MXPA06008498A - Deteccion del adn de un rumiante mediante pcr. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos, composiciones y equipos para amplificar, cuantificar, y/o detectar ADN de rumiantes a partir de muestras.

Description

DETECCIÓN DEL ADN DE UN RUMIANTE MEDIANTE PCR ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La encefalopatía espongiforme de bovino (BSE) o enfermedad de las "Vacas Locas" fue reconocida primeo en Gran Bretaña en 1986 y se distribuyó a paises del continente europeo (véase por ejemplo, Anderson et al . , Nature 382: 779- 88 (1996) ) . Estudios epidemiológicos subsecuentes han identificado restos d material de oveja infectada por raspones en alimento bovina y es la causa inicial más probable de BSE. El agente patogénico de BSE, es decir, priones se distribuyen en las vacas a partir de restos de materiales. BSE también es propagado mediante la inclusión de restos de carne de bovino y huesos con carne de bovino (BMBM) como componente de alimento para los animales (véase por ejemplo, Wilesmith et al . , Vet Rec. 123: 112-3 (1988)). BSE actualmente se ha identificado en el Reino Unido, Europa, Japón y Norteamérica, Incluyendo Canadá y los Estados Unidos (véase por ejemplo, Normile, Science, 303: 156-157 (2004)). En 1997, en respuesta a la evidencia epidemiológica de la transmisión en restos de BSE, la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) prohibió la incorporación de ciertos tejidos de mamíferos (por ejemplo, tejidos derivados del SNC y tejido del intestino) en alimento para rumiantes (véase por ejemplo, 62(108) Registro Federal 30935-78 (5 de junio de 1997) ) . Se cree que los productos que poseen un minimo riesgo, incluyendo sangre, productos de sangre, gelatina, leche y productos de la leche destituidos únicamente de fuentes del cerdo o del caballo y productos de carne inspeccionados pueden ofrecerse para el consumo humano donde inicialmente se exentaron de la restricción. En enero de 2004, la USDA prohibió la incorporación de "materiales especificados de riesgo", es decir, cráneo, cerebro, ganglio trigémino, ojos, columna vertebral, médula espinal y raices dorsales de ganglios de ganado de 30 meses de edad y mayores, asi como amígdalas e ileo distal del intestino delgado de ganado de cualquier edad en alimentos para humanos, incluyendo cualquier alimento semejante para ingresar como suplemento de comida humana, en el mismo mes, la FDA extendió la restricción a sangre de mamíferos y productos con sangre, carne no consumible y otros restos de comida rumiante de restaurantes . Además, la FDA notificó que los materiales derivados de bovinos de animales nacidos o que residen en paises donde apareció BSE no podían utilizarse para fabricar productos regulados por la FDA pretendidos para su administración a humanos (incluyendo por ejemplo, vacunas) . La FDA también recomendó que el uso de proteínas derivadas de ganado de alto riesgo debía evitarse en la fabricación de cosméticos .

Actualmente, estimaciones de confianza están basadas en un sistema honorable acompañado por firmas y sitios de visita de la FDA en donde son verificados los protocolos de fabricación y mantenimiento de registros. Las pruebas de verificación actualmente disponibles para determinar la presencia de fuentes de proteínas de rumiantes en alimentos para animales es un método de examen microscópico durante un período de tiempo (Tartaglia et al . , J Food Prot . 61(5): 513-518 (1998)) que tiene un límite inferior de detección mayor que 5% por peso del alimento o valoración inmunológica con un límite de detección reportado de l%-5% por peso ("Reveal®" Neogen Corp., Lansing MI). Desde que las restricciones iniciales fueron implementadas, el desarrollo de métodos para extraer e identificar restricciones adicionales en muestras (por ejemplo alimento para rumiantes, alimento para mascotas, cosméticos, alimento para humanos y nutracéuticos) ha proporcionado una cantidad de atención por los investigadores. Por ejemplo, Tartaglia et al . , J Food Prot . 5: 513-518 (1998); Wang et al . , Mol . Cell Probes 1: 1-5 (2000); y Kremar y Rencova, J Food Prot . 1: 117-119 (2001) describen métodos de extracción e identificación de ADN mitocondrial de bovino. Myers et al . , J. Food Prot . 4: 564- 566 (2001) compararon métodos de extracción de ácidos nucleicos. Sin embargo, ninguno de estos métodos se dirige al procedimiento de inhibidores presentes en los alimentos que interfieren con la detección del ADN causando así, una alta incidencia de resultados falsos negativos. Un equipo comercial que dirige la presencia de inhibidores PCR está disponible (equipo Qiagen Stool, Qiagen Inc., Valencia CA, 91355) , pero como se discute en los ejemplos a continuación, el uso de este equipo no elimina todos los inhibidores PCR presentes en alimentos para animales . Un equipo comercial de detección basado en un sistema de inmunovaloración de mareaje de enzimas (ELISA) identifica la contaminación en rumiantes en alimentos derivados de ganado (Neogen AgriScreen, Lansing MI, 48912), pero este equipo depende de la presencia de la proteína de rumiantes en alimento de ganado y no está dirigido a una porción de cantidades por minuto de proteína que puede estar en el alimento. La aplicación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ADN mitocondrial (ADNmt) se ha investigado para detectar la presencia de contaminación bovina en alimento para rumiantes (Tartaglia et al . , J Food Prot . 61(5): 513-518 (1998)). Sin embargo, el procedimiento falla para detectar niveles de contaminación menores de 0.125% por peso y requieren un paso de incubación durante la noche. Los investigadores además sugieren un paso adicional utilizando un análisis de endonucleasas de restricción del producto amplificado para asegurar la especificidad del producto amplificado. Los resultados falsos negativos que fallan al detectar la presencia de una proteína de rumiante restringida en el suplemento alimenticio para animales, suplemento alimenticio de humanos, vacunas, nutracéuticos o cosméticos, puede generar la contaminación de estas sustancias con la proteína de rumiante restringida, ya sea directa o indirectamente. Tal contaminación puede tener un impacto adverso significativo sobre la salud del público al incrementar el riesgo de BSE. Además, el alto riesgo de contaminación tiene potencialmente efectos devastadores sobre las industrias de alimentos, cosméticos y de vacunas porque incrementa drásticamente los costos asociados con el monitoreo de sus productos derivados de material de rumiante. Pruebas más sensibles para detectar material de rumiante en cualquier alimento, vacunas o cosméticos antes de que ingresen al alimento, vacuna o cosmético puede incrementar la eficiencia de monitorear alimento, vacunas o cosméticos por contaminación de un material de rumiante y reducir enormemente el riesgo de BSE al público en general. Así, existe una necesidad en la técnica para métodos y composiciones adicionales para detectar el ADN de rumiantes. En particular, existe una necesidad de métodos más sensibles y precisos para detectar ADN de rumiante, que reduce y/o elimina falsos negativos. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y equipos para amplificar, cuantificar y/o detectar ADN de rumiante en muestras . Una modalidad de la invención proporciona un método para amplificar ADN de rumiante en una muestra (por ejemplo, del alimento de un animal, el componente del alimento de un animal, un cosmético, un nutracéutico, una vacuna, una infusión de fluido coloide, o combinaciones de éstos) al poner en contacto el ácido nucleico de una muestra con una RNasa (por ejemplo, RNasa A, RNasa B, RNasa D, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T, RNasa V, y combinaciones de éstos) para generar un ácido nucleico sometido a tratamiento con RNasa; amplificar el ácido nucleico sometido a tratamiento con RNasa utilizando un primer cebador específico de rumiante y un segundo cebados específico de rumiante para amplificar el ADN de rumiante presente en la muestra, para producir un primer ADN de rumiante amplificado. En algunas modalidades, los métodos además comprender detectar el ADN de rumiante amplificado. En algunas modalidades, los métodos además comprenden amplificar el primer ADN de rumiante amplificado con un tercer cebador específico de rumiante y un cuarto cebador específico de rumiante. En algunas modalidades, el ácido nucleico se aisla de la muestra antes de poner en contacto este ácido nucleico con una RNasa. En algunas modalidades, el ADN de rumiante detectado es de una vaca, una oveja, una cabra, un alce, un venado y combinaciones de éstos. En algunas modalidades, el ácido nucleico sometido a tratamiento con RNasa es generado al poner en contacto este ácido nucleico aislado con la RNasa en aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40°C por aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 120 minutos. En otras modalidades, el ácido nucleico sometido a tratamiento con RNasa se genera al poner en contacto el ácido nucleico aislado con la RNasa en aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 60 minutos. En algunas modalidades, el ADN de rumiantes comprende una secuencia de ADN mitocondrial (por ejemplo, citocromo c, citocromo b, ARN 12S, subunidad 8 de ATPasa, subunidad 6 de ATPasa, ATP sintetasa, subunidad 8 y subsecuencias de estos) . En algunas modalidades, los pares cebadores específicos de rumiante son SEQ ID NOS: 1 y 2; SEQ ID NOS: 3 y 4; o SEQ ID NOS: 11 y 12. En algunas modalidades, la muestra es un alimento para animales (por ejemplo, sebo bovino, leche o una fracción de estos) . En algunas modalidades, el alimento para animales es alimento de res (por ejemplo, que comprende aproximadamente de 0.5% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 0.75% a aproximadamente 20%, o aproximadamente 1% de sebo bovino) . En algunas modalidades, los métodos además comprenden detectar el producto amplificado (por ejemplo, mediante la detección de una señal a partir de un enlace fluoróforo del producto amplificado o mediante la detección de una señal a partir de una sonda de oligonucleótido enlazada al producto amplificado) . Otra modalidad de la invención también proporciona un equipo para detectar ADN de rumiante. Los equipos generalmente comprenden al menos un par de cebadores específicos de rumiante, RNasa (por ejemplo, RNasa A, RNasa B, RNasa D; RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T, RNasa V, y combinaciones de éstas) e instrucciones de uso. En algunas modalidades, los equipos además comprenden un segundo par de cebadores específicos de rumiante. Una modalidad adicional de la invención comprende aislar ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácido nucleico a ser reforzadas en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13 ó 14. Las composiciones y métodos de la presente invención son descritos con mayor detalle a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe los datos de los análisis del punto de fusión de los productos amplificados descritos en el Ejemplo 4. La Figura 2 es una tabla (Tabla 1) que resume los efectos inhibidores de contaminantes sobre la amplificación del ácido nucleico. La inhibición mediante PCR fue determinada utilizando cantidades en picogramos del ADN testigo (ADN humano - HADN) . Cantidades mínimas en picogramos de HADN variaron una centésima de veces entre los siete extractos de alimento de res sin diluir. Al diluir los extractos (1:100) se incrementó la amplificación del HADN. El mínimo nivel de detección se mejoró en los Alimentos de res Nos. 2, 3, 4 y 6 por 10 veces; los Alimentos Nos. 1, 5 y 7 permanecieron iguales. La Figura 3 es una tabla (Tabla 2) que resume los análisis de pureza del ADN extraído del alimento de res. Las determinaciones para evaluar la cantidad y pureza del material extraído detectó la presencia de sustancias diferentes al ADN. La ebullición y centrifugación de los extractos no tuvo efecto sobre la cantidad de ADN no específico, la proporción de 260/280 nm o sobre el resultado PCR. La proporción promedio del espectrofotómetro a 260/280 nm fue de 2.11 (STD DEV: +/-0.09; proporción: 1.40 a 2.37) y 4/126 extractos estuvieron por debajo de 1.8. La proporción de > 2.0 implica ARN como posible contaminante. La disparidad entre el ADN (determinaciones fluorométricas) y ácido nucleico (cálculos espectrofotométricos) fue de 10 µg/ml a 40 µg/ml veces mayor en el contenido de ácido nucleico. La electroforesis en gel demostró que el tratamiento de los extractos con ARNasa retirando el ARN donde las bandas de ADN y una banda de peso molecular por debajo de 2,000 pb permanecieron . La Figura 4 es una tabla (Tabla 3) que resume el efecto de (1) tratamiento con RNasa; y (2) el tipo de alimento y concentración de restos de carne de bovino y huesos con carne de bovino (BMBM) sobre la detección de ADNmt de bovino. El tratamiento con ARNasa mejoró la sensibilidad de detección del ADNmt-B y la consistencia de detección del ADNmt-B en los Alimentos Nos. 3, 5, 6 y 7. ADNmt-B se detectó en los Alimentos Nos 1 y 2 que muestran picos con 0.10% BMBM. El ADNmt-B fue detectado en los Alimentos Nos. 1, 2 y 7 que muestran picos con 0.1% BMBM. ADNmt-B se detectó en el Alimento No. 1 que mostró picos con 0.05% BMBM. ADNmt-B se detectó en todos los alimentos sometidos con ARNasa y mostraron picos con 0.02% BMBM. Con excepción del Alimento No. 3, ADNmt-B se detecto en todos los alimentos mostrando picos con 0.1% BMBM. La Figura 5 es una tabla (Tabla 4) que resume el efecto del tratamiento con RNasa sobre el número de resultados falsos negativos. Además, el tratamiento con RNasa disminuyó los resultados falsos negativos un 75%, (42/105 a 10/105). Los resultados falsos negativos en las muestras de alimento que contenían elevadas concentraciones de BMBM (2%, 1% y 0.5%) se redujeron 100% (22/63 a 0/63). Los resultados falsos negativos en las muestras de alimento que contenían bajas concentraciones de BMBM (0.2% y 0.1%) se redujeron al 50% (20/42 a 10/42) . Todas las muestras de alimento que contenían 0% de BMBM fueron negativos. La Figura 6 muestra la detección de y diferenciación del ADN de especies como bovinos, oveja y cabra en una reacción simple de PCR utilizando una serie de sondas FRET (SEQ ID NOS: 13 y 14) y cebadores 8SEA ID NOS: 11 y 12) diseñados para que el ADN de las tres especies de rumiantes pudiera amplificarse y las sondas pudieran enlazarse a los tres amplicones pero que varían en sus grados de homología. Las sondas FRET se enlazan a una secuencia objetivo de bovino con 100% de homología, a una secuencia objetivo de cabra con 93% de homología y a una secuencia objetivo de oveja con 88% de homología. Las diferencias de resultados de homología en las tres curvas distintas de temperatura de fusión (Tm) de cada una de las especies de bovino, cabra u oveja. La Figura 7 muestra datos que comparan el método basado en PCR y un método basado en anticuerpos para detectar la presencia de sangre seca de bovino (BDB) y carne de bovino y huesos con carne de bovino (BMBM) en cinco alimentos de res representativos. Los resultados mostrados son los resultados de análisis por triplicado. Todos los alimentos sin picos fueron negativos con ambos métodos . La Figura ' 8 muestra datos que demostraron la eficiencia de reacción PCR del ADN convencional de bovino serialmente diluido en un extracto de ADN para una muestra de vacuna .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Introducción La presente invención proporciona métodos y equipos para amplificar, cuantificar y/o detectar el ADN de rumiante en una muestra (por ejemplo de un alimento para animales, un componente de alimento para animales, un cosmético, un nutracéutico, una vacuna, un fluido de infusión coloide, o combinaciones de éstos). En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para amplificar, cuantificar y/o detectar el ADN de rumiante en un alimento para animales o en componentes alimenticios para animales. La presente invención está basada en el descubrimiento sorprendente del ARN presente en una muestra (por ejemplo, una muestra como la de alimento para animales, cosmético, nutricéutico o vacuna que se ha probado para la presencia de ADN de rumiante) interfiere con las reacciones de amplificación para detectar ADN de rumiante en la muestra. Los inventores han descrito que el tratamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras con RNasa mejora la consistencia y sensibilidad de las reacciones de ampliación para detectar ADN de rumiante. En particular, los inventores han descrito que el tratamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras (por ejemplo, muestras analizadas para la presencia de ADN de rumiante) con RNasa reduce la incidencia de falsos negativos donde los ácidos nucleicos están sujetos a reacciones de amplificación para detectar ADN de rumiante.

