KR100720867B1 - 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한알레르기 유발 식품 검출방법 - Google Patents

알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한알레르기 유발 식품 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알레르기를 유발하는 식품인 고등어 또는 이의 가공 식품 내 함유된 알레르기 유발 식품을 신속, 간편하게 검출할 수 있는 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발 식품 검출 방법에 관한 것이다.
알레르기 유발 식품, 프라이머, 검출키트

Description

알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발 식품 검출방법{PRIMER FOR THE DETECTION OF RAW MATERIAL CAUSING ALLERGEN AND DETECTION METHOD OF ALLERGEN WITH SAME}
도 1은 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 선정 과정을 간략하게 도시한 것이다.
도 2는 소 10두의 rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 3은 알레르기를 유발하는 우유 검출용 프라이머로 우유, 돼지고기, 계란, 사슴, 말, 양, 염소, 고등어, 게 및 미생물 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 4는 알레르기를 유발하는 우유 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 5는 돼지 10두의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 6은 알레르기를 유발하는 돼지고기 검출용 프라이머로 우유, 돼지고기, 계란, 사슴, 말, 양, 염소, 고등어, 게 및 미생물 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 7은 알레르기를 유발하는 돼지고기 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 8은 10개의 계란의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 9는 알레르기를 유발하는 계란 검출용 프라이머로 우유, 돼지고기, 계란, 사슴, 말, 양, 염소, 고등어, 게 및 미생물 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 10은 알레르기를 유발하는 계란 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 11은 4마리의 고등어의 파르발부민 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 12는 알레르기를 유발하는 고등어 검출용 프라이머로 우유, 돼지고기, 계란, 사슴, 말, 양, 염소, 고등어, 게, 미생물, 홍어, 상어, 병어, 숭어, 가오리 및 광어 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 13은 알레르기를 유발하는 고등어 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 14는 10마리의 게로부터 추출한 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 15는 알레르기를 유발하는 게 검출용 프라이머로 우유, 돼지고기, 계란, 사슴, 말, 양, 염소, 고등어, 게, 미생물, 홍어, 상어, 병어, 숭어, 가오리 및 광어 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 16은 알레르기를 유발하는 게 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 17은 4종의 대두의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 18은 알레르기를 유발하는 대두 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 19는 알레르기를 유발하는 대두 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 20은 4종의 복숭아의 지질 전이 단백질 유전자의 염기서열을 정렬한 것이 다.
도 21은 알레르기를 유발하는 복숭아 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 22는 알레르기를 유발하는 복숭아 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 23은 4종의 땅콩의 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 24는 알레르기를 유발하는 땅콩 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 25는 알레르기를 유발하는 땅콩 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 26은 4종의 토마토의 폴리갈락투로네이즈 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 27은 알레르기를 유발하는 토마토 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 28은 알레르기를 유발하는 토마토 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 29는 4종의 메밀의 p22 kDa 저장 단백질 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 30은 알레르기를 유발하는 메밀 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 31은 알레르기를 유발하는 메밀 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 32는 4종의 밀의 어글루틴 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다.
도 33은 알레르기를 유발하는 밀 검출용 프라이머로 토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자 각각으로부터 추출한 DNA를 PCR한 결과이다.
도 34는 알레르기를 유발하는 밀 검출용 프라이머의 검출한계를 확인한 것으로, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 10 pg 및 1 pg의 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 35는 우유, 계란, 돼지고기, 고등어, 게, 땅콩, 밀, 메밀, 대두, 복숭아 및 토마토 각각에 특이적인 PCR 프라이머 세트로 PCR 한 결과이다.
[기술분야]
본 발명은 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발 식품 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우유, 돼지고기, 닭고기, 계란, 고등어, 게, 대두, 복숭아, 땅콩, 토마토, 메밀 및 밀로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 식품 또는 이의 가공 식품 내 함유된 알레르기 유발 식품을 신속, 간편하게 검출하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
식품 알레르기(food allergy)는 정상인에게는 무해한 식품을 특정인이 섭취하였을 때 그 식품의 특정 단백질에 대한 인체의 과도한 면역반응이 일어나는 것을 말한다. 식품 알레르기를 가진 사람은 소수이지만, 이들은 알레르기 원인 식품으로 인해 심한 경우 목숨까지 위협받을 수 있으며, 전 세계 1억 5천만명(미국민 중 6-7백만 명, 개발도상국 인구의 2.5%, 우리나라에서는 5-38% 정도)이 질환으로 고생하고 있다. 따라서 식품 안전성 측면에 있어서, 알레르기를 유발하는 식품을 분석하는 것이 매우 중요한 사안으로 부각되고 있다. 식품 알레르기의 원인물질은 주로 식품중의 단백질이며, 미국에서는 우유, 계란, 대두, 생선 등 일상적으로 섭취하는 8가지가 전체 알레르기 반응의 90% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 국내 알레르기 유발 원인식품으로는 고등어가 가장 많으며, 복숭아, 돼지고기, 닭 고기, 우유, 계란 등은 특히 유아나 어린이의 아토피성 피부염의 원인이 된다. 각 국가별 알레르기 유발 식품에 대한 관리사항은 하기 표 1과 같다.
