CN110117662B - 大麻哈鱼的荧光pcr检测方法及其引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法及其引物和探针，该方法设计大麻哈鱼的引物和探针，并提取大麻哈鱼样品中的DNA；根据所述引物和探针及样品DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。本发明可有效地以实时荧光PCR方法对大麻哈鱼进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法及其引物和探针。
背景技术
三文鱼以其橙白相间的外形和丰腴柔美的滋味，都让人馋涎欲滴。但随着人们对三文鱼喜爱程度的剧增，市场上冒出了很多挪威三文鱼、帝王三文鱼、红三文鱼、阿拉斯加三文鱼、淡水三文鱼等等外形酷似的三文鱼刺身产品。经典“三文鱼”只是大西洋鲑（Salmo salar）这一种，挪威三文鱼是它的常用商用名；市场上带着其他前缀的三文鱼和大西洋鲑是同科，但并非同属，包括大麻哈鱼（Oncorhynchus keta）、马苏大马哈鱼（Oncorhynchus masou）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、红点鲑（Salvelinus leucomaenis）、太门哲罗鲑（Hucho taimen）等等，但因制成刺身、寿司等产品后，上述鱼类外观上难以与大西洋鲑加以区分，因此给售假创造了空间。像这种多种鱼类都被称作“三文鱼”的现象，在分类学上被称作“一名多物”。“一名多物”现象的存在，使得人们在交流的过程中会发生物种的混淆，不利于科研贸易等事务的进行。
大麻哈鱼，属于鲑科（Salmonidae），大麻哈鱼属（Oncorhynchus），是一种常常被用来当做三文鱼进行售卖的鱼类。因此需要一种可鉴别大麻哈鱼的方法，以保护消费者的合法权益。
形态学方法是传统的动物种属鉴定方法，但市售的三文鱼往往都以刺身或寿司的形式出现，因此，单纯的形态学鉴定方法往往不能满足对鱼肉制品售假现象的监管与控制的需求。而种属鉴定的免疫学方法大都直接鉴定样本中的蛋白成分，其基本原理是抗体抗原反应，但免疫学方法存在对样本材料要求高，检测准确率低等缺陷，如动物食品的蛋白结构一旦遭到破坏，免疫学方法便不再适用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法及其引物和探针，可有效地以实时荧光PCR方法对大麻哈鱼进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种大麻哈鱼的引物和探针，其中，所述引物和探针见下表：
其中，F表示上游引物；R表示下游引物；P表示探针。
为解决上述问题，本发明还提供一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其中，至少包括如下步骤：
S1：设计大麻哈鱼的引物和探针，所述引物和探针见下表：
其中，OK-F表示上游引物；OK-R表示下游引物；OK-P表示探针；
S2：提取大麻哈鱼样品中的DNA；
S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；
S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。
其中，所述上游引物的浓度为10pmol/μL，下游引物的浓度为10 pmol/μL，探针的浓度为10 pmol/μL。
其中，步骤S2具体为：
S21：获取0.2g大麻哈鱼样品，并在液氮中研磨；
S22：使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；
S23：将抽提后的DNA溶解在100μL水中，获得DNA液。
其中，步骤S3具体为：
S31：获取10μL的Premix Ex Taq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探针以及1μL的DNA液，并加水补足至20μL；
S32：使用实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR扩增反应，其中实时荧光PCR扩增反应的程序如下：
95℃预变性10 sec；95℃变性5 sec；60℃退火并延伸23 sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。
其中，在步骤S3后，还包括步骤S30：设置阳性对照、阴性对照及提取空白对照。
其中，在步骤S4之前，还包括步骤S40：获取真核生物的引物和探针，并作为内参照引物和探针；其中真核生物的引物和探针见下表：
*引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量；其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探针。
其中，步骤S4具体为：
S41：若检测结果显示空白对照、阴性对照无FAM荧光信号，阳性对照Ct值小于等于30，则判定实时荧光PCR扩增反应有效，否则反应无效；
S42：在实时荧光PCR扩增反应有效的前提下，用内参照引物探针筛选出Ct值≤30的样品；
S43：在Ct值≤30的样品中的特异性曲线出现扩增曲线时，则表示DNA抽提有效，否则应重新提取DNA，直至Ct值≤30；
S44：在实时荧光PCR扩增反应有效，且抽提的DNA有效的情况下，大麻哈鱼的特异性引物探针检测得到的Ct值≤35时，则判断样品为阳性，若Ct值＞35，则判断样品为阴性。
区别于现有技术，本发明通过设计适用于大麻哈鱼的引物和探针，并用于实时荧光PCR检测，可有效地以实时荧光PCR方法对大麻哈鱼进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
