KR102117391B1

KR102117391B1 - 패류 알레르기 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102117391B1
Application number: KR1020190032760A
Authority: KR
Inventors: 김해영; 서승만
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2020-06-01

Abstract

본 발명은 알레르기 유발 어패류의 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

패류 알레르기 검출용 멀티플렉스 PCR 프라이머 및 이의 용도{MULTIPLEX PCR PRIMERS FOR DETECTION OF SHELLFISHES CAUSING ALLERGY, AND USES THEREOF}

알레르기(Allergy)는 생물체가 특정 외래성 물질과 접함으로써 항원항체반응에 의하여 유발되는 생체 내 급격한 면역반응을 의미한다.

면역반응은 생체의 자기 보존을 위한 중요한 방어 메커니즘의 하나로서, 이 메커니즘이 생체에 불리하게 작용하여 통상적이지 않은 장애를 일으키는 경우를 알레르기라 한다.

알레르기 반응을 유발하는 항원은 알레르겐(allergen)이라고 하며, 전형적인 알레르겐은 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 음식물, 염색약, 화학물질 등이 있으며, 알레르겐이 식품인 경우를 식품 알레르기라고 한다.

식품 알레르기(food allergy)는 정상인에게는 무해한 식품을 특정인이 섭취하는 경우에 그 식품의 특정 알레르겐(allergen)으로 인체의 과도한 면역반응이 일어나는 것을 말한다.

식품 알레르기의 형태는 호흡기, 소화기, 피부에 두드러기, 가려움이나 아나필락시스의 형태로 나타나며, 식품 섭취 후 수분에서 1~2시간 이내에 발생한다. 식품 알레르기를 가진 사람은 소수이지만, 이들은 알레르기 원인 식품으로 인해 심한 경우 목숨까지 위협받을 수 있다. 따라서 식품 안전성 측면에 있어서, 알레르기를 유발하는 식품을 분석하는 것이 매우 중요한 사안으로 부각되고 있다.

식품 알레르기에 대한 예방 및 치료방법은 특별히 없으며, 이를 예방하는 유일한 방법은 식품에 알레르기 유발 식품에 대한 정확한 표시제도를 통해 감수성이 있는 소비자들이 해당 식품을 섭취하지 않는 것이다. 이는 식품 자체뿐만 아니라 이를 원료로 하여 제조, 가공된 가공식품의 경우에도 동일하게 적용되어야 한다.

또한, 드물지 않게 한 가지 이상의 식품에 알레르기 반응이 나타나는 경우가 있으며, 알레르기 비염 등 호흡기 알레르기와 식품 알레르기가 동반되는 경우가 흔하게 보고되고 있다. 원재료 식품들이 서로 분류학적으로 인접하거나, 알레르겐의 분자구조가 유사할 경우 동일한 알레르기 반응을 유발할 수 있으며, 이를 교차반응이라 한다.

대표적인 교차반응의 예로 자작나무 꽃가루(Birch pollen) 관련 알레르기 반응이 있다면, 배, 사과, 멜론, 키위 등의 과일류, 땅콩, 헤이즐넛 등의 견과류 그리고, 옥수수, 상추 등의 채소류 중에서 한 가지 이상의 식품에서 알레르기 반응을 보일 수 있다. 이와 같은 교차반응은 알레르기를 유발하는 특정 알레르겐이 동일하기 때문에 발생하며, 알레르기 유발 식품을 표기하기 위해서 교차반응을 예측할 수 있는 특정 식품 원료의 알레르겐을 검출하는 것이 필요하다.

식품 속에 특정 식품 원료의 알레르겐을 검출하기 위해서, 알레르기 유발 식품의 존재 여부를 검사하는 방법이 요구되나, 이를 검사하는 방법은 알레르겐을 직접 검출하는 ELISA나 EIA법이 대부분이다.

그러나 검사 대상이 되는 단백질인 알레르겐은 다양한 원료가 혼합되는 여러 단계의 가공 과정에서 쉽게 소실될 수 있기 때문에, 검사의 정확도가 낮고 검출 시간이 오래 걸리는 문제가 있다. 알레르겐은 아주 소량의 존재만으로 치명적인 반응을 일으키기 때문에, 민감도가 높은 알레르기 유발 식품 검출 방법이 필요하다.