(표 1)
대한민국 (식품의약품 안전청 지정) 일본 CODEX EU 미국
알레르기 유발 재료 명 표기의무화 의무화 의무화 의무화 의무화
난류(가금류), 우유, 메밀, 땅콩, 대두, 밀, 고등어, 게, 돼지고기, 복숭아, 토마토 우유, 난, 메밀, 땅콩, 밀, 전복, 오징어, 연어알젖, 새우, 오렌지, 키위, 게, 쇠고기, 호두, 연어, 고등어, 대두, 닭고기, 돼지고기, 송이버섯, 복숭아, 참마, 사과, 젤라틴 곡류(글루텐), 갑각류, 난류, 어류, 땅콩 및 대두, 유제품, 견과류, 설파이트(sulfite) 곡류(글루텐), 갑각류, 난류, 생선 ,대두, 유제품, 너트, 샐러리, 겨자, 참깨, 설파이트 우유, 난류, 생선, 갑각류, 견과류, 밀, 땅콩, 대두
식품 알레르기에 대한 예방 및 치료방법은 특별히 없으며, 이를 예방하는 유일한 방법은 식품에 알레르기 유발 식품에 대한 정확한 표시제도와, 감수성이 있는 소비자들이 해당 식품을 섭취하지 않는 것이다. 이는 식품 자체 뿐만 아니라 이를 원료로 하여 제조, 가공된 가공식품의 경우에도 동일하게 적용되어야 한다.
알레르기 유발 식품을 검사하는 방법은, 알레르기를 유발하는 해당 단백질을 ELISA나 EIA 법을 사용하여 직접 검출하는 방법이다. 그러나, 검사 대상이 되는 단백질들은 대부분 다양한 원료의 혼합을 통한 제조과정이나 여러 단계의 가공 과정에서 소실되기 쉬워, 민감도와 특이도 면에서 매우 떨어지는 문제점이 있다. 또 다른 알레르기 유발 식품 검출방법으로는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여, 알레르기를 유발하는 식품의 DNA를 검출하는 방법이 있다. 상기 방법은 기존의 단백질 검출 방법에 비하여, 가열, 가공 식품 등 여러 공정 과정을 거친 식품에서도 DNA를 검출할 수 있는 장점이 있다.
그러나, 아직 국내에서는 식품 내 알레르기 유발 식품을 검출할 수 있는 키트가 아직 개발되어 있지 않은 실정이며, 국외의 경우에도 알레르기 유발 식품 검출용 단백질 검출 키트는 여러 제품이 출시되어 있으나 유전자 분석을 통한 PCR 및 실시간 PCR 키트의 개발은 아직 초기 단계에 있는 실정이다. 따라서 식품의약품안전청에서 고시한 한국인에게서 특별히 많은 알레르기 반응을 유발하는 알레르기 유발 식품을 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 방법의 확립이 요구되고 있다.
상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 식품의약품안정청에서 선정한 11종의 알레르기 유발 식품을 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머를 이용한 PCR 방법으로, 식품 및 가공 식품내 알레르기 유발 식품의 함유 유무를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 2종 이상의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머를 이용한 실시간 PCR 방법으로, 식품 및 가공 식품내 다수 종의 알레르기 유발 식품의 함유 유무를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 식품 및 가공 식품내 알레르기 유발 식품의 함유 유무를 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 식품의약품안전청에서 고시한 한국인에게서 특별히 많은 알레 르기 반응을 유발시키는 11종에 대한 알레르기 유발 식품 검출방법을 확립하고자 연구하던 중, 11종의 알레르기 유발 식품 각각에 특이적인 염기서열 단편을 확보하고, 이를 토대로 PCR을 이용한 알레르기 유발 식품 검출방법을 개발하였다.
본 발명은 고등어를 검출할 수 있는 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는, 도 1에 기재된 전략에 따라 선정하였으며, 이에 따라 각각의 알레르기 유발 식품을 검출하기 위한 검출 대상 유전자로 표 2에 기재된 각 식품에 특이적인 유전자 부위를 선별하였다.
(표 2)
알레르기 유발 식품 표적 유전자
동물성 우유 미토콘드리아 유전자
계란 미토콘드리아 유전자
돼지 미토콘드리아 유전자
고등어 파르발부민(칼슘 결합 단백질)
게 미토콘드리아 유전자
식물성 대두 글루코스-결합 렉틴 전구체
땅콩 땅콩응집소전구체(peanut agglutinin precusor)
토마토 폴리갈락투로네이즈(PG)
밀 어글루틴
메밀 레구민 형 단백질(allergenic protein)
복숭아 지질 전이 단백질
상기 표 2의 표적 유전자의 염기서열에서, (1) 각 프라이머의 길이가 18 - 30 bp이며, (2) 최적의 어닐링 온도는 60℃ 내외를 가지며, (3) 프라이머내 염기서열의 GC:AT의 비율에서 GC의 비율이 65-40%이며, 바람직하기로는 50:50이며, (4) 프라이머 내부에 이차 구조가 형성되지 않으며, (5) PCR 반응에서 비특이적 반응이 발생되지 않는 부위를 검색하여, 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍을 각각 제작하였다.
구체적인, 본 발명의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍은 하기와 같다.
(1) 알레르기를 유발하는 우유 검출용 프라이머 쌍
서열번호 1로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머이며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 98 bp이다.
서열번호 1:5'-TGGGGCTAGGAGTTAATCATTTG-3'(Bo100R)
서열번호 2:5'-CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC-3'(Bo100F)
(2) 알레르기를 유발하는 돼지고기 검출용 프라이머 쌍
서열번호 3으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루지며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 100 bp이다.
서열번호 3: 5'-TATTGGGCTAGGAGTTTGTTATTAG-3'(Po100R)
서열번호 4: 5'-CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC-3'(Po100F)
(3) 알레르기를 유발하는 계란 검출용 프라이머 쌍
서열번호 5로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 92 bp이다.
