAG6的特异性检出结果的电泳图象。在图1b中，泳道序号1：マンカン种(加拿大)；2：内蒙古种(中国)；3：榆林种(中国)；4：会津在来种(日本)；5：业务用荞麦粉A，M：表示100bp的指针标记。在图1b中，可以看出，作为辨认非特异性带出现的荞麦检出用引物是不适当的。
实验1的结果选拔出FAG19/22(扩增尺寸127bp)的一组作为以下实验的引物。
FAG19(正向引物)：5’-AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT-3’
FAG22(反向引物)：5’-CCT CCT GCC TCC CAT TCT TC-3’
在荞麦以外的植物中，荞麦蔓与荞麦同是蓼科植物，但这一组引物中没有见到交叉反应(图1a，表2)。
(5)实验2.由PCR确认荞麦的检出界限
在实验2中，以研究通过试样FAG19/22引物的PCR检出荞麦的检出限为目的，制造在DNA水平和粉末水平模拟混入荞麦的试样，确认使用这样的DNA试样液进行PCR的检出限。
DNA水平的模拟混入试样，将小麦和荞麦种子抽出的DNA分别稀释到10ng/μL，将它们混和制造这些试样使得在小麦DNA中荞麦DNA的混入率的体积比为0.1、10、50、100、1,000ppm和1％。而粉末水平的模拟混入试样，是以小麦粉中荞麦粉的混入率为0.1、10、50、100、1,000ppm和1％的质量比来混和制造试样，将各个混入试样在微粉碎以后抽出DNA。
图2a和图2b表示检出结果的电泳图象。上部的数字表示荞麦的混入率，M表示100bp的指针标记，NC表示无模板对照组(没有模板DNA空白)的水。在此，图2a是以小麦DNA稀释荞麦DNA的DNA水平的模拟混入试样作为被检体，图2b是以小麦粉稀释荞麦粉的粉末水平模拟混入试样作为被检体。
                    表2.检出荞麦用的引物，FAG19/22的特异性
    试样名称     品种     产地     由PCR检出的结果     图1中的泳道序号
    黑荞麦黑荞麦黑荞麦黑荞麦黑荞麦黑荞麦黑荞麦荞麦粉A荞麦粉B     マンカンマンカンマンカン内蒙古榆林キタワセ会津在来     美国加拿大中国中国中国北海道福岛     +++++++++     123456789
    小麦小麦裸麦大麦大米玉米大豆小米菜种燕麦荞麦蔓     农林61号CAD(Cmadian Amber Durum)ミノリムギコシヒカリ非GMO(饲料用)ムラユタカ熊本产Canola赛马饲料用冈山大学资源生物科学研究所     日本加拿大加拿大日本日本澳大利亚日本日本加拿大加拿大日本     -----------     1011121314151617181920
在实验2中由试样FAG19/22的PCR检出荞麦的检出限确认的结果，在DNA水平和粉末水平的模拟混入试样中荞麦混入率，都以10ppm为检出限(图2)。但是在进行多次实验之中，有多次的检出限是50ppm，这暗示在这样的PCR中，稳定的检出限是50ppm。因为食物过敏是人由极微量的过敏物质而发病的，在食品卫生法的修订的“对含有过敏物质食品的标示要义务化”当中含有指定原料的食品，即使含量是极其微量也必须标示出来。在厚生劳动省过敏标示研讨会的中间报告(平成13年10月17日)中，出示了判断标示必要性的基准，但在此处报告说，在加工食品中，作为特定原材料的总蛋白质含量在几个μg/mL(g)以上(1～9ppm以上)的情况下，标示是必要的。因为荞麦全粉的蛋白质含量大约是12wt％(根据第5次修订的食品成分表)，本PCR检出界限50ppm换算成荞麦蛋白质的混入率就是6ppm。这就是说，在此表示的通过PCR检出荞麦的方法，由于知道了在标示研讨会上出示的标示基准，所以可以认为是充分的分析方法。
(6)实验3.通过PCR检出加工食品中的荞麦
使用FAG19/22作为检出荞麦用的引物，以含有荞麦的加工食品作为原料进行荞麦的检出。使用的试样是两种挂面(100％的荞麦和30％的荞麦)、4种点心(荞麦饼A、B、荞麦江米条、荞麦ボゥロ和烤点心)和荞麦茶，在分别微粉碎以后，挂面用迪西植物最大量试剂盒(Qiagen)，点心和荞麦茶用Genomic Tip20/G(Qiagen)抽出DNA，供PCR使用。对于荞麦饼，由于得到的DNA的纯度低到1.2，所以每个PCR反应管添加50～1,800ng(由吸光度计算的值)的DNA。
使用FAG19/22对加工食品进行检出荞麦的结果(实验3)，以每个PCR中，除去荞麦饼B的模型DNA的量为25ng的规定量检出荞麦(图3a)。另外，在荞麦饼中，模型DNA的添加量即使增加到50ng或120ng，也不能辨认出PCR的括增带，但增量达到1,800ng时，检出荞麦就成为可能的(图3b)。
现在，在检查食品过敏的临床现场，实施诱发实验或针刺-划痕实验、PAST方法等，但是这些方法是以过敏患者的自身或者血液作为对象进行的检查，难以适用于食品的分析。另外，作为用于检出或定量过敏源本身的特定蛋白质分离检出法，使用了电泳法(SDS-PAGE)或蛋白质印迹杂交法(ウエスタンブロツテイング法)、免疫化学的方法(ELISA法)，但是这些对于检出已知的主要抗原是有效的，而对于未知抗原的检出，或者用于加热的工序有可能使蛋白质变性的某些加工食品中就未必适当。
下面表3中显示出图3a和图3b的泳道序号(试样名)
表3
  泳道序号     试样名
图3a   123456789M   荞麦饼A荞麦饼B(模型DNA量50ng/管)荞麦饼B(模型DNA量120ng/管)荞麦江米条荞麦ボウロ荞麦烤点心荞麦茶黑荞麦(荞麦种子)水100bp指针