한국등록특허 제10-1864704호 한국등록특허 제10-1540852호

본 발명의 목적은 특정 알레르기를 유발하는 어패류의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 알레르기 유발 어패류 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 알레르기 유발 어패류 검출용 바이오 칩(chip)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 대상 시료내 알레르기 유발 어패류를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 알레르기 유발 어패류 포함 시료의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은, 서열번호 1 내지 10의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 알레르기 유발 어패류의 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “프라이머 쌍”은 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 합쳐 동시에 지칭하는 용어이고, “프라이머 세트”는 상기 제 1 프라이머 쌍 내지 제 5 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상으로 구성된 다수의 프라이머 쌍 묶음을 지칭하는 용어로 사용하였다.

프라이머 쌍의 설계는 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3 회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따른다. 그 외에 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.

상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화 되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 구체적으로는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있고, 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.

상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.

상기 프라이머 세트는 표적 원료에 존재하는 특정 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 원료가 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 중폭 되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 원료의 존부를 판단할 수 있다.

상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 제 1 프라이머 쌍 내지 제 5 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것으로 구성될 수 있다.

본 발명에서, “어패류”는 어류와 패류를 총칭하는 것으로서, 주로 식품으로서의 생선 및 조개 종류를 말한다. 어패류는 살 뿐만 아니라 알, 내장까지도 식용으로 하여 날 것 형태로 생식하거나, 조리하거나 가공하는 등 다양한 형태로 섭취가 이루어지고 있다. 상기 어패류는 식품 알레르기의 원인 중 하나로 손꼽히고 있다.

본 발명에서, “알레르기 유발 어패류”는 식품 알레르기를 일으키는 어패류를 말하는 것으로서, 식품 알레르기의 증상으로 두드러기, 입술 부종이나 가려움증 등과 같은 경미한 증상부터 혈관부종, 후두부종, 설사, 구토, 복통, 위장관 단백소실, 발진 등의 강한 피부 증상 등의 중증 양상을 나타낼 뿐만 아니라 심각한 경우 아나필락시스, 전신성 쇼크 등을 일으켜 사망에까지 이르게 한다. 본 발명에서는 높은 특이도와 민감도를 가지고 상기와 같은 알레르기 유발 어패류의 존재 여부를 확인할 수 있도록 하였다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 알레르기 유발 어패류는 굴, 홍합, 전복, 조개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명에서, “굴”은 조개류에 속하며, 필수 아미노산을 다량 포함하고 있어 '바다의 우유'라고도 불린다. 칼슘과 비타민이 풍부하며, 고혈압, 동맥경화 등의 성인병 예병 효과가 있다고 알려져 있어 다수 섭취되고 있으나, 식품 알레르기를 일으키는 대표적인 어패류 중 하나이다. 주로 소화기관계에서 알레르기 반응을 나타내며, 구토와 설사, 붓기 등 강력한 면역반응을 나타내어 식도와 기도를 붓게하여 심각하면 사망에까지 이르게 할 수 있다.

본 발명에서, “홍합”은 홍합과에 속하는 패류로서, 칼슘, 인, 철분 등이 풍부하게 들어있으며, 세계 여러 국가에서 식재료로 즐겨 사용되고 있다. 그러나, 홍합 역시 식품 알레르기를 유발하는 원인 중 하나로 알려져 있으며, 피부 발진, 위장관, 전신성 증상이 나타난다.

본 발명에서, “전복”은 전복과에 딸린 연체동물로서, 예로부터 식용으로 해온 주요 수산물 중 하나이다. 저지방 고단백 식품으로 비타민과 미네랄이 풍부에 기력 회복에 도움을 주며, 간을 보호해주는 것으로 알려져 있어 보양식으로 다수 섭취되고 있다. 그러나, 전복 역시 식품 알레르기를 유발하는 원인 중 하나로 알려져 있으며, 전복 섭취 후 호흡곤란, 얼굴 부종 및 아나필락시스가 발생된 사례가 보고된 바 있다(Allergy Asthma Respir Dis 4(6):449-452, November 2016).