서열번호 5: 5'-CGTAGGAGGATAGGTTCCAGA-3'(Ch92R)
서열번호 6: 5'-AACCCTATTTGACTCCCTCAA-3'(Ch92F)
또한 계란 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는 닭고기 검출용 프라이머로도 사용가능하다.
(4) 알레르기를 유발하는 고등어 검출용 프라이머 쌍
서열번호 7로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 128 bp이다.
서열번호 7: 5'-CCATGATTAAGGGATAAAGAG-3'(Ma138F)
서열번호 8: 5'-TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC-3'(Ma138R)
(5) 알레르기를 유발하는 게 검출용 프라이머 쌍
서열번호 9로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 150 bp이다.
서열번호 9: 5'-CCATGATTAAGGGATAAAGAG-3'(Cb145F)
서열번호 10: 5'-TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC-3'(Cb145R)
(6) 대두 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍
서열번호 11로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 118 bp이다.
서열번호 11: 5'-TCCACATTTGGGACAAAGAA-3'(Soy118F)
서열번호 12: 5'-GGTGCGAGAAAGAAGGCA-3'(Soy118R)
(7) 알레르기를 유발하는 복숭아 검출용 프라이머 쌍
서열번호 13으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 169 bp이다.
서열번호 13: 5'-CGGTGGAGCTGTGCCTCCAGC-3'(Pe169F)
서열번호 14: 5'-AACTCCACACTTGCCGGGAAG-3'(Pe169R)
(8) 알레르기를 유발하는 땅콩 검출용 프라이머 쌍
서열번호 15로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 136 bp이다.
서열번호 15: 5'-GAAACCTAATCTTGCAAGGTG-3'(Nut136F)
서열번호 16: 5'-CCCAGAGGCGCACCTGGGT-3'(Nut136R)
(9) 알레르기를 유발하는 토마토 검출용 프라이머 쌍
서열번호 17로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 383 bp이다.
서열번호 17: 5'-AAAATTTCAGACTACAAAG-3'(To383F)
서열번호 18: 5'-AATCAAATGCAATTAACGTAC-3'(To383R)
(10) 알레르기를 유발하는 메밀 검출용 프라이머 쌍
서열번호 19로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 20으로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 138 bp이다.
서열번호 19: 5'-GAGCCCTCTCGTAGAGTCCG-3'(Bu138F)
서열번호 20: 5'-GGAGTAGGAAGGAAGCAAGAG-3'(Bu138R)
(11) 알레르기를 유발하는 밀 검출용 프라이머 쌍
서열번호 21로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 22로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지며, 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍에 의하여 PCR 되는 증폭 산물의 크기는 127 bp이다.
서열번호 21: 5'-GGTTCCGAGTTCTGCGGCG-3'(We125F)
서열번호 22: 5'-TGCCACAGGATCCCCACTTGC-3'(We125R)
또한 본 발명은, 상기 1종 이상의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로, 알레르기 유발물질을 탐지하는 것을 포함하는 알레르기 유발 식품 검출방법에 관한 것이다. 상기 알레르기 유발 식품 검출방법에 대상이 되는 시료는, 알레르기를 유발하는 식품 또는 상기 식품의 일부가 함유된 가공 또는 가공되지 않은 식품일 수 있으며, 구체적으로는 시중에 시판되는 음료를 포함한 모든 식품일 수 있다.
본 발명의 검출방법은, 2종 이상의 다른 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍을 이용한 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex polymerase Chain Reaction)로 실시될 수 있으며, 이로서 알레르기의 원인이 되는 2종 이상의 알레르기 유발 식품을 동시에 신속 정확하게 검출할 수 있다. 이는 본 발명의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍이, 알레르기 유발 식품에 따라 서로 다른 크기의 DNA를 증폭하기에 가능한 것이다.
본 발명의 검출방법에서 채택되는 PCR 반응조건은, PCR의 종류, 예컨대 다중 PCR, 마이크로 PCR, 단일 PCR 등에 따라 통상의 PCR 반응조건을 채택하거나 일부 변형하여 실시할 수 있으며, 이는 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 예측할 수 있는 범주에 해당된다. 구체적인 PCR 반응 조건은 후술되는 실시예 1-13에서 채택한 조건일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 마이크로 PCR은 소형 PCR용 칩을 이용한 방법으로, 주형 DNA와 프라이머 쌍만을 이용하여 20㎕ 반응 조성물을 제조하고, 여기서 1㎕를 취하여 실리콘 칩에 주입한 방법으로, PCR 반응을 진행하여 유전자 증폭사항을 실시간으로 모니터링할 수 있다. 이는 시판되는 기계를 이용하여 용이하게 실시할 수 있다.
상기 단일 PCR 및 다중 PCR은 통상적인 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR) 기기 또는 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR) 기기로 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 검출방법은, 일례로, 알레르기 유발 식품 함유 물질로 예상되는 시료를 채취하고, 상기 시료로부터 DNA를 회수한 후 PCR을 실시하는 것이다. PCR 결과는 통상적인 PCR 검출 수단, 예컨대 전기영동 또는 상기 PCR시 한쪽 말단이 형광물질 또는 방상능 물질과 같은 검출가능한 표지물질로 표지시킨 프라이머로 실시 하여, 이를 검출하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 시료로부터 DNA를 회수하는 것은 당업자에게 공지된 기술 또는 시판되는 시약 또는 키트를 이용하여 용이하게 실시가능하다.