I . Definiciones Una "muestra" como se utiliza en la presente se refiere a una muestra de cualquier fuente que sea sospechosa de contener polipéptidos de rumiante o ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de rumiante. Estas muestras pueden ser evaluadas mediante los métodos descritos aquí e incluyen por ejemplo, alimento de rumiante, alimento para mascotas, cosméticos, comida humana, nutricéuticos, vacunas o fluidos de infusión coloide. Una muestra puede ser de una fuente de laboratorio o de una fuente que no es de laboratorio. Una muestra puede ser suspendida o disuelta en materiales líquidos como amortiguadores, extractores, solventes y lo similar, las muestras también incluyen fluidos del cuerpo de animal y de humano como toda la sangre, fracciones de sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, fluidos de linfa, leche y fluidos biológicos como extractos celulares, supernadantes de cultivo celular; especímenes fijos de tejido y especímenes fijos de células. "Rumiante" como se utiliza aquí se refiere a un mamífero que tiene un estómago dividido en múltiples compartimentos (es decir, un rumen, un retículo, un omaso y un abomaso) y es capaz de digerir celulosa. Ejemplos de rumiantes incluyen por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, venados, alces, búfalos, bisontes, llamas, alpacas, dromedarios, camellos, bóvidos de altas montañas, renos, jirafas y lo similar. "Alimento para animales" y "componente de alimento para animales" como se utiliza aquí se refiere a cualquier composición o porción de esta que complemente la nutrición de un animal. Los componentes alimenticios para animales incluyen por ejemplo, proteínas, carbohidratos y grasa. Los componentes alimenticios específicos para animales incluyen por ejemplo, cereal, sebo de bovino, sangre y/o fracciones de éstos, leche y/o fracciones de ésta, melaza/azúcar (por ejemplo azúcar de caña o procesado, melaza de remolacha, caña de azúcar y cítricos y combinaciones de éstos), zanahorias, barras de dulce, granos (por ejemplo, trigo, avena, cebada, triticale (cereal híbrido de trigo y centeno) , arroz, maíz/cereal, sorgo, centeno y combinaciones de éstos) , fracciones de grano procesado (por ejemplo, salvado fino, salvado, moliendas, germinado de cereal (Triticum) , granos de cervecero, peinadura de malta, galletas, pan, maíz molido, sémola y combinaciones de éstos), pulsos/legumbres (por ejemplo, semillas maduras secas o suculentas, y vainas inmaduras de plantas leguminosas, incluyendo por ejemplo, guisantes, frijoles, lentejas, frijoles de soya y altramuz y combinaciones de éstos), aceites de semillas (por ejemplo, semillas de algodón, semillas de girasol, semillas de alazor, semillas de colza/canola, linaza y semillas de ajonjolí y combinaciones de éstas); harinas de proteínas de plantas (por ejemplo, harinas de semillas aceitosas, harina de cacahuate, harina de frijol de soya, harina de copra, harina de palma de almendra, y combinaciones de éstos) ; productos de frutas (por ejemplo, pulpa de cítricos, pulpa de piña, pulpa de frutas pomáceas, cascara de uva, bagazo de uva, y combinaciones de éstos); pastos (por ejemplo, hierbas y pastos de legumbres, y mezclas de hierbas/pastos de legumbres) ; forraje (por ejemplo, semillas, heno, forraje conservado en silo y paja de legumbres, pastos y cereales, trozos de caña de azúcar, y combinaciones de éstos) ; forraje (por ejemplo, forraje de cereal, forraje de semillas oleosas, forraje de legumbres y combinaciones de éstos); alfalfa (por ejemplo, seca, fresca, medias flores y combinaciones de éstos) ; grano de cebada, pulpa seca de remolacha, pastos con muchas raíces, granos de cervecero (por ejemplo, húmedos, secos y combinaciones de estos) , pastos bromeliáceos, heno de pastos bromeliáceos viejos, pulpa de cítricos (por ejemplo, secos, en silo y combinaciones de éstos) , tréboles (por ejemplo, heno, en silo y combinaciones de éstos, melaza de cacahuate, cereal (por ejemplo, bulbos, espigas, en silo y combinaciones de éstos) , alimento de cereal de relleno, semillas de algodón (por ejemplo, corteza, entero, harina y combinaciones de éstos) , granos destilados secos, harina de pescado, alimento de maíz molido, harina de cordero, Lespedeza (por ejemplo, fresco, en heno y combinaciones de éstos) , harina de linaza, harina de carne y hueso (por ejemplo, de res, oveja, cabras, aves y combinaciones de éstos) , leche (fresca, seca, congelada y combinaciones de éstos) , mijos, pastos del nabo, pastos de orquídea, harina de cacahuate, corteza natural del sauce, alimentos que contienen "ligaduras" que comprenden colágeno bovino. El alimento para animales puede además incluir componentes suplementarios como por ejemplo, minerales, vitaminas y nutricéuticos . El alimento para animales incluye por ejemplo, alimento para res, alimento para oveja, alimento para cabra, alimento para perro, alimento para gato, alimento de venado, alimento para alce y lo similar. El alimento para animales y componentes alimenticios son extendidos por ser composiciones que no contienen normalmente ADN de rumiante.

"Animales" o "animal" como se utiliza aquí se refiere a cualquier organismo vertebrado. Los animales incluyen mamíferos, aves, anfibios, reptiles, rumiantes, primates (por ejemplo, humanos, gorilas y chimpancés) . Los animales incluyen animales domesticados (por ejemplo, reses, ovejas, cabras, cerdos, pollos, patos, pavos, gansos, codorniz, gallinas de guinea, gatos y perros) así como animales no domesticados (por ejemplo, alce, becerro, reno y jirafas) . Los animales pueden estar en forma silvestre (es decir, en sus ambientes naturales) o pueden mantenerse en parques zoológicos. Otros animales dentro de la definición utilizada aquí incluye, por ejemplo, elefantes, rinocerontes, hipopótamos, leones, tigres, osos, jaguares, pumas, gato montes y lo similar. Un "cosmético" o "cosmocéutico" como se utiliza aquí se refiere a cualquier compuesto pretendido para ser frotado, vertido, irrigado o rociado en, introducido a, o por otra parte aplicado al cuerpo humano para limpieza, belleza, promover lo atractivo o alterar la apariencia. Tipos ejemplares de cosméticos incluyen por ejemplo, agentes acondicionadores de la piel, emolientes, fijadores y agentes acondicionadores del cabello y uñas. Cosméticos ejemplares incluyen por ejemplo, humectantes de la piel (incluyendo por ejemplo, lociones del cuerpo, lociones de la piel y cremas anti-arrugas), limpiadores de la piel, productos para el cuidado del acné (incluyendo por ejemplo, humectantes de la piel, limpiadores de la piel, tonificantes de la piel y encubridores) , perfumes, humectantes para labios, bálsamo para labios, lápiz labial, barnices de uñas, preparaciones de productos para ojos y faciales, champús, acondicionadores para el cabello, ondulados permanentes, pastas de dientes, implantes de colágeno y desodorantes, así como cualquier material pretendido de usarse como un componente de un producto cosmético. Un "nutricéutico" como se utiliza aquí se refiere a cualquier sustancia que es un alimento o parte de un alimento y proporciona beneficios médicos o saludables, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades. Los nutricéuticos incluyen por ejemplo, nutrientes aislados, suplementos dietéticos y dietas específicas para alimentos diseñados por la ingeniería dietética, productos herbales y alimentos procesados tales como cereales, sopas y bebidas, un producto aislado de los alimentos y generalmente vendido en formas medicinales que no están generalmente asociadas con los alimentos pero que demuestran tener un beneficio fisiológico para proporcionar protección contra enfermedades crónicas . Los nutricéuticos además incluyen cualquier comida que esté nutricionalmente incluida en los complementos nutricionales tales como por ejemplo, aminoácidos dincluyendo por ejemplo, Tirosina, Triptófano) ; aceites y ácidos grasos (incluyendo por ejemplo, ácido linoleico y aceites Omega 3) ; minerales/coenzimas/elementos traza (incluyendo por ejemplo, hierro, coenzima Q10, zinc) ; vitaminas (incluyendo por ejemplo, ácido ascórbico, Vitamina E) ; proteínas (sueros) polvos/bebidas; basadas en plantas/hierbas (incluyendo por ejemplo, alfalfa, fitonutrientes, palmitos aserrados) ; remedios herbales y homeopáticos (incluyendo por ejemplo, veneno de Leopard, hierba de San Juan; tratamientos contra colitis (incluyendo por ejemplo, aquellos que contienen calostro de bovino como enemas); tratamientos contra artritis (incluyendo por ejemplo, aquellos que contienen glucosamina-condroitina de bovino) ; sustitutos de la unión de cartílagos (incluyen por ejemplo, aquellos que contienen cartílago de bovino); ayuda digestiva (sales biliares, jugos gástricos) y productos para mantener el peso (incluyen por ejemplo, aquellos que contienen proteínas de bovino como colágeno, gelatina y proteína en suero) . Una "vacuna" como se utiliza aquí se refiere a una preparación que comprende un agente inmunogénico infeccioso que es administrado para estimular una respuesta (por ejemplo, una respuesta inmunitaria) que protegerá al individuo por sí mismo si se administra a la enfermedad debida a un agente infeccioso. Los individuos a los que se les administran vacunas incluyen cualquier animal como se define aquí. Las vacunas incluyen vacunas terapéuticas proporcionadas después de la infección y pretenden reducir o contrarrestar la progresión de la enfermedad así como vacunas preventivas (es decir, profilácticas) para prevenir el inicio de la infección. Los agentes infecciosos utilizados en las vacunas están totalmente muertos (inactivos) , atenuadamente vivos (debilitados) o artificiales (por ejemplo, en forma recombinante) bacterias fabricadas, virus u hongos. Vacunas ejemplares incluyen por ejemplo, cepa de Bacterina J5 de E. coli (Upjohn), UltraBac 7 (toxoide de Bacterina de tipos penfringentes de Clostridum Chauvoei-Septicum-Novyi-Sordellii C y D) , Spirovav (Bacterina de Leptospira Hardjo) (Pfizer) , Leptoferm-5 (Bacterina de Leptospira Canicola-Grippotyphossa-Harjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona) (Pfizer) , ScourGuard 3 (Virus Bovino de Rota-Coronavirus) , toxoide de Bacterina de Clostridum Prenfringens tipo C-E. coli (Pfizer), Bovi-Shield Gold (Vacuna modificada del virus de bovino vivo Rinotraqueitis-virus de diarrea-Parainfluenza-virus sincicial respiratorio) , Bacterina de Leptospira Canicol-Grippotyphosa-Harjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona (Pfizer) , Vacuna de virus atenuado de Defensor 3 Rabies (Pfizer) y Vanguard Plus 5 Canino enfermedad-Adenovirus tipo 2-Coronavirus-Parainfluenza-Parvovirus una vacuna modificada del virus vivo inactivado Bacterina de Leptospira (Pfizer) . Un "fluido de infusión coloide" como se describe aquí se refiere a un fluido que cuando es administrado a un paciente, puede generar un incremento significativo del volumen en sangre, salida cardiaca, volumen de retención, presión sanguínea, saluda de orina y liberación de oxígeno. Fluidos de infusión coloide ejemplares incluyen por ejemplo, expansores del plasma. Los expansores del plasma son productos sustitutos de la sangre utilizados para mantener el volumen sanguíneo circulatorio de los pacientes durante procesos quirúrgicos o cuidado de lesiones hemorrágicas, lesiones agudas o de cirugía, quemaduras, sepsis, peritonitis, pancreatitis o lesión por fractura. Los expansores de plasma incluyen, por ejemplo, albúmina, productos basados en gelatina como Gelofusine® y productos basados en colágeno. Los expansores de plasma pueden derivarse de productos naturales o producidos de forma recombinante. "RNasa" como se utiliza aquí se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis (es decir, la degradación) del ácido ribonucleico. Las RNasas adecuadas incluyen por ejemplo, RNasa A, RNasa B, RNasa D, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T y RNasa V. Las RNasas hidrolizan el ARN en ambas formas de cadenas sencilla y doble y reconocen residuos de ácidos ribonucleicos particulares, por ejemplo, la RNasa A se abre en posición 3' a partir de residuos de una cadena sencilla C y U; RNasa D hidroliza la cadena doble de ARN; RNasa H degrada específicamente el ARN en híbridos ARN:ADN; RNasa I preferiblemente degrada el ARN de una sola cadena en los nucleósidos individuales 3' monofosfatos al romper siempre el enlace fosfodiéster; RNasa Tl rompe los residuos G ubicados en posición 3 de cadena sencilla y RNasa VI rompe las bases pareadas de nucleótidos. "Inhibidor PCR" como se utiliza aquí se refiere a cualquier compuesto que afecta el proceso de amplificación PCR, es decir, al interferir con cualquier porción del proceso propio de amplificación o al interferir con la detección del producto amplificado. El inhibidor PCR puede físicamente, es decir, interferir mecánicamente con la reacción PCR o la detección del producto amplificado. Alternativamente, el inhibidor PCR puede interferir químicamente con la reacción PCR o la detección del producto amplificado. Una "reacción de amplificación" se refiere a cualquier reacción química, incluyendo una reacción enzimática, que resulta en incrementar copias de un modelo de secuencia de ácidos nucleicos . Las reacciones de amplificación incluyen la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de ligasa (LCR) (véanse Patentes estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al . ,editores (1990)), amplificación del desplazamiento de cadena (SDA) (Walker et al . , Nucleic Acids Res . 20(7): 1691 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1): 1 (1993)), amplificación mediada por transcripción (Phyffer, et al . , J Clin . Microbiol . 33: 1856 (1995)), secuencia de ácidos nucleicos basada en amplificación (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91 (1991), amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) (Lisby, Mol . Biotechnol . 12(1): 75 (1999)); Hatch et al . , Genet . Anal . 15(2): 35 (1999)) y señal de amplificación de ADN ramificado (ADNb) (véase por ejemplo, Iqbal et al . , Mol . Cell Probes 13(4): 315 (1999)). "Amplificación" se refiere a someter a una solución a condiciones suficientes para permitir la amplificación de un polinucleótido si todos los componentes de la reacción están intactos. Los • componentes de una reacción de amplificación incluyen, por ejemplo, cebadores, un molde de polinucleótido, polimerasas, nucleótidos y lo similar. Así, un paso de amplificación puede ocurrir sin producir un producto si por ejemplo, los cebadores se degradan. "Detectar" como se utiliza aquí se refiere a la detección de un producto amplificado, es decir, un producto generado utilizando los métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados de detección se describen en detalle aquí. La detección de un producto amplificado puede ser de forma directa o indirecta y puede estar acompañado por cualquier método conocido en la técnica. E producto amplificado también puede ser medido (es decir, cuantificado) utilizando los métodos conocidos en la técnica. "Reactivos de amplificación" se refieren a reactivos utilizados en una reacción de amplificación. Estos reactivos pueden incluir, por ejemplo, cebadores de oligonucleótido, borato, fosfato, carbonato, barbital, Tris, etc., amortiguadores basificados (véase Patente estadounidense No, 5,508,178); sales como cloruro de sodio o de potasio; magnesio; trifosfatos de desoxinucleótido 8dMNTP) ; una polimerasa de ácido nucleico como ADN Taq polimerasa; así como DMSO; y agentes estabilizantes como gelatina, suero de albúmina bovino y detergentes no iónicos (por ejemplo, T een-20) . El término "cebador" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ceba la síntesis de un polinucleótido en una reacción de amplificación. Generalmente un cebador comprende cerca de aproximadamente 100 nucleótidos y preferiblemente comprende cerca de aproximadamente 30 nucleótidos. Los cebadores ejemplares se encuentran en el rango d aproximadamente 5 a aproximadamente 25 nucleótidos. La "integridad" de un cebador se refiere a la capacidad del cebador para cebar una reacción de amplificación. Por ejemplo, la integridad de un cebador está generalmente no más intacto después de la degradación de las secuencias cebadas como por el rompimiento de una endonucleasa.

