CN105039329A - 三文鱼及其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量pcr法 - Google Patents

Abstract

三文鱼及其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量PCR法。本发明公开了一种利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：①、鲑科以及4种常见三文鱼的特异性鉴定引物与探针设计；所述4种常见三文鱼为大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑；②、待测三文鱼样品中基因组DNA的提取；③、双重荧光定量PCR扩增体系设置；④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。本发明为三文鱼及其深加工产品种类的快速检测提供了有效方法，为水产品和食品进出口提供技术保障。

Description

三文鱼及其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量PCR法

技术领域

本发明涉及一种适用于三文鱼及其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量PCR检测方法。

背景技术

三文鱼(salmon)是对鲑科鱼类或鲑鳟鱼类的一个泛称，被誉为“鱼中至尊”、“水中珍品”。三文鱼主要产于北冰洋与大西洋、太平洋的交界水域，属于冷水域洄游鱼类。濒临北冰洋的挪威是世界上最大的三文鱼养殖与捕捞国，其产量占到了世界总产量的一半。挪威三文鱼以其品质最好、口感最佳，被国际美食界被誉为“冰海之皇”。目前国内公认的经济种类大概分3个亚科、7个属、约36种。作为一个商品名称，只要肌肉坚实而富有弹性、且白色纹理清晰、色泽呈鲜红色或橘红色的鲑科鱼类都可称为三文鱼。因此，在不同国家的消费市场三文鱼所涵盖种类各不相同，比如挪威的三文鱼主要为大西洋鲑，芬兰的三文鱼主要是养殖的大规格红肉虹鳟，美国的三文鱼主要是阿拉斯加鲑鱼。

作为一种新型的海鲜产品，三文鱼因肉质鲜美、口味独特、营养丰富，正应时登上中国食品消费市场的舞台，逐渐出现在广大老百姓的餐桌上。据海关统计数据显示，我国三文鱼年进口量呈持续上升态势，逐渐成为世界三文鱼主要进口国家之一。但由于国内外不同地区对三文鱼所指品种不一，三文鱼进货渠道多样，产地多样，导致国内市场三文鱼品种混杂，价格也相差很大，从几十元到几百元不等。并有业内人士透露，目前国内市场上已经有用虾红素染色的养殖淡水虹鳟鱼冒充挪威三文鱼的现象。由于三文鱼主要以生食为主，淡水养殖鱼类容易寄生寄生虫类，这无疑大大增加了消费者感染寄生虫的风险。另外非正规渠道而来的进口三文鱼在运输过程中如冷链不完整，容易滋生细菌，品质更无从保障。对于普通消费者而言，除根据权威机构给出的建议查看商家的检验检疫合格证外，只能靠观察色泽、手感等这些感官判断标准三文鱼的品质。至于所购买三文鱼的品种是否与标签上所标注的一致，更是无从判断。因此，迫切需要建立灵敏、可靠的检测方法与体系对进口三文鱼进行种类鉴定。

目前，已报道的三文鱼种类鉴定的方法有传统形态学法、蛋白质电泳法和DNA分子遗传标记方法。形态学方法依赖于专业人士的长期工作经验，对亲缘关系相近的相似种的判断并非有效。而且对于市面上常见的加工过的三文鱼产品(生鱼片、罐头类)，可供种类鉴别的形态学特征几乎不存在；蛋白质分析方法不适用于深加工产品，因为产品加工过程中的热处理使蛋白质的生化特性及其结构完整性都被破坏；而基于DNA技术的分子生物学方法，就显示出明显优势。1)DNA比蛋白质耐热性强。尽管DNA在加工过程中也会被降解，但是仍然能提取出小片段的DNA。2)作为生物体的遗传物质，DNA分子能够提供更多信息。3)DNA分子稳定，不受组织类型、年龄及生理状态等因素的影响。

DNA分子技术用于种类鉴定有多种常见方法，如限制性片段长度多态性(RFLP)标记、单碱基多态性(SNP)标记、微卫星(microsatellite)标记、DNA条形码技术(DNAbarcode)、荧光定量PCR技术等。