본 발명에서, “조개”는 조개류에 속하는 모든 연체동물을 총칭하는 것으로서, 전 세계적으로 다수 섭취되고 있으며, 여러가지 요리의 재료로 사용되고 있다. 조개 알레르기는 식품 알레르기 중 가증 흔한 알레르기로도 알려져 있으며, 구토나 설사 등의 위장관 증상, 가려움증, 통증, 저혈압 증상 뿐만 아니라 심각하면 사망에까지 이르게 할 수 있다.

본 발명 일 실시예에 있어서, 상기 굴의 유전자를 검출하는 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 홍합의 유전자를 검출하는 제 2 프라이머 쌍은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 홍합의 유전자를 검출하는 제 3 프라이머 쌍은 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조개의 유전자를 검출하는 제 4 프라이머 쌍은 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 4종의 어패류를 모두 포함하는 진핵생물(eukaryotes)의 18S rRNA 유전자를 검출하는 제 5 프라이머 쌍은 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열로 구성될 수 있다.

또한, 상기 프라이머 쌍은 선택된 1 종의 프라이머 쌍이 포함되거나 2 종 이상의 복수 개의 프라이머 쌍이 포함된 형태로 프라이머 세트를 구성할 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 상기 본 발명의 각 프라이머 쌍들이 알레르기 유발 어패류 4종 각각에 대해 매우 높은 특이도를 나타냄을 확인하였으며(도 1), 상기 4종의 어패류 및 다른 해산물의 유전자가 모두 혼합된 경우에도 각 어패류를 한 번에 모두 선별해내었는 바(도 2), 본 발명의 상기 프라이머 쌍들은 단독 또는 복합된 형태의 프라이머 세트로서 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 조성물을 포함하는 알레르기 유발 어패류 검출용 키트를 제공한다.

상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.

상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.

본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 알레르기 유발 어패류를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 검출용 키트는 RT-PCR 키트일 수 있다. 구체적으로, RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 조성물을 포함하는 알레르기 유발 어패류 검출용 바이오 칩(chip)을 제공한다.

본 발명에서, 상기 “바이오 칩(chip)”은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.

바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.

바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 10 내지 50개, 구체적으로는 10 내지 30개, 더욱 구체적으로는 15 내지 20개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 대상 시료에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 알레르기 유발 어패류의 검출방법을 제공한다.

상기 검출방법에 사용하는 대상 시료는 알레르기 유발 어패류가 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 다양한 해산물 가공식품 등에서 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 대상 시료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA 추출방법을 통해 수득할 수 있으며, 예컨대 알카라인 추출법, 열수추출법, 컬럼 추출법 및 페놀/클로로포름 추출법 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검출방법은 대상 시료 내 존재하는 어패류의 DNA를 검출할 수 있는 특정 방법들을 의미하는 것으로, DNA 서열 분석 방법; 프로브 하이브리드화 방법; 구조 특이적인 절단 분석; 효소 미스매치 절단 방법(enzyme mismatch cleavage method); 중합효소 연쇄 반응(PCR); 측쇄 하이브리드화 방법; 롤링 서클 복제(rolling circle replication); 핵산서열기반 증폭(Nucleic acid sequence based amplification, NASBA); 분자 비콘 기술(molecular beacon technology); E-센서 기술(미국 특허 제6,248,229호 등); 사이클링 프로브 기술(cycling probe technology); 데이드 베링(Dade Behring) 시그날 증폭 방법; 리가제 연쇄 반응; 및 샌드위치 하이브리드화 방법 또는 서던 블로팅(southern blotting)을 이용하는 것일 수 있다.

상기 검출방법은 상기 조성물을 이용하여 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭 반응을 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 검출방법의 반응산물이 전기 영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.

구체적으로, 상기 검출방법은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 것으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.

상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 1 종 또는 복수의 알레르기 유발 어패류를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 구축하였으며, 상기 프라이머 세트는 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 농도에서도 효과적으로 타겟 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다.

더욱 구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 본 발명의 조성물을 이용한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 방법일 수 있다.

본 발명에서, 상기 “멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)”은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭하는 것으로, 본 발명에서는 한 번의 PCR 반응으로 대상 시료내 존재하는 1 내지 4종의 알레르기 유발 어패류를 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 멀티플렉스 PCR은 다양한 시료를 한 번의 증폭 반응으로 확인할 수 있으므로 경제적이고, 시간이 절약될 수 있다.