Una "sonda" o "sonda de oligonucleótido" se refiere a una secuencia de polinucleótido capaz de la hibridización de una secuencia de polinucleótido de interés y permite la detección de la secuencia de polinucleótido de elección. Por ejemplo, "sondas" puede comprender polinucleótidos enlazados a reactivos radioactivos o fluorescentes, para permitir la detección de estos reactivos. El término "subsecuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es continua dentro de una segunda secuencia pero no incluye todos los nucleótidos de la segunda secuencia. Un "objetivo" o "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia de polinucleótido de cadena sencilla o doble que busca ser amplificada en la reacción de amplificación. Dos secuencias objetivo son diferentes si comprenden secuencias de polinucleótido no idénticas. Las secuencias objetivo mitocondriales adecuadas incluyen, por ejemplo, citocromo B, citocromo C ARN 12S, subunidad 8 de ATPasa, subunidad 6 de ATPasa, ATP sintetasa, subunidad 8 y subsecuencias y combinaciones de estos. La frase "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de estos en forma ya sea de cadena simple o doble. El término incluye ácidos nucleicos que contienen nucleótidos análogos conocidos o residuos modificados de la cadena principal o uniones que son sintéticas, ocurren naturalmente y que ocurren no naturalmente, que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de estos análogos incluyen sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, ribonucleótidos de 2-0-metilo, péptidos de ácidos nucleicos (PNA) . Dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se dice que son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente en las dos secuencias son los mismos cuando se alinean para una correspondencia máxima como se describe posteriormente, el término "complementario a" se usa aquí para indicar todos los de una primera secuencia son complementarios para al menos una porción de una secuencia del polinucleótido de referencia. Una alineación óptima de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL. Math. 2: 482 (1981) , mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman, Proc.

Natl. Acad. Sci, EUA 85: 2444 (1988), mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programa de Genética de Wisconsin, Grupo de Genética por Computadora (GCG), 575 Science Dr. Madison, Wl) o mediante inspección. El "Porcentaje de identidad de secuencias" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, donde una porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) que se comparan con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se determina al calcular el número de posiciones en donde aparecen bases de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos en ambas secuencias para producir un número de posiciones agrupadas, dividiendo el número de posiciones agrupadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para generar el porcentaje de identidad de secuencia. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede representarse por cualquier número entero de 25% a 100%. En modalidades más preferidas se incluye al menos: 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99%. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similar de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). El programa para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional de Biotecnología de Información (http: //w .ncbi.ni .gov/) . Este algoritmo involucra primero la identificación de los pares de secuencias más registrados (HSP) al identificar palabras de longitud corta W en la secuencia requerida, con ya sea un grupo o algunos valores positivos que satisfacen el ingreso de registros T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos, T se refiere como la palabra vecina de ingreso registrada (Altschul et al., supra) . Este registro inicial de palabra vecina encontrada actúa como el comienzo para iniciar la búsqueda de encontrar HSP grandes que la contengan. La palabra encontrada se extiende en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que el registro de alineación cumulativa aumenta. La extensión de la palabra encontrada en cada dirección se detiene cuando: el registro de alineación cumulativa falla por X cantidad de su valor máximo logrado; el registro cumulativo es cero o menor, debido a la acumulación de una o más residuos de alineaciones registradas de forma negativa; o es alcanzado el final de esta secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de alineación. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de registro BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci, EUA 89: 10915 (1989)), alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas . El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos que aparecen naturalmente y los sintéticos, así como aminoácidos análogos y aminoácidos miméticos que funcionan de forma similar a los aminoácidos que aparecen naturalmente. Los aminoácidos que aparecen naturalmente son aquellos codificados por un código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados tardíamente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina . Los aminoácidos análogos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica como los aminoácidos que aparecen naturalmente, es decir, un a carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Estos análogos tienen grupos R modificados 8por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptidos modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como los aminoácidos que aparecen naturalmente. Los aminoácidos miméticos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de forma similar a los aminoácidos que aparecen naturalmente. Los aminoácidos pueden referirse aquí ya sea por su símbolo conocido de tres letras o por símbolos de una letra recomendados por la Comisión Bioquímica de Nomenclatura IUPAC-IUB. Los nucleótidos, igualmente, pueden referirse por los códigos de letras aceptados comúnmente. Los nucleótidos mezclados son designados como se describe en por ejemplo, Eur. J. Biochem . (1985) 150: 1.

III . Métodos de la Invención Una modalidad de la presente invención proporciona métodos de amplificación, detección y/o cuantificación de ADN de rumiante en muestras (por ejemplo, alimento para rumiante, alimento para mascotas, cosméticos, comida humana y nutricéuticos). Las secuencias objetivo del ADN de rumiante de interés particular incluyen secuencias de ADN mitocondrial y secuencias de ADN no mitocondrial. Las secuencias adecuadas de ADN mitocondrial incluyen por ejemplo, secuencias que codifican para: citocromo c, citocromo b, ARN 12S, subunidad 8 de ATPasa, subunidad 6 de ATPasa, ATP sintetasa, subunidad 8 y subsecuencias y combinaciones de estos.

A. Tratamiento con RNasa De acuerdo con los métodos de la invención, los ácidos nucleicos de las muestras se ponen en contacto con una RNasa bajo condiciones (por ejemplo, tiempo adecuado, temperatura y pH) adecuadas para que la RNasa degrade cualquier ARN presente en el alimento para animales, así como reducir y/o eliminar un inhibidor de la reacción de amplificación utilizada para amplificar el ADN del rumiante, en el alimento para animales. Generalmente, la RNasa se pone en contacto con el ácido nucleico durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 120 minutos, más generalmente de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 90 minutos, siempre más típicamente de aproximadamente 45 hasta aproximadamente 75 minutos, más generalmente durante aproximadamente 60 minutos. Típicamente, la RNasa se pone en contacto con el ácido nucleico de aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 42 °C, más generalmente de aproximadamente 35 °C hasta aproximadamente 40°C, más generalmente en aproximadamente 37 °C. En general, la RNasa se pone en contacto con el ácido nucleico en aproximadamente un pH de 6.0 a un pH de 8.0, más generalmente a un pH de 6.8 a aproximadamente un pH de 7.5, más generalmente en un pH de 7.0. en general, aproximadamente de 0.01 hasta aproximadamente 1 µg de RNasa se ponen en contacto con el ácido nucleico, más típicamente aproximadamente de 0.025 hasta aproximadamente 0.5 µg de RNasa se ponen en contacto con el ácido nucleico, más generalmente aproximadamente de 0.4 hasta 0.25 µg de RNasa se ponen en contacto con el ácido nucleico, más generalmente, aproximadamente 0.05 µg de RNasa se ponen en contacto con el ácido nucleico. En algunas modalidades, la RNasa se calienta hasta aproximadamente 100 °C para destruir cualquier DNasa contaminante antes de poner en contacto la RNasa con el ácido nucleico. El experimentado en la técnica apreciará que la RNasa puede ponerse en contacto con el ácido nucleico antes o después de la extracción del ácido nucleico a partir del alimento para animales. El experto en la técnica apreciara que cualquier RNasa conocida en la técnica puede utilizarse en los métodos de la invención. Las RNasas adecuadas incluyen por ejemplo, RNasa A, RNasa B, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T RNasa V y combinaciones de éstas. Muchas RNasas y combinaciones de RNasas están disponibles comercialmente. Por ejemplo, RNasa libre de DNasa de Roche Diagnostics Corporation (Número de Catálogo 1 119 915) puede utilizarse de forma conveniente en los métodos de la invención.