RFLP首先需要对目标DNA片段进行PCR扩增,然后选择合适的限制性内切酶切割扩增片段,通过琼脂糖凝胶电泳获得不同物种的限制性酶切片段图谱。该方法花费低，操作简单，但也存在诸多缺点：1)由于存在种内变异以及不同密码子的简并性特征,同一物种不同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱；2)除生鱼片外，三文鱼深产品(如三文鱼罐头)在加工过程中通常使用长时间(>15min)高温(>115℃)处理，DNA分子常降解为100-200bp的小片段，这可能严重影响酶切片段的多态性的判断。

SNP和microsatellite标记常用于三文鱼同种鱼类的群体分析。DNAbarcode是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行快速物种鉴定的技术，由Hebert等(2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研究首次将DNABarcode技术用于标本编码。2004年，生命条形码联盟(theConsortiumfortheBarcodeofLife,CBOL)成立，支持生物DNA条形码研究的发展。至今，该组织下的鱼类DNA条码(FishBarcodeofLifecampaign,FISH-BOL)已经获得了10267个种的DNA条形码记录,包含97％的鱼类品种。该方法在新物种的发掘和物种系统进化分析方面非常高效，但其缺点是混合样品中通常有多种成分被同时扩增,会造成测序结果的杂乱，因此不适用于混合样品的鉴定。

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的新的核酸定量检测方法，它在常规的PCR基础上加入荧光信号物质(探针或染料)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过扩增曲线的Ct值(荧光信号强度达到基础信号(BaseLine)时的循环数，表明PCR开始进入指数扩增期)对未知模板进行定量分析。它集中了核酸杂交特异性强和PCR扩增灵敏度高的优点，检测范围广(≥7个数量级)、检测极限低(1c/r)，可同时对多个样品进行快速准确分析，被认为是目前最可靠的核酸定量检测技术。在我国进出口食品的检验检疫方面，已广泛应用于病原体检测、有害生物风险分析以及转基因产品的监管等多个方面。

近年来新发展的双重荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中含两对引物和不同荧光基团标记的探针，通过实时荧光反应可同时检测两种目标基因，建立快捷准确的双重荧光定量PCR方法进行种类鉴定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种双重荧光定量PCR技术，利用该技术灵敏准确的特性，分别检测鲑科的保守基因和4种三文鱼(虹鳟(O.mykiss)、大西洋鲑(S.salar)、红大麻哈(红鲑，O.nerka)、大马哈鱼(狗鲑，O.keta))的特异基因，建立一套合适的双重扩增和分析体系，从而对深加工三文鱼产品种类进行双重快速鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种三文鱼或其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的序列由鲑科以及大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑中的至少任意一种组成(如表1所示)：

表1

备注说明：

上述鲑科FP中：m:a/c；上述鲑科RP中：w:a/t，r:a/g，y:c/t。无论选用任意一个，效果均一致。

本发明还提供了利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，包括以下步骤：

①、鲑科以及4种常见三文鱼的特异性鉴定引物与探针设计；

所述4种常见三文鱼为大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑；

②、待测三文鱼样品中基因组DNA的提取；

③、双重荧光定量PCR扩增体系设置；

④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断(即，对市售三文鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符)。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的改进：所述步骤①是针对4种常见三文鱼的16SrDNA、CR序列进行双重荧光定量PCR检测的特异性鉴定引物与探针的设计。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：所述的探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，鲑科5’荧光染料标记采用HEX，4种常见三文鱼种类采用FAM；探针的3’淬灭集团均选择TAMRA荧光标记。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：

所述步骤①中的特异性引物和探针的序列由鲑科以及大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑中的至少任意一种组成(具体如上述表1所示)。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：

所述步骤③双重荧光定量PCR扩增体系设置；

双重荧光定量PCR体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，三文鱼的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，三文鱼的特异性探针(10μM)0.2μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(34.7ng/μL-107ng/μL)1.5μL，补水至20μL；

实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，61℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

备注说明：上述三文鱼是指“大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑”中的任意一种。

可同时设置三个重复和非模板空白对照。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：

所述步骤②中，三文鱼(即，未加工样品)通过Axygen基因组小量DNA提取试剂盒提取；三文鱼深加工样品通过天根深加工制品提取试剂盒(DP326)提取(即，采用天根生化科技(北京)有限公司深加工食品DNA提取试剂盒(DP326)进行提取)。