멀티플렉스 PCR을 사용하면 기존 방식의 PCR과 달리 1회의 PCR 반응을 통해 하나 이상의 알레르기 유발 어패류 각각의 특이 지역을 동시에 증폭할 수 있으며, 하나 이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 1 종 이상의 유전자를 한 번에 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, a) 대상 시료에 서열번호 1 내지 10의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 알레르기 유발 어패류의 검출용 조성물을 처리하는 단계; 및 b) 상기 시료 내에 굴, 홍합, 전복 및 조개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 알레르기 유발 어패류의 포함 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 알레르기 유발 어패류 포함 시료의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 “시료”는 알레르기 유발 어패류의 포함 여부를 확인하고자 하는 대상이 되는 물질을 말한다. 구체적으로 해산물 가공식품, 영양제, 음료 등 각종 식이에 포함되는 물질 등을 대상으로 할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니며 알레르기 유발 어패류의 포함 여부를 확인하고자 하는 것이라면 모두 대상 시료가 될 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 특별한 제한 없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행되는 모든 유전자 스크리닝 방법을 통해 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 제 1 프라이머 쌍 내지 제 5 프라이머 쌍에서 하나 이상 선택된 것으로 이루어진 알레르기 유발 어패류 검출용 조성물을 이용하면, 대상 시료 내 존재하는 굴, 홍합, 전복 및 조개를 정확히 판별할 수 있다.

또한, 본 발명의 제 1 프라이머 쌍 내지 제 5 프라이머 쌍은 멀티플렉스 PCR용 프라이머로써, 상기 알레르기 유발 어패류인 굴, 홍합, 전복 및 조개를 동시에 검출할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 흰다리 새우(1), 꽃게(2), 오징어(3), 모시조개(4), 홍합(5), 전복(6), 참굴(7), 및 고등어(8)를 포함하는 8종의 식품에 대해 심플렉스 PCR을 수행하여 특이도를 확인한 결과이다. NT는 음성대조군이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 흰다리 새우(1), 꽃게(2), 오징어(3), 모시조개(4), 홍합(5), 전복(6), 참굴(7), 및 고등어(8)를 포함하는 8종의 식품에 대해 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과를 나타내었다. P는 굴, 홍합, 전복 및 조개의 혼합물이고, NT는 음성대조군이다.
도 3은 본 발명 프라이머 쌍의 멀티플렉스 PCR의 민감도를 확인한 결과이다. (M: 사이즈 마커, lane 1: 50 ng, lane 2: 10 ng, lane 3: 2 ng, lane 4: 0.4 ng, lane 5: 0.08 ng, lane 6: 0.016 ng, lane 7: 0.0032 ng, NT: 음성 대조군).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 알레르기 유발 어패류 특이 프라이머의 디자인

알레르겐 유발 식품을 검출하기 위해, 프라이머 디자이너 프로그램 (Version 3.0; Scientific and Educational Software, USA)을 사용하여 알레르기 유발 어패류의 트로포미오신(tropomyosin) 유전자에 특이적인 프라이머를 디자인하였다.

이때, 상기 알레르기 유발 어패류인 굴, 홍합, 전복 및 조개의 유전자와 DNA존재를 확인하기 위한 내재 프라이머는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Genebank 염기서열을 참고하였다.

선별된 유전자는 NCBI BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 한 번 더 재확인 과정을 거친 후, Tm 값과 G+C 함량을 고려하여 특정 프라이머를 디자인하였고, PCR 반응의 실패를 확인하기 위한 내재 프라이머는 진핵생물의 18S rRNA 서열로부터 디자인하였다(표 1).