B. Extracción del ácido nucleico Los ácidos nucleicos pueden extraerse de la muestra utilizando cualquier método conocido en la técnica y/o mediante equipos comercialmente disponibles. Por ejemplo, la extracción del isotiocianato de guanidina como se describe en Tartaglia et al . , J. Food Prot . 61(5): 513-518 (1998); extracción chelex como se describe en Wang et al . , Mol . Cell Probes 14: 1-5 (2000); extracción a partir de papel Whatman como se describe en la Patente estadounidense No. 5,496,562; extracción de celulosa basada en filtros FTA como se describe en Orlandi y Lampe, J. Clin . Microbiology, 38(6): 2271-2277 (2000) y en Burgoyne et al . , Quinto Simposio Internacional sobre Identificación Humana, 1994 (Hoenecke et al . , editores) pueden utilizarse para extraer ácidos nucleicos a partir de las muestras. Además, el equipo Neogen (Catálogo Neogen No. 8100), el equipo Qiagen Stool (Catálogo Aiqgen No. 51504), el equipo Qiagen Plant (Catálogo Qiagen No. 69181) y las tarjetas Whatman FTA (por ejemplo, Nos. de Catálogo Whatman WB120055; WB 120056; WB120205; WB120208; WB120210) pueden ser de forma conveniente utilizados para extraer ácidos nucleicos de cualquier muestra. En una modalidad preferida, se utilizan las tarjetas FTA basadas en celulosa para extraer ácidos nucleicos. Las tarjetas FTA generalmente comprenden compuestos que lisan las membranas celulares y desnaturalizan proteínas. Las muestras son aplicadas a las tarjetas FTA y se les permite secarse. El ADN es capturado dentro de la matriz de las tarjetas FTA y es estable a temperatura ambiente durante más de 14 años. Para la extracción de ácidos nucleicos mediante análisis PCR de la muestra (por ejemplo, alimento para animales, comida humana, una vacuna, un cosmético o un nutricéutico) , una punción (por ejemplo, una punción de 1-2 mm) se toman de la tarjeta FTA y la tarjeta FTA se lava según las instrucciones del fabricante. La punción lavada puede ya sea colocarse directamente en una reacción PCR o el ADN puede eluirse de la punción utilizando cualquier método conocido en la técnica. Las muestras líquidas pueden aplicarse directamente a la tarjeta sin un procesamiento previo. Las muestras más complejas (por ejemplo, muestras sólidas) pueden requerir ser procesadas antes de su aplicación en la tarjeta TFA. Generalmente, aproximadamente de 1 µl hasta aproximadamente 1000 µl, más generalmente de aproximadamente 2.5 hasta aproximadamente 500 µl, más generalmente aproximadamente de 5 µl hasta aproximadamente 250 µl, más generalmente aproximadamente de 7.5 µl hasta aproximadamente 100 µl, más típicamente aproximadamente de 10 µl hasta aproximadamente 65 µl de muestra puede colocarse sobre la tarjeta FTA. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Sambrook et al . , editores, 3a edición 2001); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND Applications (Innis et al . , 1990); GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL (Klieger, 1990); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al . , editores (1994) ) .

C . Componentes para la reacción de amplificación 1. Oligonucleótidos Los oligonucleótidos que son utilizados en la presente invención así como los oligonucleótidos para detectar la amplificación de productos pueden sintetizarse químicamente, utilizando métodos conocidos en la técnica. Estos oligonucleótidos pueden marcarse con radioisótopos, porciones quimioluminiscentes o porciones fluorescentes. Estas marcas son útiles para la caracterización y detección de productos de amplificación al utilizar los métodos y composiciones de la presenten invención. Generalmente, los cebadores objetivo están presentes en la mezcla de reacción a una concentración de aproximadamente 0.1 µM hasta aproximadamente 1.0 µM, más típicamente aproximadamente de 0.25 µM hasta aproximadamente 0.9 µM, siempre más generalmente aproximadamente de 0.5 hasta aproximadamente 0.75 µM, más típicamente aproximadamente 0.6 µm. La longitud del cebador puede ser aproximadamente de 8 hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, más generalmente de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 nucleótidos de longitud, más generalmente aproximadamente de 12 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más típicamente aproximadamente de 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, más generalmente aproximadamente de 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, más típicamente aproximadamente de 19 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, los cebadores de la invención tienen todos la misma temperatura de fusión. En general, los cebadores amplifican una secuencia de ADN de rumiante que exhibe una alta variación entre especies. Las secuencias objetivo adecuadas incluyen por ejemplo, citocromo B, citocromo C, ARN 12S, subunidad 8 de ATPasa, subunidad 6 de ATPasa, ATP sintetasa, subunidad 8 y secuencias y combinaciones de los mismos . 2. Soluciones reguladoras del pH Las soluciones reguladoras del pH que pueden utilizarse son borato, fosfato, carbonato, barbital, Tris, etc., soluciones reguladoras del pH básicos. (Véase Patente estadounidense No. 5,508,178). El pH de la invención puede mantenerse en el rango de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5. (Véase Patente estadounidense No. 5,508,178). La solución reguladora del pH convencional utilizada en las reacciones de amplificación es una solución reguladora del pH básica Tris entre 10 y 50 mM con un pH de alrededor de 8.3 a 8.8 (Véase Innis et al . , supra). El experimentado en la técnica reconocerá que las condiciones de la solución reguladora del pH o amortiguador pueden ser diseñadas para permitir el funcionamiento de todas las reacciones de interés. Así, las condiciones del amortiguador pueden diseñarse para apoyar la reacción de amplificación así como cualesquiera reacciones de restricción enzimática subsecuentes. Una reacción particular del amortiguador puede probarse por su capacidad para apoyar varias reacciones al probar las reacciones tanto individualmente como en combinación. 3. Concentración de sal la concentración de sal presente en la reacción puede afectar la capacidad de los cebadores para templar el ácido nucleico objetivo. (Véase Innis et al . ) . Puede agregarse cloruro de potasio de más a una concentración de aproximadamente 50 mM a la mezcla de la reacción para promover el templado del cebador. También puede agregarse cloruro de sodio para promover el templado del cebador. (Véase Innis et al . ) . 4. Concentración del ion magnesio La concentración del ion magnesio en la reacción puede afectar la amplificación de las secuencias objetivo. (Véase Innis et al . ) . El cebador templado, desnaturalización de la cadena, especificidad de amplificación, formación del dímero-cebador y actividad enzimática son todos ejemplos de parámetros que se ven afectados por la concentración de magnesio. (Véase Innis et al . ) . Las reacciones de amplificaciones pueden contener aproximadamente una concentración d 0.5 a 2.5 M de magnesio que excede sobre la concentración de dNTP. La presencia de magnesio quelante en la reacción puede afectar la concentración óptima de magnesio. Una serie de reacciones de amplificación pueden llevarse a cabo sobre un rango de concentraciones de magnesio para determinar la concentración óptima de magnesio. La concentración óptima de magnesio puede variar dependiendo de la naturaleza de (los) ácido (s) nucleico (s) objetivo y los cebadores que son utilizados, ente otros parámetros.

. Concentración del trifosfato de desoxinucleótido Los trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP) se agregan a la reacción a una concentración final de aproximadamente 20 µM a aproximadamente 300 µM. En general, cada uno de los cuatro dNTP (G, A, C, T) están presentes a concentraciones equivalentes. (Véase Innis et al . ) . 6. Polimerasa de ácido nucleico Una variedad de polimerasas dependientes de ADN están comercialmente disponibles para que funcionen utilizando los métodos y composiciones de la presenten invención. Por ejemplo, la ADN Taq polimerasa puede utilizarse para amplificar las secuencias objetivo de ADN. La valoración PCR puede llevarse a cabo utilizando un componente enzimático como una fuente de ADN polimerasa termoestable adecuada que comprende ADN Taq polimerasa donde puede ser una enzima purificada de forma natural a partir de Thermus aquaticus y/o una forma diseñada genéticamente de la enzima. Otras enzimas de polimerasa comercialmente disponibles incluyen por ejemplo, Taq polimerasas marcadas por Promega o Pharmacia. Otros ejemplos de ADN polimerasas termoestables que pueden utilizarse en la invención incluyen ADN polimerasas obtenidas de por ejemplo, especies de Thermus y Pyrococcus . Los rangos de concentración de la polimerasa pueden estar en el rango de 1-5 unidades por mezcla de reacción. La mezcla de reacción está generalmente entre 15 y 100 µl. En algunas modalidades, una polimerasa de "inicio caliente" puede utilizarse para prevenir la extensión de eventos de pérdida del cebador cuando la temperatura de una reacción aumenta inicialmente. Las polimerasas de inicio caliente pueden tener, por ejemplo, aductores de calor lábiles que requieren de un paso de activación del calor (generalmente 95 °C durante aproximadamente 10-15 minutos) o pueden tener un anticuerpo asociado con la polimerasa para prevenir la activación. 7. Otros agentes Los agentes adicionales algunas veces son adicionados a la reacción para lograr los resultados deseados. Por ejemplo, DMSO se puede agregar a la reacción, pero se reporta por inhibir la actividad de ADN Taq polimerasa. Por lo tanto, el DMSO se recomienda para la amplificación de múltiples secuencias de objetivos en la misma reacción (véase Innis et al . , supra). Los agentes estabilizantes como gelatina, albúmina de suero bovino y detergentes no iónicos (por ejemplo, Tween-20) son comúnmente agregados para la amplificación de reacciones . (Véase Innis et al . , supra) .

D . Amplificación El uso de una plantilla o molde de amplificación de ARN o ADN utilizando reacciones es bien conocido (véase Patentes estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,683,202; PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis et al . (1990) ) . Métodos como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y reacción en cadena de ligasa (LCR) pueden utilizarse para amplificar secuencias de ácidos nucleicos a partir de ADN objetivo directamente de un alimento para animales y componentes de alimentos para animales. La reacción se lleva a cabo preferiblemente en un ciclizador térmico para facilitar los tiempos de incubación a temperaturas deseadas. Oligonucleótidos degenerados pueden designarse para amplificar las secuencias homologas del ADN objetivo utilizando las secuencias conocidas que codifican la secuencia de ADN objetivo. Sitios de endonucleasas de restricción pueden incorporarse en los cebadores. Las condiciones ejemplares de reacción PCR típicamente comprenden ya sea dos o más ciclos de pasos. Dos ciclos de pasos tienen un paso de determinación seguido de un paso de elongación/hibridización. Estos pasos de ciclos comprenden un paso de desnaturalización seguido de un paso de hibridización seguido por un paso separado de elongación. Para un PCR, una temperatura de aproximadamente 36°C es típica para una amplificación poco rigurosa, a través de temperaturas templadas que pueden variar entre aproximadamente 32 °C y 48 °C dependiendo de la longitud del cebador. Para una amplificación PCR muy rigurosa, una temperatura de aproximadamente 62 °C es general, a través de las temperaturas templadas muy rigurosas que pueden estar en el rango de aproximadamente 50°C a aproximadamente 65°C, dependiendo de la longitud y especificidad del cebador. Las condiciones generales del sitio para ambas amplificaciones poco rigurosas incluyen una fase de desnaturalización de 90 °C - 95 °C durante 15 segundos - 2 minutos, una fase de templado de por lo menos 10 segundos - 2 minutos y una fase de extensión de aproximadamente 72 °C durante 5 segundos - 2 minutos . En algunas modalidades, la reacción de amplificación es una valoración establecida de PCR como se describe en por ejemplo, Aradaib et al . , Vet . Sci . Animal Husbandry 37(1-2): 13-23 (1998) y Aradaib et al . , Vet . Sci . Animal Husbandry 37 (1-2) : 144-50 (1998) . Dos pasos de amplificación se llevan a cabo. La primera amplificación utiliza un par de cebadores "externos" (por ejemplo, SEQ ID NOS.: 7 y 10) diseñadas para amplificar una región altamente conservada de la secuencia objetivo. La segunda amplificación utiliza un par de cebadores "internos" (es decir, "establecidos") (por ejemplo, SEQ ID NOS.: 8 y 9) diseñados para amplificar una porción de la secuencia objetivo que es contenida dentro del primer producto de amplificación. Las reacciones isotérmicas de amplificación también son conocidas y pueden utilizarse según los métodos de la invención. Ejemplos de reacciones isotérmicas de amplificación incluyen amplificación de desplazamiento de la cadena (SDA) (Walker et al . , Nucleic Acid Res. 20(7): 1691 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1): 1 (1993)), amplificación mediada por transcripción (Phyffer et al . , J. Clin. Microbiol. 34: 834 (1996); Vuorinen et al . , J. Clin. Microbiol. 33: 1856 (1995)), amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91 (1991), y amplificación basada en señales de ADN ramificado (ADNb) (véase por ejemplo, Iqbal et al . , Mol. Cell. Probes 13(4): 316 (1999). En una modalidad preferida, puede utilizarse la amplificación de enrollamiento circular (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1): 75 (1999); Hatch et al . , Genet. Anal. 15 (2): 35 (1999)). Otros métodos conocidos de amplificación por el experimentado en la técnica incluyen CPR (Reacción de Sonda de Ciclización) , SSR (replicación de Secuencia Mantenida por sí misma) , SDA (Amplificación del Desplazamiento de la Cadena) , QBR (Q-Beta Replicasa) , Re-AMP (RAMP de formación) , RCR (Reacción de Reparación de la Cadena) , TAS (Sistema de Amplificación Basado en la Transcripción) y HCS (sistema de captura de híbridos) .

Cualquier método conocido de amplificación por el experimentado en la técnica puede ser usado con los métodos de la presente invención proporcionando dos cebadores en ya sea al final de la secuencia objetivo.