또한 본 발명은, 1종 이상의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 알레르기 유발 식품 검출키트를 제공한다. 상기 검출키트는 프라이머이 외에, PCR 반응에 요구되는 통상적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소, 표지물질 등)을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 검출키트는 다음과 같이 구성된다.
(1) 우유 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 계란 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 돼지고기 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 게 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 토마토 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 복숭아 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 땅콩 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 고등어 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 메밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍, 밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍 및 대두 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 세트;
(2) PCR 반응완충액(Reaction Buffer); 및
(3) Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)
아울러, 본 발명의 검출키트는, 상기 11종의 알레르기 유발 식품을 각각 검출할 수 있는 상기의 프로브를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 형광물질, 예컨대 FAM, VIC, TET, TAMRA, JOE 및 NED 등으로 한쪽 말단이 표지된 것일 수 있으며, 바람직하기로는 서로다른 프로브는 서로다른 형광물질로 표지된 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알레르기를 유발하는 우유 검출용 프라이머
1-1. 우유 유전자 및 검출 부위 선정
우유는 소에서 생산되므로, 우유 검출용 프라이머는 소의 미토콘드리아 DNA 중 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위에 대하여 제작하였다.
먼저, 국내 및 국외에서 우유 생산을 위한 종으로 사용하고 있는 10종의 소들의, rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 2는 소 10두의 rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 2의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 2의 정렬된 염기서열에서, 1538번째부터 1635까지의 98 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
1-2. 우유 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 1538번째부터 1635까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 하기 기준에 따라, 우유 특이 프라이머로 Bo 100R 및 Bo 100F를 제조하였다. 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 세트, Bo 100R 및 Bo 100F는 98 bp의 PCR 산물을 증폭시키다.
-프라이머 선정 기준-
: 각 프라이머의 길이는 18 - 30 bp
: 최적의 어닐링 온도는 60℃ 내외를 가짐
: GC:AT의 비율은 가능한 50:50이며, GC의 비율은 최고 65%를 넘지 않으며, 최하 40% 미만이 되지 않음
: 내부에 이차 구조가 형성되지 않음
: PCR 반응에서 비특이적 반응이 발생되지 않음
-우유 검출용 프라이머-
Bo 100R(Genbank accession No.AY126697)
: 5'-TGGGGCTAGGAGTTAATCATTTG-3'(서열번호 1)
Bo 100F(Genbank accession No.AY126697)
: 5'-CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC-3'(서열번호 2)
1-3. 서열검색을 통한 우유 검출용 프라이머의 특이성 평가
우유 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 소에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
1-4. 우유 검출용 프라이머의 특이도 검증
계란, 양, 돼지, 사슴, 우유, 말, 염소, 어류 및 세균으로부터 DNA를 추출한 후, 하기 표 3의 PCR 반응 조성물을 제조하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
(표 3)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Bo100F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Bo100R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 4)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 10 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과 도 3의 전기영동 결과를 확인할 수 있었다. 도 3에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 우유에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 돼지 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 계란 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 사슴은 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 말 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 양 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 염소 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 혼합 미생물 (Campylobacter jejuni, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus) DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 3에서 확인된 바와 같이, 본 발명이 우유 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는, 우유만을 검출할 수 있었다.
1-5. 우유 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 1-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 우유에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 4에 나타낸다. 도 4에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 우유 검출용 프라이머 Bo100F-Bo100R의 검출한계는 10 pg인것으로 확인되었다.
실시예 2: 알레르기를 유발하는 돼지고기 검출용 프라이머
2-1. 돼지고기 유전자 및 검출 부위 선정
돼지고기에 대한 검출부위는 미토콘드리아 DNA 중 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부분으로 선정하였다.
국내 및 국외에서 사육되고 있는 10종의 돼지들의, 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 5는 돼지 10두의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 5의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 5의 정렬된 염기서열에서, 1462번째부터 1561까지의 100 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
2-2. 돼지고기 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 1462번째부터 1561까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 돼지고기 검출용 프라이머로 Po100R 및 Po100F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Po 100R(Genbank accession No.AF304202)
: 5'-TATTGGGCTAGGAGTTTGTTATTAG-3'(서열번호 3)
Po 100F(Genbank accession No.AF304202)
: 5'-CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC-3'(서열번호 4)
2-3. 염기서열 검색을 통한 돼지고기 검출용 프라이머의 특이성 평가
돼지고기 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면 에 동일 종 즉, 돼지에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
2-4. 돼지고기 검출용 프라이머의 특이도 검증
닭, 양, 돼지, 사슴, 우유, 말, 염소, 어류 및 세균으로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 5 및 6에 각각 나타내었다.
(표 5)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Po100F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Po100R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 6)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 10 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 우유에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 돼지 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 계란 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 사슴은 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 말 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 양 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 염소 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 혼합 미생물(Campylobacter jejuni, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus) DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 6에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 돼지고기 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는, 돼지고기만을 특이적으로 검출하였다.
2-5. 돼지고기 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 2-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 돼지에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 7에 나타낸다. 도 7에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 돼지고기 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Po100F 및 Po100R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 3: 알레르기를 유발하는 계란 검출용 프라이머
3-1. 계란 유전자 및 검출 부위 선정
계란에 대한 검출부위는 미토콘드리아 DNA 중 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부분으로 선정하였다.