图3b   12345M   荞麦饼B(模型DNA量50ng/管)荞麦饼B(模型DNA量120ng/管)荞麦饼B(模型DNA量180ng/管)黑荞麦(荞麦种子)水100bp指针
产业上利用的可能性
由于DNA耐受加热的性能比蛋白质要高，即使在加工食品中经常会有残留。为此，在本发明中出示的，通过以DNA为指标的PCR法检出特定物质的方法，特别在加工食品中，作为食品中过敏源物质的间接分析手段，弥补了过去蛋白质检出法的不足，被认为是极其有用的。
序列表
<110>山川宏人等
<120>食品的检验方法
<130>PCT-178
<160>11
<210>SEQ ID No：1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG3，disigned sense primer based on SEQ ID No：11 between 149 and 169
<400>1
ccagcaattc cagcatcagt g                    21
<210>SEQ ID No：2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG4，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 334 and
     313
<400>2
ttggagtagg aaggaagcaa ga                  22
<210>SEQ ID No：3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG5，disigned sense primer based on SEQ ID No：11 between 278 and 297
<400>3
tgtcgccgtc cgtgtcgtaa                     20
<210>SEQ ID No：4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG6，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 530 and
     510
<400>4
ggattcttcg ctctcactct g                    21
<210>SEQ ID No：5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG17，disigned sense primer based on SEQ ID No：11 between 1435 and 145
     5
<400>5
tggagtgggt ggagttgaag a                      21
<210>SEQ ID No：6
<21121
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG18，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 1624 a
     nd 1604
<400>6
tcatctcggg actggaatgg t                      21
<210>SEQ ID No：7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG19，disigned sense primer based on SEQ ID No：11 between 1464 and 14
     84
<400>7
aacgccataa ccagcccgat t               21
<210>SEQ ID No：8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG20，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 1626 an
     d 1606
<400>8
tctcatctcg ggactggaat g               21
<210>SEQ ID No：9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG22，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 1590 a
     nd 1571
<400>9
cctcctgcct cccattcttc                20
<210>SEQ ID No：10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FAG24，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：11 between 1592 a
     nd 1572
<400>10
aacctcctgc ctcccattct t              21
<210>SEQ ID No：11
<211>1825
<212>DNA
<213>Fagopyrum esculentum
<220>
<221>CDS
<222>(39)..(1655)
<223>major allergenic storage protein(FAGAG1)mRNA，complete cds.