作为本发明的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法的进一步改进：

所述步骤④的判断为：根据双重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检三文鱼样品中是否属于上述4种常见三文鱼；检测基因无S曲线产生或/且Ct值大于30者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性。

备注说明：本发明所选择的这4种三文鱼是在世界市场中三文鱼经济价值比较高、养殖量比较大的种类，并且，是在中国市场中最常见的4种。这4种三文鱼都属于鲑科鱼类，外形在非专业鉴定下容易混淆，并且三文鱼在市场中的消费形式主要是生鱼片及其他加工产品，在除去外部特征的情况下，更加难以区分。

在本发明中，DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。

本发明中，荧光定量PCR扩增引物与探针的设计方法为：对于区分鲑科/非鲑科鱼类的扩增引物和探针设计方法是从NCBI数据库中检索鲑科和非鲑科鱼类16SrDNAgene特征序列，经DNAstar软件的MegAlign功能比对鲑科鱼类序列同源性，筛选出合理的目的片段基因后导入Primerpremier5.0进行区分鲑科与非鲑科鱼类引物和探针的设计；对于区分4种常见三文鱼的扩增引物和探针设计方法是从NCBI数据库中检索这4种三文鱼的ControlRegion(CR)特征序列，经DNAstar软件的MegAlign功能比对4种三文鱼序列差异性，筛选出合理的差异性目的片段基因后导入Primerpremier5.0进行每种鱼类的特异性引物和探针的设计；以上设计的引物和探针均委托SangonBiotech(上海，中国)公司合成。

本发明中，探针5’荧光报告基团标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，以MiniOpticonRealTimeSystem(Bio-Rad)为例，区分鲑科鱼类与非鲑科鱼类的探针用HEX标记，4种常见三文鱼设计的种类特异性探针用FAM标记，探针的3’淬灭集团可以选择TAMRA。

综上所述，与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，降低试剂成本，缩短检测时间。本发明为三文鱼及其深加工产品种类的快速检测提供了有效方法，为水产品和食品进出口提供技术保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为使用本发明特异性引物和探针实时荧光PCR扩增阳性对照，阴性对照等鱼类样本以及空白对照的扩增曲线图谱；

a.以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑的样本作为鲑科16SrDNA扩增的阳性对照；以狗鱼、鳓鱼作为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

b.以大西洋鲑(SS)的样本为阳性对照；以其他四种样本(虹鳟、狗鲑、红鲑、狗鱼)为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

c.以虹鳟(OM)的样本为阳性对照；以其他四种样本(大西洋鲑、狗鲑、红鲑、狗鱼)为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

d.以狗鲑(OK)的样本为阳性对照；以其他四种样本(大西洋鲑、虹鳟、红鲑、狗鱼)为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

e.以红鲑(ON)的样本为阳性对照；以其他四种样本(大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、狗鱼)为阴性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

备注说明：

1)、图1a-e：qPCR扩增体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，相应三文鱼的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(34.7ng/μL-107ng/μL)1.5μL，补水至20μL。实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，61℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

以图a为例，qPCR扩增体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(79.4ng/μL)1.5μL，补水至20μL。

以此类推，图b所用的特异性引物和探针为：

图c所用的特异性引物和探针为：

图d所用的特异性引物和探针为：

图e所用的特异性引物和探针为：

2)、上述每幅图中，每个样品的qPCR扩增均设置了3个重复。

3)、图1a-e的结果，我们得出结论：每组引物和探针均能特异性地扩增目标样品，而且对照组的阴性样品没有扩增。

图2为双重荧光定量PCR体系同时扩增鲑科16SrDNA和CR基因的扩增曲线图谱。

a.以鲑科16SrDNA和大西洋鲑的CR的混合引物和探针作为双重荧光定量PCR检测体系；以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑作为鲑科16SrDNA的阳性对照，以狗鱼、鳓鱼作为阴性对照，用于区分鲑科和非鲑科鱼类；以大西洋鲑作为CR基因的阳性对照，用于区分大西洋鲑与其他鱼类；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