10 마리 각기 다른 개체 계란(Chicken egg)에 대해서 약 2.6 Kb 정도의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동 염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 8은 10개의 계란의 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 8의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 8의 정렬된 염기서열에서, 1658번째부터 1749까지의 92 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
3-2. 계란 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 11658번째부터 1749까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 계란 검출용 프라이머로 Ch92F 및 Ch92R를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Ch92R(Genbank accession No.AY235570)
: 5'-CGTAGGAGGATAGGTTCCAGA-3'(서열번호 5)
Ch92F(Genbank accession No.AY235570)
: 5'-ACCCTATTTGACTCCCTCAA-3'(서열번호 6)
3-3. 염기서열 검색을 통한 계란 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머의 특이성 평가
계란 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터 베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 닭에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
3-4. 계란 검출용 프라이머의 특이도 검증
계란, 양, 돼지, 사슴, 우유, 말, 염소, 어류 및 세균으로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 7 및 8에 각각 나타내었다.
(표 7)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Ch92F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Ch92R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 8)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 10 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 우유에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 돼지 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 닭 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 사슴은 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 말 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 양 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 염소 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 혼합 미생물(Campylobacter jejuni, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus) DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 9에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 계란 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는, 계란만을 검출할 수 있었다.
3-5. 계란 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 3-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 계란에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 10에 나타낸다. 도 10에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 계란 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Ch92F 및 Ch92R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 4: 알레르기를 유발하는 고등어 검출용 프라이머
4-1. 고등어 유전자 및 검출 부위 선정
고등어에 대한 검출부위는 파르발부민(calcium binding protein) 유전자로 선정하였다.
4 마리의 고등어들로부터 DNA를 추출하여 각각 파르발부민 유전자 부위를 증 폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 11은 4마리의 고등어의 파르발부민 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 11의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 11의 정렬된 염기서열에서, M을 기준으로 362번째부터 490까지의 128 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
4-2. 고등어 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 1462번째부터 1561까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 고등어 검출용 프라이머로 Ma138R 및 Ma138F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Ma138R(Genbank accession No. AB091470)
: 5'-CCATGATTAAGGGATAAAGAG-3'(서열번호 7)
Ma138F(Genbank accession No. AB091470)
: 5'-TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC-3'(서열번호 8)
4-3. 염기서열 검색을 통한 고등어 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머의 특이성 평가
고등어 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상 기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 고등어에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
4-4. 고등어 검출용 프라이머의 특이도 검증
닭, 양, 고등어, 사슴, 우유, 말, 염소, 어류, 세균, 홍어, 상어, 병어, 숭어, 가오리 및 광어로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 9 및 10에 각각 나타내었다.
(표 9)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Ma138F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Ma138R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 10)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 10 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 우유에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 계란 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 사슴은 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 말 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 양 DNA에 대한 PCR 결과 이고, 레인7은 염소 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 혼합 미생물(Campylobacter jejuni, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus) DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인11은 홍어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인12는 상어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인13은 병어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인14는 숭어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인15는 가오리 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인16은 광어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인17은 고등어 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 12에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 고등어 검출용 프라이머는, 고등어만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
4-5. 고등어 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 4-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 고등어에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 13에 나타낸다. 도 13에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 고등어 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Ma138F 및 Ma138R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 5: 알레르기를 유발하는 게 검출용 프라이머
5-1. 게 유전자 및 검출 부위 선정
게에 대한 검출부위는 미토콘드리아 DNA 중 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부분으로 선정하였다.
각기 다른 개체 10종의 게들의, 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 14는 10마리의 게로부터 추출한 12S rRNA-tRNAval-16S rRNA 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 14의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 14의 정렬된 염기서열에서, 47번째부터 197까지의 150 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
5-2. 게 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 47번째부터 197까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 게 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머로 Cb145R 및 Cb145F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Cb145R(Genbank accession No. AF092945)
: 5'-CCATGATTAAGGGATAAAGAG-3'(서열번호 9)
Cb145F(Genbank accession No. AF092945)
: 5'-TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC-3'(서열번호 10)
5-3. 염기서열 검색을 통한 게 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머의 특이성 평가
게 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 게에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
5-4. 게 검출용 프라이머의 특이도 검증
계란, 양, 게, 사슴, 우유, 말, 염소, 어류 및 세균으로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 11 및 12에 각각 나타내었다.
(표 11)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Cb145F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Cb145R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 12)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 10 sec/60℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 15에 나 타내었다. 도 15에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 소에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 계란 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 사슴은 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 말 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 양 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 염소 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 게 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 혼합 미생물(Campylobacter jejuni, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus) DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인11은 홍어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인12는 상어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인13은 병어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인14는 숭어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인15는 가오리 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인16은 광어 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인17은 게 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 15에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 게 검출용 프라이머는, 게만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
5-5. 게 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 5-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 게에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 16에 나타낸다. 도 16에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 게 검출용 프라이머 Cb145F 및 Cb145R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 6: 알레르기를 유발하는 대두 검출용 프라이머
6-1. 대두 유전자 및 검출 부위 선정
대두에 대한 검출부위는 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 대두들의 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자 부위를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 17은 4종의 대두의 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자 부위의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 17의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 17의 정렬된 염기서열에서, 1216번째부터 1354까지의 118 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종 내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
6-2. 대두 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 47번째부터 197까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 대두 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머로 Soy117R 및 Soy117F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Soy117R(Genbank accession No. K00821)
: 5'- TCCACATTTGGGACAAAGAA-3'(서열번호 11)
Soy117F(Genbank accession No. K00821)
: 5'-GGTGCGAGAAAGAAGGCA-3'(서열번호 12)
6-3. 염기서열 검색을 통한 대두 검출용 프라이머의 특이성 평가
대두 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 대두에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
6-4. 대두 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 13 및 14에 각각 나타내었다.