세트번호	서열번호	프라이머 명	염기서열 (5'-3')	유전자명	검출
세트 1	1	OysT-F	CCC TAA ACA GCC ATC CAT AC	Tropomyosin (Cra g 1)	굴
세트 1	2	OysT-R	GCC ACA ACT GAG AGT TGT TC	Tropomyosin (Cra g 1)	굴
세트 2	3	MusT-F	GAT TAG TCA AGC CAA TTC CC	Tropomyosin (Myt e 1)	홍합
세트 2	4	MusT-R	CCA TTT TCA TGG CAA CCA TC	Tropomyosin (Myt e 1)	홍합
세트 3	5	AbalT-F	GAA CAA GAG GTG AGT GGA AC	Tropomyosin (Hal d 1)	전복
세트 3	6	AbalT-R	TCG AGT CTC TCT GTG GCA GT	Tropomyosin (Hal d 1)	전복
세트 4	7	ClaT-F	CTT GCT GAA AAG GAG AAG TAC	Tropomyosin (Rud p 1)	조개
세트 4	8	ClaT-R	CTC ACA TGC CAG CTA ACT CA	Tropomyosin (Rud p 1)	조개
세트 5	9	Euk-F	TAA AGG AAT TGA CGG AAG GG	18S rRNA	진핵 생물
세트 5	10	Euk-R	TCG TTA TCG GAA TCA ACC AG	18S rRNA	진핵 생물

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 프라이머 세트 1 내지 4는 어패류의 대표적인 알레르기 유발 단백질인 트로포마이신을 대상으로 제작되었다.

프라이머 세트 1은 프라이머 OysT-F/R로 구성되며, 굴의 알레르겐인 트로포미오신을 검출할 수 있고, 증폭된 증폭 산물의 크기는 150 bp이다.

프라이머 세트 2는 프라이머 MusT -F/R로 구성되며, 홍합의 알레르겐인 트로포미오신을 검출할 수 있고, 증폭된 증폭 산물의 크기는 119 bp이다.

프라이머 세트 3은 프라이머 AbalT -F/R로 구성되며, 전복의 알레르겐인 트로포미오신을 검출할 수 있고, 증폭된 증폭 산물의 크기는 98 bp이다.

프라이머 세트 4는 프라이머 ClaT -F/R로 구성되며, 조개의 알레르겐인 트로포미오신을 검출할 수 있고, 증폭된 증폭 산물의 크기는 76 bp이다.

프라이머 세트 5는 프라이머 Euk -F/R로 구성되며, 18S rRNA를 검출할 수 있고, 증폭된 증폭 산물의 크기는 190 bp이다.

상기 프라이머는 가공 식품에 효과적으로 적용하기 위해 약 200 bp 이하로 설계되었다.

실시예 2: 시료 준비

상기 프라이머 세트의 성능을 평가하기 위하여, 흰다리 새우(Litopenaeus vannamei), 꽃게(Portunus trituberculatus), 오징어(Todarodes pacificus), 홍합(Mytilus edulis), 전복(Haliotis discus hannai), 참굴(Crassostrea gigas), 모시조개(Ruditapes philippinarum) 및 고등어(Scomber japonicus) 총 8 종의 해산물을 선정하여 해양수산부 및 국내 시장을 통해 입수하였다.

또한, 상업적으로 가공된 조미료, 죽, 통조림 등 총 20여개의 해산물 가공식품을 국내 시장에서 구입하였고, 상기 모든 시료는 액체질소를 사용하여 균질화 한 후, -20℃에서 보관하였다.

실시예 3: DNA 추출

상기 시료의 유전체 DNA는 DNeasy®Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 추출된 DNA는 자외선-분광광도계(UV-1700, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 농도와 순도를 측정하였다.

실시예 4: 심플렉스(simplex) 및 멀티플렉스(multiplex) PCR 조건 설정

PCR 최적 조건을 설정하기 위하여, 상기 실시예 1의 프라이머 세트로 심플렉스(simplex) 및 멀티플렉스(multiplex) PCR을 실시하였다.

심플렉스 및 멀티플렉스를 위한 PCR 조성은 2.5 μL의 10x 완충액, 200 μM의 dNTP, 1 U의 Ex-Taq 중합 효소 (Takara, Shiga, Japan), 각 400 nM의 프라이머 및 50 ng의 DNA 주형을 함유하는 25 μL 혼합물로 설정하였다. 다만, 멀티플렉스를 위한 PCR 조성에서는 상기 조성과 다른 구성은 동일하되, 프라이머 세트 1 내지 5의 농도를 달리하여 첨가하였다 (표 2).