E . Detección de productos amplificados Cualquier método conocido en la técnica puede utilizarse para detectar los productos amplificados, incluyendo por ejemplo, valoraciones de fase sólida, cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño y mareaje por fluorescencia de ácidos nucleicos amplificados (véase MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Sambrook et al . , editores, 3a edición, 2001); Reischl y Kochanowski, Mol . Biotechnol . 3(1): 55-71 (1995)). La electroforesis en gel del producto amplificad seguida de los análisis convencionales conocidos en la técnica también pueden utilizarse para detectar y cuantificar el producto amplificado. Las técnicas de electroforesis en gel adecuadas incluyen por ejemplo, electroforesis en gel seguida de la cuantificación del producto amplificado sobre un secuenciador fluorescente de ADN automatizado (véase por ejemplo, Porcher et al . , Biotechniques 13(1): 106-14 (1992)); fluorometría (véase por ejemplo, Innis et al . , supra) , análisis en computadora de imágenes de geles tenidos mediante tintes intercalados (véase por ejemplo, Schneeberger et al . , PCR Methods Appl . 4 ( 4 ) : 234-8 (1995) ; y cuantificación de la radioactividad incorporada durante la amplificación (véase por ejemplo, Innis et al . , supra) . Otros métodos adecuados para detectar los productos amplificados utilizando sondas duales marcadas, por ejemplo, sondas marcadas tanto con un localizador como con un colorante de extinción, cuya fluorescencia solo puede enlazarse a sus secuencias objetivo; y al utilizar la tecnología de transferencia de energía mediante resonancia de fluorescencia (FRET) en donde las sondas marcadas con ya sea una marca donadora o aceptora se enlaza dentro del fragmento amplificado adyacente a la otra, haciéndose fluorescente solamente cuando ambas sondas se enlazan a sus secuencias objetivo. Informadores y extinguidores adecuados incluyen por ejemplo, colorantes que se extinguen en los hoyos negros (BHQ) , TAMRA, FAM, CY3, CY5, Fluoresceína, HEX, JOE, ciclizador de luz roja, Verde Oregon, Rodamina, Rodamina verde, Rodamina roja, ROX, TAMRA, TET, rojo Texas y Guías Moleculares . Los pasos de amplificación y detección pueden llevarse a cabo de forma secuencial o de manera simultánea. En una modalidad preferida, PCR en tiempo real se utiliza para detectar secuencias objetivo. Por ejemplo, en una modalidad preferida, PCR en tiempo real que utiliza SYBR® Verde I puede utilizarse para amplificar y detectar los ácidos nucleicos objetivo (véase por ejemplo, Pounched et al . , BMC Biotechnol . 3: 18 (2003)). SYBR® Verde I solamente fluoresce cuando se enlaza a la doble cadena de ADN (ADNds) . Así, la intensidad de la señal de fluorescencia depende de la cantidad de ADNds que está presente en el producto amplificado. La especificidad de la detección puede confirmarse de manera conveniente utilizando el análisis de la curva de temperaturas de fusión. En otra modalidad preferida, las sondas FRET y cebadores pueden utilizarse para detectar el ADN de un rumiante. El experimentado en la técnica apreciará que los cebadores y sondas pueden de forma conveniente estar diseñada para utilizarse en la ciclización de luz (Roche Molecular Biochemicals). Por ejemplo, una serie sencilla de cebadores (por ejemplo, SEA ID NOS.: 11 y 12) y sondas (SEA ID NOS.: 13 y 14) pueden de manera conveniente ser diseñados para que el ADN de especies múltiples de rumiantes (por ejemplo, res, cabra, oveja, alce, venado y los similares) puedan amplificarse y las sondas puedan enlazarse a todos los amplicones pero con grados de variación de homología. Las diferencias en homología resultan en distintas curvas de temperaturas de fusión (Tm) , cada una correspondiente a una especie individual de rumiante.

IV. Equipos de la Invención La presente invención también proporciona equipos para amplificar el ADN de un rumiante. Estos equipos generalmente comprenden dos o más componentes necesarios para amplificar el ADN de un rumiante. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o accesorios. Por ejemplo, un recipiente dentro de un equipo puede contener una primera serie de cebadores, por ejemplo, SEQ ID NOS.: 1 y 2; 3 y 4; Ó 5 y 6 y otro recipiente dentro de un equipo puede contener una segunda serie de cebadores, por ejemplo, SEQ ID NOS.: 1 y 2; 3 y 4; Ó 5 y 6. Además, los equipos comprenden instrucciones de uso, es decir, instrucciones para usar los cebadores en las reacciones de amplificación y/o detección descritas aquí. Los equipos pueden además comprender cualquier ' componente de extracción, amplificación, reacción de detección o los amortiguadores descritos aquí. Los equipos pueden además comprender RNasas adecuadas (por ejemplo, RNasa A, RNasa B, RNasa D, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T, RNasa V y combinaciones de éstas) para utilizarse en los métodos de la invención.

EJEMPLOS Las modalidades de la presente invención son además ilustradas por los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son ofrecidos para ilustrar, mas no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos: Preparación de alimentos de res : Siete muestras representativas de alimentos de red se hicieron en forma de polvo fino en un Molino Wiley (Arthur H Thomas Co., S edesboro, NJ, modelo 3375-E10) siguiendo los métodos oficiales de análisis (véase por ejemplo, JAOC, 16a edición publicada por AOAC, Departamento Internacional 400, 2200 Wilson Boulvd., Arlington VA 22201 1995, artículos 965.16 y 950.02). Los siete alimentos comprendieron las siguientes composiciones : Alimento No. 1: (Ración I "Final"): 80% concentrado (cereal), 20% crudo sin melaza y suero bovino; Ingredientes % Materia seca Forraje de alfalfa 4.63 Heno de alfalfa 12.96 Trigales 3.70 Cereal en silo 25.74 Almendras descortezadas 4.63 Pulpa de cítricos (húmeda) 3.70 Hojuelas de maíz 18.15 Semillas de algodón (enteras) 8.33 Harina de soya 4.44 Harina de cañóla 2.78 Puente de harina de soya 4.63 Puente de mezcla de proteínas (pescado/sangre) 1.48 Mezcla de minerales 3.89 Alimento No. 2: (Ración II "Final"): 80% concentrado (cereal) ; 20% crudo sin melaza y suero bovino Ingredientes % Matería seca Forraje de alfalfa 4.63 Heno de alfalfa 12.96 Trigales 3.70 Cereal en silo 25.74 Almendras descortezadas 4.63 Pulpa de cítricos (húmeda) 3.70 Hojuelas de maíz 18.15 Semillas de algodón (enteras) 8.33 Harina de soya 4.44 Harina de cañóla 2.78 Puente de harina de soya 4.63 Puente de mezcla de proteínas (pescado/sangre) 1.48 Mezcla de minerales 3.89 Grasa (suero de vaca) 0.5 Melaza 0.43 Alimento No. 3: (Ración de "Inicio"): 60% concentrado (cereal y 40% crudo y Muestras Diarias de Alimento; Ingredientes % Materia seca Heno de alfalfa 17.96 Heno de avena 13.13 Cereal en silo 27.63 Trigales 10.36 Minerales 6.04 Harina de cañóla 11.05 Pulpa de cítricos 5.18 (húmeda) Hoiuelas de maíz 5.64 Alimento No. 4: (Ración de "Crecimiento"): 60% concentrado (cereal) y 40% crudo y Muestras Diarias de Alimento; Ingredientes % Materia seca Cereal fundamental 38.6 Harina de semillas de maíz 41.4 Heno de alfalfa 12.0 Cereal en silo 44.0 Mezcla de minerales 4.0 Alimento No. 5: (Ración de "Producción Baja de Leche en Adultos") Ingredientes % Materia seca Forraje de alfalfa 7.14 Heno de alfalfa 15.48 Cereal en silo 28.57 Almendras descortezadas 2.86 Pulpa de cítricos (húmeda) 4.29 Hojuelas de maíz 16.67 Semillas de algodón (enteras) 9.52 Harina de soya 4.76 Puente de harina de soya 4.29 Mezcla de minerales 4.76 Melaza/mezcla de grasas 1.67 Alimento No. 6 (Ración para becerro de 3-6 meses de edad) Ingredientes % Materia seca Paia de trigal 11.49 Forraje de alfalfa 17.01 Leche de vaca de desecho* 22.99 Trigales 32.18 Harina de cañóla 2.30 Pulpa de cítricos (húmeda") 4.60 Hojuelas de maíz 6.90 Minerales 2.53 *la Leche de vaca de desecho es el alimento no consumido de la tasa de alta producción (ración final) que es obtenida y mezclada con su ración de vaquilla.

Alimento No. 7 (Ración Comercial para Terneras Destetadas] Ingredientes % Materia seca Heno de alfalfa 16.09 Cereal en silo 30.65 Trigales 19.16 Harina de soya 9.96 Hojuelas de maíz 19.16 Minerales 4.98 Para confirmar la ausencia de cantidades traza de productos bovinos en los alimentos, todos los alimentos (los que no alcanzaron picos y se indicaron por contener 0% de carne de bovino y médula ósea "BMBM") fueron analizados al mismo tiempo para observar los picos alcanzados cuando se alimentó con carne y harina de carne y hueso de bovino suministradas (BMBM) que se mezclaron con los siete alimentos anteriores para producir contenidos de alimentos de 2%, 1%, 0.5%, 0.2% y 0.1% de BMBM p/p. Una muestra sin pico alcanzado de cada alimento (0% BMBM) se incluyó como control negativo. Un alimento de res (Alimento 1) se seleccionó para contener 0.05% y 0.01% de BMBM y se extrajo solo una vez. Extracción de ADN y análisis con el equipo Qiagen : Desde que está dirigido a la presencia de inhibidores PCR en las muestras, se seleccionó el equipo Qiagen Stool (mini equipo Qiagen Stool para ADN, catálogo 51504, Qiagen Inc., Valencia, CA) para las extracciones. Utilizando procedimientos de muestreo convencionales, se extrajo el ADN no específico utilizando modificaciones reflejadas en el protocolo del equipo Qiagen Stool (véase por ejemplo, J.

Official Analy. Chem . , artículos 965.16 y 950.02 (Assoc. Official Analy. Chem. 16a edición (1995)). Brevemente, se incrementa la cantidad del reactivo de digestión para compensar para las cantidades adsorbidas del alimento en polvo y solamente se utilizan 100 µl para la elución. El control positivo fue ADN mitocondrial de bovino (b-mtADN) extraído de BMBM utilizando el equipo Qiagen Stool; los controles negativos fueron los alimentos que no mostraron picos con BMBM (0% BMBM) . Extracción de ADN y análisis con el equipo Neogen : La extracción de ADN se llevó a cabo en alimentos de res que mostraron picos y se corrieron según las instrucciones del equipo Neogen (Neogen Corporation, Lansing, MI, AgriScreen para Alimento de Rumiantes, catálogo 8100) . Antes del PCR el producto extraído de los alimentos de res que mostraron y no mostraron picos se cuantificó y evaluó para ver su pureza. El ADN fue cuantificado utilizando un fluorómetro (Hoefer Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, modelo TK-0-100) . La pureza del ADN (es decir, la proporción de 260/280 nm) fue cuantificada utilizando un espectrofotómetro (Amersham Biosciences, San Francisco, CA, modelo Ultraspec 2100) . En un experimento, las alícuotas de los extractos seleccionados se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. La pureza del ADN fue además investigada mediante la digestión de tres muestras seleccionadas con ARNasa (ADN libre de ARNasa - Roche Diagnostics Corporation Indianápolis, IN, Catálogo 1 119 915) mientras que se agregaron 0.05 ug de ARNasa a 10 µl del material extraído y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos . Las muestras luego fueron incubadas a 95°C durante 10 minutos para inactivar la ARNasa y luego se sometieron a electroforesis con los extractos sin tratamiento (1.2% de agarosa que contiene bromuro de etidio a 60V durante 50 minutos) utilizando un marcador de ADN para su comparación (Invitrogen ADN de 100 pb de Corrimiento, catálogo 10380, Carlsbad, CA) . Todos los extractos de alimentos de res fueron digeridos con ARNasa como se menciona anteriormente y se llevó a cabo el análisis PCR en los extractos tratados con ARNasa y sin tratar utilizando el siguiente protocolo para PCR. PCR: Se llevó a cabo PCR de fluorescencia utilizando sondas de hibridización con el equipo de control para ADN humano (HADN) (Roche, Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) que se llevaron a cabo en todas las siete muestras de alimento que tenían 0% BMBM. La mezcla de reacción de 18 µl contenía cebador de beta-globina MgCl2 4 mM, LC Rojo 640 o LC Rojo 705 y las sondas de hibridización (Roche Ciencias Aplicadas) . El alimento analizado se agregó a la mezcla de reacción en una proporción de 1:3.8 comparado con el agua de grado PCR adicionada. Se agregaron concentraciones de 3 pg, 30 pg, 300 pg, 3 ng y 30 ng a partir del equipo de control de ADN en incrementos de 2 µl como en el molde de ADN. Los montajes térmicos utilizados fueron: un paso de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos; seguido de 45 ciclos a 95 °C durante 30 segundos. El agua con grado PCR sirvió como control negativo en cada serie. De forma separada, una serie de controles se corrieron pero sin agregar alimento a la mezcla de reacción.

Ejemplo 2: Identificación de ARN como un contaminante que inhibe la amplificación PCR del ADN de un rumiante en alimentos de res Las valoraciones utilizando ADN humano como un control interno PCR indicaron que las sustancias que inhiben PCR están presentes en el producto extraído de los alimentos de res. Los inhibidores fueron indicados en cantidades mínimas en picogramos de HADN detectado: (Figura 2: Tabla 1). Cantidades mínimas en picogramos de HADN varían cien veces entre los siete extractos de alimentos de res sin diluir. Durante las extracciones (1:100) se incrementó la amplificación del HADN detectado. El nivel mínimo de detección fue mejorado en los Alimentos Nos. 2, 3, 4 y 6 por 10 veces; mientras que el nivel mínimo de detección para los Alimentos Nos. 1, 5 y 7 permaneció sin cambio. La adición de cantidades conocidas de un control interno como HADN para cada muestra de alimento permite la detección de cualquier sustancia inhibidora y la interpretación de resultados negativos. La diferencia en los niveles de detección de HADN a partir de los productos extraídos de los diferentes alimentos de res diluidos y sin diluir confirma la presencia de sustancias inhibidoras que pueden potencialmente ser diluidas . Se utilizó una prueba basada en una inmunoenzima comercial (Neogen) para contaminantes de rumiante en los alimentos. La prueba Neogen fue incapaz de detectar los picos en productos bovinos a un nivel menor de 1% y en solamente en uno de los siete alimentos. Más particularmente, la prueba Neogen fue positiva para B-mtADN en solamente un alimento que mostró pico en 1% BMBM. En comparación, mediante PCR se observó la capacidad para detectar B-mtADN en los extractos sometidos a tratamiento con ARNasa en todas las muestras que mostraron picos con 0.2% BMBM y con excepción del Alimento No. 3, se observó la capacidad para detectar N-mtADN en todos los alimentos de red que mostraron picos con 0.1% BMBM. Se detectó B-mtADN en el Alimento 1 que mostró un pico con 0.05% BMBM. Esto es semejante para el B-mtADN que fue detectado en otros alimentos bajos en inhibidores que mostraron picos con 0.5% BMBM (por ejemplo, Alimentos Nos. 2 y 7). Así, la valoración PCR tiene una mayor sensibilidad que los límites de detección del equipo Neogen.