首先应当说明的是，本发明涉及大麻哈鱼（Albatrossia pectoralis）的实时荧光PCR（Real-Time PCR）检测方法。基于具有高度物种特异性的大麻哈鱼线粒体细胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）序列（GenBank: FJ435617.1）设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real-Time PCR的方法对大麻哈鱼进行物种成分检测。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可协助有关部门有效打击鱼类，特别是三文鱼及其制品贩假的恶劣行径。
本发明属于分子生物学方法，基于核酸等遗传物质的高稳定性和多样性等特点，可广泛应用于物种种属鉴定，特别是以PCR技术为基础的核酸检测方法被应用到物种鉴别已有20年的历史。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。
利用实时荧光PCR技术本发明中的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可有效的用于鱼肉的真伪鉴别。
具体对：为了实现上述目的，本发明提供一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其中，至少包括如下步骤：
S1：设计大麻哈鱼的引物和探针，所述引物和探针见表1：
表1
其中，OK-F表示上游引物；OK-R表示下游引物；OK-P表示探针；
S2：提取大麻哈鱼样品中的DNA；
S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；
S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。
具体地，步骤S2中样本DNA提取。取0.2 g大麻哈鱼肌肉组织，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100μL水中；
步骤S3中实时荧光PCR扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光PCR反应体系如下：10μL的 Premix Ex Taq（Takara），上游引物（10 pmol/μL浓度）0.4μL，下游引物（10pmol/μL）0.4μL，探针（10 pmol/μL）0.4μL，取上述提取的DNA液1μL，用水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle 480（Roche）进行反应，反应程序为：
95℃预变性10 sec； 95℃变性5 sec；60℃退火并延伸23 sec，执行40 个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。
步骤S4中结果判定。Ct（Cycle threshold，循环阈值；即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。
实际操作时，如步骤S1的引物和探针的设计可采用下述方式获得：
基于具有高度物种特异性的大麻哈鱼线粒体细胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）序列（GenBank: FJ435617.1）用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用PrimerExpress设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行BLAST验证，以保证引物的高特异性。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。
步骤S2的样本DNA提取可可采用下述方式获得：
取0.2 g鱼肉，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)，按照说明书进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100μL水中。提取过程设置以水替代样品的提取空白对照。
步骤S3的实时荧光PCR对样本的检测可采用下述方式获得：
实时荧光PCR扩增反应。引物探针序列如表1所示，实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq（Takara），上游引物（10 pmol/μL）0.4μL，下游引物（10 pmol/μL）0.4μL，探针（10 pmol/μL）0.4μL，取上述提取的DNA液1μL，用水补足体积至20μL。应用实时荧光PCR仪lightcycle 480（Roche）进行反应。
其中检测过程除了样品外，设置阳性对照（阳性对照得到的DNA浓度≥20 ng/μL，以满足Ct值≤30）、阴性对照、提取空白对照。分别用大麻哈鱼的检测引物探针和内参照引物和探针进行检测。
而内参照引物和探针是真核生物的引物和探针见表2：
表2
*引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量；其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探针。
步骤S4中，检测结果若显示空白对照、阴性对照无FAM荧光信号，阳性对照Ct值小于等于30，可以判定荧光PCR反应有效，否则反应无效。在荧光PCR反应有效的前提下，用内参照引物探针进行检测的样品的Ct值小于等于30（保证抽提得到的DNA有一定的浓度和纯度），并出现明显的扩增曲线时，表示DNA抽提有效，否则应重新提取DNA，直至Ct值小于等于30。在荧光PCR反应有效，且抽提的DNA也有效的情况下，大麻哈鱼的特异性引物探针检测得到的Ct值小于等于35时，则判断样品阳性，若Ct值大于35则判断样品阴性。