시약	최종 농도	부피
샘플 DNA	50 ng	1 μl
증류수	Up to 25 μl	Up to 25 μl
10X PCR 완충액(MgCl₂첨가)	1X	2.5 μl
dNTP	200 μM	2 μl
Tap DNA 중합효소	1 U	1 μl
프라이머 세트 1 (굴)	800 nM	1 μl
프라이머 세트 2 (홍합)	3200 nM	1 μl
프라이머 세트 3 (전복)	400 nM	1 μl
프라이머 세트 4 (조개)	800 nM	1 μl
프라이머 세트 5 (진핵생물)	200 nM	1 μl

심플렉스 및 멀티플렉스 PCR은 thermal cycler (PC-808; ASTEC, Kyoto, Japan)를 사용하였고, 94 ℃에서 5 분 동안 예비 배양한 후; (94°C에서 30초, 62°C에서 30초, 72℃에서 30초) 반응을 35회 반복하고; 72℃에서 5분 증폭하였다(표 3).

온도	시간	Cycle 수
94 ℃	5 분	1
94 ℃	30 초	40
62 ℃	30 초
72 ℃	30 초
72 ℃	5 분	1

실시예 5: PCR 생성물의 서열 분석

상기 실시예 1의 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 정제하고, 제조사의 프로토콜에 따라 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, USA)에 복제하였다.

증폭된 PCR 산물을 포함하는 각 플라스미드 DNA는 DNA-spinTM Plasmid DNA Purification Kit(Intron Biotechnology, 성남)를 이용하여 추출하고 서열 분석하였다.

서열 분석은 Genotech(제노텍, 한국)에 위탁하였고, NCBI 데이터베이스의 BLAST 검색을 통해 결과를 분석하였다.

실험예 1: 심플렉스(simplex) PCR을 통한 특이도 확인

멀티플렉스 PCR의 가능여부를 확인하기에 앞서, 심플렉스 PCR을 수행하여 실시예 1에서 설계한 프라이머의 특이도를 확인하였다.

상기 실시예 4에서 설정된 심플렉스 PCR 조건 하에서, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 흰다리 새우(1), 꽃게(2), 오징어(3), 모시조개(4), 홍합(5), 전복(6), 참굴(7), 및 고등어(8)를 포함하는 8종의 식품을 분석하였다.

각 PCR 증폭 산물에 대한 서열분석 결과, 트로포미오신 유전자 및 18S rRNA 유전자에 해당하는 부위가 특이적으로 증폭한 것을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 프라이머 세트의 예상 증폭 산물인 굴 120 bp, 홍합 119 bp, 전복 98 bp, 조개 76 bp 크기의 밴드가 각각 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(도 1).

실험예 2: 멀티플렉스(multiplex) PCR의 특이도 확인

본 발명자들은 실험예 1의 심플렉스 PCR의 결과를 고려하여 멀티플렉스 PCR을 위한 최적의 각 프라이머 세트의 농도, 증폭 온도 및 시간을 설정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 Taq DNA 중합 효소, PCR 완충액, dNTP 및 프라이머 세트와 같은 PCR 조성, 온도 및 시간을 조절하였고, 최적의 멀티플렉스 PCR 조건을 확립하였다.

멀티플렉스 PCR의 특이도를 확인하기 위하여 상기한 조건에서 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 흰다리 새우(1), 꽃게(2), 오징어(3), 모시조개(4), 홍합(5), 전복(6), 참굴(7), 및 고등어(8)를 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 모든 샘플에서 18S rRNA 밴드가 발견되어 PCR이 정상적으로 이루어진 것을 확인하였고, 굴 120 bp, 홍합 119 bp, 전복 98 bp, 조개 76 bp에 해당하는 특이적인 밴드가 확인되었으나, 나머지 샘플에서는 특이적인 밴드가 발견되지 않았다.

이러한 결과는 본 발명의 프라이머 쌍이 타깃 어패류에만 증폭되고 타깃을 제외한 나머지 해산물에는 어떤 증폭도 일어나지 않는 것을 나타내는 결과로써, 알레르기 유발 어패류인 굴, 홍합, 전복 및 조개를 특이적으로 교차반응 없이 검출이 가능함을 나타내는 것이다.