b.以鲑科16SrDNA和虹鳟的CR的混合引物和探针作为双重荧光定量PCR检测体系；以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑作为鲑科16SrDNA的阳性对照，以狗鱼、鳓鱼作为阴性对照，用于区分鲑科和非鲑科鱼类；以虹鳟作为CR基因的阳性对照，用于区分虹鳟与其他鱼类；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

c.以鲑科16SrDNA和狗鲑的CR的混合引物和探针作为双重荧光定量PCR检测体系；以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑作为鲑科16SrDNA的阳性对照，以狗鱼、鳓鱼作为阴性对照，用于区分鲑科和非鲑科鱼类；以狗鲑作为CR基因的阳性对照，用于区分狗鲑与其他鱼类；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

d.以鲑科16SrDNA和红鲑的CR的混合引物和探针作为双重荧光定量PCR检测体系；以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑作为鲑科16SrDNA的阳性对照，以狗鱼、鳓鱼作为阴性对照，用于区分鲑科和非鲑科鱼类；以红鲑作为CR基因的阳性对照，用于区分红鲑与其他鱼类；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

备注说明：

1)、双重荧光定量PCR体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，三文鱼的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，三文鱼的特异性探针(10μM)0.2μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(34.7ng/μL-107ng/μL)1.5μL，补水至20μL。

实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，61℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

以图a为例：

双重荧光定量PCR体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，大西洋鲑的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，大西洋鲑的特异性探针(10μM)0.2μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(34.7ng/μL-107ng/μL)1.5μL，补水至20μL。

图b-d以此类推。

2)、上述每幅图中，每个双重荧光扩增实验均设置了3个重复。

3)、从图2得到，在区分鲑科和非鲑科的探针以及4种常见三文鱼的特异性探针组成的双重荧光定量PCR体系中，两种探针可以在同一反应管中进行样品检测，鉴定结果既可以确定待测样品是否为鲑科鱼类，并且同时可鉴定出是否为4种常见三文鱼。

以图a为例，鉴定结果显示：在鲑科16SrDNA和大西洋鲑CR的混合引物和探针作为双重荧光定量PCR检测体系中两种探针可以在同一反应管中对样品进行检测；大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑均可以被鲑科16SrDNA探针检测出来，均鉴定为鲑科鱼类；狗鱼、鳓鱼则不能被鲑科16SrDNA探针检测出来，鉴定为非鲑科鱼类；同时，大西洋鲑可以被大西洋鲑CR探针特异性扩增出来，检测鉴定为大西洋鲑；虹鳟、狗鲑、红鲑、狗鱼和鳓鱼均不能被大西洋鲑CR探针检测出来，鉴定为非大西洋鲑。并且灭菌蒸馏水为模板的反应无扩增。图中实线均代表鲑科16SrDNA特异性探针在实验扩增中的检测曲线，虚线均代表大西洋鲑特异探针在实验扩增中的检测曲线。以此类推图b-d。

图3为鲑科16SrDNA、大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑5种探针灵敏度的检测的标准曲线。将大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑DNA浓度进行十倍梯度稀释，再根据每一稀释倍数的DNA进行特异性荧光定量PCR鉴定。标准曲线图是以DNA浓度的log值作为横坐标，以对应DNA稀释浓度的扩增阈值(C_t)的平均值作为纵坐标。

根据上述标准曲线图，得出：

5个检测探针(鲑科16SrDNA、大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑)标准曲线的斜率分别为-3.4413、-3.7982、-3.6923、-3.5923、-3.4397，根据公式E＝10^(–1/slope)-1，计算出5个检测探针(鲑科16SrDNA、大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑)在检测浓度范围内的扩增效率分别为95.25％、83.35％、86.57％、89.83％、95.31％。结果分析表明大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑DNA溶液分别在0.794×10^-2ng/μL-79.4ng/μL、0.107×10^-1ng/μL-107ng/μL、1.007×10^-2ng/μL-100.7ng/μL、0.347×10^-2ng/μL-34.7ng/μL的检测范围内荧光定量PCR起始模板浓度和Ct值之间具有较好的线性关系。