其中，为了验证检测结果的精确性，本发明还可进行实时荧光PCR特异性验证，具体如下：
分别对大麻哈鱼、大西洋鲑、虹鳟、细鳞大麻哈鱼、马苏大麻哈鱼、银大麻哈鱼等18种鱼类，包括真正生物学意义上的三文鱼（大西洋鲑）和常被用于当做“三文鱼”的其他鱼类（包括虹鳟、细鳞大麻哈鱼、马苏大马哈鱼、银大麻哈鱼等）和其他较常见鱼类，以及其他常见的家畜家禽5个物种，共23个物种（表3）进行引物探针的特异性验证，反应体系和反应程序如上述步骤S3、S4所述。如表3所示，用大麻哈鱼的特异性引物探针检测时，只有大麻哈鱼的样本得到阳性结果，其他物种均显示为阴性结果。而用真核生物通用引物探针检测时，除水的样本外，其他都得到阳性结果。上述结果表明，所有物种抽提得到的DNA品质良好，且荧光PCR反应有效，在此基础上可以判断本发明设计的大麻哈鱼的引物探针具有很好的物种特异性。
表3实时荧光PCR特异性验证结果
所有实验取重复3次的平均值；Undet.表示Ct值低于检测限。
与此同时，本发明还提供一种实时荧光PCR灵敏度验证方法，具体如下：
对抽提到的大麻哈鱼的DNA（浓度为85 ng/μL）进行5倍梯度稀释，检测引物探针的灵敏度。反应体系和反应程序如上所述。结果显示（表4），DNA浓度为1.4 ng/μL（实际测得浓度）或0.7 ng/μL（换算得到的浓度）时（表4中的样品4），检测得到的Ct值为33.26，尚小于35，此时扩增的S形曲线还比较明显，检测结果比较可靠；当DNA继续稀释时（表4中样品5），得到的Ct值大于35，此时易与假阳性的翘尾现象混淆，不易判断。因此，从本检测的结果判断，对检测样品的浓度要求大于或等于1 ng/μL时（接近样品4的浓度时），检测结果较为可靠。
表4实时荧光PCR对大麻哈鱼检测的灵敏度验证
其中，*用Nanodrop 1000（Thermo）实际测得浓度/5倍梯度稀释推算得到的浓度；浓度数值保留一位小数；
—表示低于检测范围；
所有实验取重复3次的平均值。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种大麻哈鱼的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针由下表中的序列组成：
其中，OK-F表示上游引物；OK-R表示下游引物；OK-P表示探针。
2.一种大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
S1：设计大麻哈鱼的引物和探针，所述引物和探针由下表中的序列组成：
其中，OK-F表示上游引物；OK-R表示下游引物；OK-P表示探针；
S2：提取大麻哈鱼样品中的DNA；
S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；
S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。
3.根据权利要求2所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述上游引物的浓度为10 pmol/μL，下游引物的浓度为10 pmol/μL，探针的浓度为10 pmol/μL。
4.根据权利要求3所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2具体为：
S21：获取0.2g大麻哈鱼样品，并在液氮中研磨；
S22：使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；
S23：将抽提后的DNA溶解在100μL水中，获得DNA液。
5.根据权利要求4所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S3具体为：
S31：获取10μL的Premix Ex Taq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探针以及1μL的DNA液，并加水补足至20μL；
S32：使用实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR扩增反应，其中实时荧光PCR扩增反应的程序如下：
95℃预变性10 sec；95℃变性5 sec；60℃退火并延伸23 sec，执行40 个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。
6.根据权利要求5所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，在步骤S3后，还包括步骤S30：设置阳性对照、阴性对照及提取空白对照。
7.根据权利要求6所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，在步骤S4之前，还包括步骤S40：获取真核生物的引物和探针，并作为内参照引物和探针；其中真核生物的引物和探针由下表中的序列组成：
其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探针。
8.根据权利要求7所述大麻哈鱼的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S4具体为：
S41：若检测结果显示空白对照、阴性对照无FAM荧光信号，阳性对照Ct值小于等于30，则判定实时荧光PCR扩增反应有效，否则反应无效；
S42：在实时荧光PCR扩增反应有效的前提下，用内参照引物探针筛选出Ct值≤30的样品；
S43：在Ct值≤30的样品中的特异性曲线出现扩增曲线时，则表示DNA抽提有效，否则应重新提取DNA，直至Ct值≤30；
S44：在实时荧光PCR扩增反应有效，且抽提的DNA有效的情况下，大麻哈鱼的特异性引物探针检测得到的Ct值≤35时，则判断样品为阳性，若Ct值＞35，则判断样品为阴性。
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