(표 13)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Soy117F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Soy117R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 14)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 18에 나 타내었다. 도 18에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 감자 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 18에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 대두 검출용 프라이머는, 대두만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
6-5. 대두 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 6-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 대두에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 19에 나타낸다. 도 19에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 대두 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Soy117F 및 Soy117R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 7: 알레르기를 유발하는 복숭아 검출용 프라이머
7-1. 복숭아 유전자 및 검출 부위 선정
복숭아에 대한 검출부위는 지질 전이 단백질 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 복숭아들의, 지질 전이 단백질 유전자를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 20은 4종의 복숭아의 지질 전이 단백질 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 20의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 20의 정렬된 염기서열에서, 5번 염기서열을 기준으로 57 번째에서 225 번까지의 169 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
7-2. 복숭아 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 57 번째에서 225 번까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 복숭아 검출용 프라이머로 Pe169R 및 Pe169F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Pe169R(Genbank accession No. AJ277163)
: 5'-CGGTGGAGCTGTGCCTCCAGC-3'(서열번호 13)
Pe169F(Genbank accession No. AJ277163)
: 5'-AACTCCACACTTGCCGGGAAG-3'(서열번호 14)
7-3. 염기서열 검색을 통한 복숭아 검출용 프라이머의 특이성 평가
복숭아 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 복숭아에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
7-4. 복숭아 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 15 및 16에 각각 나타내었다.
(표 15)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Pe169F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Pe169R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 16)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/58℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 15에 나타내었다. 도 21에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결 과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 벼 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 21에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 복숭아 검출용 프라이머는, 복숭아만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
7-5. 복숭아 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 7-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 복숭아에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 22에 나타낸다. 도 22에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 복숭아 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Pe169F 및 Pe169R의 검출한계는 50 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 8: 알레르기를 유발하는 땅콩 검출용 프라이머
8-1. 땅콩 유전자 및 검출 부위 선정
땅콩에 대한 검출부위는 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 땅콩들의, 글루코스 결합성 렉틴 전구체유 전자를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 23은 4종의 땅콩의 글루코스 결합성 렉틴 전구체 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 23의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 23의 정렬된 염기서열에서, 2번 염기서열을 기준으로 52 번째에서 187 번까지의 136 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
8-2. 땅콩 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 52 번째에서 187 번까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 땅콩 검출용 프라이머로 Nut136R 및 Nut136F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Nut136R(Genbank accession No. U22472)
: 5'-GAAACCTAATCTTGCAAGGTG-3'(서열번호 15)
Nut136F(Genbank accession No. U22472)
: 5'-CCCAGAGGCGCACCTGGGT-3'(서열번호 16)
8-3. 염기서열 검색을 통한 땅콩 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머의 특이성 평가
땅콩 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상 기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 땅콩에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
8-4. 땅콩 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 17 및 18에 각각 나타내었다.
(표 17)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Nut136F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Nut136R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 18)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/55℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 24에 나타내었다. 도 24에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 벼 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 24에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 땅콩 검출용 프라이머는, 땅콩만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
8-5. 땅콩 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 8-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 땅콩에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 25에 나타낸다. 도 25에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 땅콩 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Nut136F 및 Nut136R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 9: 알레르기를 유발하는 토마토 검출용 프라이머
9-1. 토마토 유전자 및 검출 부위 선정
토마토에 대한 검출부위는 폴리갈락투로네이즈 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 토마토들의, 폴리갈락투로네이즈유전자를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 26은 4종의 토마토의 폴리갈락투로네이즈 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 26의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 26의 정렬된 염기서열에서, 2번 염기서열을 기준으로 332 번째에서 616 번까지의 383 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
9-2. 토마토 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 3354번째에서 3737번까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 토마토 검출용 프라이머로 To383R 및 To383F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
To383R(Genbank accession No. X14074)
: 5'-AAAATTTCAGACTACAAAG-3'(서열번호 17)
To383F(Genbank accession No. X14074)
: 5'-AATCAAATGCAATTAACGTAC-3'(서열번호 18)
9-3. 염기서열 검색을 통한 토마토 검출용 프라이머의 특이성 평가
토마토 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 토마토에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
9-4. 토마토 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 토마토, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 19 및 20에 각각 나타내었다.
(표 19)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Nut136F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
To383R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 20)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/55℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 27에 나타내었다. 도 27에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 벼 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 27에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 토마토 검출용 프라이머는, 토마토만을 검출할 수 있었다.
9-5. 토마토 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 9-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 토마토에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 28에 나타낸다. 도 28에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 토마토 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 To383F 및 To383R의 검출한계는 10 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 10: 알레르기를 유발하는 메밀 검출용 프라이머
10-1. 메밀 유전자 및 검출 부위 선정
메밀에 대한 검출부위는 p22 kDa 저장 단백질 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 메밀들의, p22 kDa 저장 단백질 유전자를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 29은 4종의 메밀의 p22 kDa 저장 단백질 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 29의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임 의로 지정된 것이다. 도 29의 정렬된 염기서열에서, 3번 염기서열을 기준으로 97 번째에서 234 번까지의 138 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
10-2. 메밀 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 97번째에서 234번까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 메밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머로 Bu138R 및 Bu138F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
Bu138R(Genbank accession No. AF152003)
: 5'-GAGCCCTCTCGTAGAGTCCG-3'(서열번호 19)
Bu138F(Genbank accession No. AF152003)
: 5'-GGAGTAGGAAGGAAGCAAGAG-3'(서열번호 20)
10-3. 염기서열 검색을 통한 메밀 검출용 프라이머의 특이성 평가
메밀 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 메밀에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
10-4. 메밀 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 21 및 22에 각각 나타내었다.