图4采用建立的荧光定量PCR检测体系对混合样本进行检测。

a.以4种三文鱼的混合DNA作为待检测样品，以大西洋鲑DNA作为对照样品。

b.以4种三文鱼的混合DNA作为待检测样品，以虹鳟DNA作为对照样品。

c.以4种三文鱼的混合DNA作为待检测样品，以狗鲑DNA作为对照样品。

d.以4种三文鱼的混合DNA作为待检测样品，以红鲑DNA作为对照样品。

具体如下：

1)、以图a为例，以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑4种混合DNA作为混合样品，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/4；以仅含1/4大西洋鲑DNA，3/4的无菌蒸馏水为对照组样品；混合DNA标记的曲线即为混合DNA实验组的特异探针检测曲线，SSDNA对照组标记的曲线即为SSDNA对照组中的特异探针检测曲线；图中实线均代表鲑科16SrDNA特异性探针在实验组和对照组中的检测曲线，虚线均代表大西洋鲑特异探针在实验组和对照组中的检测曲线。图a的反应体系是根据双重荧光定量PCR扩增体系设置的；所用特异性引物和探针为鲑科16SrDNA和大西洋鲑的特异性引物和探针。每个双重荧光定量PCR扩增实验均设置3个重复。

以此类推，图b-d均以大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑4种混合DNA作为混合样品，即实验组，混合样品中，每种DNA均占总混合DNA的1/4；以仅含1/4目标三文鱼DNA，3/4的无菌蒸馏水为对照组样品；混合DNA标记的曲线即为混合DNA实验组的特异探针检测曲线，DNA对照组标记的曲线即为对应目标三文鱼DNA对照组中的特异探针检测曲线；图中实线均代表鲑科16SrDNA特异性探针在实验组和对照组中的检测曲线，虚线均代表大西洋鲑特异探针在实验组和对照组中的检测曲线。每个qPCR扩增实验均设置3个重复。

备注说明：该双重荧光定量PCR体系和实时荧光PCR反应程序同图2所述。

2)、图4a-d结果显示，即便4种三文鱼混合在同一管中，仅占总量1/4的目标三文鱼样品DNA也能被双重荧光定量PCR成功检测出来。说明，建立的双重荧光定量PCR检测体系可以应用于混合样品的鉴定。

具体实施方式

实施例1、采用上述双重荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的三文鱼生鱼片进行种类鉴定：

1)、鲑科以及4种常见三文鱼的特异性鉴定引物与探针设计；

具体如表1所述。

2)、待测三文鱼样品中基因组DNA的提取；

从市场上随机购买标识为三文鱼的生鱼片，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒提取样品DNA，于-20℃保存。

3)荧光定量PCR扩增体系设置：

利用双重荧光定量PCR对其进行种类鉴定。

双重荧光定量PCR体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，三文鱼的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，三文鱼的特异性探针(10μM)0.2μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物(5μM)各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针(10μM)0.2μL，DNA模板(34.7ng/μL-107ng/μL)1.5μL，补水至20μL。

实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，61℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

备注说明：三文鱼的特异性上下游引物、三文鱼的特异性探针分别如表1所述。

同时设置三个重复和非模板空白对照；

备注说明：非模板空白对照，即将上述反应体系中的“基因组DNA1.5μL”改成灭菌蒸馏水为模板1.5μL；其余类同。

4)市售三文鱼样品的种类鉴定，判断是否与标签所述相符。

根据双重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检三文鱼样品中是否属于鲑科的4种常见三文鱼；其中检测基因无S曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性。

具体如下：

若鲑科16SrDNA检测基因无S型扩增曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该样品为非鲑科鱼类；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品种类属于鲑科。若4种常见三文鱼的CR检测基因均无S曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该样品为非此4种常见三文鱼鱼类；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品属于鲑科，且为有扩增反应的特定三文鱼种类。根据检测结果，对比标签标识的商品三文鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

实验1、将事先已经确定商品名称与实际相符的以下鱼的样品按照实施例1所述方法进行检测，所得结果如下表2所述。

表2

备注说明：银鲑、粉红鲑、王鲑代表的是不同于本发明的4种三文鱼的其他种类的三文鱼。

实施例2、采用上述双重荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的三文鱼鱼肉松商品进行种类鉴定：