Se intentó caracterizar de forma básica a la sustancia inhibidora. Las sustancias inhibidoras principalmente fueron sospechosas de tener naturaleza enzimática y/o proteinácea, sin embargo esta posibilidad fue excluida al evidenciar que la fusión no tuvo efecto sobre la amplificación de los ácidos nucleicos extraídos. Las cuantificaciones de la proporción de 260/280 nm (promedio de 2.11) de los ácidos nucleicos extraídos indicaron que los ácidos nucleicos estaban contaminados con ARN. La contaminación por ARN de los ácidos nucleicos fue confirmada mediante la digestión de extractos con ARNasa y una coelectroforesis de las muestras tratadas y no tratadas. Una banda de peso molecular por debajo de 2,000 pb sugiere que el ADN está degradado. Es preferible hacer la cuantificación del ADN a por medio de un fluorómetro que detecta solamente ADN; un espectrofotómetro que lee a 260 nm cuantifica tanto ADN como ARN. Las cuantificaciones de ácidos nucleicos (espectrofotometría a 260 n ) fueron 10 a 40 veces mayores que las cuantificaciones de ADN fluorométricas . Esta cantidad excesiva de ADN contaminante cuantificado en la mayoría de los extractos puede interferir en la reacción de amplificación solamente por medios mecánicos, es decir, por interferencia física con los componentes de la reacción de amplificación. La interferencia causada por la presencia de ADN degradado puede generar el establecimiento de resultados falsos positivos, sin embargo, no se encontró nada a través de esta prueba. Otra explicación posible es que el ADN degradado representa solo parte del ADN marcado, reduciendo así el B-mtADN por debajo de la cantidad necesaria para su amplificación. Esto puede contribuir a resultados falsos negativos observados en las bajas concentraciones de 0.2% y 0.1% BMBM vistos en los Alimentos de res sometidos a tratamiento con ARNasa Nos. 3, 4, 5, 6 y 7. Un proceso de extracción en donde la integridad del ADN está mejor conservada y el tratamiento de los alimentos de res con ARNasa se hace antes de la purificación de la columna y concentración, teóricamente puede aumentar la cantidad de B-mtADN en el eluato y mejorar además el nivel de detección. Así, se confirma la presencia de sustancias inhibidoras de PCR extraídas de forma simultánea con ADN no específico de los siete tipos representativos de alimentos de res. Más aún, se ha caracterizado e identificado en ARN en una mayor cantidad de sustancia inhibidora.

Ejemplo 3: Amplificación y determinación del ADN de un rumiante en múltiples alimentos para animales y componentes alimenticios Se llevó a cabo PCR de fluorescencia utilizando el ciclizador de luz (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) en todos los siete alimentos representativos que contenían 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1% y 0% de carne de bovino y hueso con carne (BMBM) . Cada una de las muestras de ARNasa tratadas y sin tratamiento se corrieron al mismo tiempo. La elevada producción de mtADN disponible a partir de células de mamífero, la elevada tasa de mutación del mtADN y la conservación genética del mtADN generaron ADN mitocondrial altamente adecuado de utilizarse como secuenciador específico objetivo para el ADN de rumiante, por ejemplo ADN de res (véase por ejemplo, Robin y Wong, J. Cell Physiol . 136: 507-13 (1988) y Saccone et al . , Gene 261: 153-9 (2000)). Los cebadores CSL1 y CSL2 amplifican un producto de 283 pb : CSLl B GAATTTCGGTTCCCTCCTG y CSR2 B GGCTATTACTGTGAGCAGA. Un volumen de 5 µl de ADN extraído del alimento se agregó a 15 µl de la reacción que contiene MgCl2 3.5 mM, 0.6 mM de cada cebador y tinte fluorescente SYBR® Verde I . Los montajes térmicos utilizados fueron: paso de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos; seguido de 40 ciclos a 95°C durante 0 segundos, 56°C durante 10 segundos y 72 °C durante 12 segundos; un período de fusión a 95°C durante 0 segundos, 65°C durante 10 segundos y 95°C durante 0 segundos; y un período de enfriamiento a 40°C durante 60 segundos. Los controles PCR negativos (ADNasa/ARNasa libre de agua) y positivos (BMBM) se corrieron junto con las muestras de alimento.

Adicionalmente, en análisis PCR se llevó a cabo sobre las muestras utilizando cebadores específicos de cabra que produjeron un producto de 428 pb : GSLl B TCATACATATCGGACGACGT y GRS2 B CAAGAATTAGTAGCATGGCG . La mezcla de reacción de 15 µl contenía MgCl2 3 mM, 0.8 mM de ambos cebadores y tinte Fast Start SYBR® Verde I (Roche Ciencias Aplicadas) . Los montajes térmicos utilizados fueron: un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos; 45 ciclos a 95°C durante 10 segundos; 57°C durante 5 segundos y 72°C durante 25 segundos; un período de fusión a 95 °C durante 0 segundos, 65°C durante 15 segundos y 95°C durante 0 segundos; y un período de enfriamiento a 40°C durante 30 segundos. Además, los productos suministrados de las cinco especies de animales generalmente se utilizaron en los alimentos de animales que se extrajeron utilizando el equipo Qiagen Stool. Los productos utilizados fueron sangre seca de cerdo, harina de pescado, harina de borrego, harina de aves y sangre seca de res. Cada una de las siete muestras de alimentos de res presentaron picos con 2% p/p de cada producto. Esto se sometieron a extracción con ADN no específico, se sometieron a tratamiento con ARNasa y se corrieron utilizando los cebadores específicos para red, CSL1 y CSL2, y BMBM como el control PCR positivo. Un volumen de 5 µl de molde de ADN (muestra "desconocida") se agregó a una mezcla de reacción de 15 µl que contenía MgCl2 3 mM, 0.6 mM de cada cebador y el tinte SYBR® Verde I. Los montajes térmicos utilizados fueron: un paso de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos; seguido por 40 ciclos a 95 °C durante 0 segundos, 56°C durante 10 segundos y 72°C durante 12 segundos; un período de fusión de 95 °C durante 0 segundos, 65°C durante 10 segundos y 95°C durante 0 segundos; y un período de enfriamiento a 40 °C durante 60 segundos. La amplificación del B-mtADN ocurrió en solo tres alimentos, los mismos alimentos con B-mtADN que fu detectado al menor nivel, es decir, alimentos que tuvieron un pico con 0.1% BMBM. La incapacidad para detectar el ADN de los productos suministrados de otras especies, especialmente aquellas de rumiantes cercanamente relacionados muestra las ventajas de los cebadores altamente específicos en la tecnología PCR. La pérdida de detección con sangre seca de bovino en cuatro de los siete alimentos de res se explica debido a los leucocitos que son únicamente del material presente de ácidos nucleicos en toda la sangre, a partir de una baja cantidad de B-mtADN disponible en el producto de sangre seca. Las tres muestras positivas de sangre seca de bovino en los Alimentos de res Nos. 1, 2 y 7 fueron los mismos tres alimentos que obtuvieron picos con BMBM y una baja cantidad de B-mtADN. Esto indica que el tratamiento con ARNasa en estos alimentos fue totalmente exitoso y que las bajas cantidades de amplicón pueden detectarse si el producto extraído además contiene bajas cantidades de sustancias inhibidoras. Los resultados negativos obtenidos utilizando cebadores de cabra también confirma la naturaleza específica de los cebadores específicos de cabra, especialmente en el caso del mtADN de especies de rumiantes cercanamente relacionadas . Así se obtuvo la cuantificación del efecto al retirar el ARN en el paso de detección de B-mtADN utilizando la tecnología PCR de fluorescencia.

Ejemplo 4: Amplificación y detección del ADN de un rumiante en alimentos de res El Alimento de Res 1 generó un pico con 0.1%, 0.05, 0.01% y 0.001% BMBM. Los productos extraídos se corrieron sobre un ciclizador de luz bajo las mismas condiciones como en las siete muestras de alimento sometidas a tratamiento con ARNasa. El análisis de la curva de temperaturas de fusión (Figura 1) demuestra visualmente la amplificación de las secuencias objetivo. La temperatura de fusión y el punto de cruzamiento del control positivo fue de 85.28 y 19.05, respectivamente. Los productos de amplificación de las muestras de alimento que contienen 0.05% y 0.01% BMBM ambas tuvieron la misma temperatura de fusión (52.28) y tuvieron puntos de cruzamiento de 25.67 y 24.96 respectivamente, los mismos productos extraídos se corrieron sobre electroforesis en gel (1.2% agarosa que contiene bromuro de etidio a 60 V durante 50 minutos) . Un ADN de corrimiento (Invitrogen 100 pb de Corrimiento, catálogo 10380, Carlsbad, CA) se utilizó para la comparación. Los alimentos de res generaron picos con cantidades predeterminadas de carne de bovino y huesos con carne (BMBM) . El producto extraído fue sometido a tratamiento con ARNasa y ADN mitocondrial específico para bovino (B-mtADN) y fue amplificado mediante tecnología de ciclización de luz. El nivel mínimo de detección del B-mtADN varó con el tratamiento del extracto con ARNasa, la concentración (%) de BMBM y complejidad del alimento. El tratamiento con ARNasa de cada muestra redujo la sobreposición de resultados falsos negativos en un 75%. El tratamiento con ARNasa redujo dramáticamente los resultados falsos negativos en un 100% en muestras que contenían 2%, 1% y 0.5% BMBM. A los niveles de 0.2% y 0.1% los falsos negativos se redijeron un 50%. La confirmación de la amplificación de un producto de 283 pb valida los cebadores específicos para bovino así como el uso de la tecnología del ciclizador de luz (Figura 1) . Los productos PCR de los alimentos de res que obtuvieron picos con 1% y 0.5% BMBM y los dos controles positivos BMBM mostraron fuertes picos a la misma temperatura, a través de puntos de cruzamiento ligeramente bajos, (para entender, a partir de la concentración menor del ampligen en los extractos que en los controles positivos) . Los productos PCR de alimentos de res que obtuvieron picos con 0.01% y 0.001% BMBM no se amplificaron. La electroforesis en gel de los productos PCR demostraron el mismo resultado. Una banda de ADN de corrimiento de 300 pb fue comparada con las bandas desarrolladas con los productos PCR de alimentos de res que generaron picos con 0.1% y 0.5% BMBM y con los dos productos BMBM para control positivo, que se perdieron con los productos de control negativo y productos PCR de los alimentos de res que alcanzaron picos con 0.01% y 0.001% BMBM.

Ejemplo 5: El uso de la tecnología de sonda FRET en PCR de fluorescencia en tiempo real para detectar y diferenciar el ADN de especies de rumiante A fin de detectar y diferenciar el ADN de las especies de bovino, oveja y cabra en una reacción sencilla de PCR, se diseñaron una serie de sondas FRET (SEQ ID NOS.: 13 y 14) y cebadores (SEQ ID NOS.: 11 y 12) y utilizados de forma similar a la descrita por Roche para análisis mutacional utilizando el ciclizador de luz (Roche Molecular Biochemicals) . La técnica de análisis mutacional utilizando el ciclizador de luz está basado en el principio que durante el calentamiento de los productos PCR, las sondas FRET específicas de secuencia se fusionarán a temperaturas definidas. La temperatura en la que las sondas se disocian con el ADN objetivo (generalmente definida como Tm, la temperatura en la que 50% de la sonda se ha disociado con el ADN objetivo) está directamente relacionada tanto con las homologías de secuencias entre las sondas como con la secuencia y tamaño de las sondas. En homologías de secuencia al 100% entre las sondas y la secuencia objetivo, las sondas permanecerán templadas en la secuencia objetivo a una temperatura máxima mayor. En el evento de desproporción de una base sencilla entre las sondas y la secuencia objetivo, la estabilidad de las sondas templadas se reducirá, resultando así en una temperatura menor donde las sondas pueden fundirse en la secuencia objetivo. Roche describe este método para la detección de ADN de tipo silvestre y mutante al comparar las diferencias en las curvas de temperatura de fusión resultantes. Se utilizó una modificación de esta aproximación para distinguir entre las diferencias de la secuencia de ADN amplificado con una serie sencilla de cebadores, permitiendo así la identificación de ADN bovino, de oveja y de cabra lo que resulta de una amplificación PCR. Una serie simple de cebadores y sondas fue designada hasta que el ADN de las tres especies de rumiantes fue amplificada y las sondas se enlazaron a los tres amplicones pero con grados de variación de homología. Las sondas FRET se enlazaron a la secuencia objetivo de bovino con 100% de homología, a la secuencia objetivo de cabra con 93% de homología y a la secuencia objetivo de oveja con 88% de homología. Las diferencias en homología resultaron en tres curvas de temperaturas de fusión distintas (Tm) , correspondientes cada una con las especies de bovino, cabra u oveja. Los resultados se muestran en la Figura 6. La tecnología de sondas FRET puede ser utilizada de forma conveniente en conjunto con el tratamiento de ARNasas como se describe aquí para amplificar y detectar el ADN de un rumiante.