(표 21)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Nut136F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
Bu138R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 22)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/55℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 30에 나타내었다. 도 30에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 감자 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 30에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 메밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머는, 메밀만을 검출할 수 있었다.
10-5. 메밀 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 10-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 메밀에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 31에 나타낸다. 도 28에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 메밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 Bu138F 및 Bu138R의 검출한계는 50 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 11: 알레르기를 유발하는 밀 검출용 프라이머
11-1. 밀 유전자 및 검출 부위 선정
밀에 대한 검출부위는 어글루틴 유전자로 선정하였다.
각기 다른 개체에서 생산된 4종의 밀들의, 어글루틴 유전자를 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 정제하여 자동염기서열분석기 (ABI 310 Genetic Analyzer, PE, USA)를 이용하여 염기서열을 분석 비교하였다.
도 32는 4종의 밀의 어글루틴 유전자의 염기서열을 정렬한 것이다. 도 32의 염기서열 번호는 본 연구에서 분석한 염기서열 순서를 기준으로 임의로 지정된 것이다. 도 32의 정렬된 염기서열에서, 1번 염기서열을 기준으로 337 번째에서 463 번까지의 127 bp가 다른 동물 종 및 다른 식품 원료와 구분되고, 같은 종내에서도 다형성이 나타나지 않는 부위임을 확인할 수 있었다.
11-2. 밀 검출용 프라이머 제조
상기에서, 특이성이 확인된 337번째에서 463번까지의 부위를 증폭할 있는 프라이머를 설계하고자 하였다. 이에 실시예 1과 동일한 프라이머 선정기준에 적합한 부위를 평가하여, 밀 검출용 프라이머로 We125R 및 We125F를 선정하고 이를 각각 제조하였다.
We125R(Genbank accession No. J02961)
: 5'-GGTTCCGAGTTCTGCGGCG-3'(서열번호 21)
We125F(Genbank accession No. J02961)
: 5'-TGCCACAGGATCCCCACTTGC-3'(서열번호 22)
11-3. 염기서열 검색을 통한 밀 검출용 프라이머의 특이성 평가
밀 검출용 프라이머는 프라이머의 염기서열을 GeneBank 및 EMBL의 데이터베이스를 이용하여 특이도를 확인하였다. 그 결과, 상기 프라이머와 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물의 염기서열을 확인하지 못하였으나, 반면에 동일 종 즉, 밀에서는 프라이머와 동일한 염기서열이 검색되었다.
11-4. 밀 검출용 프라이머의 특이도 검증
토마토, 밀, 대두, 땅콩, 메밀, 복숭아, 시금치, 옥수수, 벼 및 감자로부터 DNA를 추출한 후, PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성물 및 PCR 반응 조건은 하기 표 23 및 24에 각각 나타내었다.
(표 23)
시약 최종 농도 부피(㎕)
DNA 50 ng - 100 ng 5
물 8.0
5x PCR 완충액 (with MgCl2 10 mmol/l) 1x 2 mmol/l 5
dNTP, 10 mmol/l 1 mmol/l 2.5
Nut136F 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
We125R 프라이머, 20 pmol/㎕ 40 pmol 2
텍 DNA 중합효소, 5U/㎕ 2.5 unit 0.5
(표 24)
시간/온도 횟수
활성화/변성 개시/ 5 min/94℃ 1 회
증폭 20 sec/94℃ 30 sec/55℃ 30 sec/72℃ 35 회
최종 연장 5 min/72℃ 1 회
PCR 산물은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동하였으며, 그 결과는 도 33에 나타내었다. 도 33에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, N은 음성 대조군이고, 레인1은 토마토에서 추출한 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 대두 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 땅콩 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 메밀 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 복숭아 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 옥수수 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인8은 시금치 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인9는 벼 DNA에 대한 PCR 결과이고, 레인10은 감자 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 33에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 밀 검출용 프라이머는, 밀만을 검출할 수 있었다.
11-5. 밀 검출용 프라이머의 검출한계 검증
상기 11-4.와 동일하게 실시하였으며, 다만 밀에서 추출한 DNA만을 시료로 사용하였고 이를 100 ng에서 1pg의 다양한 농도에서 PCR을 실시하였다. 그 결과는 도 34에 나타낸다. 도 34에서, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인1은 DNA 100 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인2는 DNA 10 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인3은 DNA 1 ng에 대한 PCR 결과이고, 레인4는 DNA 100 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인5는 DNA 50 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인6은 DNA 10 pg에 대한 PCR 결과이고, 레인7은 DNA 1 pg에 대한 PCR 결과로, 밀 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 We125F 및 We125R의 검출한계는 50 pg인 것으로 확인되었다.
실시예 12: 알레르기 유발 식품 검출 키트
과자류, 어묵, 이유식, 쨈, 가공된 아몬드 및 게장 등에 대하여, 알레르기 유발 식품 유발 유전자를 특이적으로 분석하였다. 각 식품으로부터 DNA 추출은 코젠 바이오텍 사의 PowerPrep TM DNA Extraction from Food and Feed kit)를 사용하였다.