실험예 3: 멀티플렉스(multiplex) PCR의 민감도 확인

멀티플렉스 PCR의 민감도 검사를 위하여 굴, 홍합, 전복 및 조개의 DNA를 혼합한 유전체 DNA(gDNA)를 50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 및 0.0032 ng의 농도별로 희석하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 여러 종류의 유전자가 혼합되어 있음에도교차반응 없이 굴, 홍합, 전복 및 조개 각각에 대해 특이적인 밴드가 나타남을 확인하였으며, 특히 0.016 ng의 농도에서도 밴드의 혼합없이 어패류의 알레르겐인 트로포미오신이 명확히 검출되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 검출용 조성물이 교차반응 없이 특이도가 높으면서도 매우 우수한 검출한계를 나타내는 바, 특이도와 민감도가 모두 우수함을 나타내는 것이다.

실험예 4. 상업용 가공식품에의 응용 가능성 확인

상기 멀티플렉스 PCR 조건으로 해산물 통조림 3개, 조미료 3개, 죽 8개, 절인 굴, 건조 해산물 3개 및 해산물 스프 2개를 분석하고 제품의 라벨과 비교하였다(표 4).

번호	식품명	표시된 성분	PCR 결과
1	조개 통조림	조개	조개
2	전복 통조림 A	전복	전복
3	전복 통조림 B	전복	전복
4	양념 A	홍합, 조개(추출물)	홍합
5	양념 B	홍합, 조개(추출물)	홍합
6	양념 C	홍합	홍합
7	죽A	조개	조개
8	죽B	조개	조개
9	죽C	굴	굴
10	죽D	전복	전복
11	죽E	전복	전복
12	죽F	전복	전복
13	죽G	굴	굴
14	죽H	굴, 조개	굴, 조개
15	절인 굴	굴	굴
16	말린 홍합	홍합	홍합
17	말린 조개	조개	조개
18	말린 굴	굴	굴
19	스프 A	홍합	홍합
20	스프 B	전복	전복

그 결과 상기 20가지 제품 모두에 대해서 라벨과 PCR 결과 검출된 어패류 종류가 모두 일치하였다.

본 발명은 알레르기 유발 어패류를 빠르고 정확하게 동정할 수 있도록 각 어패류에 특이적인 프라이머 쌍, 프라이머 세트 및 이들을 포함하는 어패류 검출용 조성물을 제공하고, 이들을 이용하여 알레르기 유발 어패류를 검출할 수 있는 키트, 바이오 칩 및 검출방법을 제공한다. 또한, 상기 조성물을 이용한 검출방법을 상업용 가공식품 모니터링에 적용하여 제품의 표시성분과 동일하게 검출해 낼 수 있는 능력을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> MULTIPLEX PCR PRIMERS FOR DETECTION OF SHELLFISHES CAUSING ALLERGY, AND USES THEREOF <130> 19PP30064 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OysT-R <400> 1 ccctaaacag ccatccatac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OysT-R <400> 2 gccacaactg agagttgttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MusT-F <400> 3 gattagtcaa gccaattccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MusT-R <400> 4 ccattttcat ggcaaccatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AbalT-F <400> 5 gaacaagagg tgagtggaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AbalT-R <400> 6 tcgagtctct ctgtggcagt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaT-F <400> 7 cttgctgaaa aggagaagta c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaT-R <400> 8 ctcacatgcc agctaactca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Euk-F <400> 9 taaaggaatt gacggaaggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Euk-R <400> 10 gaacaagagg tgagtggaac 20

Claims

서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 제 4 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 제 5 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트;를 포함하는,
굴, 홍합, 전복 및 조개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 알레르기 유발 어패류 검출용 조성물.
삭제
제1항의 조성물을 포함하는,
알레르기 유발 어패류 검출용 키트.
제1항의 조성물을 포함하는,
알레르기 유발 어패류 검출용 바이오 칩(chip).
대상 시료에 제1항의 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 알레르기 유발 어패류 검출방법.
제5항에 있어서,
중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는,
알레르기 유발 어패류 검출 방법.
a) 대상 시료에 제1항의 조성물을 처리하는 단계;및
b) 상기 시료 내에 굴, 홍합, 전복 및 조개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 알레르기 유발 어패류 포함 여부를 확인하는 단계를 포함하는,
알레르기 유발 어패류 포함 시료의 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는,
알레르기 유발 어패류 포함 시료의 스크리닝 방법.