Ejemplo 6: El uso del análisis PCR establecido para amplificar el ADN de un rumiante El análisis PCR establecido como se describe en por ejemplo, Aradaib et al . , Vet . Sci . Animal Husbandry 37 (1-2): 13-23 (1998) y en Aradaib et al . , Vet . Sci . Animal Husbandry 37 (1-2): 144-150 (1998) pueden también ser utilizados para amplificar secuencias objetivo de ácidos nucleicos. Un primer paso de amplificación utilizando un par de cebadores "externos" (por ejemplo, SEQ ID NOS.: 7 y 10) se lleva a cabo para amplificar una región altamente conservada de la secuencia objetivo (por ejemplo, citocromo b) . Una segunda amplificación utilizando un par de cebadores "internos" (es decir, "establecidos") (por ejemplo, SEQ ID NOS.: 5 y 6 u 8 y 9) se lleva a cabo para amplificar una porción de la secuencia objetivo (por ejemplo, citocromo b) que está contenida dentro del primer producto de amplificación. En particular, las SEQ ID NOS.: 7 y 10 se pueden utilizar para amplificar una secuencia de 736 pb a partir del citocromo b de un rumiante. Las SEQ IDS NOS.: 8 y 9 pueden utilizarse para amplificar una secuencia de 483 pb a partir del citocromo b de un rumiante dentro de la secuencia de 736 pb amplificada durante las SEQ IS NOS.: 7 y 10. Las SEQ IS NOS.: 5 y 6 pueden utilizarse para amplificar una secuencia de 606 pb a partir del citocromo b de oveja dentro de la secuencia de 736 pb amplificada utilizando las SEQ ID NOS.: 7 y 10. El PCR establecido puede ser utilizado de forma conveniente en conjunto con el tratamiento de ARNasa descrito aquí para amplificar y detectar el ADN de un rumiante. Los estudios dirigidos en condiciones de "tiempo real" y problemas encontrados en la detección de componentes restringidos en los alimentos para animales o componentes alimenticios para animales. En particular, esto confirma que los diferentes resultados son obtenidos con los alimentos de reses de complejidad variable. Estas diferencias se atribuyen a las sustancias inhibidoras extraídas de forma simultánea con el ADN objetivo. Las cuantificaciones típicas tomadas durante la extracción para reducir la cantidad de inhibidores no puede ser totalmente efectiva y por lo tanto un control interno para detectar la presencia de cualquier inhibidor PCR puede incluirse en la mezcla de reacción. La identificación y reducción o eliminación de la sustancia que genera inhibición puede mejorar la consistencia y detección. En los "picos" alcanzados por los alimentos con productos animales suministrados se representa la incorporación de los componentes adicionados de forma más frecuente a los alimentos de res, estimulando nuevamente condiciones de campo. Cuando la presencia de las sustancias inhibidoras se toman en consideración, el uso de cebadores altamente específicos combinados con la tecnología PCR de fluorescencia en tiempo real ofrece el potencial para la solución de detección e identificación de cantidades mínimas de productos restringidos contenidos en diversos alimentos de res .

Ejemplo 7: Comparación de PCR y anticuerpos para la detección de la contaminación de biproductos bovinos a partir de alimentos de res Se comparó el método basado en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para detectar ácidos nucleicos de rumiantes en muestras (véase por ejemplo, Sawyer et al . , J. Foodborne Pathogens and Disease 1(2): 105-113 (2004) y el Ejemplo 3 anterior) con un anticuerpo basado en el método para detectar péptidos de rumiante en muestras (es decir, Reveal® para Detección de Rumiantes (Neogen Corporation, Lansing, MI) ) . La comparación de las dos tecnologías diferentes usando los mismos alimentos que alcanzaron "picos" con aditivos restringidos de ya sea carne de bovino y harina de hueso (BMBM) o sangre seca de bovino (BDB) demostraron que la detección consistente de cantidades pequeñas de contaminación fueron más semejantes con un análisis PCR cuantitativo y sensible. Más particularmente, se investigó la eficacia de ambas tecnologías en la detección de la presencia de tejidos bovinos en una variedad de alimentos de res comparando los resultados al utilizar cinco alimentos representativos que alcanzaron "picos" a concentraciones determinadas de ya sea carne de bovino y harina de hueso (BMBM) o sangre seca de bovino (BDB) . Antes de realizar el análisis PCR, se llevó a cabo la digestión de las muestras y la extracción del ADN utilizando las modificaciones de un equipo comercial (equipo Qiagen Plant, Qiagen Inc., Valencia, CA) . La detección y análisis fueron acompañados mediante PCR de fluorescencia al utilizar el ciclizador de luz (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) y se llevaron a cabo a cada concentración de BMBM y BDB. En el análisis PCR cuantitativo se utilizaron cebadores mitocondriales específicos de bovino y sondas de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) como se describe a detalle en el Ejemplo 5 anterior. El equipo Reveal® se utilizó según las instrucciones del fabricante. Se incluyeron en este estudio cinco alimentos de res representativos. La proporción del concentrado en crudo para cada alimento se describe como sigue: #1 Ración Final 1: 80%: 20% sin melaza ni sebo de bovino; #2 Ración Final II: 80%: 20% sin melaza ni sebo de bovino; #3 Ración de Inicio para Terneras: 40:60%; #4 Ración para Crecimiento de Terneras: 60%: 40%: y #5 Ración para Terneras Destetadas: 70%: 30% ("Marcador de Terneras" Molino Alderman-Cave y Compañía de Granos de Nuevo México, Roswell, NM) una ración comercial de granos. Los alimentos alcanzaron sus picos" ya sea con la carne de bovino y harina de hueso (BMBM) suministrados comercialmente o con sangre seca de bovino (BDB) como se especifica en cada protocolo. Los alimentos que no alcanzaron "picos" se incluyeron como controles negativos. Una serie de muestras de los cinco alimentos de res fue procesada según las instrucciones del fabricante del equipo de prueba en tiras Reveal®. Los alimentos alcanzaron sus picos al agregar una cantidad apropiada de BMBM o BDB directamente al frasco de extracción que contiene 10 mg del alimento. Las muestras "que alcanzaron picos fueron mezcladas y luego fusionadas durante 10 minutos. Se transfiere una alícuota a partir del líquido hacia un tubo de microcentrífuga; se insertó una prueba de descortezamiento y se le permitió desarrollarse durante 10 minutos precisos. Otra serie de muestras de los cinco alimentos de res fue procesada como sigue: antes del análisis PCR, cada muestra de alimento fue convertida a un polvo fino y alcanzó su pico al agregar una cantidad apropiada de BMBM o BDB. La digestión y extracción del ADN fue acompañada al utiliazr modificaciones menores del equipo Qiagen Plant cuyo protocolo se adaptó para acomodar una muestra de gran tamaño (0.22 gm) y agregar ARNasa libre de ADN y ARN (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) a una proporción ajustada al volumen del eluato de la columna de partículas. El ADN extraído en alícuotas se sometió a un análisis PCR. Los resultados se muestran en la Figura 7. Como se explica anteriormente, los inhibidores como ARN, liberados del alimento durante la digestión se han implicado en generar resultados PCR falsos negativos. El tratamiento del ADN extraído con ARNasa antes del resultado con PCR resultó en niveles de detección más sensibles y consistentes. (Sawyer et al . , 2004, supra) . Los alimentos que contienen altas cantidades de crudo aparecen para estar asociados de forma más frecuente con la presencie de inhibidores PDCR. La disparidad en los resultados PCR se observa de forma consistente entre los otros alimentos analizados y el alimento #3, (60% de crudo) y una extensión menor en el alimento #4 (40% de crudo). (Sawyer et al . , 2004, supra) . Esta incapacidad para lograr de forma consistente los bajos niveles de detección en los otros alimentos fue observada en ambas tecnologías. Los cebadores de ADN mitocondrial para bovino se utilizaron para detectar mediante análisis PCR solamente células nucleadas . A partir de que solo las células blancas de la sangre son nucleadas y las células rojas de la sangre constituyen la mayor parte de la masa en la sangre seca, es más difícil de detectar un ADN de rumiante en los alimentos que alcanzaron picos con BDB. Los productos de carne y harina de hueso contienen más células nucleadas. Así, el ADN de rumiante es más semejante al detectado en los alimentos que alcanzaron picos con BMBM que en los alimentos que alcanzaron picos con el mismo porcentaje de BDB. De forma similar, el suero bovino incluido en los alimentos #2 y #3 permanecieron indetectables en el control negativo sin picos debido a la escasez de células nucleadas y a la baja concentración (1.5% a 2.5% de "grasa") presentes en el alimento. La tecnología PCR consiste en BMBM detectados para los cinco alimentos al 1% y aun "pico" diez veces menor (0.1%) . BDB fue detectado de forma similar al nivel de 1%; sin embargo, todas las muestras de alimento fueron negativas cuando se corrieron en el nivel de "pico" de 0.1% BDB. La prueba basada en anticuerpos Reveal® Strip detectó BMBM a un nivel del 1% en los alimentos #1, #2, #4 y #5, pero los resultados fueron inconclusos en el alimento #3. BMBM no fue detectado en ninguno de los alimentos al nivel de 0.1%. BDB no fue detectado en ninguno de los cinco alimentos al nivel del 5% (cinco veces mayor que el nivel detectado por PCR) . Desde que se encontró que la prueba Reveal® produce resultados negativos en alimentos que alcanzan su pico con 5% BMBM, una concentración que es visualmente positiva para hacer la visión positiva no analiza las muestras que alcanzan su pico con 1% BMBM. Las fallas para detectar de forma consistente BMBM a un nivel del 1% para la formación de un "pico" y BDB a un nivel de 5% para la formación de un "pico" es una desventaja de la prueba Reveal®.

Los resultados de la prueba Reveal® a niveles mínimos para la detección son subjetivos y ambiguos. En todos los casos, una línea de control positivo definida es aparente a los 5 minutos, sin embargo, la mayoría de las muestras evaluadas requieren de 10 minutos para desarrollar una barra perceptible en la línea de análisis de la muestra. En algunas muestras, la intensidad de la muestra de prueba incrementa y se vuelve más aparente durante 10-15 adicionales, pero en todos los casos nunca se ordenó la intensidad de la línea de prueba positiva. El último desarrollo de la línea de muestra utiliza la elaboración para mantener un registro preciso y permanente utilizando las tiras de prueba almacenadas cuestionables . Así, la prueba Reveal® no se considera real para la detección de contaminación de muestras de rumiantes a niveles bajos o desconocidos de contaminación. Por lo tanto, se concluye que PCR ofrece una herramienta más comprensiva y real .

Ejemplo 8: Desarrollo y evaluación de una valoración PCR de fluorescencia en tiempo real para la detección de contaminantes de bovino en alimentos de res comercialmente disponibles Una valoración de la reacción en cadena de polimerasa de fluorescencia en tiempo real se llevó a cabo para detectar materiales prohibidos de rumiante como carne de bovino y harina de hueso (BMBM) en alimentos de res utilizando cebadores y sondas FRET que marcan el gen de citocromo b mitocondrial específico para rumiante que se desarrolla y evalúa en dos diferentes tipos de alimento de res. Los problemas comunes involucrados con el análisis basado en PCR incluyen la presencia de altos niveles de inhibidores PCR y la necesidad de ciertas de procesamiento de premuestras a fin de llevar a cabo extracciones de ADN. Se ha desarrollado una técnica de procesamiento de premuestras para extraer el ADN del alimento de res que no requiere que el alimento de res sea convertido en polvo fino y se utilizan los materiales que se han dispuesto de entre las muestras, reduciendo así, el potencial de contaminación por cruzamiento. El método de extracción de ADN utiliza tecnología de la tarjeta Whatman FTA®, que es adaptable a muestras elevadas a través del análisis y permite su almacenamiento a temperatura ambiente con ordenamiento establecido de muestras por más de 14 años. Las tarjetas Whatman FTA® son tratadas de forma subsecuente con ARNasa y experimentar una extracción con Chelex-100 (BioRad, Hercules, Ca) , para retirar de esta forma los inhibidores potenciales PCR y eluir el ADN a partir de la tarjeta FTA® para descargar el análisis PCR. El límite de detección fue evaluado durante un período de 30 pruebas sobre la mezcla del alimento inicial para terneras y la ración inicial de las muestras de alimento que alcanzan picos con concentraciones conocidas de carne de bovino y harina de carne (BMBM) . La detección de contaminación se hizo mediante un análisis PCR a 0.05% p/p BMBM con 100% de sensibilidad, 100% de especificidad y 100% de confianza. Las concentraciones de contaminación a 0.005% y 0.001% p/p de BMBM también se detectaron en ambos tipos de alimento pero con niveles de variación de confianza.

Ejemplo 9: Efecto del tratamiento con ARN sobre los alimentos de res analizados con PCR al utilizar el protocolo de extracción de ADN/FTA Para determinar el efecto del tratamiento con ARNasa sobre la exactitud diagnóstico de la valoración PCR de fluorescencia en tiempo real para detectar contaminaciones de rumiante tal como carne de bovino y harina de carne (BMBM) en alimentos de res, se corrieron 30 muestras más con menor tratamiento de ARNasa y se llevó a cabo el análisis estadístico. Preparación de muestras: Se prepararon treinta réplicas en donde se establecieron BMBM comerciales que se agregaron a una concentración de 0.001% p/p de una ración de inicio. A fin de obtener 0.001% BMBM, se pesaron en una balanza analítica Mettier AE 160 0.003 g de BMBM y luego se agregaron a 300 g de la ración de inicio. Los 300 g de la ración de inicio que alcanza un pico después se pesa en cantidades de 10 gramos para la extracción del ADN. Extracción de ADN a partir de los alimentos de res: Las muestras de alimento de 10 g se colocan en un tubo Falcon estéril de 50 ml (Fisher Scientific, Pittsburg, Pa) . Un volumen de 25 ml de amortiguador para lisis celular se preparó a partir de isotiocianato de guanidina 5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM, 0.5% sarcosil, ß-mercaptoetanol 0.2 M(Chakratovy y Tyagi, FEMS Microbiol . Lett . 205: 113-117 (2001)) y se agregó a la muestra que fue sometida a vórtice.