(표 25)
알레르기 유발 식품 프라이머 명 서열번호 서열(5'-3') 증폭산물 크기 (bp)
우유 Bo100R Bo100F 1 2 TGGGGCTAGGAGTTAATCATTTG CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC 98
돼지 Po100R Po100F 3 4 TATTGGGCTAGGAGTTTGTTATTAG CATAGTAGGCCTAAAAGCAGCC 100
계란 Ch92R Ch92F 5 6 CGTAGGAGGATAGGTTCCAGA ACCCTATTTGACTCCCTCAA 92
고등어 Ma138F Ma138R 7 8 CCATGATTAAGGGATAAAGAG TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC 128
게 Cb145F Cb145R 9 10 CCATGATTAAGGGATAAAGAG TTGCATAGGAGGAAAGGTCTC 150
대두 Soy118F Soy118R 11 12 TCCACATTTGGGACAAAGAA GGTGCGAGAAAGAAGGCA 118
복숭아 Pe169F Pe169R 13 14 CGGTGGAGCTGTGCCTCCAGC AACTCCACACTTGCCGGGAAG 169
땅콩 Nut136F Nut136R 15 16 GAAACCTAATCTTGCAAGGTG CCCAGAGGCGCACCTGGGT 136
토마토 To383F To383R 17 18 AAAATTTCAGACTACAAAG AATCAAATGCAATTAACGTAC 383
메밀 Bu138F Bu138R 19 20 GAGCCCTCTCGTAGAGTCCG GGAGTAGGAAGGAAGCAAGAG 138
밀 We125F We125R 21 22 GGTTCCGAGTTCTGCGGCG TGCCACAGGATCCCCACTTGC 127
표 25 및 도 35에 각 가공 식품에 대한 알레르기 유발 식품 분석결과를 나타내었다. 도 35에서, A 내지 K는 우유, 계란, 돼지고기, 고등어, 게, 땅콩, 밀, 메밀, 대두, 복숭아 및 토마토 각각에 특이적인 PCR 프라이머 세트로 PCR 한 결과이며, M은 100 bp DNA 사이즈 마커이고, NC는 음성 대조군이고 PC는 양성 대조군이다. 또한 A 내지 K에서, 레인1 내지 레인10의 식품 시료는 각각 과자, 케찹, 즉석식품, 고등어 통조림, 간장게장, 주스, 어묵, 빵, 분유I 및 분유II이다.
(표 26)
과자 케찹 즉석 식품 고등어 통조림 간장 게장 혼합 쥬스 어묵 빵 분유1 분유2 증폭크기 (bp)
우유(A) O/O X/X O/O X/X X/X X/X X/X O/O O/O O/O 98
계란(B) O/O X/X /XX X/X X/X X/X X/X O/O O/O O/O 92
돼지고기(C) X/X X/X O/O X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X 100
고등어(D) X/X X/X X/X O/O X/X X/X X/X X/X X/X X/X 128
게(E) X/X X/X X/X X/X O/O X:쥬스 O:게장 X/X X/X X/X X/X 150
땅콩(F) O/O X/X X/X X/X X/X X/X X:어묵 O:쨈 O/O O/O O/O 136
밀(G) O/O X/X X/X X/X X/X X/X X/X O/O O/O O/O 127
메밀(H) X/X X/X X/X X/X X/X X/X X:어묵 O:부침가루 X/X X/X X/X 138
대두(I) O/O X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X O/O O/O 118
복숭아(J) X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X X/X 169
토마토(K) X/X X/X X/X X/X X/X O/O X/X X/X X/X O/O 383
표 26 및 도 35에서, 11종의 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머를 이용하여 각 식품에 대한 검출 결과를 보이고 있다. E는 레인6에서 주스 대신 게장으로, F는 레인7에서 어묵 대신 땅콩으로, 그리고 H는 레인7에서 어묵 대신 부침가루를 이용하여 반응한 결과를 나타내었다. 그 결과, 쥬스는 게 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 반응시 검출되지 않았다. 또한 F는 어묵 대신 땅콩 쨈과 반응한 결과를 나타내었다. 어묵에서는 땅콩 성분이 검출 되지 않았다. 그리고 메밀 알레르기 유발 식품은 부침가루에서 검출되었다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 인간에게 알레르기를 유발하는 알레르기 유발물질인 알레르기 유발 식품의 함유 유무를 쉽고 간단하게 판별할 수 있는 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발 식품 검출 방법을 제공한다. 본 발명을 통하여, 알레르기 유발 식품에 함유 유무에 관한 정보 를 소비자에게 제공할 수 있으며, 식품 표시 기준 마련, 식품 안정성 확보에 기여할 수 있다. 또한 식품 알레르기와 관련된 표시기준의 법령의 기초 자료로 사용될 수 있으며, 특히 식품 제조 및 가공 과정을 개선시킬 수 있도록 활용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 7로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 알레르기를 유발하는 고등어 검출용 프라이머 쌍.
  2. 제 1항에 따른 고등어 검출용 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 알레르기 유발물질을 탐지하는 것을 포함하는 알레르기 유발 식품 검출방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 시료는,
    가공 처리된 식품, 또는 가공되지 않은 식품인 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 고등어 검출용 프라이머 쌍은 128 bp의 DNA 단편을 증폭시키는 것인 방법.
  6. 제 1항에 따른 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 쌍을 포함하며 알레르기를 유발하는 고등어를 검출하는 알레르기 유발 식품 검출용 키트.
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