从市场上随机购买标识为三文鱼鱼松商品，采用天根深加工食品DNA提取试剂盒(DP326)提取样品DNA，于-20℃保存。利用双重荧光定量PCR对其进行种类鉴定。若鲑科16SrDNA检测基因无S型扩增曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该鱼松样品中不包含鲑科鱼类成分；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中包含鲑科鱼类成分。若4种常见三文鱼的CR检测基因均无S曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含有此4种常见三文鱼鱼类成分；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有鲑科鱼类成分，且含有检测过程中有扩增反应的特定三文鱼种类。根据检测结果，对比标签标识的商品三文鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

即，将实施例1中的步骤2)作了更改，其余内容同实施例1。

实验2、将事先已经确定商品名称与实际相符的三文鱼鱼肉松的样品按照实施例2所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。

表3

实施例3、采用上述双重荧光定量PCR检测方法对市场上随机购买的三文鱼鱼罐头商品进行种类鉴定：

从市场上随机购买标识为三文鱼鱼罐头商品，采用天根深加工食品DNA提取试剂盒(DP326)提取样品DNA，于-20℃保存。利用双重荧光定量PCR对其进行种类鉴定。若鲑科16SrDNA检测基因无S型扩增曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该鱼罐头样品中不包含鲑科鱼类成分；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中包含鲑科鱼类成分。若4种常见三文鱼的CR检测基因均无S曲线产生和/或Ct值大于30者，判定结果为阴性，即可判定该样品中不含有此4种常见三文鱼鱼类成分；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性，即判定该样品中含有鲑科鱼类成分，且含有检测过程中有扩增反应的特定三文鱼种类。根据检测结果，对比标签标识的商品三文鱼种类，从而判定出待测样品种类与标签所述是否相符合。

即，将实施例1中的步骤2)作了更改，其余内容同实施例1。

实验3、将事先已经确定商品名称与实际相符的三文鱼鱼罐头的样品按照实施例3所述方法进行检测，所得结果如下表4所述。

表4

对比例1：

将实施例1中所用的引物改成如表5所示的序列，其余等同于实施例1。

表5

然后将实验1所述样品按照此对比例1所述方法进行检测，所得结果如下表6所述。

表6

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.三文鱼或其深加工产品种类鉴定的双重荧光定量PCR检测方法中所用的特异性引物和探针，其特征是：

所述特异性引物和探针的序列由鲑科以及大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑中的至少任意一种组成：

。

2.利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是包括以下步骤：

①、鲑科以及4种常见三文鱼的特异性鉴定引物与探针设计；

所述4种常见三文鱼为大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑；

②、待测三文鱼样品中基因组DNA的提取；

③、双重荧光定量PCR扩增体系设置；

④、根据实时荧光PCR检测结果进行判断。

3.根据权利要求2所述的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：所述步骤①是针对4种常见三文鱼的16SrDNA、CR序列进行双重荧光定量PCR检测的特异性鉴定引物与探针的设计。

4.根据权利要求3所述的双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：所述的探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，鲑科5’荧光染料标记采用HEX，4种常见三文鱼种类采用FAM；探针的3’淬灭集团均选择TAMRA荧光标记。

5.根据权利要求2、3或4所述的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：

所述步骤①中的特异性引物和探针的序列由鲑科以及大西洋鲑、虹鳟、狗鲑、红鲑中的至少任意一种组成：

。

6.根据权利要求5所述的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：

所述步骤③双重荧光定量PCR扩增体系设置；

双重荧光定量PCR体系为：20μL总体积中含有AceQ^TMqPCRProbeMasterMix10μL，三文鱼的特异性上下游引物各0.4μL，三文鱼的特异性探针0.2μL，鲑科16SrDNA的特异性上下游引物各0.4μL，鲑科16SrDNA的特异性探针0.2μL，DNA模板1.5μL，补水至20μL；

实时荧光PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10sec，61℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

7.根据权利要求6所述的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：

所述步骤②中，三文鱼通过Axygen基因组小量DNA提取试剂盒提取；三文鱼深加工样品通过天根深加工制品提取试剂盒提取。

8.根据权利要求2～7任一所述的利用双重荧光定量PCR检测三文鱼或其深加工产品种类的方法，其特征是：

所述步骤④的判断为：根据双重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检三文鱼样品中是否属于上述4种常见三文鱼；检测基因无S曲线产生或/且Ct值大于30者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于30者，可判定该样品结果为阳性。