<400>11
gatcaccacc tcgacaacac aacttcaaac attccaccat gtcaactaaa ctcatactct     60
ccttctcact gtgccttatg gtactaagct gctctgcgca gctattgcca tggcagaagg    120
gacaacgcag ccgcccccac catggacacc agcaattcca gcatcagtgt gatatccaga    180
ggctcaccgc ctctgagccc tctcgtagag tccggtccga ggccggagtt actgagattt    240
gggaccatga cacccctgag ttccgatgtg ccggatttgt cgccgtccgt gtcgtaattc    300
agcctggagg cctcttgctt ccttcctact ccaacgcccc ttacatcacc tttgtcgagc    360
aagggagggg agtgcaggga gtggtcgtgc caggatgccc ggagacgttc cagtcagggt    420
cggaatttga gtaccctcgg tctcagagag accaacgctc caggcagagt gagagcggag    480
aatccagccg tggagaccaa cgctccaggc agagtgagag cgaagaatcc agccgtggag    540
accaacgctc caggcagagt gagagcgaag aattcagccg tggagaccag caccagaaga    600
ttttcaggat cagagacggc gacgtcatcc catctcccgc cggtgtcgtg cagtggaccc    660
acaacaacgg tgacaacgat ctcatcagta tcactcttta cgatgccaac agcttccaga    720
accagctcga tgagaacgtt aggaacttct tcctagctgg tcagagcaag cagagcaggg    780
aggaccgccg cagccagcga cagactaggg aggaaggcag tgaccgccaa tcccgtgaga     840
gccaagacga cgaagcactt ctcgaagcaa acatcttgag tggattcgag gacgagatcc     900
tccaagaaat cttccgaaat gttgaccagg agaccatcag caagctcaga ggtgagaacg     960
accagagagg attcatcgtc caggctcggg acctcaaact ccgggtccca gaggagtatg    1020
aagaagaact ccagagggaa agaggtgaca ggaaaagagg tggaagcggg aggagcaatg    1080
gattggagca agcgttctgc aacctgaaat tcaggcaaaa tgttaacagg ccttctcgcg    1140
ccgacgtctt caacccacgc gccggtcgta tcaacaccgt agacagcaac aatctcccga    1200
tcctcgaatt catccaactt agcgcccagc acgtcgtcct ctacaagaat gcgatcctcg    1260
gaccgagatg gaacttgaac gcgcacagcg cactgtacgt gacgagagga gaaggaagag    1320
tccaggttgt cggagatgaa ggaagaagtg tgttcgacga caacgtgcag cgaggacaga    1380
tccttgtggt cccacaggga ttcgcagtgg tgttgaaggc aggaagagaa ggactggagt    1440
gggtggagtt gaagaacgac gacaacgcca taaccagccc gattgccggg aagacttcgg    1500
tgttgagggc gatccctgtg gaggttcttg ccaactccta cgatatctcg acgaaggaag    1560
cgttcagatt gaagaatggg aggcaggagg ttgaggtctt ccgaccattc cagtcccgag    1620
atgagaagga gagggagcgt ttctccatag tttaagagag acaaagggtc tatcgtatgc    1680
aaaataaaac agaaggagaa ggataaggga gtcttgtcta tcgtttagct agtcaagtcc    1740
ctcttccact tctgggttat gttctatgtt tttactttag tgtcaataaa agagtgaatt    1800
ctcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                          1825

Claims (11)

1.用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，来测定在食品中有无特定物质的方法。
2.为了标示食品中有无微量成分，而用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，来测定在食品中有无特定物质的，对食品进行标示的方法。
3.为了识别在食品中含有对食品摄取者有害的特定物质过敏源，而使用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，来测定在食品中有无特定物质的方法。
4.如权利要求1～3中任何一项的方法，其中所述特定物质是特定的谷类。
5.如权利要求1～4中任何一项的方法，其中所述食品是被加工处理过的食品。
6.如权利要求1～4中任何一项的方法，其中所述食品是食品原料。
7.如权利要求1～6中任何一项的方法，其中所述特定的谷类是荞麦。
8.如权利要求1～7中任何一项的方法，其中所述基因是序列表的序列号为11表示的荞麦基因，所述引物是：
①从第121g至360c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选择的正向引物和反向引物；或者
②从第1381t至1680c的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段选择的正向引物或反向引物。
9.如权利要求1～8中任何一项的方法，其中使用所述引物进行PCR，在电泳图象中，在含有苦荞麦(Fagopyrum tataricum)和/或荞麦(Fagopyrumesculentum)的被检体中能够辨认出明确的扩增带，而在含有荞麦蔓(Fallopia)的被检体中，则不能辨认出。
10.用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的，用来测定食品中有无特定物质和/或测量其浓度的PCR引物。
11.含有用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的PCR引物的，用来测定在食品中有无特定物质和/或测量其浓度用的试剂盒。
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