La muestra se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos. La muestra se colocó en una centrífuga y fue centrifugada a 17,000 x g durante un minuto para recuperar el amortiguador de lisis celular del alimento de res altamente absorbente. Un volumen de 65 µl del amortiguador de lisis celular se retiró utilizando una punta de pipeta de espacio ancho y se descargó sobre una tarjeta Whatman FTA® (Whatman, Clifton, NJ, catálogo #WB 12 0206) y se secó a temperatura ambiente durante una hora. Un lavado de la tarjeta Whatman fue utilizado para obtener dos discos separados de 2 mm que contienen la muestra. Cada uno de los treinta discos de 2 mm fue colocado en un tubo estéril de 1.5 ml y se etiquetaron los tratamientos con RNasa 1-30 y los que no se trataron con RNasa 1-30. Tratamiento con RNasa: Se agregaron 100 µl de RNasa (ADN libre de RNasa; Roche Ciencias Aplicadas, Indianápolis, IN, catálogo # 1119915) a una concentración de 0.05 µg/µl a cada uno de los tubos estériles de 1.5 ml etiquetados con el tratamiento de RNasa 1-30. Los tubos fueron colocados en un bloque de calentamiento y se les permitió incubarse a 37 °C durante una hora. Luego de la incubación, los 100 µl de RNasa se retiran del tubo y se descartan. Se agregan 200 µl de Instagene (BioRad, Hercules, Ca y catálogo # 732-0630) y las muestras son colocadas en u bloque de calentamiento a 56°C durante 30 minutos. Las muestras se retiran del bloque de calentamiento y se someten a vórtice durante 10 minutos. Las muestras luego son colocadas en un bloque de calentamiento a 100 °C durante 8 minutos. Las muestras luego fueron sometidas a vórtice y centrifugadas a 12,000 x g durante 3 minutos. El supernadante se retira y se coloca en un nuevo tubo estéril de 1.5 ml para análisis PCR. Tratamiento sin RNasa. Se agregan 200 µl del reactivo de purificación TFA (catálogo # WB12 0204) a cada tubo estéril de 1.5 etiquetado con tratamiento RNasa 1-30. Los tubos fueron incubados durante 5 minutos a temperatura ambiente. El reactivo de purificación TFA luego fue descartado y el proceso fue repetido para un total de dos lavados. Luego se agregaron 200 µl de amortiguador TE-1 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.0) y los tubos fueron incubados a temperatura ambiente durante 5 minutos . El amortiguador TE-1 fue descartado y el proceso fue repetido para un total de dos lavados. Se agregaron 200 µl de Instagene (BioRad, Hercules, Ca, catálogo #732-0630) y las muestras fueron colocadas en un bloque de calentamiento a 56°C durante 30 minutos. Las muestras fueron retiradas del bloque de calentamiento y se sometieron a vórtice durante 10 segundos. Las muestras luego fueron colocadas en un bloque de calentamiento a 100 °C durante 8 minutos. Las muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron a 12,000 x g durante 3 minutos. El supernadante se retiró y se depositó en un nuevo tubo estéril de 1.5 ml para análisis PCR. Protocolo PCR convencional FRET: Las reacciones PCR se corrieron a una concentración final de cebador inicial 0.5 µM, cebador final 0.5 µM, sonda marcada con fluoresceína 0.2 uM, sonda marcada con LC-Rojo 640 0.4 µM, MgCl2 3 mM y una mezcla de sondas maestras de hibridización de ADN de inicio rápido para ciclizador de luz IX. Las muestras de ADN fueron agregadas en volúmenes de 5 µl a la mezcla de reacción para un total de 20 µl en cada reacción. Todas las sesenta reacciones PCR se corrieron de manera simultánea al utilizar el equipo Corbett Roto-Gene 3000. Las condiciones de ciclización fueron 95 °C durante 10 minutos (desnaturalización y activación de Taq polimerasa) seguido de un programa de amplificación de 50 ciclos a 95°C durante 0 segundos, 55°C durante 12 segundos y 72 °C durante 14 segundos. LC-Rojo 640 fue monitoreado al final de cada etapa a 55 °C. el programa de amplificación fue seguido de un ciclo de fusión de 95 °C durante 30 segundos, 38°C durante 30 segundos y 80°C durante 0 segundos con una traza de transición de 0. l°C/segundo. La determinación de un resultado positivo PCR, se hizo basado en la presencia de una curva de amplificación y una curva de fusión con temperaturas de fusión (Tm) entre 62°C y 63°C. a una Tm entre 62°C y 63°C se representa la hibridización con 100% de homología entre las sondas y la secuencia de mtADN de bovino. Los resultados de este análisis para detectar ADN de un rumiante derivado a partir de BMBM en una concentración de 0.001% p/p en la ración de inicio con y sin el uso de RNasa se compararon utilizando la prueba McNemar para la proporción de correlaciones (Remington y Schork: Statistics with Applications to the Biological & Health Sciences, 1970) . A un nivel de confianza del 90% se encontró un efecto significativo (0.05 < p < 0.1) entre el uso de muestras sometidas a tratamiento con RNasa y la proporción de resultados positivos PCR. Cuando se compara con las muestras no tratadas con RNasa (Tabla 6). 26.7% de las muestras sometidas a tratamiento con RNasa fueron PCR positivas en comparación con 6.7% de muestras PCR positivas sin tratamiento con RNasa (Tabla 7).

Tabla 6 Resultados PCR de treinta muestras de ración de inicio que alcanzaron picos con BMBM a 0.001% p/p sometidas y no sometidas a tratamiento con RNasa. Tratamiento con RNasa 0.05 < p < 0.1 Tabla 7: Resultados PCR de muestras individuales de la ración de inicio que alcanza picos con BMBM al 0.001% p/p sometidos y no sometidos a tratamiento con RNasa Ración de inicio: profundas y que alcanzaron su pico a 0.001% BMBM Ejemplo 10: Detección del ADN de un rumiante en una muestra de vacuna utilizando el tratamiento de ARNasa y el protocolo de extracción triple de ADN/FTA Para evaluar los límites de detección de la detección PCR de bovino actual cuando se aplica a la vacuna de la cepa de Bacterina J5 de E. coli (Upjohn) y para evaluar los efectos de cepa de Bacterina J5 de E . coli (Upjohn) sobre la eficiencia de la reacción PCR usando el mareaje cuantitativo PCR de fluorescencia en tiempo real para el gen de citocromo b mitocondrial de bovino, se llevaron a cabo los siguientes experimentos . ADN de bovino convencional : Se preparó un ADN de bovino convencional para extraer el ADN a partir de carne de bovino y harina de hueso (BMBM) y cuantificar con un espectrofotómetro. Extracción de ADN a partir de una vacuna de cepa de Bacterina J5 de E. coli (Upjohn) : Se aplicaron 65 µl de la vacuna J5 de E. coli sobre una tarjeta FTA y se siguió el protocolo de extracción del Ejemplo 9 anterior. El extracto de ADN luego fue cuantificado con un espectrofotómetro. La concentración y la proporción 260/280 se utilizó a fin de verificar que el ADN fue aislado a partir de vacuna J5 de E. coli. Preparación de diluciones seriales : Una serie de cuatro diluciones seriales fueron preparadas en donde 10 µl del ADN convencional de bovino se diluyeron en 90 µl del extracto de ADN J5 de E. coli . PCR en tiempo real : El PCR se corrió sobre la cuatro diluciones seriales incluyendo el ADN de bovino convencional no diluido. El experimento fue repetido para un total de tres veces. La concentración de ADN de bovino se determinó para ser de 50 ng/µl con una proporción de 260/280 de 2.00 y también se determinó la concentración del ADN extraído de la vacuna J5 de E . coli que fue de 6.57 ng/µl con una proporción 260/280 de 1.77. Para PCR en tiempo real, los valores ajustados en relación al logaritmo de las concentraciones de ADN se utilizaron a fin de construir una gráfica (Figura 8) . La eficiencia de la reacción PCR se calculó basada en la pendiente de la línea. La valoración PCR fue capaz de detectar 5 pg/µl de ADN de bovino con una eficiencia PCR promedio del 99% sobre estas pruebas (Tabla 8). Tabla 8. Eficiencias de reacción PCR del ADN de bovino convencional serialmente diluidas en el extracto de ADN a partir de la vacuna de la cepa J5 de E. coli (Upjohn) .

Se entenderá que los ejemplos y modalidades descritas aquí son para propósitos ilustrativos solamente y que las diversas modificaciones y cambios en vista de esto serán sugeridos por los diestros en la técnica y son incluidos dentro de la vista de esta solicitud y están considerados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citados aquí se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para amplificar el ADN de un rumiante en una muestra, caracterizado porque el método comprende: poner en contacto el ácido nucleico de la muestra con una RNasa, a partir de la RNasa generada del ácido nucleico sometido a tratamiento; y amplificar el ácido nucleico sometido a tratamiento con ARNasa utilizando un cebador específico de rumiante y un segundo cebador específico de rumiante, a partir del ADN específico de rumiante presente en la muestra para producir un ADN de rumiante amplificado.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico se aisla del alimento para animales antes de poner en contacto el ácido nucleico con una RNasa.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN de rumiante es un miembro seleccionado del grupo que comprende: ADN de res, ADN de oveja, ADN de cabra y combinaciones de estos.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la RNasa es un miembro seleccionado del grupo que comprende: RNasa A, RNasa B, RNasa D, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T, RNasa V y combinaciones de estas.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico sometido a tratamiento con RNasa se genera al poner en contacto el ácido nucleico aislado con la RNasa a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C durante 15 minutos a aproximadamente 120 minutos.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico sometido a tratamiento con la RNasa se genera al poner en contacto el ácido nucleico aislado con la RNasa a una temperatura de aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 60 minutos.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN de rumiante comprende una secuencia de ADN mitocondrial.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de ADN mitocondrial codifica para un miembro seleccionado del grupo que comprende: citocromo c, citocromo b, ARN 12S, subunidad 8 de ATPasa, subunidad 6 de ATPasa, ATP sintetasa, subunidad 8 y subsecuencias y combinaciones de estos.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de ADN mitocondrial codifica para el citocromo b o una subsecuencia de este.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer cebador específico de rumiante y el segundo cebador específico de rumiante son seleccionados del grupo que comprende: SEQ IDS NOS.: 1 y 2, SEQ ID NOS.: 3 y 4 y SEQ ID NOS.: 11 y 12.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende detectar el ADN de rumiante amplificado.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la detección del ADN de rumiante amplificado comprende detectar una señal fluorescente.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque detectar un ADN de rumiante amplificado comprende poner en contacto el ADN de rumiante amplificado con una sonda de oligonucleótido. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el ADN de rumiante es amplificado utilizando un primer cebador específico de rumiante y un segundo cebados específico de rumiante que comprende las secuencias incluidas en SEQ ID NOS.: 11 y 12 y la detección del ADN de rumiante amplificado comprende poner en contacto el ADN de rumiante amplificado con sondas de oligonucleótido que comprenden las secuencias incluidas en SEQ ID NOS.: 13 y
14. 14.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende amplificar el ADN de rumiante amplificado con un tercer cebados específico de rumiante y un cuarto cebador específico de rumiante, a partir de la producción de la amplificación de un segundo ADN de rumiante.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende detectar esta segunda amplificación de ADN de rumiante.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es un miembro seleccionado del grupo que comprende: un alimento para animales, un componente alimenticio para animales, un cosmético, un nutracéutico, una vacuna, un fluido líquido coloide o combinaciones de estos.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es alimento para animales.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el alimento para animales es alimento de res.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el alimento de res comprende aproximadamente 0.5% a aproximadamente 30% de suero bovino.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el alimento de res comprende aproximadamente 1% de suero bovino.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es un componente alimenticio para animales.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el componente alimenticio para animales es suero de vaca.
24. 24. Un equipo para amplificar el ADN de un rumiante, caracterizado porque el equipo comprende: un primer par de cebadores específicos para rumiante; una ARNasa; e instrucciones de uso.
25. 25. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la RNasa es un miembro seleccionado del grupo que comprende: RNasa A, RNasa B, RNasa D, RNasa E, RNasa H, RNasa I, RNasa P, RNasa S, RNasa T, RNasa V y combinaciones de estas.
26. 26. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el primer par de cebadores específicos para rumiante se selecciona del grupo que consiste de las secuencias incluidas en SEQ ID NOS.: 1 y 2; SEQ ID NOS.: 3 y 4; y SEQ ID NOS.: 11 y 12.
27. 27. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende un segundo par de cebadores específicos para rumiante.
28. 28. El equipo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el primer par de cebadores específicos para rumiante se selecciona del grupo que comprende de las secuencias incluidas en SEQ IS NOS.: 1 y 2 y SEQ ID NOS.: 3 y 4 y el segundo par de cebadores específicos para rumiante se selecciona del grupo que comprende las secuencias incluidas en SEQ ID NOS.: 1 y 2 y SEQ ID NOS.: 3 y 4.
29. 29. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende una sonda de oligonucleótido para detectar una secuencia objetivo amplificada .
30. 30. El equipo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la sonda de oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende: SEQ ID NOS. : 13 y 14.
31. 31. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se incluye en las SEA ID NOS.: 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13 ó 14.